VIABILIDAD DE LACTOBACILLUS CASEI

INOCULADO EN GELATINA DE MAMEY

D. Y. Escalante Rendiz, L.G Caballero Espada, I.I Crdenas Bates, L. M Ferrez Canul
1
Facultad de Ingeniera Qumica, y
2
Licenciatura en Qumica Industrial, de la UADY


RESUMEN
Los probiticos son cultivos activos
que contribuyen al equilibrio
microbiano intestinal, ayudan a
reforzar nuestro sistema inmunolgico
y tienen efectos positivos en la salud
de quien los consume, sin embargo
para que estos microorganismos
puedan tener dichos efectos positivos
en el sistema se necesita un medio
adecuado para ser suministrados.
Durante muchos aos la mayora de
los probiticos han sido administrados
y comerciados como productos
lcteos. Hoy da el inters en este tipo
de productos hace necesario
diversificar la disponibilidad de los
productos probiticos en el mercado.
Debido a lo anterior el presente
trabajo pretende evaluar la viabilidad
del microorganismo Lactobacillus
Casei inoculado en gelatina de
mamey.
El L. Casei se aisl a partir de una
alcuota, de producto lcteo
fermentado Yakult, las cuales fueron
identificadas por medio de la tincin
de Gram, prueba de catalasa y
fermentacin de carbohidratos. Se
prepararon gelatinas con un 20% de
mamey las cuales fueron inoculadas
con L. casei, posteriormente se estudi
la viabilidad de este microorganismo
en dicho medio, los resultados
obtenidos muestran que el
microorganismo probitico es capaz
de sobrevivir sin descender su cuenta
del intervalo aceptado para productos
probiticos segn las normas Codex
STAN 243-2003 y la Lactic Acid
Bacteria Beverages Association.
Palabras clave: probitico, mamey, viabilidad.
INTRODUCCIN
Los microorganismos conocidos como probiticos cuando son
consumidos en cantidades adecuadas confieren beneficios a la salud
incluyendo la reduccin del nivel de colesterol, mejorando las
funciones gastrointestinales y fortaleciendo el sistema
inmunolgico (Martha Lozano, 2011).
Sin embargo, para que estos microorganismos puedan llegar al sitio
donde van a ejercer su accin, necesitan de ciertas cualidades o
caractersticas especficas que no tienen naturalmente, por lo cual,
se aplican diversas tcnicas para ayudar a los probiticos a
sobrevivir al paso por el tracto gastrointestinal (Lillian Frioni ,
1999).
Entre estas tecnologas se encuentra el encapsulamiento usando
agentes gelifican ts que resisten los valores de pH que se
encuentran en el tracto digestivo (Nicols Trujillo, 2004)
La mayora de los productos encontrados en el mercado son lcteos
sin embargo hoy en da las frutas representan un excelente vehculo
para la administracin de probiticos debido a los nutrientes
benficos como minerales, vitaminas, azcares fermentables y
antioxidantes que contienen, los cuales favorecen la viabilidad de
los microorganismos probiticos en el producto final.
En particular el mamey (Pouteria sapota) proveniente es un
miembro de las Sapotaceae, nativo de Amrica Central (Mxico).
Es notable por su bajo contenido de cidos y su pulpa tiene un
rango de pH que va de 4.5 a 6.0. La pulpa del fruto de zapote
mamey contiene cantidades considerables de antioxidantes los
cuales favorecen la viabilidad de los probiticos. (Bioextracto,
2000)
Para poder indicar que un alimento es considerado funcional se
debe tener la existencia de microorganismos, estos deben sumar
una cantidad mnima de 106 (Codex STAN 243-2003). Segn la
Lactic Acid Bacteria Beverages
Association deber contener
como mnimo: 10 Bifidobacterias viables por gramo o ml.
MATERIALES Y MTODOS
ETAPA 1- Obtencin del microorganismo a
partir del Yakult
Aislamiento
A partir de una muestra de 100 L de Yakult y
se prepararon 6 microdiluciones de
concentraciones de 10
-1
a 10
-6
, se sembraron 100
L de cada dilucin en 6 placas con medio LS-
Diferencial por extensin y se incubaron a 35 C
en condiciones de aerobiosis, por tres das para
aislar la cepa de Lactobacillus casei.
ETAPA 2- Purificacin del microorganismo,
preparacin medios de cultivo e
identificacin.
Purificacin por estras
Para la purificacin de los microorganismos se
tomaron las colonias de coloracin rosada,
circulares y tamao pequeo que presentaron un
crecimiento ms aislado, con el asa previamente
esterilizada se descargaron formando estras en
un medio Agar-MRS.
I dentificacin
Para la identificacin de los microorganismos se
utilizaron la prueba de catalasa, la tincin de
Gram y la fermentacin de carbohidratos durante
24 horas a 37C, utilizando como azcares el
manitol, xilosa, sacarosa, glucosa y lactosa.
ETAPA 3- Conservacin del microorganismo
Congelacin
Se tom una colonia pura de cada
microorganismo y se sembr en 5 mL de caldo
MRS que posteriormente se incub a 37C a 150
rpm por 24 horas. Posteriormente 1 mL del caldo
MRS del cultivo, se coloc en un tubo
Eppendorf, se centrifug a 10000 rpm durante
aproximadamente 10 minutos, se decant y se
aadi 1 mL de caldo MRS al 20% glicerol, se
homogeneiz en vrtex y se someti a
congelamiento a -20C.


ETAPA 4- Cintica de crecimiento y
cuantificacin del microorganismo
Se prepar una solucin madre al 10% de
muestra con agua peptonada al 0.1%. Se
inocularon 270 ml de caldo MRS con la muestra
de 10%.
Para la cintica de crecimiento bacteriano se
utiliz la curva de McFalrad, midiendo la
absorbancia en el espectrofotmetro
ThermoScientific Genesys 20 a diez tubos los
cuales contenan BaCl2 (0.1 a 1 ml) y H2S04
(9.9 a 9 ml).
Al caldo MRS inoculado con la muestra al 10%
se le midi la absorbancia cada dos horas
durante 24 horas, con una longitud de onda de
590-580 nm.
Se realiz la curva de crecimiento y con base en
la ecuacin de esta, se calcularon las
concentraciones de microorganismos en los
distintos tiempos.
Mtodo de Miles and Misra
Se prepararon diluciones seriadas de hasta 10
-6

respetando un volumen final de 5 ml.
Se colocaron 100 L de las disoluciones en las
placas seccionadas y marcadas previamente en
forma de gotas. Se incubaron durante un periodo
de 24 horas. Posteriormente, se observ su
crecimiento.
ETAPA 5- Preparacin de las gelatinas con el
microorganismo
J ugo de Mamey
Se us como sustrato el jugo de mamey
(Pouteria sapota), el mamey se compr en un
supermercado local. A la pulpa del fruto se le
agregaron aproximadamente 500 ml de agua y se
licuaron hasta tener una consistencia liquida.
Para la preparacin de la gelatina se usaron 8.4 g
de grenetina los cuales se disolvieron en 300 ml
de agua hervida. La gelatina tuvo una
concentracin de 20% de jugo de mamey sele
inculo el microorganismo previamente
centrifugando a 6000 rpm durante 15 min. Se
decant y se lav con 30 mL de solucin
fisiolgica (NaCl al 0.85% en agua destilada) se
homogeneiz y se centrifug a las mismas
condiciones. Se decant y se lav nuevamente
con 30 mL de solucin fisiolgica, y se
homogeniz en el vortex, se agregaron 60 ml de
jugo y 210 mL de agua.
Para el conteo en placa se prepararon tres
gelatinas por triplicado inoculadas con L. Casei
shirota, y una muestra control.
ETAPA 6- Activacin y viabilidad de las
gelatinas
De cada muestra de gelatina se preparan
diluciones seriadas hasta 10
-6
con agua
peptonada al 0.1% y cada una de ellas se sembr
por extensin en placas de agar-MRS seguido de
una incubacin a 35C por 48 horas para su
posterior conteo.

RESULTADOS Y DISCUSIN
Las colonias aisladas en un medio MRS, fueron
redondas blancas cremosas y pequeas, (figura
1) este es el crecimiento caracterstico para este
lactobacilo en ese medio.

Figura 1. Observacin de las colonias aisladas a partir de
Yakult en MRS.

Para la identificacin de los microorganismos se
realiz la tincin de Gram a dos tipos de
colonias, la colonia 1, crculos rojos de tamao
grande y a colonia 2, crculos rosados de tamao
pequeo.
Se observ la colonia 1 en el microscopio al
100x los organismos fueron de color verde con
forma de redonda, por lo que dan negativo para
la tincin de Gram. Mientras tanto, la colonia 2,
se observ coloracin azul-morada y en forma de
bastoncillos, siendo, Gram positivas.
Los resultados para la prueba de catalasa,
arrojaron que la colonia 1, dio positiva, es decir
se observ efervescencia lo que indica que la
enzima peroxidasa o catalasa est
descomponiendo el perxido de hidrgeno
(H2O2) formando H2O y O2 que se desprende
como pequeas burbujas, para la colonia 2, el
resultado fue negativo, por lo que se concluye
que no contiene la enzima ya antes mencionada.
El conjunto de las caractersticas que cumpli la
colonia 2, de ser Gram positiva y catalasa
negativa, con caractersticas del Lactobacillus
casei.
Posterior a esto, se realiz la prueba de
fermentacin de azcares utilizando como base
rojo de fenol. Los carbohidratos que dieron
positivos fueron: sacarosa, lactosa y manitol,
pasando a color amarillo intenso caractersticos,
lo que nos informa es la produccin de cidos y
fermentacin del alcohol, el nico carbohidrato
que dio negativo a la prueba fue la xilosa, ya que
el cambio de coloracin fue a naranja, lo que
indica el aumento de pH por la produccin de
sustancias alcalinas.
Para realizar la cintica se utilizaron los
estndares de Mc Farland que se realizan para
aproximar la turbidez a la concentracin de
clulas suspendidas. La escala de Mc Farland
representa concentraciones especficas en
UFC/mL.
Se comprob la relacin entre el nmero de
bacterias y la absorbancia leda utilizando la
ecuacin obtenida.
Para observar el comportamiento de los
microorganismos, se tuvo que realizar la curva
de calibracin con los datos obtenidos de la
escala de Mc Farland, la curva de calibracin de
muestra en la figura 2. Con una R=0.9868 y la
ecuacin de la recta es: y = 6x10
-10
x + 0.0049.


Figura 2. Escala de Mc Farland.

El crecimiento microbiano hace referencia al
aumento del nmero de microorganismos a lo
largo del tiempo y no al aumento de tamao de
un microorganismo. El aumento del nmero de
microorganismos permite la formacin de
colonias o de poblaciones. Las bacterias se
reproducen generalmente por fisin binaria. El
resultado de la fisin binaria son dos clulas
hijas por cada clula madre, as, una clula se
divide en dos, dos en cuatro y cuatro en ocho y
as sucesivamente (Brock, 2009), todo esto se
puede observar en la figura 3.



Figura 3. Cintica de crecimiento del microorganismo
Lactobacillus Casei

La cintica de crecimiento de los organismos
corresponde a las etapas de crecimiento de
microorganismos, la fase lag el periodo de
adaptacin de los microorganismos a un nuevo
ambiente y ocurri en las primeras 2 horas.
La fase logartmica o de crecimiento exponencial
durante este periodo las clulas se empiezan a
dividir en forma constante, la actividad
metablica: respiracin celular, la sntesis de
protenas es mxima. El nmero de clulas vivas
en reproduccin es mucho mayor que las clulas
vivas de la poblacin que comienzan a morir,
esta parte ocurri a partir de las dos horas hasta
aproximadamente las 10 horas. fase estacionaria,
en este periodo se genera un factor limitante del
crecimiento, razn por la cual se detiene el
crecimiento de los microorganismos, generando
una tasa reproductiva igual a la tasa de
mortalidad, es un periodo de equilibrio que
ocurri entre las 10 horas y las 14 horas. Y la
ltima fase de muerte, o de declive logartmico,
en esta fase las clulas no se reproducen, solo
mueren y son destruidas por lisis en forma
exponencial a causa del incremento en las
cantidades de cido y otros desechos dainos en
el ambiente que se observa a partir de las 16
horas.
Para el estudio de viabilidad de hicieron los
respectivos conteos en las gelatinas desde el
tiempo cero hasta el tiempo dos, las cuales se
hicieron por triplicado. Los resultados obtenidos
en los conteos se muestran en la figura 4. En la
cual podemos observar una disminucin en el
nmero de colonias de formadas a partir de las
50 horas, sin embargo a partir de la hora 60 la
grfica nos indica un aumento en el nmero de
colonias, esto nos indica que el L. casei pudo
adaptarse al medio en las primeras 60 horas para
su posterior desarrollo en las siguientes horas.

0
0.5
1
1.5
2
0.00E+00 2.00E+09 4.00E+09
a
b
s
o
r
b
a
n
c
i
a

C (UFC/ml)
8.5
9
9.5
10
10.5
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11
L
o
g

C

(
U
F
C
/
m
l
)

tiempo (horas)
Ci nti ca de creci mi ento

Figura 4. Viabilidad del L. casei en la gelatina de mamey
Las gelatinas de mamey inoculadas mantuvieron
sus cuentas por encima del mnimo establecido
para los productos probiticos que es 1x10
6

UFC/mL del producto, despus de 3 das de
almacenamiento en refrigeracin, es decir, no
presentaron diferencias significativas entre s ni
con respecto al tiempo.
Conclusin
En conclusin el L. casei puede sobrevivir en la
gelatina de mamey durante un periodo aceptable
de tiempo, manteniendo su nmero dentro de los
mrgenes establecidos para alimentos
funcionales por la Codex STAN 243-2003 y la
Lactic Acid Bacteria Beverages Association.



Referencias:
Martha Celia Lozano Prez (2011). Estudio de la
viabilidad de Lactobacillus casei Shirota en una
gelatina de pitaya (Stenocereus griseus H.)
Lillian Frioni (1999) Procesos microbianos. Ed.
De la fundacin Universidad Nacional de Rio
Cuarto, Argentina. Ao.
Nicols Dvalos Trujillo (2004) efecto de tres
tipos de estabilizantes (cmc, gelatina, pectina) al
0.15 % en el rendimiento de queso fresco
pasteurizado. 2004 recuperado de:
http://www.dspace.espoch.edu.ec/bitstream/123
456789/3224/1/27T0052.pdf
Bioextracto (2000) Boletn 71 mamey. Ao
2000 recuperado de:
http://www.bioextracto.com.mx/bol71.html
Michael T. Madigan, (2009) Brock Biologa de
los microorganismos 10 Edicin, Ed Pearson