PRCTICA: N 02

DETERMINACIN DEL NMERO TOTAL DE BACTERIAS: RECUENTO

MICROSCOPICO DIRECTO DE BREED
I. INTRODUCCIN
La leche es uno de los alimentos ms completos, ya que tiene las sustancias
nutritivas necesarias para cubrir la demanda para cubrir del organismos humano y
contiene grasa en forma de emulsin en un porcentaje de 3.2 a 4.5%; posibilitando la
diferenciacin de leche magra cuando se ha extrado la nata y leche rica en grasas
cuando sus valores son los que se han expresado a lo largo de este informe.
Contiene protenas entre 3.0 a 3.3% de los cuales el 75% de ellas es casena y el resto
albminas y globulinas; contienen igualmente glcidos en valores de 4.7%
expresadas en lactosa lo que le otorga una dulzura relativamente baja del cual se
parte para considerar el uso en la condiciones fisiolgicas de los lactantes y como
medio teraputico. Contiene adems 0.7% de vitaminas entre las que se cuentan
bsicamente; los liposolubles; las hidrosolubles del complejo B; la biotina; el .cido
pantotnico; cido flico, nicotinamida y cartida. Por su pH de aproximadamente
6.5 se constituye en un buen medio de cultivo para numerosos grmenes tales
como bacterias y hongos por lo que se considera un producto alimenticio muy
perecedero que a su vez puede ser un vehculo de grmenes patgenos para el ser
humano La leche cruda siempre contiene una variedad de microorganismos que
estn en funcin del estado sanitario de los animales de donde proviene, de los
cuidados tcnicos durante el ordeo, limpieza de los aparatos y recipientes.

METODO DE BREED
El mtodo de Breed es un mtodo de recuento directo bastante simple, fcil y
eficaz a pesar de ser un mtodo antiguo (1911). Este mtodo de Conteo Directo al
Microscopio (CMD) es usado mayoritariamente para el diagnstico microbiolgico
de la leche y se le considera un mtodo rpido para estimar el grado de
contaminacin bacteriano de la leche pero que no est diseado para el conteo
rutinario de la leche cruda ya que el conteo en placa es ms preciso, ms prctico y
ms barato que un conteo directo ejecutado adecuadamente. Si el mtodo se
contemplara como un mtodo para estimar la calidad de la leche con propsito de
pago, su uso sera limitado para pequeo nmero de muestras con alto contenido
bacteriano (2.3 x 106 ufc/mL) debido a la insensibilidad del mtodo.
El mtodo de Breed es un mtodo rpido que se fundamenta en la observacin
directa y en la enumeracin de microorganismos en un volumen determinado de
alimento pero para poder realizarlo al microscopio debe estar calibrado de modo
que se conozca el rea del campo microscpico
Fundamento:









Caractersticas:
Es rpido.
Se cuenta el nmero total: clulas viables y no viables.
Se fundamenta en la observacin directa y en la enumeracin de los
microorganismos de muestras determinadas.
Se utiliza para alimentos lquidos, si es slido se diluye.
Se puede observar la morfologa de los microorganismos

I. OBJETIVOS

Determinar el nmero de bacterias totales, clulas viables y no viables
utilizando el mtodo de Breed
Enumerar los m.o en un volumen conocido de alimentos
Al final de la prctica se determinara la poblacin bacteriana en la
muestra

II. MATERIALES

a) Muestra

Leche de vaca fresca

b) Material de laboratorio
Microscopio compuesto

Lminas portaobjetos

lminas patrn de Breed

Asas calibradas (3mm de dimetro)

Reactivos para coloracin Gram y para coloracin con azul de
metileno.

Pipeta de Breed (0,01ml)o pipeta automtica(10 ul)

Xilon


III. PROCEDIMIENTO

a) Para la muestra:
Colocar 250 ml de la muestra (leche) en un frasco de boca ancha estril.
Homogenizar la muestra (mnimo 20 veces)





b) Mtodo de Breed:

Desengrasar con cuidado un portaobjetos.
Simular un porta y dibujar en el dos cuadrados de 1 cm por lado.
Colocarlo debajo del porta y observamos dos superficies bien
delimitadas de 1 cm2.
Colocar en la superficie y extender en los lmites del cuadrado 1 gota de
micropipeta (10 ul) de inculo (leche).
Inmediatamente secar y fijar por calor suavemente. Cubrir la extensin
con azul de metileno durante 1 min. lavar con agua destilada, secar y
observar al microscopio con objetivo de 40-60 aumentos.
A continuacin contar el nmero de microorganismos en 30 campos, de
manera que el nmero de campos es ms grande cuanto ms bajo
es el de microorganismos.


c) EXAMEN MICROSCPICO

Seleccionar los campos representativos en la mitad de cualquiera de los
extremos (recorrer toda la lmina).
Contar entre 10 y 100 campos dependiendo de la densidad de clulas
por campo (si hay bastantes clulas slo observar 10 campos).
Para efectos de la prctica se analizara 30 campos por estudiante.
Si las bacterias se encuentras en racimos o cadenas se cuentan como
una sola.













IV. RESULTADOS:

El microscopio utilizado fue el numero 7












TOTAL: 117

Clculos correspondientes

Promedio = x = microorganismos = 117
30 campos 30
Promedio = 3.9 => 4
Factor microscpico

a. Medir el dimetro del campo en mm dimetro = 17.5mm
b. Determinar el rea del campo en mm
2
A = .r
2


Dnde: r = (dimetro)
= 3.1416
r = dimetro / 2 = 0.175/2 = 0.0875
A = .r
2

A = (3.1416) (0.0875)
2
= 2.405 mm
2

N de
Campo
N de
Bacteria
21 3
22 4
23 4
24 3
25 5
26 4
27 6
28 3
29 4
30 6
N de
Campo
N de
Bacteria
11 0
12 2
13 3
14 4
15 3
16 6
17 7
18 4
19 3
20 4
N de
Campo
N de
Bacteria
1 3
2 2
3 2
4 4
5 6
6 5
7 6
8 4
9 3
10 4

Calculo del Nmero de microorganismos en gr. /ml

N de microorganismos. =5,1 x415 x100 x100 = 2x 10000000 m.o x g/ml
INTERPRETACION:
SEGN LA NORMA OFICIAL DE LA LECHE
Tengamos en cuenta algunas definiciones, segn la ltima Norma Oficial Peruana
vigente del 2003, norma que tiene carcter voluntario:
Leche: es el producto ntegro de la secrecin mamaria normal sin adicin ni sustraccin
alguna y que ha sido obtenida mediante el ordeo.
Leche cruda entera: es el producto ntegro no alterado ni adulterado del ordeo
higinico, regular y completo de vacas sanas y bien alimentadas, sin calostro y exento de
color, olor, sabor y consistencia anormales y que no ha sido sometido a procesamiento o
tratamiento alguno.






CONCLUSIONES
Se logr hacer el recuento de microorganismos totales mediante el Mtodo de
Breed.
Se concluy que la leche trada si estaba dentro del rango permitido por la
INDECOPI del nmero de microorganismos que debe haber en la leche que es de
1 500 000 grmenes/ml. pues la muestra trada para la prueba obtuvo 1 219 999
microorganismos /ml.
RECUENTO MICROSCPICO
DE MICROORGANISMOS
=
N promedio
de m.o por
campo
X
Factor
microscpico
X
Recproco
de la
dilucin
CUESTIONARIO:
1. A parte de la leche y jugos que tipo de alimentos se puede utilizar el Mtodo de Breed?

Este mtodo se utiliza para la industria lctea, ya que proporciona una idea rpida del
nmero de microorganismo de un producto lcteo; a adems se podra utilizar para el
numero de microorganismos en el agua.
2. Recuento en Placas
Se funde agar nutritivo en tubos en cantidad de 10 ml. Se enfra a 45 C en bao Maria.
Se rotulan dos o ms placas de Petri por cada una de las diluciones. Se vierte 1 ml. De cada
una de las diluciones en el centro de la placa correspondiente.
Se aade a cada placa el contenido de un tubo de agar, girndola y mezclndola de la
siguiente forma:
Se mueve la placa suavemente seis veces describiendo crculos en el sentido de las saetas
de un reloj, crculos de unos 15 cm de dimetro.
Se deja que solidifique, se invierte y se incuba durante 24-48 horas.








Diluciones seriadas para el recuento en placa.

3. Recuento en Tubos Arrollados
En lugar de usar placas se siembran con el material diluido en tubos o frascos conteniendo
el medio y se hacen girar horizontalmente hasta que el medio solidifique.
Se distribuye el medio en cantidades de 2-4 ml. en matraces de tapn de rosca. Se funde y
se enfra a 45 C en bao Maria. se aaden 0,1 ml de cada dilucin y se hace girar
horizontalmente en agua fra hasta que el agar se dispone en una pelcula uniforme
alrededor de las paredes del frasco.
Los tubos arrollados se incuban invertidos, para que el agua de condensacin se recoja en
el cuello del frasco y no extienda las colonias que crecen en la superficie del agar. Para
contar, se marca una linea paralela al eje longitudinal del frasco y haciendo girar a la
botella se cuentan las colonias mediante una lupa de pocos aumentos.













4. Mtodo del recuento en filtro de membrana:
En este mtodo, el recuento de microorganismos es realizado utilizando un filtro de
membrana. Se filtra un volumen conocido de muestro a travs de un filtro de membrana,
clulas sobre la superficie. El filtro con los microorganismos retenidos es colocado sobre
medio de cultivo slido. El nmero de colonias formadas en la superficie del
filtro permite determinar el nmero total de microorganismos viables en la muestra
filtrada.








Equipo de filtracin por membrana


REFERENCIA BIBLIOGRFICAS
Pearson, L.; 1976; Tcnicas de Laboratorio para el anlisis de los alimentos;
Editorial Acribia; Zaragoza.

http://www.infolactea.com/descargas/biblioteca/362.pdf

file:///C:/Users/PTADA/Desktop/ALIMENTOS%20I/Dialnet-PracticasDeMicrobiologia-
100835.pdf

http://www.ramos.utfsm.cl/doc/530/sc/LABORATORIO_3.pdf