FACULTAD DE INGENIERIA EN INDUSTRIAS ALIMENTARIAS DEPARTAMENTO ACADEMICO DE CIENCIA, TECNOLOGIA E INGENIERIA DE ALIMENTOS
PROYECTO DE TESIS
Caracterizaci n reologica del licor de cacao de la variedad CCN51 de la zona de Pucaca (Theobroma cacao)
RESPONSABLE : BECERRA RAMIREZ, Edil
ASESOR : Ing. RIVERA ROJAS, Humberto
COASESOR :
TINGO MARA - PER 2014
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I. EL PROBLEMA
1.1 Planteamiento del problema El cacao (Theobroma cacao) es un cultivo de notable importancia econmica para Per; declarado recientemente como producto bandera de Per, por la Comisin Nacional de Productos de Bandera (Coproba). Y debido al alto valor nutricional y amplio consumo en la alimentacin por el mundo en general; la produccin de cacao, chocolates y subproductos pasan a constituir una prioridad en el pas. Gran parte del cacao Peruano es exportado y continua siendo considerado entre los ms finos de aroma del mundo, sin embargo, su participacin en el mercado internacional es prcticamente imperceptible en las estadsticas. Durante los ltimos anos las compaas procesadoras de cacao, y en particular aquellas encargadas de la produccin de chocolate, han comprendido que la calidad sensorial constituye el xito de un producto y, para ello, es necesario conocer los factores que determinan la calidad sensorial de dicho producto. En la elaboracin del chocolate se pueden citar innumerables factores vinculados a esta, cuyo manejo apropiado puede generar un carcter aromtico distintivo y deseable. Los estudios que se han realizado en torno a las diferentes etapas que conforman la elaboracin del chocolate son diversos. Sin embargo, la bioqumica y los procesos qumicos que conducen a la 2
formacin y al desarrollo del aroma y del sabor del chocolate, su relacin con el carcter final y la percepcin de la calidad no se entienden por completo. Esta situacin hace necesario en realizar la caracterizacin reolgica del licor de cacao para compilar la informacin necesaria, referente a los diferentes factores que determinan la calidad sensorial del chocolate. La semilla del fruto del rbol de cacao es la principal materia prima para la elaboracin del chocolate, la cual es sometida a una serie de etapas de transformacin primaria en donde se efecta la cosecha, la apertura de la vaina, la fermentacin y el secado. Posteriormente se procede con el proceso de manufactura del chocolate en el cual los granos son limpiados y tostados, seguidos por la produccin del licor de cacao, mezcla y refinado, conchado, temperado y moldeado, enfriamiento y finalmente el embalaje, almacenamiento y distribucin. El sabor, el aroma, la apariencia y la textura son fundamentales para la aceptacin del chocolate, los cuales estn influenciados de una u otra forma por diversos factores, tales como la variedad de cacao, el clima, el suelo, el tratamiento post-cosecha, as como por el proceso de manufactura del chocolate.
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1.2 Justificacin El presente trabajo de investigacin se justifica por los siguientes motivos: La falta de datos cientficos y de trabajos de investigacin en aguaje,fruto extico de nuestra amazonia. La informacin del presente estudio permitirconocer los tipos de ismeros de vitaminas y el contenido de los mismos presentes en la pulpa de este fruto. Los datos que se obtengan servirn para la formulacin de nuevos productos e incentivacin para su produccin y comercializacin.
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II. OBJETIVOS 2.1 Objetivo general Cuantificacin deismeros de vitaminas A, D yE en dos variedades de pulpa deaguaje Mauritia flexuosa por HPLC en fase reversa. 2.2 Objetivos especficos Realizar las medidas biomtricas y el balance de materia en la obtencin de pulpa de aguaje: cascara, pulpa, piel y semilla. Evaluacin al estado fresco y seco, almacenados a -20C de las dos variedades de aguaje.
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III. REFERENCIA BIBLIOGRAFICA 3.1 Antecedentes Segn GARCA y RETEGUI (2002),realizaron la conservacin de pulpa de Mauritiaflexuosal. aguaje con aplicacin de mtodos de factores combinados.El objetivo de este trabajo fue estudiar la estabilidad fsico- qumica, sensorial y microbiolgica durante el almacenamiento a temperatura ambiente de pulpa de aguaje. Se han realizado los estudios de aplicacin de la tecnologa de factores combinados en la conservacin de pulpa de aguaje. Segn GARCA et al (2008), determinaronpor CLAR la Vitamina E en el Pool de Aceite de Hgado de Tiburn.En este trabajo se desarroll y valid un mtodo analtico, por Cromatografa Lquida de Alta Resolucin (CLAR), para determinar vitamina E, aplicable al control de la calidad del pool de aceite de hgado de tiburn.El mtodo se bas en la separacin de la vitamina a travs de una columna cromatogrfica Lichrosorb RP - 18 (5 m, 25 cm x 4 mm), empleando una fase mvil compuesta por metanol: agua (98:2). La cuantificacin de las vitamina E se realiz frente a muestras de referencia empleando el mtodo del estndar externo, a una longitud de onda de 284 nm. El mtodo analtico desarrollado result lineal, preciso, especfico y exacto en el rango de concentraciones estudiadas. Segn SIERRA et al (2007),realizaron la validacin de una metodologa por cromatografa lquida de alta eficiencia para la determinacin 6
simultnea de vitaminas A, D 3 y E en inyectables de uso veterinario. Obtuvieron resultados del desarrollo y de la validacin de una metodologa analtica para la cuantificacin simultnea de vitamina A palmitato, vitamina D 3 y vitamina E acetato en inyectables de uso pecuario. El procedimiento consiste en una separacin por cromatografa lquida de alta eficiencia (CLAE) en fase inversa empleando como fase mvil una mezcla de acetonitrilo, metanol, agua (45:50:2.5), una columna C18 a 45 C y deteccin a una longitud de onda de 280 nm. Se encontr que el mtodo es selectivo, lineal y preciso. Estas caractersticas junto con su sencillez hacen que el mtodo sea adecuado y conveniente para el objetivo propuesto. La robustez de la metodologa fue tambin investigada. El mtodo validado se aplic para la determinacin de las vitaminas en tres productos inyectables del mercado colombiano con registro sanitario del Instituto Colombiano Agropecuario (ICA).
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3.2 Conceptos bsicos generales 3.2.1 Caractersticas botnicas del aguaje 3.2.1.1 Clasificacin taxonmica NAVARRO (2006), menciona que la taxonoma del aguaje es la siguiente: Reino : Vegetal Divisin : Fanergamas Clase : Monocotiledne Subclase : Liliopsida Orden : Arecales Familia : Arecaceae Sub Familia : Calamaoid Tribu : Lepidocaryeae Gnero : Mauritia Especie : flexuosa 3.2.1.2 Descripcin morfolgica El aguaje es una palmera arborescente de un solo tallo, sin espinas, que alcanza 25 a 30 m de altura en su estado de adulto. Crece en suelos inundados o con mal drenaje. El tallo es cilndrico con hasta 50 cm de dimetro y est constituido por un material fibroso duro. La corona de hojas se presenta en nmero de 10 a 20 por planta, con peciolo cilndrico y largo (hasta 6 m). La planta es dioica con rboles de flores masculinas y rboles de flores femeninas, sin caractersticas que permitan diferenciar a los individuos machos 8
de las hembras, hasta la floracin. La proporcin de plantas masculinas y femeninas es similar, pero, es alterada por la prctica que existe de cortar las plantas femeninas para cosechar los frutos. El fruto es una drupa, de forma elptica, con longitud entre 5 y 7 cm y dimetro entre 4 y 5 cm. El epicarpio (cscara) es escamoso, de color rojo vino o rojo oscuro. El mesocarpio, la nica parte comestible, de 4 a 6 mm de espesor, es suave, sabor agridulce y de color naranja a naranja-rojizo y representa solamente 12 a 13% del peso seco del fruto. El endocarpio (cobertura de la semilla) es suave, rico en celulosa y pobremente diferenciado. Hay una, muy raramente, de dos semillas por fruto, casi esfricas, cubiertas con una testa marrn. La floracin y fructificacin se distribuyen irregularmente durante el ao, pero, siempre ocurren anualmente. Los frutos maduros se encuentran todo el ao, con abundancia en la primera mitad del ao (Per y Amazona norte de Brasil), o en la segunda mitad del ao (Colombia, Venezuela y Amazona central de Brasil). El peso promedio de los frutos en una inflorescencia es de 40 kg (VILLACHICA, 1996). Se puedendiferenciar tres variedades de fruta por sucolor: el Amarillo o Posheco, cuando todo elmesocarpio es de color amarillo; el Colorado, cuando la parte externa del mesocarpioes de color rojo y el resto es amarillo; elShambo, cuando todo el mesocarpio es decolor rojo (NAVARRO, 2006).
3.2.1.3 Composicin qumica 9
La pulpa del aguaje es el alimento ms nutritivo de los frutos del trpico. En la tabla 01, se presenta el anlisis qumico y el valor nutritivo de la pulpa: Cuadro 1. Composicin qumica en 100 g de pulpa Componentes 100 g de pulpa Energa 283,0 kcal Agua 53,6 g Protenas 3,0 g Lpidos 21,1 g Carbohidratos 18,1 g Fibra 10,4 g Ceniza 0,9 g Calcio 74,0 mg Fsforo 27,0 mg Hierro 0,7 mg Fuente: NAVARRO, 2006 3.2.2 Vitaminas 3.2.2.1 Vitamina A Definicin La vitamina A, tambin denominada trans-retinol (retinol), es un alcohol isoprenoide que desempea un papel clave en la visin. Se trata de un compuesto poliisoprenoide que contiene un anillo ciclohexano (MELO- CUAMATZI, 2004). 10
Se conoce bien la importancia de la vitamina A como factor para el crecimiento y la salud normal. El estudio del ojo y sus enfermedades, y las investigaciones sobre el valor nutricional de las grasas a comienzos de siglo fueron rutas diferentes que condujeron al descubrimiento de esta vitamina,(SASTRE y HERNNDEZ, 1999). En 1909, Stepp descubri que en la yema del huevo exista una sustancia soluble esencial para el mantenimiento de la vida. McCollum en 1992 introdujo el trmino de sustancia liposoluble A para este factor y en 1920 Drummond llamo a esta sustancia vitamina A. Adems, fue la primera vez que se observo que los extractos amarillos de planta ricos en carotenos tenan actividad de vitamina A. La explicacin llego aos ms tarde (1992) al descubrirse en ratas que el beta caroteno se converta en vitamina A. La estrecha relacin entre esta vitamina y los grupos carotenoides se rebel cuando se determino la forma estructural de ambos, aunque los carotenos ya haban sido extrados y cristalizados de zanahorias en el ao 1831 por Wakenroder. La vitamina A 2 fue aislada por Morton en 1937 y la actividad biolgica del acido retinoico fue descubierta en el ao 1946. Wald en los 1934 - 1935 aisl retinaldehido de la retina y demostr que estaba implicado en el proceso de la visin,(SASTRE y HERNNDEZ, 1999). Estructura. El termino vitamina A se ha utilizado para los derivados beta ionona que poseen una estructura yactividad biolgica comparable a la molcula base que es el transretinol. En la naturaleza la vitamina A puede 11
encontrarse en tres estados de oxidacin diferentes como resultado de la unin de 4 unidades de isopreno: alcohol (retinol), aldehdo (retinaldehido) y acido (acido retinoico). En los mamferos, la conversin del retinol a retinal es un proceso reversible; sin embargo, la transformacin del aldehdo en acido retinoico es irreversible,(SASTRE y HERNNDEZ, 1999). Suele denominarse retinoide a todas las formas de vitamina A, incluso a sus anlogos sintticos, por su enorme importancia en la fisiologa de la retina, aunque algunos autores consideran que son retinoides solo derivados sintticos y anlogos de la vitamina A. El trmino incluye alrededor de unas 1500 formas. Los retinoides pueden presentar cambios en su estructura tanto a nivel de la cadena lateral como el anillo,(SASTRE y HERNNDEZ, 1999). Los retinoides nativos en solucin y tambin los carotenos por accin de la luz, calor y iodo pueden sufrir transformaciones (transiciones). Estas transiciones involucran las isomerizaciones cis-trans de los enlaces dobles. La cadena lateral de la vitamina A tiene 4 dobles enlaces que tericamente son 16 ismeros. El 13-cis-retinol y all-trans-retinol estn en equilibrio en solucin con un 33 por 100 de forma cis,(SASTRE y HERNNDEZ, 1999). Con respecto a la estabilidad, la vitamina A es muy sensible al O 2 del aire, especialmente en presencia de luz y calor. Los esteres son ms estables al O 2 de las formas alcohlicas. Las formas comerciales de la vitamina A (retinil acetato y retinil palmitato) se presentan en forma oleosa, emulsin acuosa o polvo estabilizado. Estos productos deben ser protegidos de la luz y 12
oxigeno durante su almacenamiento. La actividad de la vitamina A que enriquece la harina disminuye solo con la luz cuando se almacena a 40 45 C al cabo de varios meses,(SASTRE y HERNNDEZ, 1999). Respecto a sus propiedades fsicas la mayora de las formas de vitamina A son compuestos cristalinos con un punto de fusin relativamente bajo. Por su estructura todos los retinoides tienen un espectro de absorcin caracterstico que se utiliza para su identificacin. Cuando se irradian con luz UV el retinol emite una fluorescencia amarillo-verdosa, mientras que el 3- dehidroretinol lo hace en el marrn-naranja, (SASTRE y HERNNDEZ, 1999). La actividad de los carotenoides es similar a la vitamina A. Son sensibles a la luz, cidos y O 2 la oxidacin de los carotenoides con O 2 , produce compuestos no coloreados. Son ms bien solubles en cloroformo y benceno, poco solubles en ter y acetona e insolubles en agua. La unidad de medida de la actividad de vitamina A se expresa como equivalente de retinol (RE). La concentracin de vitamina A y -caroteno en plasma se expresan como mol/L, mol/dL o mol/Ml, (SASTRE y HERNNDEZ, 1999).
3.2.2.2 Vitamina D Definicin La vitamina D se ha considerado durantedcadas como factor antirraqutico esencial para la regulacin del metabolismo mineral. Actualmente se reconoce que su principal metabolito, la 1,2 (OH)2D o calcitrol, 13
es una hormona esteroidea con amplias funciones en el organismo,(SASTRE y HERNNDEZ, 1999). La 1,2 (OH)2D tiene accin en los principales rganos relacionados con la homeostasis mineral como intestino, hueso y rin. Adems, est implicada en el proceso de la osteognesis, en la modulacin de la respuesta inmune, en la funcin de las clulas musculares, as como la diferenciacin y crecimiento del tejido hematopoytico y epidrmico,(SASTRE y HERNNDEZ, 1999). La vitamina D efecta muchas de estas acciones como el resto de las hormonas esteroideas, es decir por acoplamiento con un receptor nuclear/citosolico, que en una subsecuente asociacin con regiones selectivas de los genes produce un aumento o disminucin de su expresin. En los aos treinta se asla la vitamina D como principio activo, pero permanecen desconocidos su metabolismo as como su mecanismo de accin. En la dcada de los setenta se describen su fisiologa y metabolismo. Actualmente se puede considerar que es una vitamina y una hormona. Puede considerarse como vitamina ya que cuando su sntesis cutnea endgena es insuficiente, debido a irradiacin solar baja o a disminucin en la capacidad de fotoconversion de la piel, su deficiencia puede ser curada por suplementos de esta sustancia con la dieta. Pero ya sea sintetizada por la piel o ingerida por va oral, el esteroide bsico es transformado a metabolismo activo, actuando como una prehormona. En virtud de su produccin endgena, la regulacin de su sntesis, su distribucin por va sangunea a los tejidos diana lejos del lugar de produccin as como por su 14
mecanismo de accin, la vitamina D (en cuanto a su metabolito activo, la 1,25(OH)2D) puede considerarse como una hormona esteroidea, (SASTRE y HERNNDEZ, 1999). Estructura La vitamina D tiene una estructura qumica muy semejante a la del colesterol. El trmino calciferol engloba a dos esteroles: colecalciferol (vitamina D3), que es la forma de la vitamina D que se encuentra en los animales y en las plantas ergocalciferol (vitamina D2). Los calciferoles no estn ampliamente distribuidos en la naturaleza y la mayora de los alimentos animales o vegetales contienen solo precursores inactivos que necesitan de la radiacin ultravioleta para su conversin en calciferoles. Las vitaminas D2 y D3 se producen en la piel de los animales y en las plantas por la conversin no enzimtica de sus precursores. El precursor de la vitamina D3 en la piel es el 7-dehidrocolesterol. Por la accin de los rayos ultravioleta se rompe la unin en el carbono 9-10; posteriormente se produce una isomerizacin, y el ergosterol o el 7-dehidrocolesterol se transforma en ergocalciferol (D2) o colecalciferol (D3), respectivamente,(SASTRE y HERNNDEZ, 1999).
3.2.2.3 Vitamina E Definicin Con el termino vitamina E se denominan a todos los derivados del tocoferol y tocotrienol. Los cuales tienen una actividad biolgica cualitativa de alfa tocoferol. Este trmino tambin se aplica a deficiencia de 15
vitamina E, actividad de vitamina E, antagonistas de la vitamina E, etc. La actividad de la vitamina E est condicionada por diferentes tocoferoles y tocotrienoles presentes en la dieta. No se supo por muchos aos con que patologa se poda relacionar esta vitamina. Se observ que la lechuga y el germen de trigo eran ricos en este factor. En 1992, Evans y Bishop publicaron la existencia de un nuevo factor nutricional, primero llamado factor X, el cual prevena la muerte fetal y atrofia testicular. Tres aos ms tarde, Evans publico lo siguiente: Nosotros hemos adoptado la letra E como la designacin de este nuevo factor dentro de la serie alfabticams prxima a la designacin de la vitamina antirraqutica D. En los 20 aos siguientes fue dirigida a encontrar la aplicacin de esta nueva vitamina en la prevencin o cura en los desordenes de la reproduccin, tanto en veterinaria como en medicina humana, sin ningn xito. Hasta que cuarenta aos mas tarde de su descubrimiento que el edema y la hemolisis del recin nacido pretermino estaban relacionados con la deficiencia de vitamina E. Las investigaciones iniciales fueron difciles por la falta de mtodos adecuados y por que la vitamina E no tiene una accin de coenzima selectiva como las otras vitaminas y se encuentra e interviene en la fase lipdica. Esta situacin cambia cuando Evans y sus colaboradores aislaron en alcohol vitamina E altamente activa de germen de trigo. Se determino su formula (C29H30O2) y se le dio el nombre de tocoferol (tocos = nacimiento); dos aos ms tarde se aislaron el y tocoferol con menor actividad que el tocoferol. Al mismo tiempo Olcott y Emerson (1973) descubrieron que estos 16
tocoferoles eran efectivos antioxidantes, aunque su poder antioxidante y su actividad biolgica no eran paralelos. Por mucho tiempo no se considero la funcin esencial de esta vitamina en nuestra alimentacin debido a que en los pases bien nutridos esta deficiencia es desconocida. Adems las reservas en rganos y tejidos son grandes, por la cual es difcil producir una avitaminosis. Ha sido en los ltimos 15 aos cuando se ha definido su papel esencial para un desarrollo normal y mantenimiento del sistema nervioso central, nervios perifricos y msculos de nios y adultos. Actualmente se reconoce que la deficiencia de vitamina E se produce comnmente en lactantes, nios y adultos con mala absorcin crnica a las grasas; como posible complicacin de la nutricin parenteral total, es un problema nutricional en pases desarrollados, y como una caracterstica del error innato del metabolismo en el cual est involucrada la protena transportadora del tocoferol heptico. Fue en 1968 cuando la Food and Nutrition Board la considero como un componente esencial, (SASTRE y HERNNDEZ, 1999). Estructura El termino de vitamina E se le da a una familia compuesta de 8 sustancias similares que existen en la naturaleza derivadas del 6- cromanol, cuatro tocoferoles (,, y tocoferol: la posicin q ocupa el grupo metilo en el anillo cromanol determina la letra griega utilizada como prefijo), con la cadena lateral saturada y cuatro tocotrienoles ((,, y tocotrienol) con la cadena lateral insaturada. Los grupos metilos le confieren diferente 17
bioactividad(alfa > gamma > beta > delta). La esterificacin del grupo fenlico del anillo de cromanol con acetato, succinato, nicotina, etc., protege al tocoferol de la oxidacin. Sin embargo, puesto que estos grupos ocupan los sitios donde est la actividad antioxidante de este compuesto, se requiere que estos esteres sean hidrolizados para que tengan actividad biolgica. La nomenclatura puede ser confusa pero hay un acuerdo internacional que especifica que el d--tocoferol se llama RRR--tocoferol; es la forma ms extendida en la naturaleza. Al diesteroisomero con configuracin2S,4R,8R se llama 2-epi--tocoferol. A la mezcla RRR-- tocoferol y 2-epi--tocoferol obtenida por sntesis del fitol e hidroquinona se denomina 2-ambo--tocoferol 1 UI se define como 1 mg de 2-ambo--tocoferil acetato. La vitamina E sintetica es una mezcla de los 8 diesteroisomeros conocida como all-rac--tocoferol. El alfa tocoferil acetato es la forma cuantitativamente ms importante utilizada como suplemento diettico en medicina. La vitamina E no esterificada se utiliza como antioxidante en tecnologa alimentaria (evitan que las grasas y aceites se enrancien). En ausencia de O2, los tocoferoles tienen una estabilidad elevada al calor, la luz y alcalinidad. En presencia de O2 pierden sus propiedades antioxidantes,(SASTRE y HERNNDEZ, 1999). Fuentes La vitamina E se encuentra principalmente en el aceite de los vegetales (soja, maz, algodn y girasol), granos, plantas y en el tejido adiposo de los animales. Se localiza principalmente en las hojas y partes 18
verdes de las plantas, las cuales contienen ms-tocoferol que las partes amarillas. Tambin se encuentran en algas marrones, verdes y rojas, en algunas levaduras y hongos, pero no en las bacterias. La distribucin de los tocoferoles es diferente a los tocotrienoles. Los tocotrienoles son abundantes en el aceite de la semilla de palma. El aceite de girasol es tal vez la fuente ms importante de vitamina E (42,1 a 113 mg/100g de aceite). El aceite de germen de trigo es comparable al de girasol. La destilacin de un aceite produce prdidas considerables en su contenido de vitamina E, que causa desestabilizacin del mismo, por lo que son los vapores destilados en la refinera de los aceites utilizados en la alimentacin las fuentes naturales ms importante de vitamina E. Normalmente en un cocinado cuidadoso se pierde un 10 por 100 de esta vitamina. Las mayores prdidas ocurren al frer, asar o cocer a fuego lento, y son totales cuando se fre en aceites que son recalentados repetidamente. El tocoferol se degrada lentamente si hay una gran cantidad de cidos grasos insaturados en los alimentos congelados. En los granos almacenados se pierden un 10 por 100 cada mes. El germen y salvado del grano contienen la vitamina E por lo que las harinas blancas prcticamente se eliminan en la elaboracin. En los vegetales desecados las perdidas fluctan entre el 50 70 por 100. Para los nios las principales fuentes dietticas son los aceites vegetales, margarinas, germen de trigo, nueces y hojas verdes. Las formulas infantiles contienen 0,4 mg de vitamina E/mg de Polyunsaturated fatty acids (PUFA). 19
3.2.3 CROMATOGRAFA LIQUIDA DE ALTA RESOLUCIN (HPLC) Es una tcnica de separacin de compuestos, que permite aislar, identificar y cuantificar los compuestos desconocidos tales como vitaminas, protenas y compuestos activos como flavonoides, alcaloides y esteroles en una muestra o solucin conocida. Para la cuantificacin de estos compuestos se utiliza estndares especficos (Horie et al., 2000). La tcnica HPLC describe el proceso en el cual la fase mvil (lquido) es mecnicamente bombeado a travs de una columna que contiene la fase estacionaria (slido) y la cuantificacin de los analitos se realiza mediante un detector (Nielsen, 1998). Segn Nielsen, 1998 el sistema HPLC consta de las siguientes partes: 1. Bomba: Son dispositivos de alta tecnologa que tiene por funcin de entregar la fase mvil a travs del sistema, a diferentes flujos segn lo especifique el mtodo, en cantidades exactas y de manera precisa. 2. Inyector: El fin del proceso de inyeccin es introducir la muestra en un reservorio sujeto a accin de la bomba para luego ser llevado a la columna. 3. Columna: La columna es considerada como una herramienta para la separacin de las molculas presentes en la muestra que est siendo analizado. 4. Detector: El detector por lo general es ultravioleta (UV) o visibles (VIS), es el instrumento que detecta la presencia de las molculas motivo de anlisis. Una vez que la muestra sale de la columna es presentada al detector 20
que identifica en funcin a la absorbancia la cantidad presente de un determinado analito; luego el detector convierte esta interaccin en seal electrnica que es enviada al sistema de datos. La magnitud de esta seal es graficada contra el tiempo. En la Figura 1 se esquematiza un sistema HPLC en gradiente de baja presin, que es la configuracin con la que se trabajar. 21
Figura 1. Sistema HPLC en gradiente de baja presin 22
IV. HIPOTESIS Es posible evaluar el contenido de ismeros de vitaminas A, D y E de dos variedades de pulpa de aguaje (Mauritia flexuosa) por HPLC en fase reversa.
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V. MATERIALES Y METODOS 5.1 Lugar de ejecucin El presente trabajo de investigacin se realizar en el Centro de Investigacin de Productos Naturales de la Amazona (CIPNA), de la Universidad Nacional Agraria de la Selva (UNAS). 5.2 Materiales 5.2.1 Materia prima Las dosvariedades de aguaje (Amarillo y Shambo)se obtendrn del mbito de la regin amaznica peruana. 5.2.2 Materiales de laboratorio 5.2.2.1 Materiales - Tubos de ensayo (10ml) - Vasos de precipitacin(1000ml,500ml,100ml,50ml,10ml) - Fiolas (1000ml, 500ml, 100ml, 50ml, 10ml) - Probetas - Termmetros - Microtubos (1,5 ml, 2 ml) - Puntas para micropipeta(1000ul, 200ul, 100ul) 24
- Micropipetas - Matraces Erlenmeyer - Geringas 5.2.2.2 Equipos - Estufa - Congeladora - Centrfuga - Homogenizador - Destilador - Desionizador - Equipo de Cromatografa Lquida de Alta Performancia (HPLC) - Refrigeradora 5.2.2.3 Reactivos y solventes - Acetonitrilo (grado HPLC) - Ismeros de vitamina A, D y E - Etanol al 99.9% 5.3 Mtodos de anlisis 5.3.1 Evaluacindel contenido de vitaminas A, D e ismeros de vitamina E por HPLC Se realizar de acuerdo al mtodo descrito por SUPELCO Sigma Aldrich (1999), para la determinacin de vitaminas liposolubles.
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VI. METODOLOGA EXPERIMENTAL El siguiente trabajo de investigacin estar dividido en dos etapas: 6.1 Obtencin de los extractos En esta etapa se proceder a la obtencin de los extractos (Ver figura 2). 6.1.1 Obtencin de la muestra Las dos variedades de aguaje se obtendrn del mbito de la regin amaznica peruana, tomando criterios de poscosecha (frutos de color rojo oscuro). 6.1.2 Determinacin de medidas biomtricas Se medirn el dimetro y la longitud de los frutos de las dos variedades de aguaje empleando un vernier. 6.1.3 Maduracin del aguaje Los frutos se sumergirn en agua a 55 C, por 2 horas y media para su maduracin, (GARCIA y REATEGUI, 2002). 6.1.4 Obtencin de la pulpa y balance de materia Se desprender la cascarilla del endocarpio del fruto con la ayuda de una cuchara y luego se separar la pulpa. Se realizar el balance de materia pesando la cascara, pulpa, piel y semilla. 26
6.1.5 Conservacin y Almacenado de la pulpa Se realizaran los tratamientos descritos a continuacin: T1= Empacadoy almacenado a -20C. T2 = Secadoa 45 C, empacado y almacenado a -20C. T3= Inmersin en solucin de cido ctricoal 0.3 % por 5 seg, oreado por 5 min, secado a 45 C,empacado y almacenado a -20C. 6.1.6 Extraccin La pulpa se someter a una solucin de etanolal 70 % con el fin de extraer los ismeros para su caracterizacin. 6.1.7 Filtracin Se realizar con papel filtro y con la ayuda de una bomba de vacio para agilizar este proceso.
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Figura 2. Obtencin de los extractos para las dos variedades de aguaje. 6.2 Evaluacin del contenido de vitaminas A, D eismeros de vit. E por HPLC La caracterizacin de las vitaminas se realizara en dos grupos: 6.2.1 Vitaminas A y E empleando columna cromatogrfica C8, CLC Para la caracterizacin de ismeros de las vitaminas A y E se trabajar utilizando las siguientes caractersticas que debe tener el equipo: - Columna: Shim Pack CLC - C8, 15cm x 4.6mm ID, 5m partculas - Fase mvil:Acetonitrilo:agua (90:10) FILTRACIN EXTRACTOS EXTRACCION
MADURADO CONSERVACIN Y ALMACENADO
OBTENCIN DE LA PULPA AGUAJE 28
- Flujo de alimentacin: 2mL/min - Temperatura:30C - Deteccin: UV, 290nm - Inyeccin:10L 6.2.2 Vitaminas D2y D3 empleando columna cromatogrfica C18, Supelco Para la caracterizacin de ismeros de la vitaminaD se trabajara utilizando las siguientes caractersticas para el equipo: - Columna: Supelco C18, 15 cm x 4.6mm ID, 5m partculas - Fase mvil: Acetonitrilo 100% - Flujo de alimentacin: 1.5 mL/min - Temperatura:30C - Deteccin: UV, 290nm - Inj.:10L 29
VII. DISEO EXPERIMENTAL
Figura 3.Diseo experimental para la caracterizacin de los ismeros de las vitaminas propuestas. Donde: A, y B: Son las variedades de aguaje. T1, T2, y T3: son los tratamientos para evaluar el contenido de vitaminasA, D eismeros de vit. E. R1, R2 y R3 son las repeticiones para cada tratamiento. CARACTERIZACION DE LOS ISOMEROS DE LAS VITAMINA A, D y E Mauritia flexuosa T2 T3 T1 Variedades B A R2 R3 R1 R2 R3 R1 R2 R1 R3 30
VIII. ANLISIS ESTADSTICO Para evaluar los resultados de acuerdo al diseo experimental se utilizar el modelo estadstico diseo completo al azar con arreglo factorial de2 x 3con tres repeticiones, por cada vitamina, para lo cual se emplear el siguiente modelo matemtico: y ij = + a i + b j + (ab) ij + e ij
Donde: Y ijk : Contenido de Ismeros de vitaminasA, D y E. U : Efecto de la media general de las evaluaciones. a i : Efecto de las variedades de aguaje. b j : Efecto de los tratamientos de conservacin en la pulpa de aguaje. (ab) ij : Efecto de la interaccin de la variedades y los tratamientos de conservacin en la pulpa de aguaje. e ij : Efecto del error experimental. De existir significancia entre los tratamientos, se evaluar con la prueba de Duncan, con un nivel de significacin del 5%. El anlisis estadstico se realizar mediante el software STATGRAPHICS PLUS 5.1
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IX. CRONOGRAMA DE ACTIVIDADES En el siguiente cuadro, se muestra el cronograma de actividades, los meses divididos en semanas.
Cuadro 2. Cronograma de actividades de la presente investigacin. Meses Actividades
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6 Elaboracin del proyecto X X Presentacin y aprobacin del Proyecto X X X X Desarrollo de pruebas experimentales X X X X XX X X X X X X X X Redaccin del informe X X X X X X X X X X X X X X X
Donde: X = Semanas.
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X. PRESUPUESTO En el Cuadro 3, se presenta el presupuesto para la ejecucin de este trabajo de investigacin. Cuadro 3.Presupuesto para la ejecucin del trabajo de investigacin. N
Rubro Costo unt. S/. Costo total S/. Costo rubro S/. Costo total partida (S/.) 01.00 01.10
01.20
01.30 01.40
02.00 02.10 02.20 02.30 02.40
02.50 02.60 Bienes Materiales de escritorio - 2mill. Papel bond A4 - 4u. Plumones indelebles - 1u. Cuaderno de registro Materiales de procesamiento de datos - 1 Memoria USB - 2 CDs - 4 Cartuchos impresin Impresin, fotocopias, internet Materia prima, insumos y reactivos - 20 kg aguaje - otros Servicios Pasajes y viticos Anlisis Material de apoyo Tipeos, impresiones y encuadernados Servicios de gua y luz Alquiler de equipos
33.00 7.00 2.00
50.00 1.50 60.00
2.50 20.00
66.00 28.00 2.00
50.00 3.00 240.00
50.00 20.00
96.00
293.00
250.00 70.00
250.00 2000.00 50.00 300.00
200.00 500.00 709.00
3300.00 Sub. total Improvistos (10%) 4009.00 400.90 TOTAL 4409.90 33
XI. BIBLIOGRAFIA GARCA P., C. M.; CASTIEIRA D., C. M.; FERNNDEZ C., C. M.; ROMERO D., Jacqueline A.; COLLAZO Q.,S. M. y ARCIA M., A. 2008. Determinacin por CLAR de la Vitamina E en el Poolde Aceite de Hgado de Tiburn.Lat. Am. J. Pharm. 27 (5): 771-5 (2008). La Habana, Cuba. HORIE, HOHATA, K. 2000. Analysis of tea components by high performance liquid chromatography and high performance capillary electrophoresis. J. Chrom A: 881: 4725 4738. NAVARRO, B. 2006. Estudio de las cadenas productivas de aguaje y tagua Reserva Nacional Pacaya Samiria. ProNaturaleza, TNC, USAID. Lima, 102 pp. NIELSEN, S. 1998. Food analysis 2 da . Edic. Edit. Services Ruthbloom. Usa pp 487 526. SASTRE G, A. Y HERNNDEZ R., M.1999. Tratado de nutricin.Editorial Daz de Santos, S.A. Espaa.Pgs. 1476. SIERRA, N.; H. ROJAS, J.; CUADRA, Y.; SISA, A. Y CASTRO, G. 2007. Validacin de una metodologa por cromatografa lquida dealta eficiencia para la determinacin simultnea devitaminas A, D3 y E en inyectables de uso veterinario.Brazilian Journal of Pharmaceutical Sciences vol. 43, n. 4, out./dez., 2007. 34
VILLACHICA, H. 1996. Frutales y hortalizas promisorios de la amazonia. Lima, Per. Pgs. 367. RICARDO GARCA; MANUELA RETEGUI. 2002. Conservacin de pulpa de mauritiaflexuosal. aguaje conaplicacin de mtodos de factores combinados.Revista Amaznica de InvestigacinAlimentaria, v.2, n 1, p. 59 - 68(2002). Facultad de Ingeniera en Industrias Alimentarias de la UNAP. Iquitos, Per. MELO RUIZ, V. Y CUAMATZI TAPIA, . 2004. Bioqumica de los procesos metablicos. 1 edicin. Ed. Reverte. Barcelona-Espaa, 364 Pgs. SUPELCO1999. Separating Fat-Soluble Vitamins by Reversed Phase HPLC, Using Discovery Columns. Note 149.Discovery - Sigma-Aldrich Co. 2 pgs.