INFORME DE LABORATORIO N2

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RESUMEN

Se llev a cabo la separacin de mezclas de aminocidos mediante cromatografa en
papel. Se revel la presencia de los mismos en el papel mediante reaccin con
ninhidrina y se identificaron en el cromatograma por comparacin con la posicin
de los correspondientes patrones preparados al efecto.
Palabras clave: fase estacionaria, movilidad, solubilidad en las fases, solvente.
1. INTRODUCCIN Y OBJETIVOS

La cromatografa se engloba dentro de las llamadas tcnicas de separacin y permite el
anlisis de mezclas complejas de compuestos muy estrechamente relacionados
qumicamente. Son varias las modalidades usadas y se clasifican segn la fase mvil
(de gases, lquida) y por el tipo de soporte (columna, capa fina, papel) usados.
La separacin se lleva a cabo segn la distinta interaccin que presenta cada uno de los
componentes de una muestra respecto a dos fases: una estacionaria y otra mvil que
fluye sobre ella. Esta interaccin puede ser de varios tipos que a su vez dan lugar a
distintas subclases de cromatografa: de absorcin, de reparto, de cambio inico, de
afinidad, etc.
En esta prctica, vamos a usar la ms simple de ellas, la cromatografa ascendente
sobre papel. La fase estacionaria es la celulosa del papel y la mvil una mezcla de
disolventes orgnicos y agua. La celulosa retiene una cierta cantidad de agua
entrelazada entre sus fibras y puede dar lugar a un mecanismo de reparto de los
componentes de una muestra aplicados sobre ella cuando se hace fluir un disolvente de
polaridad distinta de la del agua. Segn la solubilidad que tengan los componentes de
la muestra respecto de las dos fases as ser su movilidad.

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2. LISTADO DE MATERIAL NECESARIO
2.1. Equipamiento
Tanque cromatogrfico.
2.2. Material
Papel cromatogrfico Whatman n1
3.
Tubos eppendorf.
Puntas de micropipetas.
4.
Pulverizador.
4.1. Reactivos
Soluciones patrn al 0,5% de aminocidos.
5.
Fase mvil, n-butanol:actico glacial:agua (12:3:5).
Solucin de Ninhidrina al 0,1% en etanol con 2 ml de piridina
3. PROCEDIMIENTO

Se trata de identificar el contenido en aminocidos de una muestra (M) cuya
composicin desconocemos.

3.1. Se traza a 1,5 cm del borde inferior de la tira de papel Whatman una lnea con
lpiz y sobre ella se marcan 3 puntos a 1,5, 3,0 y 4,5 cm, escribiendo debajo de cada
uno de ellos 1, M y 2, tal como se indica en la figura. Hay que evitar poner los dedos en
la parte central del papel ya que al final saldran nuestras huellas dactilares.


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3.2. Aplicar sobre cada uno de los puntos, con la punta de micropipeta, cada una de las
respectivas soluciones de forma que se forme una mancha de unos 5 mm de dimetro.
La solucin 1 contiene una mezcla patrn de lisina, prolina y fenilalanina. La solucin
M es la muestra cuyo contenido en aminocidos pretendemos determinar y la solucin
2 es un patrn que contiene cido glutmico, valina y leucina.
3.3. Se introduce el papel en el tanque de forma que el lquido no moje la lnea y
cerramos la tapa para que la atmsfera se sature del vapor de la fase mvil.

3.4. Se deja al menos 30 minutos para que se desarrolle el proceso.

3.5. Se sacan las tiras antes que el disolvente moje la pinza de sujecin y se marca el
punto alcanzado por la fase mvil.

3.6. Se secan en corriente de aire caliente hasta que no se aprecie olor a butanol.

3.7. Se pulveriza con la solucin de ninhidrina y se seca para que tenga lugar el
desarrollo de color.














3.8. Se mide la distancia desde la lnea de aplicacin de las muestras hasta cada mancha
y se calculan los valores del factor de resolucin (Rf) para cada aminocido. Los valores
estimados se incluyen en la figura y habr que calcularlos en cada experimento.


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4. RESULTADOS

El reparto de los aminocidos en el papel se debe a su naturaleza qumica.
5.
Las frmulas de los compuestos usados como patrn son:













El reparto que se obtiene es el siguiente: los aminocidos apolares son los que mejor
interaccionan con el solvente y son arrastrados por l; la lisina presenta la menor
movilidad debido a que al pH del solvente, este aminocido presenta sus dos grupos
amino cargados positivamente por lo que interacciona mal con el solvente,
mayoritariamente apolar (n-butanol). Los dems aminocidos se separan entre los
aminocidos apolares y el bsico.
METIONINA GLICINA VALINA ARGININA
Met
Gli
Val
Arg
Rf=Dm/Df
Df
Dm
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La posicin del aminocido se revela con ninhidrina, apareciendo una mancha de
coloracin azul-violeta. La ninhidrina reacciona con los aminocidos formando aductos
coloreados segn la reaccin:
















Tabla de Rf perteneciente a todos los grupos de trabajo en la experiencia
Aminocido Grupo I Grupo II Grupo III Grupo IV Promedio
Gli 0,43 0,4776 0.38 0,326 0.40
Val 0,60 0,4104 0.55 0,547 0.53
Met 0,65 0,59 0.50 0,534 0.56
Arg 0,28 0,49 0.40 0,2739 0.36

Distancia recorrida por cada aminocido y clculo del Rf
(Df=6,7cm)
Aminocido Distancia recorrida (cm) Rf
Metionina 3.4 0.50
Glicina 2.6 0.38
Valina 3.7 0.55
Arginina 2.7 0.40
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6. DISCUSIN Y COMENTARIOS

Esta tcnica de separacin cromatogrfica es de las ms simples, aunque tambin de las
ms didcticas, ya que los alumnos deben preparar y cortar el papel, aplicar la muestra y
revelar la posicin de los aminocidos.
La reaccion de los aminocidos con la ninhidrina es muy utilizada en la cuantificacin
de stos, ya que se forma un compuesto coloreado cuya intensidad es proporcional a la
concentracin del aminocido presente. A ninhidrina es un agente oxidante muy
potente y al reaccionar con el aminocido en caliente causa su desanimacin oxidativa,
liberando amonaco, CO2. Y un aldehdo de un tomo de carbono menos que el
aminocido original; entre tanto la ninhidrina queda reducida. Posteriormente el
amonaco liberado reacciona con una molcula adicional de ninhidrina y con la misma
ninhidrina reducida, para construir un complejo de color azul prpura.
Despus de la reaccin con ninhidrina, se observaron las manchas azul prpuras
grandes sobre el papel y la distancia recorrida por ellas depende de la solubilidad del
grupo R de los aminocidos de la muestra respecto a la fase mvil.
Al determinar los Rf se puede observar que la Valina posee el mayor valor, mientras
que la glicina posee el menor factor de retencin de la fase mvil, n-butanol:actico
glacial:agua (12:3:5).

7. RECOMENDACIONES
El papel de cromatografa no se puede tocar directamente con las manos debido a
que esto ocasiona interferencia con los resultados,
Mucho tiempo en el horno de secado distorsiona la formacin de las manchas azul
prpura.
El secado debe hacerse en el horno pues desprende ciertos gases txicos para la
salud humana.


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8. CONCLUSIONES

La cromatografa es un proceso sencillo y til para separar componentes de una
mezcla e identificarlos.
La cromatografa de un aminocido permite calcular su Rf.
El valor del Rf depende de la solubilidad del grupo R de un aminocido con respecto
a la fase mvil usada en la cromatografa.
La ninhidrina es usada para reconocer la presencia de un aminocido.
La valina tiene mayor factor de retencin que la arginina en fase mvil n-
butanol:actico glacial:agua (12:3:5).


9. BIBLIOGRAFA

A.L. Lehninger, D.L. Nelson and M.M. Cox, 1993.Principles of Biochemistry (Second
Edn.) WorthPublishers.
Murray, R. K. (2009). HARPER Bioqumica Ilustrada. Mexico: Lange Medical
Publications.
Stryer L, Berg JM, Tymoczko JL (2003) Estructura y funcin de las protenas. En:
Bioqumica, 5 ed. Editorial Revert (Barcelona, Espaa), pp. 41-76. Muestra las
caractersticas de los aminocidos: estructura, variacin de su carga con el pH, etc.