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Cuantificacin del crecimiento poblacional

ngela lvarez Coral; diego Jimnez




Universidad De Nario - Facultad De Ciencias Exactas Y Naturales
diegofer1414@hotmail.com, angevanne02@gmail.com.
Introduccin
En un sistema biolgico se define al
crecimiento como el aumento ordenado
de las estructuras y los constituyentes
celulares de un organismo. Segn ello, el
aumento de la masa celular producido
por acumulacin de productos de reserva
(glucgeno, poli- hidroxibutirato) no
constituyen crecimiento. Se puede
considerar como crecimiento al
incremento de clulas individuales por un
lado, y por otro lado se puede considerar
al crecimiento del nmero de clulas
(proliferacin de la poblacin).
En lo que se refiere al crecimiento de
clulas individuales, este consiste en el
aumento del tamao y peso de las
clulas que precede a la divisin celular.
Esta divisin trae aparejada un aumento
en el nmero de clulas (proliferacin de
la poblacin). Las bacterias se dividen
por fisin binaria, a travs de la una cual
clula madre al alcanzar un determinado
volumen se divide dando dos clulas
hijas. El proceso de fisin binaria
consiste en la autoduplicacin del
material hereditario seguido de la
reparticin en las dos clulas hijas, las
que se separan por estrangulamiento de
la membrana celular y formacin de la
pared celular.
Los mtodos directos de cuantificacin
de microorganismos permiten establecer
la poblacin total de microorganismos
existentes, tienen la ventaja de ser
rpidos aunque no es posible diferenciar
a las clulas vivas de las muertas. Entre
estos mtodos tenemos la turbidimetra
y el conteo de clulas.

Recuento microscpico:
Un volumen conocido de muestra es
depositado en un portaobjetos especial
para cuenta (hemacitmetros, cmaras
de Petroff-Hauser, Neubauer o de
Helber; estas consisten de portaobjetos
excavados y cuadriculados que facilitan
el recuento por unidad de superficie y de
volumen. Con la cuantificacin de
microorganismos a travs del tiempo es
posible el representar grficamente el
crecimiento microbiano. La curva
presenta distintas fases:
Fase de latencia lag: perodo de
adaptacin de un microorganismo a un
nuevo medio de cultivo.
Fase exponencial o logartmica:
aumento regular de la poblacin que se
duplica a intervalos regulares de tiempo
(td).
Fase estacionaria: cese del crecimiento
por agotamiento de nutrientes, por
acumulacin de productos txicos, etc.
Fase de declinacin o muerte: el
nmero de clulas que mueren es mayor
que el nmero de clulas que se dividen.
Objetivos.
- Determinar el crecimiento microbiano
mediante conteo de clulas y
turbidimetra para obtener la curva de
crecimiento.
- calcular el tiempo de duplicacin y la
ecuacin de la recta de la fase
exponencial.
MATERIALES Y MTODOS
En la practica de laboratorio inicialmente
se recibi una muestra inoculada de
E.coli en 45ml de caldo nutritivo en
Erlenmeyer de 50ml, de esta sustancia
se tom 6ml y se la agreg a 1 tubo de
ensayo que previamente fue marcado y
se le midi la absorbancia (No) en el
espectrofotmetro, este tubo fue tambin
delimitado en funcin del tiempo t=0,
seguidamente se pipeteo en los 7 tubos
restantes 6 ml de TSB cultivo activo y se
llevo a incubadora a 36 C, y
posteriormente se midi la absorbancia y
el crecimiento cada cierto tiempo; el
crecimiento se lo realiza a travs del
conteo en cmara, mediante el
microscopio.
Resultados y discusin.
hora absorbancia Conteo en
la cmara

2:30(primera
lectura)
0.075 nm
2:47 0.120 55,625
bacterias
3:04 0.184 18.750
3:21 0.187 24.875
3:38 0.225 40.000
3:55 0.290 38.125
4:12 0.307 48.750
4:29 0.337 67.500
4:48 0.342 70.000

1. Medicin de la densidad bacteriana.
- grafica de crecimiento de E. coli













Grafica 1 cintica de crecimiento en
funcin del aumento de masa celular
D.O
-Crecimiento balanceado.
Una poblacin de bacterias que se
encuentre en un medio adecuado en el
que se mantienen constantes todos sus
parmetros nutricionales y ambientales,
crece de forma tal que el incremento por
unidad de tiempo de masa celular, n de
clulas, ADN, ARN, protenas, etc., es un
valor constante y similar en cada caso:
AM/M = AN/N = A[ADN]/[ADN]
= A[protenas]/[protenas] = ... = K
As pues, durante este crecimiento, de
tipo exponencial o logartmico, el cultivo
se comporta como una reaccin auto
cataltica de primer orden:
Velocidad de aumento del componente=
= K{cantidad del componente}
y = 0.1022e
0.0104x

R = 0.8893
0
0.05
0.1
0.15
0.2
0.25
0.3
0.35
0.4
0.45
0 50 100 150
L
n

D
.
O

(
n
m
)

tiempo (min)
cinetica de crecimiento
E. coli
Ln D.O
Expon. (Ln D.O)
Tambin se puede decir que el n de
clulas, la masa celular u otros
componentes se duplican en un mismo
lapso de tiempo determinado.
Este tipo de crecimiento se denomina
balanceado o equilibrado. Se caracteriza,
pues, por ser el crecimiento en el que
todos los constituyentes celulares se
duplican en un mismo tiempo, o dicho de
otra manera:
Aquel en el que estos constituyentes
aumentan proporcionalmente por un
mismo factor en la unidad de tiempo.
Este factor es el coeficiente
exponencial de crecimiento (), que es
caracterstico para cada cepa bacteriana
en cada medio determinado.
-Expresin matemtica del crecimiento
balanceado.
Para deducirla se parti de la definicin
emprica anterior, atendiendo por un lado
al aumento de la masa celular, y por otro
al incremento del nmero de individuos.
1. En funcin del aumento de masa
celular D.O.
, y por lo tanto, dM = Mdt
Si integramos, resulta: M/M
0
= e
(t-t0)

Si se presta atencin a e
(t-t0)
en la
grafica corresponde a la variable Y,
por lo tanto vamos a tener el valor de


= 0,1022c
0,0104
(coeficiente
exponencial de crecimiento VC). Una vez
obtenido este valor, se puede estimar el
tiempo de generacin, as como tambin
el coeficiente de correlacin (R2)
R = 0,8893, nos muestra una correlacin
positiva de relacin directa.
Se tiene en cuenta ahora que la
velocidad de crecimiento VC es relativa
al tiempo de generacin tg. Tambin
conocido como tiempo de duplicacin. La
explicacin matemtica se la da mas
adelante.
Vc tg
-Vc= Ln 2/ tg
- tg= Ln2/
-tg= 0.693/ 0.1022= 6.78 h^(-1) tiempo
de generacin o tiempo de duplicacin.
2. En funcin del aumento del numero de
clulas.













Grafica 2. Velocidad de crecimiento de un
cultivo microbiano. Escala lineal. Datos de la
poblacin duplicada cada 17 min
Supongamos que partimos de una clula.
Tras una divisin (generacin celular),
tendremos 2, tras dos divisiones
tendremos 4, luego 8, etc: tenemos una
y = 0.3813x + 14.478
R = 0.5917
0
10
20
30
40
50
60
70
80
0 50 100 150
l
o
g

d
e
l

n
u
m
e
r
o

d
e

c
e
l
u
l
a
s


Tiempo (min)
Biomasa vs tiempo
Valores Y
Linear (Valores
Y)
serie geomtrica. 1, 2, 2
2
, 2
3
, 2
4
,...
2
n
(donde n es el nmero de
generaciones transcurridas). Si en vez de
partir de una clula partimos de N
0

clulas iniciales, tenemos:
N = N
0
2
n
; por lo tanto:
N/N
0
= 2
n
{2.1}
Por otro lado, el nmero de generaciones
se puede calcular fcilmente teniendo en
cuenta el tiempo transcurrido y
conociendo el tiempo medio de
generacin (g):

Sustituyendo esta expresin en la
frmula {12.3} tenemos:
N/N
0
= 2
(t-t0)/g

Aplicamos logaritmos neperianos:

{2.2}
Ahora bien, como estamos ante un
crecimiento balanceado, las dos
expresiones matemticas {1.1} y {2.2}
que se ha deducido (la de la seccin A,
basada en masa, y la de la seccin B,
basada en nmero de individuos) son
equivalentes:
, y por lo tanto:
(t-t
0
) = (t-t
0
)/gln2, de donde se deduce
el valor del coeficiente de crecimiento
exponencial:
, expresado en h
-1

Esta es la expresin matemtica del
coeficiente del crecimiento balanceado,
en funcin del tiempo medio de
generacin (g).
En nuestro caso como ya se conoce el
valor de Y en la grafica que corresponde
a (Y= ) simplemente despejamos g
en la ecuacin lo que nos quedara de
esta manera:
Tg= Ln2/
Tg= 0.693/ 0.38 = 1.82 tiempo de
generacin.
Las graficas presentadas tienen en cierta
forma el modelo tpico de crecimiento,
aunque en ellas solo se observa la fase
exponencial y no se observa ni la fase
estacionaria, ni la fase de muerte. El
periodo de latencia para E. coli esta entre
los primeros 15-20 minutos de
inoculacin despus de los cuales las
graficas presentan un aumento de D.O y
biomasa.
Cabe resaltar que en la grafica la escala
no resulto lineal debido a que el primer
conteo microscpico del numero de
bacterias que se realiz en la cmara fue
muy alto con respecto a las siguientes
lecturas, por tal razn se presenta el
primer pico y de all se observa como ya
retorna al crecimiento exponencial
normal; este error en el conteo puede
deberse a posibles errores de tipo
humano.
Turbidez.
La turbidimetra mide la reduccin de la
transmisin de luz debido a partculas de
una suspensin y cuantifica la luz
residual transmitida
Este mtodo se emplea ampliamente
para seguir el crecimiento de cultivos
microbianos; se puede medir
repetidamente la misma muestra y
construir grficos semilog para calcular
tiempos de generacin.
El principio de esto es que cuando la luz
atraviesa una sustancia, parte de la
energa es absorbida; la energa radiante
no puede producir ningn efecto sin ser
absorbida.
-Mtodos de medicin del
crecimiento- Conteo microscpico
directo
Es una tcnica comn, rpida y barata
que utiliza un equipamiento fcilmente
disponible en un laboratorio de
microbiologa, ya que consiste en contar
con un microscopio la cantidad de
clulas presentes en un volumen
determinado.
Para estos recuentos se utilizan
generalmente cmaras de recuentos
(cmara de Petroff Hauser, cmara de
Neubaver Fig. 5- ). Una de las mayores
ventajas del recuento microscpico es
brindar informacin adicional sobre el
tamao y la morfologa de los objetos
contados.
Conclusiones.
- mediante esta practica de laboratorio se
aprendi los mtodos mediante el cual se
logr cuantificar y graficar una poblacin
de bacterias.
- en todos los casos de crecimiento
poblacional, este tiene una tendencia
exponencial, teniendo en cuenta que
primero tiene un periodo de latencia.
- una desventaja del mtodo de conteo
es el cansancio que le genera al
operador, mientras cuenta, esto puede
llevar a cometer errores.
Bibliografa.
1. - Manual prctico de Microbiologa,
Carlos Gamazo y Eduardo Lpez,
Espaa, 2005, p. 39
2. http://www.microinmuno.qb.fcen.u
ba.ar/SeminarioRecuento.htm
3. Robert L. Pecsok y L. Donal Shields,
Mtodos modernos de anlisis
qumicos, Editorial Limusa.
4. Brock, T. & M. Madigan. 1993.
MICROBIOLOGA. 6ta Edicin.
Prentice Hall Hispanoamrica S. A.
Mxico.
Cuestionario.
- Fase exponencial o logartmica: en ella la
velocidad de crecimiento es mxima y el
tiempo de generacin es mnimo. Durante
esta fase las bacterias consumen a velocidad
mxima los nutrientes del medio. La
evolucin del nmero de clulas durante esa
fase se explica con los modelos matemticos
que describiremos a continuacin.
2. Una representacin semilogartmica: es
una representacin grfica de una funcin o
de un conjunto de valores numricos, en la
que el eje de abscisas o el eje de ordenadas
tienen escala logartmica mientras el otro eje
tiene una escala lineal o proporcional.
Si la representacin se hace manualmente,
se emplea papel semilogartmico,1 que
posee la escala con las marcas adecuadas
para este tipo de representaciones. Se
emplean logaritmos decimales, de base 10.
3. La fase de latencia: se caracteriza por la
adaptacin de los microorganismos, no se
presenta cuando el inoculo es nuevo y si el
inoculo proviene de un cultivo viejo, requiere
de este periodo de adaptacin.
4. En la fase estacionaria: no hay una
modificacin neta en el nmero de clulas,
existe un frgil equilibrio que desaparece
eventualmente cuando an las bacterias
metablicamente activas mueren, debido a
productos txicos y falta de nutrimentos
(factores presentes en la fase estacionaria)
asociados a enzimas liberadas por la lisis
bacteriana.

5. El conteo bacteriano seala la magnitud
de la poblacin total bacteriana. En ese
sentido se puede determinar por diversas
tcnicas que se basan en algunos de los
siguientes tipos de medida: cuenta celular
(directamente al microscopio o mediante un
contador electrnico de partculas o
indirectamente con la cuenta de colonias),
masa celular (en forma directa pesando el
contenido celular del nitrgeno o
indirectamente por turbidimetra,
proporcional al nmero de clulas) y
actividad celular (indirectamente
relacionando el grado de actividad
bioqumica al tamao de la poblacin
bacteriana). Existen muchos medios
diferenciales, en la prctica rutinaria se usan
los siguientes:
Conteo en caja de petri
Mtodo ms usado para contar bacterias. Un
caldo de cultivo con microorganismos es
diluido y posteriormente muestras del
mismo son distribuidas en la caja de petri
contenedora de agar. Es de suponerse que
cada clula se dividir en sus mltiples
alrededores para producir colonias
separadas en el agar. Cada clula es llamada
unidad formadora de colonias (UFC).
Despus de la incubacin, el nmero de
colonias se reflejar en el nmero de clulas
UFC originalmente presentes. Es importante
considerar un nmero limitado de colonias
pues de no ser as, stas pueden sobre
poblarse y dificultar el conteo de las mismas
(rango sugerido de acuerdo a FDA 25-250
colonias). El conteo se facilita utilizando un
contador de colonias. Este mtodo es
deseable porque arroja el total de clulas
viables (slo clulas vivas); en contraste con
el conteo microscpico y el conteo de peso
seco. Una desventaja radica en el tiempo que
requiere para producir las colonias, ya que se
necesitan como mnimo veinticuatro horas o
ms. Por otra parte, no es cien por ciento
fiable porque generalmente las colonias
crecen unidas en cadenas o en grupos.
Conteo por filtracin
Es realizado cuando la cantidad de bacterias
es muy pequea, como en casos de lagos y
arroyos relativamente puros. En esta tcnica
se necesitan al menos 100 mL de agua que
atraviesen una membrana delgada de un
filtro, con poros tan pequeos que no
permitan el paso de bacterias, de esta forma
stas son retenidas en la superficie del filtro.
Posteriormente el filtro es transferido a una
caja de petri que cuenta con un caldo
nutritivo, en la cual las colonias surgen de las
bacterias en la superficie del filtro. Las
colonias bacterianas formadas por este
mtodo son distintivas cuando ocupan un
medio diferencial.
Este mtodo es aplicado frecuentemente en
la deteccin y enumeracin de bacterias
coliformes, las cuales son indicadores de
contaminacin fecal en la comida o en el
agua.
Mtodo del nmero ms probable (NMP)
Es una tcnica de estimacin estadstica
basada en el hecho que a mayor nmero de
bacterias en una muestra, mayor ser la
dilucin necesitada para reducir la densidad
hasta el punto en que ninguna bacteria se le
permita crecer en la serie de tubos de
dilucin. Muestras microbianas son aadidas
a tubos con caldos de lactosa y la presencia o
ausencia de gas formado en la fermentacin
y da un estimado de nmero de clulas. Este
mtodo es ms til cuando las bacterias que
estn siendo contados no crecern en
medios slidos, como en el caso de
Chemoautotrof phic nitrifying bacteria.
Tambin es til cuando el crecimiento de la
bacteria es en un medio lquido diferencial,
usado para identificar microbios, como en
bacterias coliformes. El NMP es la nica
afirmacin en la cual existe 95% de
probabilidad que la poblacin bacteriana sea
de rango correcto, siendo el nmero
estadstico ms probable.
Determinacin directa por microscopio
Las clulas se pueden contar en un frote
teido, como es el caso del Mtodo de
Breed, colocando en la preparacin un
volumen conocido de la suspensin de
clulas sobre un rea conocida del
portaobjetos. Despus de haber fijado y
teido el frote, es posible contar con un
microscopio las bacterias.
Como no es prctico recorrer toda el rea, se
cuenta el nmero de clulas en unos cuantos
campos microscpicos seleccionados al azar.
Si el dimetro del campo microscpico se
mide con micrmetro objetivo, se puede
calcular fcilmente el rea, entonces el
nmero de campos en 1 cm2 se multiplicar
por el promedio del nmero de clulas por
campo y despus por 100 (si se vierte 0.01
mL) el resultado ser igual al nmero de
clulas por mililitro. Este mtodo es
susceptible a muchas crticas debido a su
falta de uniformidad al momento de hacer el
frote.
Mtodo de turbiedad
Para algunos experimentos, es necesario
estimar turbiedad, ya que es una forma
prctica de monitorear el crecimiento
bacteriano. Como una bacteria se multiplica
en un medio lquido, ste se torna turbio o
de aspecto nublado por las clulas. El
instrumento usado para medir la turbiedad
es un espectrofotmetro (colormetro). En el
espectrofotmetro, un haz de luz es
transmitido a travs de la suspensin
bacteriana a un detector sensible a la luz.
Mientras incremente el nmero de bacterias,
menor ser la luz captada por el detector.
Este cambio en la luz se registrar en la
escala del instrumento como el porcentaje
de transmisin. Tambin se registra una
expresin logartmica llamada absorbancia
(algunas veces nombrada densidad ptica),
un valor derivado del porcentaje de
transmisin que puede ser reportado. Ms
de un milln de clulas por milmetro deben
estar presentes para que la primera seal de
turbiedad sea visible. Aproximadamente de
10 millones a 100 millones de clulas por
mililitro son necesitadas para hacer una
suspensin suficientemente turbia para leer
en el espectrofotmetro. La turbiedad no es
til para medir contaminacin en lquidos
por la pequea cantidad relativa de
bacterias.
Determinacin del peso seco en las clulas
Es el mtodo ms directo para las
mediciones cuantitativas de la masa celular y
probablemente el ms fcilmente realizable
y reproducible, aunque se debe aplicar slo
en suspensiones celulares muy densas y las
clulas deben ser lavadas muy bien para
removerles todo material extra. Se utiliza
para bacterias filamentosas y mohos. En este
proceso, el fungus es removido del medio de
crecimiento, filtrado para remover material
extrao, drenado en un secador y despus es
pesado.
6. El recuento de viables es con mucho el
mtodo ms sensible para le determinacin
del nmero de bacterias ya que permite
detectar incluso una sola clula viable en una
suspensin su exactitud depende de que se
tomen cierta precauciones. El nmero de
colonias que se cuentan debe ser
significativo (el error estndar es
aproximadamente igual a la raz cuadrada del
nmero de colonias contadas);
preferiblemente se deben contar 2 o 3 placas
con varios cientos de colonias en cada una.
As mismo, si se est determinando el
nmero de clulas en un cultivo en
crecimiento, es importante tener en cuenta
que ese nmero continua creciendo durante
el proceso de divisiones celulares y se
examina con el microscopio contraste de
fases. En estas condiciones, resulta fcil
identificar las clulas viables, ya que forman
microcolonias, pudindose determinar con
precisin su proporcin respecto a las no
viables, que no se multiplican.

7. La constante de la velocidad de
crecimiento se expresa como constante de la
velocidad de crecimiento se expresa como k=
In2 = 0.693 g y tienen unidades de hora 1.
Mientras que g es una medida del tiempo
que tarda una poblacin en duplicar su
nmero de clulas, k es una medida del
nmero de generaciones que ocurren por
unidad de tiempo en un cultivo exponencial.

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