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ANALA SUSANA CRDOBA
AVALIAO DA DIVERSIDADE DE FUNGOS MICORRZICOS

ARBUSCULARES
EM TRS ESTGIOS DE ESTABILIZAO DE DUNAS
FLORL\NOPOLIS
1998
ANALIA SUSANA CORDOBA
ARBUSCULARES
EM TRS ESTGIOS DE ESTABILIZAO DE DUNAS
Dissertao apresentada como requisito
parcial obteno do grau de Mestre.
Curso de Ps-Graduao em Biotecnologia.
Universidade Federal de Santa Catarina.
Orientadora: Prof. Dr. Margarida Matos de
Mendona.
FLORIANOPOLIS
1998
ARBUSCULARES EM TRS ESTGIOS DA ESTABILIZAO
DE DUNAS
POR
ANALIA SUSANA CORDOBA
Dissertao julgada e aprovada em sua
forma fnal, pelo Orientador e membros
da Banca Examinadora, composta pelos
Professores Doutores;
Comisso Examinadora:
n
Margarida Matos de ^Mendona
Coordenadora do Curso de Ps-Graduao
em Biotecnologia da UFSC - Orientadora
(MIP/CCB/UFSC)
^ ^
Elza Fernandes Arajo
(UFV - Membro Titular)
COai
Ricardo I^sias Rios
(UFRJ - Membro Titular)
Florianpolis, abril de 1998
Ao Etzel, ao Andres
Ul
AGRADECIMENTOS
Expresso aqui minha gratido Professora Margarida Matos de Mendona pela
inteligente escolha desse trabalho e por sua eficaz assistncia e orientao.
Universidade Federal de Santa Catarina pela oportunidade de realizar este
curso.
Universidade Federal de Viosa, Professora Elza Fernandes de Arajo e a
Eliane Gomes pela assistncia na realizao de parte deste trabalho.
Ao Professor Ricardo Iglesias Rios pelas importantes sugestes dadas a esse
trabalho.
A Mnica Meinert pela amizade e apoio durante todo o curso
Ao Doutor Raymond Pakovsky pelo tempo dedicado s interessantes e
estimulantes discusses.
Agradeo ao Sidney Strmer pela valiosa colaborao na taxonmia desse
trabalho, ao Jos Renato Pereira Cavallazzi e ao Gilson Milde principalmente pelo
apoio na parte experimental.
A meu esposo e meu filho pelo constante estmulo e dedicao a mim
dispensados durante todo o curso
A CAPES, pelo suporte financeiro por mim recebido.
IV
INDICE
Pgina
LISTA DE ABREVIATURAS .............................................................................. viii
LISTA DE FIGURAS ......................................................................................... ...x
LISTA DE TABELAS ........................................................................................ ... xii
RESUMO ................................................................................................................ ..XV
ABSTRACT...............................................................................................................xvi
1 INTRODUO ............................... ;................................................................... ..1
2 REVISO BIBLIOGRFICA ...............................................................................3
2.1 Biodiversidade: Conceito, Significado e Preservao ..............................3
2.2 Avaliaes e Medidas da Biodiversidade ................................................ .. 9
2.3 A Biodiversidade Microbiana - O Caso Especfico dos Fungos ..............12
2.4 Os Fungos Micorrzicos: Importncia e Avaliaes da Diversidade..... ... 17
2.4.1 Diversidade a Nvel de Famlia e Espcie.................................................. ...17
2.4.2 Diversidade Gentica ................................................................................. ..21
2.5 As Dunas Como Ecossistema Modelo Para Estudos de
Biodiversidade ...24
3 MATERIAL E MTODOS ................................................................................. .. 26
3.1 Caractersticas do Local de Estudo ..............................................................26
3.2 Avaliao da Diversidade a Nvel de Espcies e de Famlias dos FMA
Aps Coleta de Esporos - Mtodos Diretos 2 g
3.2.1 Coleta, Identificao das Famlias e Espcies........................................ ......28
3.2.2 Abundncia e Riqueza .................................................................................29
3.2.3 Modelos de Abundncia ..............................................................................30
3.2.4 ndices ...........................................................................................................30
3.3 Avaliao da Diversidade Especfica Por Mtodos Indiretos ................ ... 32
3.3.1 Riqueza Aps Cultura Armadilha ..............................................................32
3.3.2 Abundncia Avaliada por meio de Bioensaio ........................................ ..33
3.4 Diversidade Gentica ................................................................................ ..34
3.4.1 Extrao de DNA .............................................. ........................................ ..34
3.4.2 Preparao Gel de Eletroforese de DNA ...................................................35
3.4.3 Purificao do DNA .................................................................................. ..36
3.4.4 Metodologia Utilizada para a Avaliao do Polimorfismo do rDNA
por PCR-FRLP ............................................................................................37
4 RESULTADOS E DISCUSSO ....................................................................... 39
4.1 Avaliao da Diversidade a Nvel de Famlia e Espcies Aps
Coleta Direta de Esporos ......................................................................... 39
4.1.1 Coleta, Identificao das Famlias e das Espcies.................................. 39
4.L2 Abimdncia e Riqueza ............................................................................... 41
4.1.3 Modelos de Abundncia ............................................................................ 44
4.1.4 ndices ......................................................................................................... 48
4.2 Avaliao da Diversidade Especfica por meio de Mtodos Indiretos ... 49
4.2.1 Diversidade Aps Culturas Armadilhas .................................................. 49
4.2.2 Abundncia Avaliada por meio de Bioensaio ......................................... 54
4.3 Avaliao da Diversidade Gentica........................................................... 58
5 CONCLUSES ................................................................................................ 63
6 REFERNCIAS BIBLIOGRFICAS .............................................................. 65
Pgina
VI
ANEXO 1 - Fluxograma das Atividades Desenvolvidas ................................. ..74
ANEXO 2 - Nmero de Esporos de FMA nos Trs Estgios de
Estabilizao das Dunas ..................................................................76
ANEXO 3 - Clculo dos ndices ........................................................................ ..78
ANEXO 4 - Ajustes aos Modelos de Distribuio de Abundncia ..................83
ANEXO 5 - Resumo dos Resultados Obtidos da Avaliao da Diversidade
a Nvel de Espcie Aps Coleta Direta de Esporos ................... ..91
vn
LISTA DE ABREVIATURAS
Al - Alumnio
C - Temperatura em graus centgrados
Ca - Clcio
ClMg - Cloreto de magnsio
CO2 - Dixido de carbono
dAlP - Deoxiadenosina trifosfato
dClP - Deoxicitidina trifosfato
dGTP - Deoxiguanosina trifosfato
dTTP - Deoxitimidina trifosfato
dm" - decmetro cbico
DNA - cido desoxirribonuclico
EDTA - cido etilenodiaminotetractico
FMA - Fungo micorrzico arbuscular
g
- grama
GPS - Global Position System
HCl - cido clordrico
H2O2 - Perxido de oxignio
IGS - Seqncias espaadoras no transcritas do rDNA
ITS - Seqncias espaadoras transcritas do rDNA
K - Potssio
Kg
- Quilograma
KOH - Hidrxido de potssio
L - Litro
In - Logaritmo natural
Vlll
log - Logaritmo de base 10
- metro quadrado
Mg - Magnsio
mg - miligrama
m mol - milimol
N -Norte
Na - Sdio
NaCl - Cloreto de sdio
NH2OH - Hidrxido de amnia
P - Fsforo
pb - Par de base
PCR - Reao da polimerase em cadeia
pH - Potncia do hidrognio (smbolo do grau de acidez ou alcalinidade)
p/v - Peso sobre volume
PVLG - lcool Polivinil-lacto-glicerol
rDNA - DNA ribossmico
RFLP - Polimorfismo de tamanho em fragmentos de restrio
RNA - Acido ribonuclico
rpm - Rotaes por minuto
rRNA - RNA ribossmico
S -Sul
SDS - Sulfato dodecil de sdio
Taq DNA
Polimerase - DNA polimerase de Themtus aquaticus
TBE - Tris-borato 0,09 M e EDTA 0,002 M
IE - Tris-HCL lOmM pH 8,0 e EDTA 1 mM
Tris - Tris hidroximetil aminometano
UNEP - United Nations Environment Programme
UV - Ultravioleta
v/v - Volume sobre volume
W - Oeste
ix
LISTA DE FIGURAS
Pgina
Figura 1 Esquema do DNA ribossmico. Os retngulos 38
representam as seqncias que codificam para as
subunidades 18S, 25S, 5.8S e 5S do RNA ribossmico.
As linhas na parte superior do esquema representam as
seqncias intergnicas no transcritas IGS e, na parte
inferior, as seqncias internas espaadoras transcritas
ITS. Os stios de anelamento dos primers ITSl e ITS4
so delineados com setas ao lado das seqncias
codificadoras.
Figura 2 Abimdncia relativa das famlias de fungos micorrzicos 43
arbusculares (FMA) nos trs estgios de estabilizao
das dunas.
Figura 3 Curva do Componente Dominncia da Diversidade das 47
espcies de fungos micorrzicos arbusculares (FMA) nos
trs estgios de estabilizao das dunas.
Figura 4 Riqueza especfica nos trs estgios de estabilizao, 53
ante-duna, duna semi-fxa e duna fxa, calculada aps
utilizao de mtodos combinados 1 - Coleta direta,
2 - Coleta direta e primeiro ciclo de cultura armadilha,
3 - Coleta direta, primeiro ciclo de cultura armadilha e
segundo ciclo de cultura armadilha.
Figura 5 Porcentagem de colonizao radicular em milho aos 20, 54
30 e 40 dias aps plantio.
Figura 6 Eletroforese em gel de agarose 0.8% do DNA total. 1- 60
DNA total extrado de esporos de duna fixa. 2-DNA
total extrado de esporos de duna semi-fixa. 3-DNA total
extrado de esporos de ante-duna. 4-DNA total extrado
de esporos Gigaspora albida. 5-DNA total extrado de
esporos de Acaulospora scrobiculata. M, marcador de
tamanho: DNA fago lambda clivado com Hin HI / Eco
RI.
Pgina
Figura? Eletroforese em gel de agarose 1.5% de DNA 61
amplificado. As bandas foram amplificadas utilizando-
se os oligonucleotdeos ITSl e ITS4 respectivamente.
M, marcador de DNA plasmidial pUC18 clivado com
Rsal e Hin I. 1-esporos de duna fixa, 2-esporos de
duna semi-fixa, 3-esporos de ante-duna, A-Gigaspora
albida, 5-Acaulospora scrobiculata. 6-duna fixa, 7-
semi-fixa, 8-ante-duna, de esporos obtidos em outra
poca de coleta ( Maio 97 ). 9-Pisolithus tinctorius
(testemunha).
Figura 8 Eletroforese em gel de agarose 2% da regio ITS do 62
rDNA de populaes de fungos endomicorrzicos nos
trs estgios de estabilizao de dunas. A clivagem foi
realizada com a enzima de restrio Hinf I. M,
corresponde ao marcador pUC 18/ Rsal-Hin L 1-esporos
de dima fixa, 2-esporos de duna semi-fixa, 3-esporos de
ante-duna, 4-Gigaspora albida, 5- Acaulospora
scrobiculata. Esporos de 6-duna fixa, 7-semi-fixa, 8-
ante-duna em outra poca de coleta. 9-Pisolithus
tinctorius.
Figura Al Fluxograma apresentando os procedimentos realizados 75
para a avaUao da diversidade especfica e gentica dos
fimgos micorrzicos arbuscuiares e os locais onde
ocorreram os procedimentos (MIP - Departamento de
Microbiologia e Parasitologia, UFSC - Universidade
Federal de Santa Catarina, UFV - Universidade Federal
de Viosa).
XI
LISTA DE TABELAS
Tabela 1 Caractersticas qumicas e fsicas de amostras de solo dos
trs lotes de coleta nas dunas.
Pgina
27
Tabela 2 Famlias e espcies de fungos micorrzicos arbusculares
(FMA), recuperados nos trs estgios de estabilizao das
dunas.
40
Tabela 3 Abundncia e riqueza das espcies em cada famlia de
fungos micorrzicos arbusculares (FMA), associados s
plantas nos trs estgios de estabilizao das dunas.
42
Tabela 4 Abundncia mdia e abundncia relativa em ordem
decrescente de ocorrncia, das espcies de fungos
micorrzicos arbusculares (FMA) nos trs estgios de
estabilizao das dunas.
46
Tabela 5 Probabilidade de ajuste das Curvas do Componente
Dominncia da Diversidade obtidas para os trs estgios
de estabilizao das dunas (Figura 3) aos modelos
clssicos de distribuio da abundncia.
47
Tabela 6 A diversidade dos trs estgios de estabilizao calculada
atravs dos diversos ndices de heterogeneidade .
48
(FMA), identificadas na ante-duna por meio da coleta
direta de esporos e de dois ciclos de cultura armadilha.
50
xu
(FMA), identifcadas na duna semi-fixa atravs da coleta
direta de esporos e de dois ciclos de cultura armadilha.
Pgina
51
(FMA), identificadas na duna fxa atravs da coleta direta
de esporos e de dois ciclos de cultura armadilha.
52
Tabela 10 Anlise da varncia por meio do teste Tukey para as
mdias de colonizao radicular em cada estgio de
estabihzao, considerando os 20, 30 e 40 dias aps
plantio.
55
Tabela 11 Anlise da varincia atravs do teste Tukey para as
mdias de colonizao radicular em cada estgio de
estabilizao.
56
Tabela Al Nmero de esporos na subamostra, abundncia mdia e
freqncia das espcies de fungos micorrizicos
arbusculares (FMA) associadas s plantas nos trs
estgios de estabilizao das dunas. Valores obtidos a
partir de seis subamostras de cada lote de coleta.
77
Tabela A2 Valores necessrios para os clculos dos diversos ndices
de dominncia, diversidade e eqitatividade para a ante-
duna.
79
de dominncia, diversidade e eqitatividade para a duna
semi-fxa.
80
de dominncia, diversidade e eqitatividade para a duna
fxa.
81
xni
Tabela A5 Reclculo dos diversos ndices de diversidade, dominncia
e eqitatividade para a ante-duna
Pgina
82
Tabela A6 Ajuste dos dados ao modelo de distribuio de abundncia
das espcies, srie geomtrica, para os trs estgios de
84
das espcies, srie log, para os trs estgios de
87
das espcies, broken stick, para os trs estgios de
90
Tabela A9 (A) A diversidade nos trs estgios de estabilizao
calculada atravs dos diversos ndices de riqueza (I) e dos
ndices de heterogeneidade ( II ). (B) Adaptao das
distribuies da abimdncia das espcies, encontradas nos
trs estgios de estabilizao das dunas, a trs dos
modelos clssicos de distribuio de abundncia das
espcies, srie geomtrica, srie log, broken stick.
92
x i v
RESUMO
A diversidade especfica e gentica dos fungos micorrzicos arbuscuiares
(FMA) foi avaliada em trs estgios de estabilizao (duna mvel, dunas semi-fixa e
fixa) das dunas na praia da Joaquina, Ilha de Santa Catarina. Na avaliao da
diversidade especfica foram utilizados mtodos diretos por meio da coleta de esporos,
indiretos a partir de esporos multiplicados em sistemas de culturas armadilhas (dois
ciclos), respectivamente, e imia combinao de ambos os mtodos O potencial de
inoculo dos FMA nos trs estgios de estabilizao foi tambm avaliado por meio de
bioensaios. Dez amostras de solo foram coletadas de cada tipo de duna, durante o vero
97 e processadas seis subamostras de 100 g de solo para a contagem e identificao de
esporos em cada duna. A partir da abundncia mdia das diferentes espcies foram
calculados os ndices de riqueza e de heterogeneidade e a abundncia relativa foi
plotada em seqncia decrescente obtendo-se as Curvas do Componente Dominncia
da Diversidade para cada estgio. As curvas foram ajustadas matematicamente aos
modelos clssicos de distribuio da abundncia. A avaliao da diversidade gentica
foi realizada, por meio da tcnica de PCR-FRLP do rDNA. Esta consistiu na ampliao
do rDNA de esporos correspondente s comunidades de FMA de cada estgio por meio
da reao de polimerizao em cadeia, seguida das restrio dos fragmentos
amplificados com a enzima Hinl e a subsequente analise eletrofortica-^^Treze espcies
foram recuperadas por meio da coleta direta. Espcies de todas as famlias de FMA
foram recuperadas das dunas, porm nem todos os representantes das diversas famlias
ocorreram nos trs estgios de estabilizao. Membros da famlia Glomaceae no foram
recuperados na ante-dima. A abundncia mdia das espcies de FMA e a riqueza
especfica aumentaram com o estgio de estabilizao. O ndice de Margalef que
tambm avalia a riqueza especfica detectou um nmero proporcionalmente elevado de
espcies na comunidade de FMA da ante-duna. A abundncia relativa das diferentes
famlias se modificou a medida que aumentou a estabilizao. As Curvas evidenciaram
diferentes nveis de adaptao das espcies s condies de cada estgio. A ante-dxma
apresentou a distribuio das espcie mais imiforme, mais adaptadas s condies deste
estgio, ajustando-se com maior probabilidade ao modelo broken stick, da mesma forma
que a duna fixa. J a duna semi-fixa se ajustou preferencialmente ao modelo da srie
log. Os ndices de heterogeneidade indicaram a maior diversidade para a comunidade de
FMA na ante-duna. A utilizao combinada da coleta direta de esporos e das culturas
armadilhas permitiu um acrscimo de trs espcies s treze identificadas por meio da
coleta direta, tendo sido consequentemente detectas dezesseis espcies nos trs estgios.
O potencial de inoculo dos FMA estimado pelos bioensaios aumentou progressivamente
com o estgio de estabilizao. Os resultados da avaliao gentica mostraram um
maior polimorfismo do material gentico dos FMA nas comunidades da duna semi-fixa.
Este resultado contrariou os resultados expressos pelos ndices e pelos modelos de
abundncia que indicaram uma baixa diversidade especfica e uma adaptao
intermediria dos FMA s condies ambientais, respectivamente.
XV
ABSTRACT
Specific and genetic diversity of arbuscular mycorrhizal fungi (AMF) was
assessed in three stages of stabilization of dunes (foredunes, intermediate and fixed
dunes) in Joaquina Beach, Santa Catarina Island. Specific diversity was assessed using
direct methods based on countings of field collected spores, indirect methods based on
countings of spores obtained after two cycles of trap-culturing, and the combination of
both methods. In all stages of stabilization, the inoculum potential of AMF was also
evaluated by means of bioassays. In the summer of 97, ten soil samples were collected
from each dune stage. Six-lOOg sub-samples were selected and processed for countings
and taxonomic identification of spores within each dune. The average species
abundance and the species richness and heterogeneity indices were assessed. The
relative abundances were plotted to obtain the "dominance diversity curves"
representative of each stage. These curves were mathematically fitted to the classic
models of abundance distribution. Genetic diversity was assessed by rDNA PCR-RFLP,
a technique consisting of a PCR amplification of the rDNA region obtained fiom spores
representing communities of AMF fi-om each dune, followed by the restriction of the
amplified fragments with the enzyme Hinf I and their eletrophoretic analysis. Thirteen
species were recovered by direct methods. Species belonging to all famihes were
present. However, not all the representatives of each family were present in the three
stages. Moreover, no members of Glomaceae were recovered from the foredune. The
average specific abundance and species richness increased with the stabihzation stage.
The Margalef s index, another assessment of species richness, indicated the foredxme as
the stage with the highest number of species of AMF. The relative abimdance for
species of the different families presented a different pattern as stabilization increased.
Species abimdance models indicated different levels of species adaptation to each dune
stage. In both the foredune and the fixed dune, the most uniform distribution of the
species and the best adaptation of species to environmental conditions were detected,
the patterns corresponding to the broken stick model. However, in the intermediate dune
the pattern tended to follow the log model. As for the heterogeneity indices, in the three
stages assessed the highest diversity for the AMF community occurred in the foredune.
The combined use of direct and indirect methods added three species to the thirteen
identified with the use of field collected spores. As a result, a total of sixteen species
were detected from all collections. The inoculum potential of AMF assessed by
bioassays increased gradually with the stabilization stage. The result of the genetic
assessment indicated a higher polymorphism in the genetic material of the AMF present
in the intermediate dune. In contrast, the indices and the models of abundance indicated,
for the intermediate dune, the lowest species diversity and a reduced adaptation of the
AMF communities to the environmental conditions.
XVI
1 - INTRODUO
Atualmente os fimgos micorrzicos arbusculares (FMA) vm sendo utilizados
em vros processos biotecnolgicos. Dentre estes se encontram a restaurao de reas
degradadas pela extrao mineral, a biorremediao de solos contaminados por metais
pesados e a estabilizao de dunas sujeitas destruio por causas naturais ou
antropognicas. Estes processos podem ser viabilizados atravs da revegetao com
plantas colonizadas por FMA.
A maiora das plantas terrestres estabelece imia simbiose mutualistica com os
FMA. Nesta simbiose, as plantas se beneficiam pelo aumento da capacidade de
absoro de nutrientes do solo e os fimgos pela obteno de carboidratos produzidos
pelas plantas. Alm do benefcio direto na nutrio mineral das plantas, os FMA podem
promover a tolerncia a estresses abiticos e biticos.
Em ecossistemas como as dunas, sujeitos a alta salinidade, seca, ventos, baixas
concentraes de nutrientes e altas temperaturas, entre outros, os FMA desempenham
um papel vital no estabelecimento das plantas pioneiras, na composio vegetal e no
progresso da sucesso. Programas de estabilizao de dunas, por meio da revegetao
com plantas adaptadas aos diversos fatores biticos e abiticos deste ecossistema, e,
portanto, colonizadas por FMA, requerem previamente a avaliao da biodiversidade,
particularmente de grupos chaves da biota do solo, como os FMA a elas associadas. O
conhecimento desta diversidade essencial, uma vez que modifcaes na estrutura das
comunidades do solo podem resultar em alteraes das caracteristicas fimcionais da
biota e conseqentemente alterar os processos ecolgicos.
A seleo de mtodos eficientes de avaliao da diversidade dos FMA,
associados s plantas nativas em diferentes estgios de estabilizao nas dunas, toma-se
fimdamental para o estabelecimento e o monitoramento dos programas de estabilizao.
Este trabalho teve como objetivo principal, avaliar a diversidade dos FMA em
trs estgios de estabilizao de dunas.
Especificamente objetivou:
1. Avaliar a diversidade em nvel de famlias e espcies, por meio de mtodos
diretos - coleta direta de esporos- e indiretos - culturas armadilhas e bioensaios.
2. Avaliar a diversidade gentica por meio da tcnica de PCR-FRLP do rDNA.
2 - REVISO DA LITERATURA
2.1 - BIODIVERSIDADE; CONCEITO, SIGNIFICADO E PRESERVAO.
A palavra Biodiversidade resultou da contrao das expresses diversidade
bitica ou diversidade biolgica e foi introduzida em 1985, como BioDiversidade,
no ttulo do encontro cientfico National Forum on BioDiversity, realizado na cidade de
Washington D.C., Estados Unidos (WILSON, 1988). O primeiro registro na literatura
cientfica da palavra Biodiversidade ocorreu em 1987, quando um autor annimo
apresentou imi relatrio sobre uma exibio de painis, intitulado Biodiversidade em
risco (Biodiversity Endangered) (HAWKSWORTH, 1997). A partir de ento, o
nmero de publicaes cientficas com ttulos que incluem a palavra biodiversidade
aumentou exponencialmente at 1992, estabilizando-se nos anos seguintes em um
nmero mdio de 250 publicaes por ano (HOGARTH, 1993; DYTHAM, 1996).
Biodiversidade refere-se variabilidade entre os organismos vivos, provenientes
de todas as fontes, incluindo ecossistemas terrestres, marinhos e demais ecossistemas
aquticos, e aos complexos ecolgicos que integram; incluindo a diversidade inter- e
intra-especfica e entre os ecossistemas. Esta definio foi adotada pela Conveno da
Diversidade Biolgica (UNEP, 1992) e registrada no artigo 2 desta conveno.
Existem, no entanto, outras definies sobre biodiversidade, tema amplo e complexo,
que freqentemente conduz discordncia, de tal forma que HULBERT (1971), citado
por MAGURRAN (1988), considerou biodiversidade um exemplo de um no-conceito.
Devido complexidade, fxmdamental subdividir a biodiversidade em
diferentes nveis. A importncia de avaliar a diversidade biolgica, no apenas em nvel
de espcies, mas tambm em nvel gentico e de ecossistema, foi inicialmente
reconhecida por NORSE et al. (1980), citado por HAWKSWORTH (1997). A
diversidade gentica pode ser considerada como o primeiro nvel de diversidade e indica
uma medida da informao que uma espcie tem codificada nos seus genes, de
importncia crucial para a sobrevivncia. J a diversidade especfica refere-se
variedade das espcies de organismos presentes em determinado local. Por ltimo, a
diversidade em nvel de ecossistemas refere-se variedade das espcies assim como aos
processos ecolgicos envolvidos. Pode-se considerar, ainda, a diversidade em nvel de
paisagem (landscape diversity), que atende geografia dos diferentes ecossistemas em
reas mais amplas e as conexes que ocorrem (SZARO, 1996).
A atual crise da biodiversidade comparada freqentemente s extines em
massa, documentadas pelos relatrios obtidos aps anlise de fsseis. Os registros
geolgicos nos fornecem a nica informao histrica sobre as respostas das espcies,
populaes, comunidades e ecossistemas frente s grandes perturbaes ambientais.
Atravs destes registros possvel enquadrar as extines que ocorrem atualmente num
contexto evolutivo de tempo mais amplo (RAUPP,1988; ERWIN,1996).
A vida surgiu na terra no final do periodo Pr-Cambriano e incio do
Cambriano. O aumento exponencial da diversidade dos organismos multicelulares,
oriundos da evoluo lenta de organismos menores e mais simples, ocorreu h 3 bilhes
de anos. A maioria dos principais flos se originou durante esta fase. Aps este periodo
de diversificao das espcies, a formao de novas espcies, assim como a sua
extino, constituram eventos naturais e o tempo de vida mdio de uma espcie foi de
aproximadamente 10 milhes de anos. Porm, a composio biolgica da terra foi
alterada diversas vezes, pelo menos em nvel de espcies. O perodo Fanerozico, que
incluiu a era Paleozica, Mesozica e Cenozica, foi afetado por profundas
perturbaes que culminaram em extines em massa. A mais sra extino ocorreu no
final do Paleozico, perodo Permiano, h 250 milhes de anos, e eliminou em tomo de
52% das famlias de animais marinhos, tendo efeito, porm, menor nas plantas e nos
animais terrestres. Outras quatro ou cinco extines em massa no Fanerozico so
citadas na literatura, com possibilidade de eliminao de metade das espcies de
animais existentes na poca (RAUPP, 1988).
A perda contnua de espcies, em extines em massa, aconteceu por processos
naturais (ERWIN, 1996). No entanto, os episdios de extino, que vivemos
atualmente, tm caracteristicas diferentes, pois so causados pelas atividades do prprio
homem e vm ocorrendo a velocidades superiores quelas dos acontecimentos naturais.
Os registros geolgicos mostram que a vida prosperou aps extines drsticas, mas que
sua recuperao levou milhes de anos para ser atingida. Assim, se a situao atual for
equivalente a um episdio correspondente a uma extino em massa, possvel que o
homem no tenha condies para testemunhar sua prpria recuperao.
A biodiversidade deve ser considerada um recurso global que precisa ser
conservado. Vrias so as causas que, atualmente, vm provocando a eroso da
biodiversidade, entre elas, o modelo de exploso demogrfica, a destruio e a
fragmentao de habitats naturais, provocada pelas atividades do homem, tais como as
prticas extrativistas, a poluio qumica do solo, da gua e do ar, alm de catstrofes,
entre outras (WILSON, 1988).
Slidos argumentos sustentam a importncia da conservao da biodiversidade.
Estes so de ordem tica e esttica, alm daqueles que suscitam maior discusso e que
so de ordem ecolgica e econmica. H preocupaes estticas quando ocorre a perda
de paisagens e espcies raras, empobrecendo-se, conseqentemente, a experincia
humana. H preocupaes ticas quando so perdidos outros seres vivos e se concede
a prerrogativa espcie humana de eliminar outras espcies do planeta (SOLBRIG,
1991).
Nos Estados Unidos da Amrica do Norte, o movimento ambientalista
denominado ecologia profunda {deep ecology), criado em 1972, contrasta com o
movimento contra a poluio e a exausto de recursos nos pases desenvolvidos,
denominado ecologia superflciaF. O primeiro tem como princpio bsico o direito
existncia de todos os seres vivos e rejeita a viso antropocntrica, baseada no princpio
de que o homem o elemento central do planeta e que o valor dos restantes seres vivos
est relacionado com seu valor utilitrio. Ecologistas, como Paul Ehrlich, consideram
este movimento suscetvel de mudar os valores, que hoje governam parte da atividade
humana, e que em conseqncia so essenciais persistncia da nossa civilizao.
Embora todos estes argumentos sejam igualmente importantes, os de natureza ecolgica
e econmica so os que se apresentam para a sociedade humana como os mais
convincentes para a preservao da biodiversidade (NATIONS, 1988; EHRLICH,
1993).
Diversos cientistas sustentam que a alta diversidade especfica essencial para o
funcionamento e sustentabilidade dos ecossistemas. NAEM et al. (1994) forneceram as
primeiras evidncias experimentais que sustentam esta hiptese. Desenvolveram
experimentos em cmaras de crescimento com condies controladas, mantendo em
cada cmara o mesmo nmero de organismos dentro dos quatro nveis trficos, porm
variando, em cada nvel, o nmero de espcies. Concluram que as comimidades com
maior biodiversidade exibiam maiores taxas de produo primria (biomassa) e maior
consumo de CO2 (respirao). Em seqncia, TILMAN & DOWNING (1994)
realizaram experimentos em condies de campo, com diferentes espcies de gramneas
permanentes, numa vasta rea experimental e durante vrios anos. Estes pesquisadores
observaram que, quanto maior a biodiversidade, maior a estabilidade dos
ecossistemas, concluindo, assim, que os ecossistemas com maior riqueza especfica
foram os mais resistentes devastao por estresses como a seca, apresentando tambm
maior capacidade de recuperao. Recentemente, TILMAN, WEDIN, & KNOPS
(1996) fizeram um notvel avano, quando demonstraram que, medida que aumentou
a biodiversidade, em diferentes ecossistemas de gramneas, aumentou tambm a
produtividade e a eficincia na utilizao dos recursos minerais do solo. Estes
pesquisadores alertaram para 0 fato de que esta concluso pode no ter sido apenas um
resultado direto do aumento da biodiversidade, mas um reflexo do aumento do nmero
de papis funcionais no ecossistema, resultante do aumento no nmero de espcies.
Foi, assim, evidenciada a importncia do papel da biodiversidade fiincional nos
ecossistemas. Existem, entretanto, crticas aos trabalhos de Tilman e colaboradores,
especificamente no que se refere ao dehneamento experimental e interpretao dos
resultados (HUSTON, 1997).
As publicaes mais recentes vm sugerindo a necessidade de reavaliao
destes conceitos, indicando que o aumento da produtividade, assim como o aumento da
capacidade de aquisio de nutrientes e da sustentabilidade dos ecossistemas podem
estar associados com o maior nmero de espcies chaves e no apenas a uma maior
riqueza especfica (GRIME,1997).
Por outro lado, NAEM & LI (1997) reforaram a hiptese de que a
biodiversidade pode representar uma segurana biolgica contra as ameaas externas.
Em experimentos com microcosmos e diversas espcies de microrganismos em
diferentes grupos funcionais ou trficos, verificaram que quanto maior foi o nmero de
espcies em cada grupo funcional, maior foi a capacidade de produo de biomassa no
ecossistema. Estes pesquisadores verificaram tambm que a redundncia de espcies,
presena de mltiplas espcies em cada grupo funcional, constituiu um importante
commodity para o ecossistema. A base ecolgica deste seguro biolgico foi explicada
pelo princpio do crescimento compensatrio, um processo ecolgico amplamente
observado na natureza, que ocorre quando uma espcie, dentro de um grupo funcional,
aumenta o seu crescimento em funo da reduo ou perda de outra espcie no mesmo
grupo funcional. Como resultado, pode-se, portanto, concluir que o efetivo papel da
biodiversidade nos ecossistemas assunto controverso.
No que se refere conservao da biodiversidade, os interesses econmicos tm
prevalecido em relao s preocupaes ticas, estticas e ambientais. A Conferncia
das Naes Unidas sobre Meio Ambiente e Desenvolvimento, realizada no Rio de
Janeiro em 1992, colocou frente a frente interesses e poderes de deciso desiguais entre
os pases que controlam a tecnologia e aqueles que detm maiores biodiversidades. A
biodiversidade constitui a matria-prima da biotecnologia e a fonte de novos produtos,
principalmente aqueles de origem microbiana. na demanda de produtos novos, assim
como na substituio de outros j produzidos por vias no biolgicas, que reside o
maior interesse na explorao da biodiversidade (BULL,1991; IWU,1996).
A biotecnologia microbiana no uma cincia nova, mas, atualmente, com o
desenvolvimento de novas tecnologias, principalmente no que se refere s tcnicas
moleculares, vem ampliando seu espectro de aplicaes. Atravs dela, vm sendo
obtidos metablitos, utilizados na indstria farmacutica, na qumica fina e na
agroqumica, enzimas para o processamento de alimentos e biotransformaes,
protenas humanas, como a insulina, obtidas por meio da engenharia gentica. Alm
destes produtos, os microrganismos vm sendo utilizados nos tratamentos de efluentes
e resduos, e muitos vm fornecendo genes para a obteno de plantas transgnicas de
importncia agrcola, medicinal e industrial. Diversos microrganismos so tambm
utilizados na preparao de inculos, que propiciam o aumento da produtividade
agrcola e florestal, como por exemplo, as bactras fixadoras de nitrognio e os fungos
micorrzicos. Estes ltimos podem ser tambm utilizados na recuperao de reas
degradadas (PETERSON, et al. 1984; NIESBET et al. 1991).
o sucesso da biotecnologia depende sobretudo da biodiversidade microbiana e
da conservao dos recursos genticos que dela advm. Os microrganismos,
principalmente os fungos e as bactrias, exibem uma extraordinria diversidade no que
se refere sua nutrio, explorao dos nichos ecolgicos, interao com outros
organismos e a seus metabolismos secundrios (NIESBET et al., 1991).
O germoplasma de interesse para a indstria biotecnolgica concentra-se,
sobretudo, nos pases tropicais e em desenvolvimento, sendo Brasil, Colmbia, Mxico
e Indonsia os quatro pases mais ricos em biodiversidade. O Brasil, por sua vez, lidera
as estatsticas mundiais neste sentido, reimindo o mais elevado nmero de espcies de
organismos do planeta. Do total dos organismos j descritos, mais de 10% ocorrem em
territrio brasileiro. A explorao racional desta riqueza daria uma nova face poltica
de desenvolvimento do pas e a perda desse patrimnio, alm de constituir um desastre
de propores planetrias, repercutiria profundamente na rea econmica do prprio
pas (MITTERMEIER et al., 1992).
A diversidade biolgica e sua conservao vem gerando grande interesse a nvel
cientfico e poltico, e so numerosas as iniciativas nacionais e internacionais
desenvolvidas nestes dois planos. Em Maio de 1989, foram lanadas pelo Programa
Ambiental das Naes Unidas {United Nations Environment Programme- UNEP) as
primeiras tentativas para desenvolver a estrutura da Conveno sobre a Diversidade
Biolgica. Nessa poca, o Conselho Governamental da UNEP deu incio s
negociaes atravs da realizao de uma conveno intemacional para a discusso do
tema da conservao da biodiversidade global. Esta conveno ocorreu em Junho de
1992, no Rio de Janeiro, durante a Conferncia das Naes Unidas para o Meio
Ambiente e Desenvolvimento, com a participao de membros de cerca de 160 pases.
O tratado estabelecido tomou-se efetivo em Dezembro de 1993 e foi ratificado por 152
pases em Julho de 1996 (IWU, 1996; SZARO, 1996; HAWKSWORTH, 1997).
A Conveno Intemacional um documento que consta de 42 artigos e 2 anexos
e apresenta, como objetivos, a conservao da diversidade biolgica mundial, a
utilizao sustentvel de seus componentes, o reconhecimento dos direitos soberanos e
da autoridade dos estados e pases sobre seus recursos naturais, a diviso dos benefcios
originados da explorao dos recursos genticos e a definio de mecanismos legais e
multilaterais para o intercmbio de material gentico (IWU, 1996).
2.2 - AVALIAES E MEDIDAS DA BIODIVERSIDADE
As medidas da biodiversidade levam em conta dois componentes: a riqueza
especifica, ou variedade ou densidade de espcie e a uniformidade {evenness) ou
eqitatividade na repartio de indivduos entre as espcies, representada pela
abundncia relativa ou o grau de dominncia das diferentes espcies (ODUM, 1985).
Esta dependncia da biodiversidade de dois componentes um dos motivos que tomam
sua avaliao complexa (MAGURRAN, 1988).
As medidas de diversidade mais utilizadas pelos ecologistas podem ser divididas
em trs categorias principais: os ndices de riqueza especfica, os modelos da
abvmdncia das espcies e os ndices de heterogeneidade (MAGURRAN, 1988).
Dentro dos ndices de riqueza, o mais simples e o mais freqentemente utilizado
o ndice de riqueza {S) que representa o nmero total das espcies presentes em uma
comimidade (ODUM, 1985). No caso de reas de estudo bem delimitadas, tanto no
espao quanto no tempo, incluindo espcies adequadamente enumeradas e identificadas,
o ndice de riqueza das espcies pode fomecer uma medida de diversidade intuitiva e
extremamente til (MAGURRAN, 1988). No entanto, com freqncia toma-se difcil a
caracterizao das comunidades, em parte devido a problemas taxonmicos e tambm
devido a problemas de amostragem. 0 nmero de espcies depende do nmero de
amostras coletadas e tambm do volume de habitat explorado (BEGON, 1986). Sendo,
portanto, fundamental, nestas determinaes, a definio de um sistema de amosfragem
representativo do local e das espcies em estudo (MAGURRAN, 1988).
Existem, entretanto, outros ndices que expressam a riqueza especfica, dentre
os quais, o ndice de Menhinick's e o de Margalef Estes ndices utilizam uma
combinao entre a riqueza (5) e o nmero total de indivduos {N) presentes na amostra.
O ndice de Margalef, assim como a riqueza {S}, sensvel ao tamanho da amostra.
Dentre as medidas de avaliao da diversidade, esto ainda os modelos de
distribuio da abundncia das espcies. Embora diversos pesquisadores tenham
proposto vrios modelos, a diversidade pode ser representada por quatro modelos
principais: a log normal, a srie geomtrica, as sries logartmicas e o modelo brocken
stick de MacArthur (MAGURRAN, 1988). Estes modelos expressam uma progresso
que representa, nas sries geomtricas, poucas espcies dominantes e as restantes pouco
10
representadas; nas sries log e log normal, maior nmero de espcies com a abundncia
intermediria e, finalizando, no modelo broken stick, espcies com abundncia
eqitativa. Quando a abundncia das espcies plotada, em seqncia decrescente, em
um grfico, as sries geomtricas so representadas por linhas retas com pendentes
ngremes. As sries log tambm so representadas por uma linha reta com pendente
ngreme, embora no to pronunciada como no modelo anterior. J as sries log normal
so representadas por curvas sigmoidais e, por ltimo, as curvas do modelo broken stick
so apresentadas por pendentes suaves (MAGURRAN, 1988). BURTON et al. (1992)
sugeriram que uma curva com forte pendente representou a dominncia de uma ou
poucas espcies relativas ao nmero total de espcies (baixa riqueza e/ou baixa
uniformidade), enquanto uma curva com pendente suave expressou um maior equilbrio
entre a distribuio das espcies, mas uma alta diversidade e/ou riqueza. Estes modelos
de distribuio de abundncia podem explicar tambm a repartio de nichos
ecolgicos. Nesse sentido, as sries geomtricas representam um caso de mxima
ocupao dos nichos, enquanto a srie broken stick de MacArthur pode refletir um caso
de mnima ocupao de nicho por cada espcie, sendo os recursos divididos
eqitativamente. Estas duas possibilidades representam o que corresponde a situaes
extremas, sendo que a maioria das distribuies que ocorrem na natureza se aproxima
ao tipo de curva sigmoidal intermediria, indicando um padro mais complexo de
diferenciao e de superposio de nichos (ODUM, 1985).
Por ltimo, a terceira categoria das medidas de avaliao da biodiversidade
constituda pelos ndices de heterogeneidade. Estes ndices so propores ou
expresses matemticas, que levam em considerao, de forma combinada, a riqueza
especfica e a abundncia relativa (ODUM, 1985). De acordo com MARGALEF
(1991), qualquer funo montona (funes que so apenas crescentes ou decrescentes)
que tenha um valor mnimo, quando todos os elementos pertenam a uma nica classe
ou espcie, e um valor mximo, quando cada elemento pertence a uma classe ou espcie
distinta, pode servir de ndice de diversidade. Dos vrios ndices de heterogeneidade
propostos, distinguem-se duas classes, os ndices informacionais e os ndices de
dominncia (MAGURRAN, 1988).
Os ndices informacionais baseiam-se no princpio de que a diversidade, ou
informao, num sistema natural, pode ser medida de forma similar informao
11
contida num cdigo ou mensagem. Dentro destes ndices, o mais utilizado o ndice de
Sliannon (//). Este ndice considera que todas as espcies esto representadas na
amostra. Outro ndice informacional o ndice de Brillouin, que apropriado para o
caso de indivduos no aleatoriamente amostrados. Este ltimo ndice, no entanto,
requer clculos mais complexos que o de Shannon {H) (MAGURRAN,1988).
O segundo grupo dos ndices de heterogeneidade refere-se aos ndices de
dominncia, que consideram com maior peso as espcies dominantes. Entre estes,
encontra-se o ndice de Berger-Parker, o qual representa uma medida de dominncia
simples e fcil de calcular, contudo, com pouca capacidade discriminativa. Outro ndice
deste grupo o ndice de diversidade de Simpson (D ou D \ que um dos mais
freqentemente utilizados.
De todos os ndices de heterogeneidade, os mais utilizados em pesquisas
ecolgicas so o ndice de Simpson {D) e o ndice de Shaimon {H). Estes dois ndices
diferem principalmente quanto forma de evidenciar as espcies na amostra. O
primeiro, evidencia as espcies dominantes, enquanto o segundo, o ndice de Shannon
{H), evidencia espcies raras na amostra (ODUM, 1985). Ambos tm uma capacidade
de discriminao moderada e um nvel intermedirio quanto complexidade dos
clculos. Em termos de sensibilidade ao tamanho da amostra, o ndice de Simpson (D)
apresenta uma sensibilidade menor (MAGURRAN, 1988). A partir dos ndices de
diversidade de Simpson (D) e Shannon (//) calculam-se os respectivos ndices de
imiformidade ou eqitatividade, os quais correspondem a uma normatizao dos ndices
de diversidade (ODUM, 1985).
As medidas de biodiversidade podem ser aplicadas em diversas escalas e
hierarquias taxonmicas. WHITTAKER (1960), citado por ODUM (1985), dividiu a
diversidade em diferentes escalas espaciais; alfa, que se refere diversidade que ocorre
dentro de um mesmo habitat ou dentro de uma comunidade; beta, para a diversidade
que ocorre entre habitats; e gama para a diversidade que ocorre numa escala geogrfica,
em nvel de bioma, de continente, de ilha, entre outros.
No que se refere aos diferentes nveis hierrquicos, as medidas de diversidade,
teoricamente, podem ser aplicadas desde a diversidade gentica at a diversidade dos
ecossistemas. Tambm podem ser utilizadas nas diferentes categorias taxonmicas,
podendo se aplicar a riqueza e o evenness s famlias, aos gneros, s raas, s
12
variedades ou aos ecotipos. Na maioria das pesquisas, estes componentes geralmente se
referem diversidade especfica (BURTON et al., 1992).
As medidas de biodiversidade podem ser importantes, no monitoramento
ambiental onde se presume que os efeitos adversos da poluio reduzam a diversidade
ou impliquem em alteraes nas formas da distribuio da abundncia das espcies.
Nos dois casos, a diversidade sinnimo de qualidade ecolgica e utilizada como
um ndice da sade do ecossistema. Para o monitoramento ambiental, utilizam-se
amplamente os ndices de diversidade e da distribuio da abundncia das espcies,
sendo que para o manejo, com finalidade de preservao, se adotam quase
exclusivamente as medidas de riqueza de espcies (MAGURRAN, 1988).
2.3 - A BIODIVERSIDADE MICROBIANA - O CASO ESPECIFICO DOS
FUNGOS
A avaliao da biodiversidade uma tarefa complicada. Os principais
problemas so a amplitude da prpria diversidade biolgica, a dificuldade na
recuperao e na identificao taxonmica de diversos grupos de seres vivos e a
carncia de taxonomistas capacitados. Estes problemas so amplificados quando se
trata de avaliar a diversidade microbiana (BOUSSIENGUET, 1991).
Estimativas indicam a existncia de 30 milhes de espcies vivas no planeta.
Dentre estas, apenas 5% foram descritas numa proporo de 15.000 a 20.000 espcies
por ano. Desta forma, com base na utilizao dos mtodos atuais de avaliao e nas
propores indicadas, estima-se que sero necessrios quase 2 milnios para se
descrever todos os organismos existentes no planeta. Lastimavelmente, a eroso dos
recursos genticos, como resultado da destruio das florestas e de outros
ecossistemas, tem ocorrido em velocidades maiores do que ocorre a avaliao da
diversidade de alguns grupos de seres vivos, como por exemplo, os microrganismos
(WILSON, 1988; BOUSSIENGUET, 1991; HUNTER, 1996).
No caso dos microrganismos, alguns autores indicam que aproximadamente
99% das espcies presentes em ecossistemas naturais ainda no foram identificadas.
13
sendo este conhecimento essencial para um manejo efetivo dos recursos naturais como
fonte de novos microrganismos ou genes para a inovao tecnolgica (ATKINSON,
1996). Os trabalhos de TORSVDC et al. (1990a ; 1990b) mostraram a situao de
precariedade em que se encontra o conhecimento da diversidade microbiana. Estes
pesquisadores coletaram duas amostras de solo de apenas uma grama, sendo uma
proveniente de uma floresta e outra de sedimentos marinhos, na Noruega. De cada
amostra foram recuperadas bactrias e extrado o DNA total. Aps anlise do DNA
foi estimado o nmero aproximado de espcies presentes, concluindo-se que, de cada
amostra, mais de 4.000 espcies estavam presentes com reduzida sobreposio nas
duas amostras. Foram, entretanto, at presentemente identificadas cerca de 4.000
espcies de bactrias, ou seja, um nmero equivalente quele identificado por
TORSVIK em uma amostra de solo reduzida. Esta situao tambm ocorre com
outros grupos de microrganismos.
A diversidade microbiana, at hoje identificada, inclui 82.500 espcies, dentro
das quais, cerca de 72.000 correspondem a espcies fiingicas. Os fungos constituem,
aps os insetos, o maior grupo de organismos no planeta. Conseqentemente, a tarefa
de se obter um inventrio a lvel mundial de maior magnitude para os fungos do que
para outro grupo de microrganismos. Estima-se, com base na relao plantas
vasculares-fungos (6:1), na Gr Bretanha, onde ambos grupos vm sendo amplamente
estudados, que a diversidade fngica global seja de aproximadamente 1.500.000
espcies. Estes dados foram confirmados pelos resultados do projeto Avaliao da
biodiversidade global {Global biodiversity assessment), empreendido pelo Programa
Ambiental das Naes Unidas entre 1993-95 (HAWKSWORTH, 1995; 1997). No
entanto, de acordo com LODGE (1997), os micologistas que pesquisam alguns
ecossistemas tropicais concluram que a diversidade fngica nestas regies maior do
que nas regies temperadas, considerando-se, portanto, o valor obtido subestimado.
A dificuldade na avaliao da diversidade fngica deve-se a diversos fatores,
que vo desde os metodolgicos dimenso desses microrganismos, como ao elevado
nmero de espcies presentes nos locais de estudo, entre outros. Apenas alguns grupos
de fungos esto completamente caracterizados e identificados taxonomicamente, fato
que resulta no s da carncia de profissionais capacitados, como de informaes sobre
as caractersticas taxonmicas diferenciadoras dos grupos ou das espcies. A falta de
14
consenso entre os microbiologistas no que se refere ao conceito de espcie e de
especificidade face ao hospedeiro constitui, tambm, um fator complicador.
(CANNON, 1997). Tradicionalmente, a biodiversidade se baseia na espcie como
unidade de avaliao. Entretanto, quando se considera o caso dos microrganismos o
conceito clssico de espcie no pode ser aplicado (TORSVIK et al., 1996). Segundo
HAWKSWORTH (1995), o conceito de morfo-espcie vem, assim, sendo o mais
utilizado pelos micologistas. Este conceito reconhece as unidades, baseando-se nas
caractersticas morfolgicas dos indivduos, mas dados moleculares vm mostrando que
algumas morfo-espcies compreendem vrias espcies biolgicas e/ou flogenticas.
Embora os fungos constituam um grupo numeroso de microrganismos com
grande potencial biotecnolgico e desempenhem funes importantes nos ecossistemas,
pouca ateno vm recebendo na rea cientfica. Os fimgos podem desempenhar
atividades saprfitas, parasitas e ainda simbiticas, sendo que neste caso diversos
fungos podem desenvolver associaes mutualsticas com as razes da maioria das
plantas vasculares, as micorrizas (HAWKSWORTH, 1991).
As micorrizas podem ser consideradas simbioses quase universais, no s pelo
grande nmero de plantas susceptveis como tambm pela ocorrncia generalizada na
maioria dos habitats. De acordo com as estruturas produzidas na raiz e sua funo so
distinguidos diversos tipos, sendo os principais, as ericides, as ectomicorrizas, as
endomicorrizas.
Os fungos envolvidos nas endomcorrizicas de tipo arbuscular (FMA) so
simbiontes obrigatrios, ou seja, s completam seu ciclo de vida na presena de uma
planta hospedeira. Estes fungos desenvolvem a simbiose associados a 90% das plantas
terrestres, constituindo o tipo mais difundido entre as micorrizas. As plantas associadas
aos FMA se beneficiam principalmente pelo aumento da capacidade de absoro de
nutrientes, particularmente o fsforo; e os fungos, por sua vez, se beneficiam recebendo
carboidratos fornecidos pelas plantas hospedeiras (HARLEY & SMITH, 1983). Alm
do benefcio direto na nutrio das plantas, os FMA podem promover a tolerncia a
estresses abiticos e biticos. Os FMA podem colonizar um nmero elevado de plantas
de grupos taxonmicos diferentes, apresentando uma falta de especificidade
generalizada para o hospedeiro (BAREA, et al., 1984). Porm, importante distinguir
entre especificidade, ou seja, a capacidade inata para colonizar; infectividade, isto
15
, o nvel de colonizao; e "efetividade", a resposta do hospedeiro colonizao. Cada
espcie de FMA dispe de infectividades distintas e tambm pode propiciar diferentes
efeitos no desenvolvimento das plantas, o que, por sua vez, depende de fatores
ambientais particularmente do solo. A infectividade de uma comunidade de FMA
depende do nmero, do tipo e do vigor de propgulos fngicos e pode ser avaliada
atravs de bioensaios com hospedeiros de fcil crescimento em condies controladas.
Existem evidncias que plantas fsseis apresentavam colonizaes radiculares
datadas de aproximadamente 400 milhes de anos (PIROZYNSKI & DALP, 1989).
Estas evidncias vm sendo corroboradas por meio da anlise molecular dos genes
ribossmcos. A seqncia gnica 17S do RNA ribossmico foi utilizada como um
relgio molecular para inferir as pocas de divergncia entre as famlias e os gneros
dos FMA. Da mesma forma, se estimou a poca em que poderiam ter sido originados
os FMA, e se concluiu que ocorreu entre 350-460 milhes de anos (SIMON et al., 1993,
1996). Ambas evidncias reforam a hiptese de que estes fungos desempenharam um
papel fundamental na colonizao do ambiente terrestre pelas plantas.
As associaes micorrzicas afetam de forma relevante o funcionamento dos
ecossistemas terrestres. Os fungos micorrzicos interagem diretamente com a
comunidade microbiana, a comunidade animal e a comunidade vegetal. Estas
interaes envolvem competies por espao e por nutrientes, quer entre fungos
micorrzicos, entre fungos saprfitas e parasitas, e ainda, com a restante biota do solo.
As interaes com a comunidade animal podem ser tanto positivas quanto negativas.
Os fimgos competem com os animais pelo carbono das plantas com as quais se
associam. Alguns animais utilizam o miclio como substrato nutricional, resultando na
perda de biomassa fngica. Algumas interaes tm tambm um papel importante na
disperso dos fungos micorrzicos. Desta forma, as micorrizas influenciam a
composio e o funcionamento das comunidades vegetais, regulando a distribuio dos
recursos e o desenvolvimento das plantas. Esta regulao pode ser realizada por meio
do transporte de nutrientes, preferencialmente de um indivduo para o outro, assim
como, pela distribuio dos nutrientes e do carbono atravs da comunidade (ALLEN,
1991).
16
A transferncia de carbono entre as razes de plantas interligadas por meio dos
miclios de FMA foi comprovada por FRANCIS et al. (1984). Estes pesquisadores
utilizaram experimentalmente plantas micorrizadas e no micorrizadas de uma nica
espcie e as submeteram a um tratamento com carbono radiativo. Estas plantas foram
consideradas como "doadoras", promovendo a infeco micorrzica e a transferncia do
carbono. Por outro lado, plantas de outra espcie, que no estavam micorrizadas, foram
consideradas como "receptoras" dos benefcios fornecidos pelas "doadoras". Estas
ltimas foram submetidas a distintas intensidades de sombreamentos. Os resultados
obtidos por meio de auto-radiografa mostraram que as interligaes funcionavam como
uma via direta na transferncia de carbono entre as razes das plantas "doadoras"
micorrizadas e as 'j-eceptoras" no micorrizadas. e, ainda, que a magnitude da
transferncia foi maior na direo das plantas receptoras, submetidas baixa
iluminao, em comparao com as plantas que receberam imia iluminao total.
O papel dos FMA nas comunidades foi investigado por GRIME et al. (1987) em
condies controladas. Estes pesquisadores concluram que a colonizao micorrzica
causou um aumento da produtividade do ecossistema por intermdio da espcie vegetal
dominante, que favoreceu as restantes espcies associadas. Todas as espcies
colonizadas apresentaram biomassa relativamente maior que as mesmas espcies sem
micorrizas. A maior diversidade vegetal foi, em parte, resultante do aumento da
sobrevivncia das plantas colonizadas. Da mesma forma que FRANCIS, estes autores
verificaram a ocorrncia de transferncia carbono radioativo das plantas colonizadas
para aquelas no colonizadas.
As plantas diferem quanto sua dependncia micorrzica. Aquelas que tm o
crescimento estimulado pela associao so denominadas micotrficas e podem ser
obrigatrias ou facultativas. As obrigatrias no se desenvolvem sem micorrizas,
enquanto que as facultativas se desenvolvem na ausncia da simbiose quando em solos
frteis, mas se beneficiam da associao quando se encontram em solos pobres. Em
sucesses vegetais, o tipo de planta que ocorre em cada estgio apresenta dependncias
distintas da simbiose micorrzica (JANOS, 1980). Este pesquisador verficou que nos
prmeiros estgios de uma sucesso ocorreu uma predominncia das plantas no
micotrficas, as quais foram substitudas gradualmente por espcies micotrficas
facultativas e, finalmente, nos ltimos estgios sucessionais por plantas micotrficas
17
obrigatrias. Este modelo evidenciou a importncia dos FMA nos processos
ecolgicos, tal como, as sucesses vegetais. No entanto, estudos realizados por
KOSKE & POLSON (1984) em dunas, em Rhode Island, nos Estados Unidos,
mostraram algims resultados contrastantes, particularmente no estgio inicial de
sucesso. Estes pesquisadores verificaram que Ammophila brevUigulata, a graminea
predominante nos estgios iniciais de estabilizao de dunas, apresentou altos ndices de
colonizao micorrizica. Esta evidncia sugeriu que o estabelecimento de micorrizas
foi essencial no processo de estabilizao das dimas e sua sucesso subseqente.
2.4 - OS FUNGOS MICORRIZICOS; IMPORTNCIA E AVALIAES DA
DIVERSIDADE.
2.4.1 - DIVERSIDADE A NIVEL DE famlia E DE ESPECIE
So reconhecidas atualmente cerca de 150 espcies de FMA o que representa
um nmero baixo, quando comparado aos milhares de espcies de ascomicetos e
basidiomicetos que constituem as estimativas de fungos ectomicorrizicos (SANDERS,
1997).
Os grupos taxonmicos dos FMA esto subdivididos de acordo com a estrutura e
o processo de desenvolvimento do fungo. As espcies, aproximadamente 150, os seis
gneros; Acaulospora, Entrophospora, Gigaspora, Scutellospora, Glomus, e
Sclerocystis; as trs famlias; Acaulosporaceae, Gigasporacea, Glomaceae e as duas
subordens; Glominae e Gigasporinae esto agrupados na Ordem Glomale-s, Classe
Zigomicetes, Subdiviso Zigomicota. Esta ordem inclui fungos micorrzicos que
produzem arbsculos nas clulas do cortex radicular. J os membros de cada subordem
diferem quanto ao tipo de estrutura micorrzica produzida e quanto seqncia de
eventos na formao dos esporos. Por outro lado, as famlias e os gneros diferem
quanto ao modo de formao dos esporos, sua organizao e ao processo germinativo.
18
Finalmente, as espcies so diferenciadas por caractersticas subcelulares geralmente
associadas ao processo germinativo (SYLVIA, 1998).
Sendo os FMA simbiontes obrigatrios, a avaliao da diversidade envolve
procedimentos complexos. Um aspecto complicador reside no fato de que os fungos
proliferam tanto no solo como no cortex radicular, portanto, dispondo de uma fase
extra-radicial e de uma fase intra-radicial. A fase extra-radicial inclui esporos e hifas e
o componente mais freqentemente utilizado nas avaliaes. A contagem de esporos
recuperados do solo uma das medidas usadas para quantificar a diversidade, sendo
uma estratgia direta de avaliao. Porm, vrios pesquisadores vm considerando
insuficiente a utilizao dos esporos como nica fonte para as avaliaes. MORTON
(1993) aponta dois motivos de considerao problemtica para a avaliao da
diversidade de FMA com base em esporos. O primeiro problema pode surgir uma vez
que a ausncia de esporos no indica necessariamente a ausncia de fungos
micorrzicos, j que estes podem estar presentes intra-radicialmente ou sob a forma
micelial no solo. O segundo, pode estar relacionado dificuldade na identificao dos
fungos a partir de esporos coletados a campo, geralmente deterorados por
hiperparasitismo ou, ento, por se encontrarem em fases de desenvolvimento
inadequadas para a identificao das estrutura diferenciadoras.
Outro aspecto a ser observado que as avaliaes por mtodos diretos refletem
eventos passados da simbiose, sendo conseqentemente incorreta a relao desta
informao com a situao contempornea, o que pode comprometer a interpretao
dos dados das avaliaes. O uso isoladamente de mtodos diretos pode desta forma
conduzir a subestimao ou superestimao da diversidade (SANDERS, 1996).
Mtodos complementares que permitam a avaliao da diversidade dos FMA
so fundamentais. Dentre estes, podem ser utilizados as culturas armadilhas e os
bioensaios, que consistem em mtodos indiretos da avaliao. MORTON (1995 b)
estimou a diversidade especifica dos FMA em quatro diferentes ecossistemas, incluindo
as dunas. Para tal, utilizou uma combinao de mtodos, como a avaliao direta a
partir de esporos recuperados diretamente do solo e a avaliao complementada com
esporos resultantes de trs geraes de culturas armadilhas. As culturas armadilhas so
importantes na complementao da diversidade e podem ser obtidas aps a
multiplicao dos esporos de FMA coletados a campo, em hospedeiros alternativos.
19
obtendo-se assim populaes mistas de fungos com esporos de alta viabilidade e,
portanto, de fcil identificao taxonmica. Atravs das culturas armadilhas , por
vezes, possvel recuperar espcies no detectadas a campo. Segundo MORTON
(1995b), o nmero de espcies identificadas, em solos de dimas, aumentou com a
utilizao desta estratgia, tendo permanecido constante aps a segimda gerao das
culturas armadilhas.
No bioensaio, mtodo indireto para avaliao da abundncia, estimado o
nmero de propgulos (esporos, hifas e razes infectadas) viveis presentes no solo, que
na contagem direta de esporos no identificado. Neste mtodo, so avaliados os
pontos de entrada dos fungos na raiz, ou a porcentagem de infeco radicular, da planta
hospedeira ao final de diferentes perodos de tempo, de cultivo em solo proveniente do
stio em estudo ( MOORMAN & REEVES, 1979 ).
A maioria dos resultados publicados sobre a diversidade dos FMA se baseou
exclusivamente em esporos coletados diretamente do solo (MORTON, 1993). Nas
diversas publicaes em que foi apresentada a diversidade especfica dos FMA,
utilizando-se esporos coletados a campo em sistema de dunas em vrias regies do
planeta, os resultados foram expressados na sua grande maioria atravs do ndice de
riqueza especfica (S) e da abundncia. Um dos primeiros estudos sistemticos sobre os
FMA em dimas foi realizado por NICOLSON (1960). Neste trabalho, o pesquisador
verificou que o grau de colonizao micorrzica nas gramneas das dunas, na Esccia,
varava conforme a estao do ano e a posio das plantas nas dunas, aumentando desde
a ante-duna duna fixa. Em pesquisas realizadas em dunas da Austrlia, KOSKE
(1975) mostrou que a abundncia, assim como a riqueza especfica, eram menores na
ante-duna e que estes valores aumentaram com o estgio de estabilizao. Da mesma
forma, KOSKE & HALVARSON (1981), em dunas em Rhode Island, analisaram as
variaes da abundncia e da freqncia dos FMA, considerando a cobertura vegetal e
algumas caractersticas qumicas e fsicas do solo, tais como, pH, matria orgnica e
tamanho dos gros de areia. Concluram que a abundncia e a riqueza aumentavam
com a cobertura vegetal, ou seja, com o nvel de estabilizao, ocorrendo uma baixa
correlao com os fatores analisados, exceto o tamanho dos gros de areia. Trabalhos
recentes realizados nas dunas do Golfo do Mxico (CORDIKI & RINCON, 1997a)
avaliaram o estado micorrzico e o potencial de inculo dos FMA, ao longo de um
20
gradiente sucessional, utilizando para tal, dois tipos de bioensaio diferentes. Um dos
bioensaios foi realizado em condies controladas e outro, em condies de campo. De
acordo com os resultados dos dois bioensaios, ocorreu um aumento da atividade
micorrzica com os estgios sucessionais. Trabalhos sobre a avaliao de diversidade
dos FMA em estgio sucessionais de uma plantao de Ammophila breviligulata em
regies de dunas em Massachussetts, Estados Unidos, verificaram que a riqueza, a
abundncia e a porcentagem de raiz colonizada aumentavam com a sucesso de forma
similar s sucesses naturais.
Poucos pesquisadores tm avaliado a diversidade especfica de forma
integrada, envolvendo diversos mtodos. No entanto, KOSKE (1987) analisou a
composio das espcies de FMA ao longo de uma linha de aproximadamente 350 Km
de dunas na costa Atlntica. Este pesquisador recuperou um total de 23 espcies,
sendo que Gigaspora sp e Scutellospora sp foram as espcies predominantes. Nesta
regio, o principal fator de variao foi a temperatura, tendo se observado ixma relativa
imiformidade no que se refere a outros fatores como as condies edfcas, a
precipitao anual e a vegetao, entre outros. A uniformidade das condies
possibilitou a avaliao da composio dos FMA em resposta a uma varivel. Para tal,
foram utilizados parmetros, como a densidade de espcies, a riqueza especfica, o
ndice de dominncia de Berger-Parker modificado e as curvas do componente
dominncia da diversidade e observados que os efeitos da temperatura numa
comunidade de FMA foram separados em dois componentes, o primeiro com efeito
direto sobre o fungo e segundo sobre a planta hospedeira. KOSKE (1987) concluiu,
ainda, que ocorreu um aumento na riqueza e na densidade de esporos com a
temperatura. Atravs das curvas, concluiu que as pendentes mais ngremes
correspondiam s regies submetidas s menores temperatviras e conseqentemente ao
maior estresse para as comunidades de FMA. O ndice de dominncia tambm
mostrou os valores mais altos nos locais de maior estresse trmico.
No Brasil, poucos trabalhos foram publicados sobre as comunidades de FMA em
dunas. Os primeiros estudos sistemticos foram efetuados por STRMER & BELLEl
(1994) nas dunas da praia da Joaquina, Ilha de Santa Catarina. Neste trabalho foram
definidas a composio e a variao sazonal das populaes de FMA, associadas com
Spartina ciliata - graminea predominante nas ante-dunas e dunas semi-fixas no sul do
21
pas. Foi observado que a riqueza especfica na duna semi-fixa foi de 12 espcies e que
as espcies predominantes, determinadas por contagem de esporos no solo, foram
Acaulospora scrobiculata e Gigaspora albida. A abundncia das espcies de FMA
nestas dunas apresentou sazonalidade e a riqueza especifica variou entre 4.6 a 6.8, sendo
o vero a estao que apresentou a maior abundncia de esporos no solo (380 esporos
por 100 gramas de solo). Alm da riqueza e da abundncia, foi utilizada a curva
componente dominncia da diversidade com o objetivo de se analisar a estrutura da
comimidade de FMA nesta dima, a qual se adaptou ao modelo broken stick. Foi
verificado, ainda, que a composio e a riqueza de espcies de FMA nestas dunas
apresentou semelhana com aquelas das dunas da costa Atlntica dos Estados Unidos.
2.4.2 -DIVERSIDADE GENETICA
As mutaes gnicas do origem diversidade gentica presente na natureza.
A seleo natural, porm, determina se essas mutaes se estabelecero ou sero
eliminadas. A ampla diversidade dos seres vivos resulta da distribuio de mutaes
favorveis que vm ocorrendo nos ltimos trs bilhes de anos, em bilhes e trilhes de
clulas. As variaes genticas presentes na natureza envolvem aspectos vinculados s
funes fisiolgicas e bioqumicas do organismo e, conseqentemente, interferem no
desempenho ecolgico das espcies ( KAMALJIT et al., 1991).
A diversidade gentica pode se manifestar em quatro nveis de organizao:
entre espcies, entre populaes, dentro das populaes e dentro dos indivduos
(HUNTER, 1996). Esta diversidade pode ser detectada e avaliada atravs de diferentes
abordagens. Uma delas a abordagem molecular, que envolve a anlise das alteraes
na estrutura da molcula de DNA ou de protenas codificadas por genes especficos
(KAMALJIT et al., 1991).
Atualmente existem vrias tcnicas moleculares, que so fireqentemente
utilizadas com objetivos ecolgicos. Para um nmero elevado de organismos, a anlise
do polimorfismo de tamanho em fragmentos de restrio (RFLP) pode ser utilizada na
avaliao da diversidade gentica. Esta tcnica se baseia no fato de que uma seqncia
22
especifica de DNA apresenta um nmero nico de stios de restrio reconhecidos por
determinada enzima de restrio. Os firagmentos de DNA, gerados pela enzima ou
enzimas de restrio, podem ser separados por eletroforese, produzindo um padro de
bandas, caracterstico para cada espcie. Qualquer mutao pontual num stio de
restrio ou outras modificaes na seqncias de DNA, como inseres ou delees,
mudaro o padro de restrio gerado pela enzima. O RFLP um procedimento
interessante para caracterizar e identificar gentipos fngicos (MARMESSE, 1993).
Os FMA no so suscetveis de cultivo em meios laboratoriais sendo, portanto,
difcil a obteno de quantidades de DNA suficiente para proceder anlise de RFLP.
Assim, SANDERS et al. (1996) indicaram que as tcnicas de identificao ou de
avaliao da diversidade gentica, nestes fungos, devem ser previamente sujeitas
reao da polimerase em cadeia ( PCR).
A tcnica denominada PCR foi criada por KARY MULLIS, em 1987, e descrita
por SAIKI et al. (1988). Atravs desta tcnica se amplificou um segmento de DNA,
situado entre duas regies de seqncias conhecidas. As amplificaes foram realizadas
a partir de dois oligonucletdeos iniciadores ou primers, que se ligaram a stios opostos
de uma seqncia especfica de DNA dupla fita e de uma DNA polimerase
termoestvel, que catalisou a reao de polimerizao de novas fitas. Os primers foram
orientados de modo que a sntese de DNA ocorreu na regio compreendida entre os
mesmos.
Os ciclos de amplificao de DNA compreendem a desnaturao do DNA-
molde, o pareamento dos primers aos stios que lhes so homlogos no DNA e a sntese
ou a polimerizao dos fragmentos de DNA. Estes ciclos so repetidos vrias vezes e
permitem a amplificao exponencial do fragmento de DNA, que , posteriormente,
analisado eletroforeticamente (WHITE et.al., 1990). LEE et al. (1990), assim como,
SANDER et al. (1995), utilizando a tcnica do PCR, amplificaram certas seqncias de
DNA a partir de pequenas quantidades de amostras, tal como um nico esporo de FMA.
Os primeiros a utilizar o PCR nos fungos micorrzicos arbuscuiares foram
SIMON et ai. (1992a, 1992b) com o objetivo de obter inicialmente o seqenciamento
dos genes nucleares que codificam para o RNA ribossmico 17S. Este seqenciamento
permitiu posteriormente o desenvolvimento de um primer especifico para os FMA
23
(VAN Si), que possibilitou a ampliao do rDNA dos FMAs a partir de uma mistura de
plantas e outros fungos.
O DNA ribossmico tem sido utilizado freqentemente em estudos taxonmicos
e filogenticos dos fungos. Na maioria dos eucariontes, o rDNA apresenta-se como um
arranjo repetitivo de trs dos quatro genes que codificam para os diferentes RNA
ribossmicos. Os genes que codificam para as subunidades 17 S, 5.8 S e 25 S esto
separados entre si por seqncias espaadoras transcritas (ITS), e as unidades
repetitivas, constitudas pelos trs genes, esto separadas por regies espaadoras no
transcritas (IGS). A ordem dos genes parece ser conservada em todos os organismos
com exceo do gene que codifica para a subunidade 5 S que, dependendo do
organismo, pode ou no estar localizado dentro desta unidade repetitiva. As regies
gnicas de rDNA so altamente conservadas; j os espaadores, particularmente o
espaador intergnico (IGS), pode variar de forma significativa at mesmo a nvel intra-
especfico ( BRUNS et al, 1991).
O DNA ribossmico nuclear que codifica para a subunidade 5.8 S, e as duas
regies espaadoras transcritas ITS, que o flanqueiam, tm sido utilizados para estudar
as relaes flogenticas entre os fungos. Os primers universais ITSl e ITS4 so os
mais comumente utilizados na amplifcao desta regio (WHITE et al., 1990). As
regies ITS dispem de caractersticas interessantes para a identificao dos fungos a
nvel molecular. Uma delas, que nos fungos, esta regio, que compreende entre 600 a
800 pares de bases, facilmente amplificada, utilizando os primers universais, os quais
so complementares s seqncias altamente conservadas dos genes rRNA. Outra
caracterstica importante deve-se natureza repetitiva do rDNA, que toma esta regio
fcil de amplificar a partir de amostras pequenas, diludas e altamente degradadas
(GARDES & BRUNS, 1993).
Nos fungos micorrzicos arbusculares foram realizadas poucas anlises de
restrio da regio ITS a partir de isolados de espcies definidas; portanto, a diversidade
gentica a nvel de famlia, gnero e espcies ainda no foi convenientemente
esclarecida (REDECKER et al., 1997). Uma das dificuldades em utilizar esta regio
para fins de identificao nos FMA reside no fato de que a regio ITS apresenta um alto
polimorfismo mesmo dentro de um nico esporo. Este polimorfismo pode ser o
24
resultado da presena de diferentes gentipos em diferentes ncleos do mesmo esporo
(esporos heterocariticos) (SANDERS et al., 1995; HOSNY et al., 1996).
2.5 - AS DUNAS COMO ECOSSISTEMA MODELO PARA ESTUDOS DE
BIODIVERSIDADE.
As dunas formam um ecossistema sujeito a alta salinidade, fortes ventos, seca,
baixas concentraes de nutrientes e altas temperaturas, entre outros, constituindo,
assim, um ambiente restritivo para a grande maioria dos organismos vivos. No que se
refere s dunas, ento, a densidade e a diversidade da microbiota do solo, assim como a
dos FMA, so relativamente baixas e, conseqentemente, as interaes biticas
simplificadas. Alm desta caracterstica, as dunas apresentam todos os estgios
sucessionais, ocorrendo simultaneamente, resultante do processo contnuo de formao
deste sistema (WATKINSON et al, 1979). Por todas estas razes, as dunas constituem
um ecossistema modelo para a realizao de diversas pesquisas ecolgicas, inerentes
aos estudos sucessionais e de estabilizao.
Existem trs tipos de dimas, quanto mobilidade do substrato e cobertura
vegetal: as ante-dimas que possuem uma cobertura vegetal esparsa ou ausente, deixando
o substrato sujeito aos ventos e, geralmente, encontram-se mais prximas da orla
martima; as dimas semi-fixas, por outro lado, que se caracterzam pela presena de
vras espcies vegetais, especialmente plantas de hbitos rasteiros, que dificultam o
deslocamento de areia e, por ltimo, as dunas fixas onde o solo se encontra totalmente
recoberto de plantas (RIZZINI, 1979).
Extensas reas da costa martima brasileira so ocupadas por dunas. No estado
de Santa Catarina, este sistema compreende cerca de 258km^ o que corresponde a 0,3%
da rea total do Estado (RIZZINI, 1979). Um dos problemas que vem ocorrendo nas
regies de dunas no estabilizadas a incurso de areia nas rodovias, construes e
terras agrcolas ao ponto de serem necessras a restaurao e a estabilizao deste
sistema. A estabilizao das dunas de Cape Cod, Massachussets, nos Estados Unidos,
tem sido uma preocupao constante para seus habitantes. Estas dunas antes da chegada
dos colonizadores apresentavam uma vegetao florestal. A destruio desta vegetao.
25
provocada pela ao do homem e prejudicada pela entrada de animais nas pastagens,
resultou na transformao da regio em rea de dimas mveis. Estas dunas vm sendo
estabilizadas atravs da revegetao com plantas com micorrizas (KOSKE & GEMMA,
1997). Outro problema-que-ameaa'as costas martimas em diversas regies, inclusive
no Brasil, a eroso causada pelo movimento das ondas e pelas modificaes do nvel
do mar. Em ambos os casos, a vegetao rasteira das ante-dunas desempenha um papel
fundamental na integridade geomorfolgica da costa e funciona como uma barreira
dinmica contra a ao das ressacas e dos ventos (DUPONT & ADDAD, 1997).
Programas de estabilizao de dunas vm sendo empreendidos em diferentes
partes do mundo, utilizando-se a revegetao como estratgia de estabilizao.
SALMERON (1967) publicou um resumo das tcnicas de fixao de dunas, utilizadas
em diversos pases do mundo, alm de definir as caracteristicas das plantas a serem
utilizadas na revegetao. A grande maioria destes programas, no entanto, no
considera o papel dos FMA no estabelecimento de plantas pioneiras, na composio
vegetal e no progresso da sucesso (KOSKE & POLSON, 1984).
Ps FMA tem um papel indireto na estabilizao das dunas atravs da melhoria
na nutrio das plantas e, diretamente, pela reteno das partculas do solo pelo
emaranhado de hifas do miclio extra-radicular, ocorrendo, assim, uma modificao da
estrutura do solo benfica ao estabelecimento de diversas plantas. Os agregados so
tambm mais resistentes ao dos ventos, proporcionando uma maior estabilidade s
dunas (KOSKE et al., 1975; SUTTON et al., 1976).
26
3 - MATERIALE MTODOS
3.1 - caractersticas do local de estudo
o estudo foi conduzido no ms de Fevereiro de 1997, na praia da Joaquina,
situada na Ilha de Santa Catarina, Santa Catarina, Brasil (27 50S e 48 34W). A
regio litoral da Ilha de Santa Catarina, assim como todo o litoral catarinense, coberto
por um solo aluvial composto de areia, geralmente profimdo e mvel e, em alguns
pontos, coberto por lodo (Reitz, 1961; Bresolin, 1979). O clima subtropical com
temperaturas mdias de aproximadamente 20C. As chuvas esto distribudas
imiformemente durante o ano. Os ventos predominantes so dos quadrantes NE e N,
com vento sul, geralmente, determinando mudanas de temperaturas.
Para realizar a coleta das amostras de solo, foram escolhidos trs lotes em dunas,
com aproximadamente 700 m^, com nveis crescentes de estabilizao, e que foram
denominados ante-duna, duna semi-fxa e dima fxa. Estes lotes, representando os trs
estgios de estabilizao, encontravam-se em uma nica direo no sentido da costa
para o interior da ilha. O primeiro, na ante-duna (273754,3S e 482707,7 W), foi
considerado o ponto de referencia 0. A duna semi-fxa (273752,6S e 482707,5W)
e a duna fxa (273745,0S e 482729,6W) encontravam-se, respectivamente, a uma
distncia de 40 e 650 metros, aproximadamente, do ponto de referncia. As medies
das coordenadas e das distncias entre as trs dunas foram efetuadas com o auxlio de
um equipamento GPS {Global Position System), modelo Plus Garmin, que avalia
distncias com um erro varivel entre 30 e 120 metros. Para as medies nas dunas da
Joaquina, por se tratar de uma rea livre, portanto, suscetvel de capturar o sinal de
vrios satlites, o erro de medio poder ser inferior a 30 metros.
27
A partir das amostras dos trs lotes foram efetuadas a anlise qumica, a
granulomtrica e a classificao textural dos solos dos trs tipos de dunas. Estas
anlises foram realizadas no Laboratrio de Anlises de Solos Viosa Ltda, Viosa,
MG. Os resultados esto apresentados na tabela 1.
TABELA 1 - Caractersticas qumicas e fsicas de amostras de solo dos trs lotes
de coleta nas dunas.
Caractersticas Ante-Duna Duna Sem-Fixa Duna Fixa
Na (mg/dm^
PH
P (mg/dm)
K (mg/dm^
Ca (m mole/dm^)
Mg (m mole/dm^
Al (m mole/dm^)
H+AI (m mole/dm^
OTO (m mole/dm^)
V(%)
m(%)
M.O. (g/Kg)
2,0
6,1
5.0
4.0
0,0
0,0
0.0
7.6
7.7
1
0
4.0
4.0
6.0
8.0
14.0
0,0
1.0
0,0
8,5
10.1
15
0
8,1
9.0 ^
5,9 L
11,0 ^
20,0 '
0.0
4,0
0.0
7,6
12,1 -
37 ^
0
10,7'
y
Argila (g/Kg)
Siite (g/Kg)
Areia Grossa (g/Kg)
Areia Fina (g/Kg)
Classificao Textural
20
40
890
50
Areia
10
20
;9io
60
areia
30
60 ;
720"
190
areia
aP*, Ca^* e extrados com KC11 N; P e K extrados com extrator bicido (HCI e H2SO4);
m = valor da saturao de alumnio: pHemH2 0 1:2,5; M,0, mtodo de Walktey e Black,
V = volume de saturao de bases
28
3.2 - AVALIAO DA DIVERSIDADE A NVEL DE FAMLIAS E ESPCIES
DOS FMA APS COLETA DE ESPOROS - MTODOS DIRETOS
3.2.1 - COLETA, IDENTIFICAO DAS FAMLIAS E ESPCIES
Em cada duna foram coletadas, em fevereiro de 1997, dez amostras de
aproximadamente 1,5L de solo junto raiz de diversas plantas nativas em dez pontos
definidos aleatoriamente no lote. As amostras de solo de cada lote foram
homogeneizadas e destas, seis subamostras de lOOg foram retiradas para a recuperao,
tipagem, identificao taxonmica e contagem dos esporos dos FMA. Os esporos
foram recuperados, utilizando-se a tcnica modificada de decantamento e peneiramento
mido de GEDERMANN & NICOLSON (1963). Cada amostra de lOOg de solo de
cada lote, foi colocada dentro de um balde com aproximadamente 5L de gua. A
mistura de areia e gua foi agitada vigorosamente com a mo por 10 segundos,
deixando-se decantar pelo mesmo perodo de tempo. Imediatamente aps a decantao,
a suspenso foi vertida sobre duas peneiras sobrepostas com poros de 0.297 mm e de
0.053 mm. Os materiais retidos nas peneiras foram recolhidos em bequeres. Para a
separao dos esporos da matria orgnica utilizou-se a tcnica de centrifiigao em
gradiente de sacarose conforme procedimento de JENKIMS (1964), citado por
SCHENK (1982), com algumas modificaes. A primeira etapa da centrifiigao foi
realizada a 2000g durante 14 minutos, tendo sido subseqentemente descartados os
sobrenadantes e os sedimentos ressuspendidos em uma soluo de sacarose 50%. A
segunda centrifiigao foi feita na mesma velocidade durante 5 minutos. O
sobrenadante foi vertido em peneira com porosidade de 0.053 mm e os esporos lavados
com pisseta com gua destilada de forma a eliminar a sacarose. Sob microscpio
estereoscpio (Nikon, modelo CELM), com aumento de 40 vezes, os esporos foram
coletados com o auxlio de uma pipeta Pasteur e colocados em papel de filtro
umedecido dentro de placas de Petri. Para a identificao dos esporos foram preparadas
lminas diagnstico. Estas lminas foram montadas em PVLG (1.66g de lcool
polivinil, 10 ml de gua, lOml de cido lctico, Iml de glicerina) e reagente de Melzer
29
(lOOg de cloro hidratado, 1.5g de iodo, 5g de iodeto de potssio, lOOml de gua
destilada). Para o preparo das lminas diagnstico foi colocada uma gota de cada meio
de montagem, junto com aproximadamente vinte esporos da espcie a ser identificada.
A lminula foi colocada aps cinco minutos. Este perodo de tempo foi suficiente para
aumentar a viscosidade do meio de montagem em contato com o ar e para posicionar os
esporos no centro de cada gota de modo a evidenciar os caracteres desejveis. Aps a
colocao da lminula, as paredes dos esporos foram quebradas suavemente pela
compresso da lminula. A preparao foi, em seguida, colocada por algumas horas em
uma superfcie plana e as extremidades da lminula foram seladas. A identificao das
espcies foi efetuada de acordo com a classificao proposta por MORTON & BENNY
(1990). As espcies no identificadas foram enviadas em Vouchers para o INVAM
(International Culture Collection of Arbuscular and Vesicular-Arbuscular Mycorrhizal
Fungi) na West Virginia University, Estados Unidos.
3.2.2 - ABUNDANCIAE RIQUEZA
Aps a identificao taxonmica e a contagem das diferentes espcies de FMA
associadas s plantas nativas de dunas nos trs estgios de estabilizao, foi calculada a
mdia do nmero de esporos de cada espcie presente nas seis subamostras, para cada
estgio de estabilizao das dunas. Utilizando-se estes resultados, foram calculadas as
mdias de abundncia para cada duna e feitas vrias anlises referentes s distribuies
das diversas espcies e famlias de FMA em cada um dos estgios de estabilizao das
dimas.
Aps a abundncia, foi calculada a riqueza, isto , o nmero de espcies
presentes em cada amostra de cada tipo de duna. Outro parmetro foi o da abundncia
relativa, que se calculou utilizando a mdia de ocorrncia das espcies, que o
percentual do nmero de indivduos de cada espcie em relao ao total de indivduos.
Entre os ndices de riqueza, alm da riqueza especfica, foi utilizado o ndice de
Margalef Este ndice foi calculado atravs da seguinte frmula:
30
onde 5 - a riqueza ou nmero total de espcies;
N - nmero total de indivduos presentes na amostra;
In - logaritmo natural.
3.2.3 - MODELOS DE ABUNDANCIA
Uma vez conhecidas a riqueza e a abundncia relativa foram obtidas as curvas
do Componente Dominncia da Diversidade. Para tal, a abimdncia relativa das
espcies de FMA de cada duna foi plotada em ordem decrescente em escala logartmica.
As curvas obtidas nestas plotagens foram ajustadas matematicamente a trs modelos de
distribuio da abundncia de acordo com MAGURRAN (1988). Os ajustes foram em
relao srie geomtrica, srie log e ao modelo broken stick. As distribuies da
abundncia das espcies de FMA nas trs dunas no foram ajustados distribuio log
normal, j que, de acordo com MAGURRAN (1998), esta distribuio se aplica a
conjuntos com grande nmero de espcies, o que no acontece com os FMA nas dimas.
3.2.3 - ndices
Com o objetivo de avaliar a diversidade nos trs estgios de estabilizao, foram
utilizados os diversos ndices de diversidade, dominncia e eqitatividade.
No que se refere aos ndices de heterogeneidade, foram utilizados os ndices de
Shannon e de Simpson e, a partir destes ndices de diversidade, calcularam-se os
respectivos ndices de uniformidade ou eqitatividade.
O ndice de Shannon (H) foi calculado atravs da seguinte frmula:
;=1
onde S - a riqueza ou nmero total de espcies;
- nmero de indivduos na i-sima espcie;
Pi = - abundncia relativa da i-sima espcie;
N
O ndice de diversidade de Simpson foi calculado pelas seguintes frmulas:
0 = 1 - ou D' =
J=1
;=1
Para expressar o ndice de Simpson foram utilizadas as duas formas D e D . A
diferena fundamentalmente em nvel de escala, j que D e D' so funes que
dependem da soma dos quadrados dos P/s cujos valores variam respectivamente nos
intervalos de 0 a 1 e de 1 a oo.
onde S - a. riqueza ou nmero total de espcies;
N - nmero total de indivduos;
n, - nmero de indivduos na i-sima espcie;
Pf = - abundncia relativa da i-sima espcie;
32
O ndice de eqitatividade de Simpson E ou E e o ndice de eqitatividade de
Shannon J foram calculados pelas seguintes frmulas:
3.3 - AVALIAO DA DIVERSIDADE ESPECFICA POR MTODOS
INDIRETOS
3.3.1 - RIQUEZA APS CULTURA ARMADILHA
Com o objetivo de avaliar a diversidade especfica nos trs estgios de dunas por
mtodos indiretos, foram estabelecidos dois ciclos de culturas armadilhas. Parte do solo
coletado a campo foi utilizado para o estabelecimento destas culturas, de acordo com o
procedimento de MORTON et al. (1993). O solo de cada tipo de duna foi misturado
com areia grossa, previamente lavada e esterilizada em autoclave durante uma hora, a
121C e 1 atmosfera de presso, numa proporo de 1:1 (v/v), colocado em vasos de
1000 ml e semeado com 40-50 sementes de sorgo {Sorghum bicolor). As sementes
utilizadas foram previamente desinfetadas com hipoclorito de sdio 20% durante 30
minutos. Para cada tipo de duna foram estabelecidas trs culturas armadilhas que
permaneceram na casa-de-vegetao por 4 meses (primeiro ciclo de cultura-armadilha)
com regas peridicas. Aps este perodo, 2 amostras de solo foram retiradas de cada
vaso para recuperao, contagem e identificao taxonmica de FMA a partir dos
esporos. O solo restante foi seco in situ por 2-3 semanas e reutilizado para o
estabelecimento do segundo ciclo de culturas-armadilhas, aps o qual novas contagens
de esporos e identificao de espcies foram realizadas.
Os resultados da identificao e das contagens dos esporos de FMA de cada
espcie em cada ciclo de cultura-armadilha foram somados aos dados obtidos por coleta
direta de esporos. Com estes valores foi obtida a riqueza especfica MORTON (1995).
3.3.2 - ABUNDANCIA AVALIADA POR MEIO DE BIOENSAIO
Antes de estabelecer o bioensaio, sementes de milho previamente desinfetadas
com hipoclorito de sdio 20% durante 60 minutos foram germinadas em substrato de
areia grossa esterilizada. Estas plantas foram, ento, cultivadas dentro de um vaso de
500 ml, contendo areia autoclavada e solo de duna 1:1 (v/v). Para cada tipo de duna,
foram estabelecidas quinze repeties. Aps vinte, trinta e quarenta dias do plantio, em
casa de vegetao, foram coletadas cinco plantas de cada tipo de duna, em cada perodo.
No laboratrio, as razes foram cuidadosamente lavadas e submetidas descolorao e
subseqente colorao pelo mtodo de KOSKE & GEMMA (1989 ). De acordo com
este mtodo, as razes foram colocadas para descolorao dentro de tubos de vidros,
contendo uma soluo de KOH 10% (p/v) e aquecidas em banho-maria a 90C, por
quarenta minutos. Em seguida, o material foi lavado em gua corrente e imerso em
soluo alcalina (H2O2 3% : NH4OH 20%) por 10-30 minutos. Decorrido este tempo, as
amostras foram novamente lavadas em gua corrente e colocadas em soluo HCl 1%
por 5 minutos e coloridas em azul de tripan 0.05%, em soluo de glicerol, sob
aquecimento a 90 C. Aps a colorao, as razes foram armazenadas em vidros
contendo soluo de glicerol e HCl 0,1%, na relao de 1:1 (v/v) .
A percentagem de colonizao do sistema radicular foi determinada pelo mtodo
proposto por GIOVANNETTI & MOSSE (1980), denominado Mtodo de Interseo de
Linhas {Gridline Intersect Method). A presena ou ausncia de estruturas fungicas
(hifas, vesculas, arbsculos e esporos) no crtex da raiz foi anotada, sob
estereomicroscpio (Nikon, modelo CELM), com aumento de 40 vezes. Foram
avaliados 200 pontos de interseo em cada amostra de raiz para a obteno dos valores
mdios de colonizao. Para cada interseo, o nmero de pontos com a presena de
34
qualquer uma das estruturas fungicas mencionadas foi contado como positivo e o
nmero de pontos sem estas estruturas contado como negativo.
Foram comparadas as mdias do nmero de pontos com razes colonizadas de
cada tipo de duna, para os diferentes perodos de tempos de coleta, isto , 20, 30, 40
dias aps plantio. Tambm foram comparadas as mdias dos trs tipos de dunas para
cada plantio. Os dados obtidos foram analisados pela Anlise da Varincia utilizando-
se o teste de Tukey. As anlises estatsticas foram realizadas por meio do programa
estatstico STATGRAPHICS ( Statistical Graphics Corp).
3.4 - DIVERSIDADE GENETICA
3.4.1 - EXTRAO DE DNA
Para a obteno de esporos e a subseqente extrao de DNA, foram utilizadas
amostras de lOOg de solo provenientes da duna semi fixa e da duna fixa e de 500g da
ante-duna. Esta diferena foi devida necessidade de se aproximar o nmero de
esporos entre as amostras (aproximadamente 100). Os esporos para este objetivo foram
recuperados pela tcnica de peneiragem e decantamento mido e posterior
centrifugao em gradiente de sacarose, de acordo com GEDERMANN & NICOLSON
(1963).
A extrao de DNA dos esporos de FMA foi feita, seguindo-se o protocolo de
extrao de ZZ (1994), com modificaes no que se refere velocidade e
temperatura de centrifugao. Os esporos coletados foram lavados em 1 ml de soluo
tampoA(50mMTris/HCl pH 7.5; 3mMEDTA; 50mM MgCb;; 50mMNaCl; 10
mM (3- mercapto etanol) e centrifugados a 12000g por 20 segundos. O sedimento
resultante foi ressuspendido em 200|al da mesma soluo tampo A. Dentro de um
Eppendorf de 1.5 ml, os esporos foram quebrados com um micropistilo e centrifugados
35
a 12000g durante 20 segundos. O sobrenadante e o sedimento foram separados e o
ltimo ressuspendido em 200|al de soluo tampo B (50 mM Tris/ Cl; 25mM EDTA;
2% SDS; 1% N-Lauryl-sarcocinato; Img/ml proteinase K; lOmM P- mercapto etanol;
lOfxg/ml Rnase). Ambos, sedimento e sobrenadante ( para alguns fungos micorrzicos o
sobrenadante pode ser utilizado), foram incubados a 65 C por 30 minutos. Aps a
incubao, foram centrifugados durante 5 minutos a 12000g. Os sedimentos resultantes
foram ressuspendidos em 200|li1 de soluo tampo B (os 2 sobrenadantes foram
conservados) e a eles acrescentado 0.4 vol.5M de acetato de potssio. Aps este ltimo
procedimento, os 4 Eppendorfs foram incubados no gelo durante 15 minutos e logo
depois centrifugados a 12000g por 15 minutos. As protenas foram desnaturadas e
removidas, extraindo subseqentemente os sobrenadantes com 200jxl fenol/clorofrmio
/lcool isoanlico (lAA) (49/49/2) cada vez. Aos sobrenadantes resultantes foram
acrescentados 1/10 vol. de acetato de sdio 3M e 2 volumes de etanol frio e, ento,
armazenados no freezer a -20 C ,pelo menos, por duas horas ( ou mais ). Aps este
tempo, foram centrifugados a 12000g por 10 minutos. Os sobrenadantes foram
descartados e o sedimento secado numa estufa a vcuo durante alguns minutos. Nos
casos em que no ficaram totalmente secos, foi dado um pulso na centrfuga e extrado
cuidadosamente o lquido com ajuda de uma micropipeta e levado novamente estufa a
vcuo. Uma vez seco, o sedimento foi ressuspendido em 20jiil de soluo tampo TE (
Tris-HCL, pH 8.0 lOmM; EDTA, pH 8.0 ImM).
3.4.2 - PREPARAO GEL DE ELETROFORESE DE DNA
Antes de proceder com o PCR, foi estimada a quantidade do DNA total, pela
comparao com um padro de DNA de quantidade conhecida, o que foi realizado por
meio de eletroforese em gel de agarose 0.8%. Na preparao do gel, 0.8 gramas de
agarose foram dissolvidos em lOOml de soluo tampo TEB (Trizma base 0.89 M,
cido brico 0.89M e EDTA 20 mM) 0.5X. A mistura foi levada em fomo de
microondas por 2 minutos para dissolver a agorose at ser obtida uma soluo clara,
transparente. Aps esfriamento, foi adicionado mistura 2|il de brometo de etdeo
36
(concentrao; lOmg/ml) depois vertida numa placa de acrlico de 12.5 x 12.5 cm, na
qual foi posicionada previamente com o auxlio de garras imi pente de 15 dentes. A
posio do pente ficou a 3.0 mm acima da base da placa. Aps o gel solidificar
temperatura ambiente, o pente foi cuidadosamente removido. Em seguida, transferiu-se
o gel para uma cuba horizontal, na qual foi submerso em soluo tampo TEB 0.5X.
Trs microlitros da preparao de DNA foram misturados a 3)^1 de soluo tampo,
contendo 0,25% de azul de bromofenol e 60 % de glicerol. em TEB IX. Esta mistura
foi aplicada no gel. A corrida eletrofortica foi de aproximadamente duas horas a 60
vohs (SAMBROOK, FRITSCCH & MANIATIS, 1989). O DNA do fago , clivado
com as enzimas de restrio Eco RI e Hind III, foi utilizado como padro de tamanho
de bandas. Terminada a eletroforese, o gel foi visualizado em transluminador de luz
UV e fotografado com cmara polaroid MP-4, utilizando-se filme polaroid 667.
3.4.3 - PURIFICAO DO DNA
Devido s dificuldades na amplificao do DNA (PCR), foi necessrio proceder
purificao do DNA, obtido dos esporos de FMA. Para este procedimento, foi
utilizado um produto da GIBCO BRL, Glass MAX. Este sistema consta de uma
matriz de shca, uma soluo tampo de ligao e uma soluo tampo de lavagem. A
purificao realizada em trs passos: ligao, lavagem e eluio. O princpio de ao
deste produto baseia-se na formao de um complexo DNA-slica, o que acontece na
presena do lodeto de sdio. Este complexo sedimentado por meio da centrifiigao,
deixando as impurezas na soluo, as quais so removidas com o sobrenadante. As
impurezas residuais e o lodeto de sdio so removidos pela lavagem do complexo
DNA-slica com a soluo tampo de lavagem. O DNA purificado, ento, eludo com
soluo tampo TE. O DNA recuperado pode, ento, ser utilizado para
seqenciamento, PCR, ou clonagem.
37
3.4.4 - METODOLOGIA UTILIZADA PARA A AVALIAO DO
POLIMORFISMO DE rDNA POR PCR-FRLP
A regio do DNA, que foi amplificada, corresponde regio espaadora ITS do
RNA ribossmico. Os pares de primers, utilizados para a amplificao desta regio,
foram o I TSl e ITS4. (FIG. 1).
Para as reaes de amplificao, foi preparada uma mistura de reagentes
suficientes para 6 reaes de PCR de acordo com WHITE (1990) e GOOSEN (1993).
Esta mistura contm 30(xl (= 300 pmol) do primer ITSl, 30|o,l (= 300 pmol) do primer
ITS4, 63|li1 0.1 mM dNTP mix (contendo 0.1 mM de cada dATP, dCTP, dGTP e
dTTP), 63|li1 MgCb (contendo 15.0 mM), 380|al gua milli Q, 2\x\ de DNA e 2\y\ de
Taq DNA polimerase (10 unidades).
Desta mistura, foram transferidos 90 m-1 para cada tubo e colocados num
termociclador Programammable Thermal Controller-100, programado para 27 ciclos,
sendo que cada ciclo consistiu de uma etapa de desnaturao de 30 segundos a 95*^C,
uma etapa de pareamento de 30 segundos a 52 e uma de alongamento a 72 C por 1.5
minutos. No primeiro ciclo, a etapa de desnaturao a 95 C foi realizada por 3
minutos. Aps o ltimo ciclo, uma etapa de 10 minutos a 72 C promoveu a elongao
final, e a temperatura foi, ento, reduzida para 4 C e ai foi mantida at a retirada das
amostras. Aps concluir o PCR, amostras de DNA foram analisadas em gel de agarose
1.5%.
A precipitao do DNA foi realizada com 50 nl da reao do PCR qual foi
acrescentada lOOmM de cloreto de sdio (NaCl) e 2.5 volumes de etanol gelado (125
|nl). A amostra foi conservada a -20 C por 48 horas, aps esse tempo foi centrifugada
a 12000 g durante 30 minutos. O sobrenadante resultante foi descartado, e o sedimento
secado em estufa e ressuspendido em 10j.il de gua. Destes 10 jxl, 3^1 foram utilizados
para testar o DNA no gel de agarose 1.5% e aos l\ restantes foi adicionado 1^1 de
tampo de clivagem, 5 unidades da enzima de restrio Hin I e l|al de gua. Os
fragmentos de DNA foram, ento, analisados em gel de agarose 2.0%. O tamanho dos
fragmentos foram comparados com o marcador de tamanho pUC 18, clivado pelas
enzimas de restrio Rsa I e Hinfl.
38
G S rP NA IG S
/
S
S 4
Figura 1 - Esquema do DNA ribossmico. Os retngulos representam as seqncias que
codificam para as subunidades 18S, 25S, 5.8S e 5S do RNA ribossmico. As
linhas na parte superior do esquema representam as seqncias intergnicas
no transcritas IGS e, na parte inferior, as seqncias internas espaadoras
transcritas ITS. Os stios de anelamento dos prmers ITS1 e ITS4 so delineados
com setas ao lado das seqncias codificadoras.
39
4 - RESULTADOS E DISCUSSO
4.1 - AVALIAO DA DIVERSIDADE A NVEL DE FAMLIAS E DE ESPCIES
APS COLETA DIRETA DE ESPOROS
4.1.1 - COLETA, IDENTIFICAO DAS FAMLIAS E DAS ESPCIES
As famlias e espcies de FMA identificadas nos trs estgios de estabilizao
das dunas so apresentadas na TABELA 2. De um total de treze espcies, apenas
Gigaspora albida, Scutellospora pellucida e Acaulospora sp. 2 foram observadas em
todos os estgios das dunas.
Algumas espcies de FMA foram observadas em um nico estgio de
estabilizao. A. gerdermann e S. weresubiae ocorreram unicamente na ante-duna,
enquanto que A. scrobiculata s ocorreu na duna semi-fixa. J Glomus aggregatum,
G. occulum, Glomus (1) e Glomus sp (2) foram recuperados apenas da duna fixa.
Dentre os fungos recuperados, trs espcies no foram identificadas.
Acaulospora sp.2 poder corresponder a uma nova espcie e foi anteriormente
recuperada da duna semi-fixa por STRMER & BELLEI (1994). As espcies de
Glomus 1 e 2 no foram ainda identificadas.
Espcies de todas as famlias de FMA foram recuperadas das dimas, porm nem
todos os representantes ocorreram nos trs estgios de estabilizao. Membros da
famlia Glomaceae no foram recuperados da ante-dima.
40
TABELA 2 - Famlias e espcies de fungos micorrzicos arbusculares (FMA), recuperados
nos trs estgios de estabilizao das dunas.
Famlias e espcies de Fi\/IA AD SF DF
Acaulosporaceae
Acaulospora appendicula Sclienck, Spain & Sieverding
Acaulospora gerdemannii Schenck & Nicoison
Acaulospora sp2 (*)
Acaulospora scrobiculata Trappe
Cigasporaceae
Gigaspora albida Sclnenck & Smith
Scutellospora coralloidea Walker & Sanders
Scutellospora pellucida Nicoison & Schenck
Scutellospora weresubiae Koske & Walker
Glomaceae
Glomus aggregatum Schenck & Smith
Glomus constrictum Trappe
Glomus occultum Walker & Koske
Glomus sp1 (**)
Glomus sp2 (**)
X
X
X
X
X
X
X
X
X
X
X
X
X
X
X
X
AD - Ante-Duna; SF - Duna Semi-Fixa; DF - Duna Fixa
(*) - possvel espcie nova
(**) - espcies no identificadas
Na famlia Glomaceae, foram identificadas cinco espcies, o que correspondeu
ao maior nmero de espcies, quando comparado com Gigasporaceae e
Acaulosporaceae, que perfizeram apenas quatro espcies em cada famlia.
A comimidade de FMA na Praia da Joaquina, quando comparada com aquela
das dimas da Costa Atlntica, na Amrica do Norte, principalmente na ante-duna e na
duna semi-fixa, apresentaram semelhanas, como indicado por STRMER & BELLEl
(1994). Na costa Atlntica, Gigaspora spp. e Scutellospora spp predominaram, assim
como Acaulospora scrobiculata (KOSKE, 1987). Por outro lado, a comunidade da
Praia da Joaquina, quando comparada com outras dunas insulares, como as das ilhas do
Hawai (KOSKE, 1988) e as das ilhas Kauai (KOSKE & GEMMA,1996), apresentou
diferenas marcantes. Nestas ilhas, os FMA, recuperados das dunas, foram
predominantemente Scutellospora hawaiiensis e diversas espcies de Glomus no
identificados.
41
A abundncia mdia de esporos de cada espcie de FMA nas amostras coletadas
nos trs estgios de estabilizao apresentada na TABELA 3. Nesta tabela
apresentada tambm a abundncia mdia total (N) de esporos de cada espcie.
Comparando as abundncias mdias, foi verificado que ocorreu um aumento com o
estgio, sendo o valor mdio de 20,5, 169,5 e 215,2 esporos em cada lOOg de solo da
ante-duna, da duna semi-fixa e da fixa respectivamente.
No que se refere riqueza especfica dos FMA, foi observado que este valor
tambm aumentou com o nvel de estabilizao, sendo, entretanto, pequena a variao
entre cada nvel. Os resultados de abundncia e de riqueza especfica so consistentes
com aqueles obtidos por KOSKE (1975) nas dunas na Austrlia, onde foi observado que
a abundncia de esporos de FMA e a riqueza especfica aumentavam com a idade e a
estabilizao das dunas. Paralelamente sobre as dunas de Rhode Island, nos Estados
Unidos, KOSKE & HALVARSON (1981) concluram que a abundncia e a riqueza de
esporos aumentou com a cobertura vegetal, caracterstica que est relacionada com o
grau de estabilidade das dunas.
O ndice de Margalef, que tambm avalia a riqueza, evidenciou a ocorrncia de
uma maior diversidade na ante-duna. Este ndice combina conjuntamente a riqueza e a
abundncia, tendo, portanto, detectado um nmero proporcionalmente elevado de
espcies na comunidade da ante-duna, quando comparado aos outros estgios. A duna
semi-fixa apresentou, de acordo com este ndice, a menor diversidade.
A abundncia relativa das diferentes famlias de FMA se modificou medida
que aumentou a estabilizao (FIGURA 2). Na ante-duna, as espcies de
Gigasporaceae representaram 78% do total das espcies identificadas. Dentro desta
famlia, 47% dos esporos pertenceram a espcies de Scutellospora. J na duna semi-
fixa foram observados membros das trs famlias, sendo que Acaulosporaceae foi
dominante com 54% do total dos esporos recuperados. A famlia Gigasporaceae foi
representada com 38%, e, finalmente, as Glomaceae com 8 % do total de esporos.
Acaulospora scrobiculata dominou em relao a outras espcies com 48% de esporos
recuperados. Na duna fixa, a famlia das Glomaceae predominou com 83% do total de
4.1.2 - ABUNDANCIA E RIQUEZA
42
esporos. Dentre as restantes, Acaulosporaceae e Gigasporaceae contriburam com 11%
e 6% das espcies, respectivamente. Em conseqncia destas predominncias,
verificou-se que as espcies com esporos de maior volume predominaram na ante-duna
e que espcies com esporos cada vez menores foram detectados medida em que
aumentou a estabilizao.
TABELA 3 - Abundncia e riqueza das espcies em cada famlia de fungos micorrzicos
arbuscuiares (FMA), associados s plantas nos trs estgios de estabilizao
das dunas.
Famlias e espcies de FM^ Abundnda mdia (***)
fiD SF DF
Acaulosporaceae
Acaulospora appencScula Schenck, Spain & Siewerding 8,2 6,8
Acaulosfxxa gerdemami Schenck &Ncolscn 3,0
Acaulospora sp2 (*) 1,5 2,2 16,3
Acaulospora scrobcuata Ttc^ppe 81,2
Ggasporaceae
Gga^xra altda Schenck & Snlth 6,3 50,7 10,5
Scutellospora coralloidea \Nsiker & Sanders 2,8 4,7
ScutellO!^a pdiudda Ncdson & Schenck 3,3 8,5
1,8
Scutellospoia v\ e f BS J bi ae Koske & V\^ker 3,5
Gomaceae
Q^omus aggregaum Schenck & Smth 8,5
Qofws constnctum Ti^jpe 14,2 10,2
Qomus occultmt V\lker & Koske 14,5
Q o m u s ^ (**) 49,0
aomussp2 (**) 97,5
Abundnaamda total (N) 20,4 169,7 215,1
Riqueza especfica (S) 6 7 9
indcedeMargalef (Mg) 1,64 1,16 1,48
AD - Ante-Duna; SF - Duna Semi-Fixa; DF - Duna Fixa
{***) - nmero mdio de esporos de cada espcie de FMA {mdia de seis subamostras)
100%
80%
60%
40%
20%
0%
78%
84%
8% 11 o/o
Ante-duna Semi-fixa Duna nixa
Acaulosporaceae Gigasporacea Glomaceae
FIGURA 2 - Abundncia relativa das famlias de fungos micorrzicos arbusculares (FMA) nos trs estgios de estabilizao das dunas.
44
Os valores da abundncia mdia e da abundncia relativa para as espcies
recuperadas nos diferente estgios de estabilizao das dunas so apresentados na
TABELA 4. Estes valores foram ordenados em seqncia decrescente para facilitar a
plotagem para a obteno das Curvas Componentes Dominncia da Diversidade. Estes
valores plotados para cada espcie, por ordem decrescente, permitiram a obteno de
uma curva para cada estgio de estabilizao (FIGURA 3). As probabilidades das
diferentes curvas se ajustarem a trs dos quatro modelos de distribuio de abundncia
esto apresentados na TABELA 5, e os clculos dos ajustes matemticos para os
diferentes modelos apresentam-se no ANEXO 3.
Na ante-duna, a distribuio da abundncia das espcies se ajustou a dois
modelos, broken stick e srie geomtrica. Estas distribuies foram confirmadas pelo
teste obtendo-se uma probabilidade entre 95% a 98% para que as curvas se
ajustassem ao modelo broken stick e 50% para a srie geomtrica. A curva
correspondente duna semi-fixa foi ajustada ao modelo log, dentro de uma
probabilidade entre 80% a 90%, e tambm ao modelo broken stick, numa probabilidade
entre 50% e 70%. Por ltimo, a curva correspondente duna fixa se ajustou ao modelo
broken stick e a srie log com probabilidades entre 50% a 70% e 20% a 30%,
respectivamente.
Embora dentro de nveis diferentes o modelo broken stick foi aquele que mais se
ajustou aos trs estgios. De acordo com ODUM (1985), este modelo exibido por
comunidades controladas por intensa competio interespecfica. Neste caso, a
estrutura das comunidades, tanto na ante-duna quanto na duna fixa, onde o modelo se
ajustou preferencialmente, estariam provavelmente controladas por interaes
competitivas a nvel de espcie. Embora a ante-duna seja o estgio que apresenta as
condies mais restritivas para a maioria dos seres vivos no que se refere a salinidade,
seca, ventos, baixas concentraes de nutrientes e altas temperaturas, entre outros, a
estrutura da comunidade presente se ajustou curva com pendente mais suave e com a
maior probabilidade de ajuste ao modelo, refletindo uma distribuio mais uniforme das
espcies e uma diviso mais eqitativa dos recursos. Estes resultados contradizem
WHITTAKER (1965, 1970, 1972), citado por MAGURRAN (1988), que sugeriu, aps
4.1.3 - MODELOS DE ABUNDANCIA
45
estudos a campo com comunidades vegetais, que os ecossistemas com baixo nmero de
espcies ou, ento, nos primeiros estgios de sucesso, se ajustam preferencialmente ao
modelo da srie geomtrica. Quando a sucesso evolui, ou as condies melhoram, os
estgios mais avanados tendem a se ajustar a modelos das sries log.
Dentre as trs dunas, a semi-fixa apresentou a curva com pendente mais
ngreme e com a maior probabilidade de ajuste ao modelo da srie log. Estes resultados
sugerem uma menor adaptao da comunidade de FMA s condies restritivas
presentes na duna semi-fixa do que as outras comunidades, mostrando assim a
predominncia de uma ou duas espcies que, neste caso, foram Acaulospora
scrobiculata e Gigaspora albida. Anteriormente, esta rea de duna semi-fixa foi
estudada por STRMER & BELLEl (1994), que concluram que a distribuio das
espcies foi adaptada ao modelo broken stick. Cabe ressaltar, porm, que este resultado
se baseou na observao da curva da abundncia relativa das espcies durante as quatro
estaes do ano, e que no foram efetuados os ajustes matemticos aos diferentes
modelos. provvel que, neste caso, uma tentativa de ajuste matemtico a outros
modelos tivesse identificado a srie log como o modelo mais adequado devido
predominncia de Acaulospora scrobiculata. Esta espcie representou 50.9% do total
de esporos recuperados.
Nas dunas da costa Atlntica, KOSKE (1987) verificou que as comunidades de
diversas regies submetidas a um gradiente latitudinal de temperatura estavam
distribudas em curvas com pendentes mais ngremes, quando submetidas s
temperaturas mais baixas. Nestas regies imia ou poucas espcies dominavam
consumindo a maioria dos recursos disponveis. Sugeriu tambm que estas
comunidades, submetidas a baixas temperaturas, se comportavam de forma idntica
quelas de ambientes sujeitos a estresses intensos e contnuos tal como na duna semi-
fixa.
46
TABELA 4 - Abundncia mdia e abundncia relativa^ em ordem decrescente de
ocorrncia, das espcies de fungos micorrzicos arbuscuiares (FMA) nos
trs estgios de estabilizao das dunas.
ANTE-DUNA
Espcies de FMA Abundncia mdia Abundncia relativa {%)
1 Gigaspora albida 6.3 31
2 Scutellospora weresubiae 3,5 17
3 Scutellospora pellucida 3,3 16
4 Acaulospora gerdemannii 3,0 15
5 Scutellospora coralloidea 2 , 8 14
6 Acaulospora sp2 1,5 7
Total da abundncia mdia 20,5
II DUNA SEMI-FIXA
Espcies de FMA Abundncia mdia Abundncia relativa (%)
1 Acaulospora scrobiculata 81,2 48
2 Gigaspora albida 50,7 30
3 Glomus constrctum 14,2 8
5 Acaulospora ap 8 . 2 5
6 Scutellospora coralloidea 4,7 3
7 Acaulospora sp2 2 . 2 1
III DUNA FIXA
Espcies de FMA Abundncia mdia Abundncia relativa (%)
1 Glomus sp2 97,5 45
2 Glomus sp1 49,0 23
3 Acaulospora sp2 16,3 8
4 Glomus ocultum 14,5 7
5 Gigaspora albida 10,5 5
6 Glomus constnctum 1 0 , 2 5
7 Glomus agregatum 8,5 4
8 Acaulospora appendicula 6 .8 3
') Nmero mdio de esporos das diferentes espcies de FMA (mdia de seis subamostras).
) Percentual de esporos da espcie dentro da amostra.
47
Afite-uuna uuna Semi-fba A uuna f ba
FIGURA 3 - Curva do Componente Dominncia da Diversidade das espcies de fungos
micorrzicos arbusculares (FMA) nos trs estgios de estabilizao das dunas.
TABELA 5 - Probabilidade de ajuste das Curvas do Componente Dominncia da Diversidade
obtidas para os trs estgios de estabilizao das dunas (Figura 3) aos modelos
clssicos de distribuio da abundncia.
Ante-Duna Semi-Fixa Duna Fixa
Srie Geomtrica P = 0,50 0, 05<P<0, 10 0,001 < P < 0,01
Srie log 0, 05< P <0,1 0,80 < P < 0,90 0,20 < P < 0,30
Broken stick 0,95 < P < 0,98 0,50 < P < 0,70 0,50 < P < 0,70
48
A ltima etapa na avaliao da diversidade das espcies e das famlias de FMA,
por mtodos diretos, consistiu nos clculos dos ndices de heterogeneidade, relativos aos
trs estgios de estabilizao de dunas. Os valores destes ndices so apresentados na
TABELA 6. Os ndices de Simpson e de Shannon, assim como seus respectivos ndices
de uniformidade ou eqitatividade e o ndice de dominncia de Simpson corroboraram
os resultados apresentados anteriormente, os quais apontaram a maior diversidade para
a comimidade de FMA na ante-duna.
A respeito das dunas da costa Atlntica, KOSKE (1987) observou que tanto as
regies, quanto as plantas, submetidas s condies mais restritivas, apresentavam o
maior ndice de dominncia Berger-Parker, e tambm as curvas de distribuio
apresentaram pendentes mais ngremes, de forma similar ao obtido para a duna semi-
fixa.
Os valores dos diferentes ndices calculados foram consistentes na identificao
da ante-duna como o estgio de maior diversidade. Os resultados obtidos evidenciam a
importncia de se avaliar a diversidade, atravs de mtodos que envolvam estatsticas de
riqueza, curvas de abundncia e ndices de diversidade.
4.1.4 - ndices
Tabela 6 - A diversidade dos trs estgios de estabilizao calculada atravs dos
diversos ndices de heterogeneidade .
ndices de heterogeneidade
ndice de dominncia de Simpson C 0 , 2 0 0,33 0,27
ndice de diversidade de Simpson D 0,80 0,67 0,73
D' 5,08 3,02 3,64
ndice de eqitatividade de Simpson E 0,96 0,78 0.82
E 0,85 0,43 0,40
ndice de diversidade de Shannon H 1,71 1,37 1,64
ndice de eqitatividade de Shannon J 0,95 0,70 0,75
49
4.2 - AVALIAO DA DIVERSIDADE ESPECFICA POR MEIO DE MTODOS
INDIRETOS
4.2.1 - DIVERSIDADE APOS CULTURAS ARMADILHAS
A diversidade especfica avaliada, aps estabelecimento e avaliao de esporos,
recuperados em culturas armadilhas correspondentes aos trs estgios, apresentada nas
TABELAS 7 , 8 e 9.
Na ante-duna (TABELA 7), ocorreu um aumento da riqueza, aps o segundo
ciclo de cultura armadilha. A. appendiculata e G. occultum no foram detectados na
coleta direta de esporos a campo, tendo, portanto, a riqueza total aumentado de 6 para 8
espcies. J na duna semi-fixa (TABELA 8), trs novas espcies, S. scutata, S.
hawaiensis e G. etunicatum foram recuperadas no primeiro ciclo da cultura armadilha.
Neste estgio, a riqueza teve o maior aimiento, com 7 e 10 espcies recuperadas entre a
coleta direta e a cultura armadilha, respectivamente. No caso da duna fixa (TABELA 9),
no houve aumento, quando se combinaram os dois ciclos de cultura armadilha com a
coleta direta. No entanto, devido predominncia, neste estgio, de Glomaceae, que
freqentemente produzem esporos de pequenas dimenses, de complexa caracterizao
taxonmica e intensamente hiperparasitados, pode ter ocorrido uma subestimativa das
espcies de Glomus recuperadas.
A avaliao da diversidade dos FMA por mtodos indiretos - culturas armadilhas
- propiciou um acrscimo de trs espcies s treze identificadas por meio da coleta
direta de esporos. Foram identificadas, assim, dezesseis espcies nos diferentes estgios
aps combinao dos resultados das avaliaes direta e indireta.
Os resultados da variao da riqueza acumulada nos trs estgios, com a
utilizao dos diversos mtodos combinados, esto apresentados na FIGURA 4. A
variao da riqueza acumulada na duna semi-fixa correspondeu quela obtida em dunas
por MORTON (1995) no experimento em que combinou quatro ecossistemas e mtodos
combinados de avaliao. Este pesquisador, no entanto, no indicou o estgio da duna
onde a avaliao foi efetuada, sendo, portanto, impossvel o estabelecimento de
qualquer comparao com os resultados obtidos em ambos os trabalhos.
50
TABELA 7 - Famlias e espcies de fungos micorrzicos arbuscuiares (FMA),
identificadas na ante-duna por meio da coleta direta de esporos e de dois
ciclos de cultura armadilha.
Famlias e espcies de FMA Coleta
Direta
Cultura
Armadilha
1 Ciclo
Cultura
Armadilha
2 Ciclo
Acaulosporaceae
Acaulospora appendicula Schenck, Spain & Sieverding X
Acaulospora gerdemannii Schenck & Nicoison X
Acaulospora sp 2 (*) X
Gigasporaceae
Gigaspora albida Schenck & Smith X X
X
Scutellospora coralloidea Walker & Sanders X X
Scutellospora pellucida Nicoison & Schenck X X
Scutellospora hawaiensis Koske & Gemma
Scutellospora scutata Walker & Diederichs
Scutellospora weresubiae Koske & Walker X X X
Glomaceae
Glomus constrctum Trappe
Glomus etunicatum Becker & Gerdemann
Glomus occultum Walker & Koske X
Glomus sp1 (**)
Glomus sp2 (**)
Total de espcies 6 4 4
Riqueza Acumulada 6 6 8
51
TABELA 8 - Famlias e espcies de fungos micxarrzicxis arbusculares (FMA), identificadas
na duna semi-fixa por meio da coleta direta de esporos e de dois ciclos de
cultura armadilha.
Famlias e espcies de FMA Coleta
Direta
Cultura
Armadilha
1 Ciclo
Cultura
Armadilha
2 Ciclo
Acaulosporaceae
Acaulospora gerdemannii Schenck & Nicolson
Acaulospora scrobiculata Trappe X
Gigasporaceae
Gigaspora albida Schenck & Smith X X X
Scutellospora coralloidea Walker & Sanders X
Scutellospora pellucida Nicolson & Schenck X
Scutellospora hawaiensis+A18 Koske & Gemma X
Scutellospora scutata Walker & Diederichs X
Glomaceae
Glomus constrictum Trappe X
Glomus etunicatum Becker & Gerdemann X
Glomus occultum Walker & Koske
Glomus sp1 (**)
Glomus sp2 {**)
Riqueza Acumulada 7
1 0 10
(**) _ espcies no identificadas
52
TABELA 9 - Famlias e espcies de fungos micorrzicos arbusculares (FMA), identificadas
na duna fixa atravs da coleta direta de esporos e de dois ciclos de cultura
armadilha.
Fam lias e espcies de FMA Coleta
Direta
Cultura
Armadilha
1 Ciclo
Cultura
Armadilha
2 Ciclo
Acaulosporaceae
Acaulospora gerdemannii Schenck & Nicoison
Gigasporaceae
Gigaspora albida Schenck & Smith X X
Scutellospora coralloidea Walker & Sanders
Scutellospora pellucida Nicoison & Schenck X
Scutellospora hawaiensis Koske & Gemma
Scutellospora scutata Walker & Diederichs
Glomaceae
Glomus aggregatum Schenck & Smith X
Glomus constrictum Trappe X
Glomus etunicatum Becker & Gerdemann
Glomus occultum Walker & Koske X
Glomus sp1 (**) X X X
Glomus sp2 (**) X X
X
Riqueza Acumulada 9 9 9
53
1 2
Nmero de Mtodos
Ante-Duna d Duna Serri-Rxa Duna Rxa
FIGURA 4 - Riqueza especfica nos trs estgios de estabilizao, ante-duna, duna senni-fixa
e duna fixa, calculada aps utilizao de mtodos combinados. 1 - Coleta
direta, 2 - Coleta direta e primeiro ciclo de cultura armadilha, 3 - Coleta direta,
primeiro ciclo de cultura armadilha e segundo ciclo de cultura armadilha.
54
4.2.2 - ABUNDANCIA AVALIADA POR MEIO DE BIOENSAIO
Os resultados dos bioensaios nos diferentes estgios, obtidos ao final de 20, 30 e
40 dias aps plantio, so apresentados na FIGURA 5. Os valores da porcentagem de
colonizao correspondem mdia percentual das razes colonizadas por FMA, nos
diferentes perodos e nos diferentes estgios. Foi observado que, tanto aos 20, quanto
aos 30 dias, os propgulos de FMA presentes no solo da ante-duna produziram a maior
porcentagem de razes colonizadas. Estes valores correspondem ao potencial de inculo
de uma populao de esporos na ante-duna dez vezes menor do que na duna fxa. No
entanto, aos 40 dias, a maior porcentagem de colonizao radicular foi observada na
duna fxa.
35
30
o
KO
0
1 25
O
1 20
D)
(0
0>
Q.
10
V
'.. *
20 30
Dias aps plantio
40
I Ante-Duna Duna Seri-Fixa Duna Fixa
FIGURA 5 - Porcentagem de colonizao radicular em razes de milho aos 20, 30 e 40 dias
aps plantio.
55
TABELA 10 - Anlise da Varincia por meio do teste Tukey para as mdias de colonizao
radicular em cada estgio de estabilizao, considerando os 20, 30 e 40 dias
aps plantio.
Ante-Duna
Dias Contagens Mdia HG Contrastes Diferena (+/-) Limites
2 0 15 8,13 X 20D - 30D
*
-9,53 4,04
30 15 17,67 X 20D- 40D
-20,53 4,04
40 15 28,67 X 30D - 40D
*
-1 1 , 0 0 4,04
Duna Semi-Fixa
2 0 15 6,53 X 20D - 30D -8,53 9,74
30 15 15,07 X 20D - 40D
*
-52,33 9,74
40 15 58,87 X 30D- 40D
*
-43,80 9,74
Duna Fixa
2 0 15 5,87 X 20D - 30D
*
-7,40 6 , 1 2
30 15 13,27 X 20D- 40D
*
-62,67 6 , 1 2
40 15 68,53 X 30D- 40D
*
-55,27 6 , 1 2
* - Assinala diferenas estatisticamente significativas
HG - Homogeneidade entre os grupos
Para se avaliarem diferenas significativas entre as mdias de colonizao
radicular, foi feita a anlise de varincia e utilizado o Teste de Tukey. Quando foram
analisadas as mdias de colonizao radicular para a ante-duna aos 20, 30 e 40 dias,
foram observadas diferenas significativas a um nvel de confiana de 95% entre as
mdias correspondentes aos diferentes dias aps plantio. J na duna semi-fixa, no
houve diferenas significativas a um nvel de confiana de 95% entre as mdias de
colonizao radicular aos 20 e aos 30 dias. No entanto, foram detectadas diferenas
significativas entre as mdias correspondentes aos 30 e 40 dias. A duna fixa
apresentou diferenas significativas entre as mdias de colonizao radicular nos trs
perodos de avaliao (TABELA 10).
56
TABELA 11 - Anlise da Varincia por meio do teste Tukey para as mdias de colonizao
radicular ao final de 20, de 30 e de 40 dias em cada estgio de estabilizao.
20 Dias
Ante-Duna 15 8,13 X Ante-Duna - Duna-Fixa
*
1,60 3,33
Semi-Fixa 15 6,53 X Ante-Duna - Semi-Fixa
*
2,27 3,33
Duna Fixa 15 5,87 X Duna Fixa - Semi-Fixa
*
-0,67 3,33
30 Dias
Ante-Duna 15 17,67 X Ante-Duna - Duna-Fixa 2,60 3,41
Semi-Fixa 15 15,07 X X Ante-Duna - Semi-Fixa
4,40 3,41
Duna Fixa 15 13,27 X Duna Fixa - Semi-Fixa -1,80 3,41
40 Dias
Ante-Duna 15 28,67 X Ante-Duna - Duna-Fixa
*
-30,20 11,23
Semi-Fixa 15 58,87 X Ante-Duna - Semi-Fixa
*
-39,87 11,23
Duna Fixa 15 68,53 X Duna Fixa - Semi-Fixa -9,67 11,23
* - Denota diferenas estatisticamente significativas
HG - Homogeneidade entre os grupos
A anlise de varincia das mdias de colonizao radicular, correspondente a
cada perodo entre as diferentes dunas, evidenciou que aos 20 dias no houve diferenas
significativas a um nvel de confiana de 95%, entre as mdias de colonizao radicular
das dunas. Aos 30 dias, foi observada diferena significativa entre as mdias de
colonizao radicular entre a ante-duna e a duna fixa. Por ltimo, aos 40 dias ocorreram
diferenas significativas entre a mdia de colonizao radicular da ante-dima e as
mdias da duna semi-fixa e duna fixa (TABELA 11).
Em dunas no Mxico, CORKIDI et al. (1997a) analisaram, por meio de
bioensaio, o potencial de inculo de solos proveniente dos diferentes estgios de
estabilizao. Concluram que a colonizao aumentou com o estgio e que, durante os
primeiro dias de avaliao, no ocorreram diferenas significativas na colonizao entre
57
os estgios. Estes pesquisadores tambm utilizaram milho como planta armadilha no
bioensaio.
A maior taxa de colonizao dos FMA foi detectada nos solos da ante-duna aos
20 dias aps plantio. A predominncia neste estgio de Gigasporaceae, que inclui
espcies caracterizadas pela produo de esporos de grandes dimenses {Giga- gigante),
com germinao rpida e por mecanismos de germinao mhipla, pode ser responsvel
pelos resultados. Esporos destas espcies dispem de alto vigor e de maior capacidade
de sobrevivncia na ausncia de razes suscetveis (KOSKE, 1987; SANDERS, 1997).
A produo de tubos germinativos mltiplos aumenta tambm a probabilidade do
contato entre o fungo e a raiz no solo e conseqentemente pode conduzir a maior
rapidez na colonizao inicial.
Por outro lado, nas dunas fixas, a taxa de colonizao ocorreu de forma
progressiva, provavelmente devido predominncia de espcies da famlia das
Glomacae. A diferena na taxa de colonizao entre as Gigasporacea e as Glomaceae
foi discutida por alguns pesquisadores. DANIELS (1981) realizou estudos de
infectividade com culturas monoespecficas de Gigaspora rosea e verificou que esse
fungo produziu 250 pontos de entrada em razes de alho-porro, aps duas semanas de
plantio, a partir de cultivos com 50 esporos de G. rosea. J no que se refere s
Glomaceae, STRMER {comunicao pessoal) observou que Glomus etunicatum
produziu uma mdia de 97 pontos de entrada nas razes das plantas armadilhas em
cultura com 100 esporos. Estes exemplos mostraram uma diferena 5 vezes maior no
nmero de pontos de colonizao em cultura do mesmo gnero da espcie predominante
da ante-duna na Joaquina, ou seja, G. albida.
A duna semi-fixa apresentou valores intermedirios no que se refere a
porcentagens de colonizao radicular. Acaulosporaceae, que representam
aproximadamente 54% do total de espcies,dispem de mecanismos de dormncia. No
existe, entretanto, informao se esta dormncia uma caracterstica do gnero ou se
espcie- especfica (GAZEY et al., 1993).
58
4.3 - AVALIAO DA DIVERSIDADE GENETICA
Antes de proceder avaliao da diversidade gentica, foi estimada a quantidade de
DNA total pela comparao com um padro de DNA de quantidade conhecida. O DNA
ntegro, no degradado, correspondente s populaes de esporos de FMA da ante-duna, da
dima semi-fixa e da duna fxa so mostrados na FIGURA 6. O DNA amplifcado,
correspondente regio ITS do rDNA das populaes de FMA, nos trs estgios de
estabilizao das dunas, apresentado na FIGURA 7. Estes resultados mostraram a
presena de diferentes regies ITS e, conseqentemente, diferenas entre as populaes de
FMA em cada duna. Na duna fxa, foram observadas duas bandas, irnia de
aproximadamente 676 pb e outra em tomo de 517 pb. Na duna semi-fxa, tambm foi
observada a banda de aproximadamente 676 pb e foi observada, ainda, uma Segunda, de
aproximadamente 500 pb. Na ante-dima, as duas bandas que foram observadas so
semelhantes s da semi-fixa. No caso das espcies utilizadas como padres, a Gigaspora
albida, espcie comiun nas trs dunas, mostrou uma nica banda de aproximadamente 500
pb. Este valor est de acordo com os observados por Redecker et al. (1997), para a mesma
espcie. Acaulospora scrobiculata, espcie de FMA predominante na duna semi-fixa,
apresentou uma banda de aproximadamente 600pb.
Os tamanhos aproximados dos firagmentos de restrio, gerados pela endonuclease
Hin I, na clivagem da regio ITS do rDNA das populaes de esporos nas diferentes
dunas, observa-se na FIGURA 8. Estes fragmentos mostraram um perfil de banda
caracterstico para as populaes de cada duna. Na ante-duna e na duna semi-fxa,
observaram-se perfs de bandas semelhantes. Na ante-duna, observaram-se
aproximadamente 5 fi-agmentos de diferentes tamanhos; j na duna semi-fxa, observaram-
se aproximadamente 7. O maior fragmento de restrio observado nestas dunas, foi de
aproximadamente 517 pb. As populaes de FMA na duna fixa exibiram o menor nmero
de fragmentos de restrio: foram observados 3 fragmentos, sendo que o maior deles tinha
aproximadamente 241 pb.
Recentemente, Redecker et al. (1997) determinaram padres de restrio para vrias
espcies de FMA, utilizando trs enzimas diferentes, Mbo I - Hin I e Taql. Foram
59
obtidos padres de bandas praticamente idnticos com as trs enzimas para todos as
espcies de Gigaspora testadas ( G.albida, G.rosea, G. candida ). No mesmo trabalho, foi
observado que h uma estreita relao flogentica entre as espcies de Gigaspora e
Scutellospora ao analisar os fragmentos de DNA de restrio, gerados por cada uma das
enzimas utilizadas. Estes padres de restrio no foram observadas com nenhuma das trs
enzimas, uma diferenciao clara entre os fragmentos de DNA, gerados nas espcies de
Gigaspora e Scutellospora analisadas. A nica espcie que mostrou um padro de bandas
diferente, quando tratada com Hin I a Scutellospora pellucida, espcie presente nas trs
dunas. Estes autores sugerem, atravs dos seus resultados, que as divergncias dentro da
seqncia ITS nos Glomus maior que nas Gigasporaceas. No entanto, isto no foi
observado na duna fixa, a qual apresentou o menor polimorfismo, embora a composio da
comunidade de FMA se caracterize pela predominncia de Glomus. importante ressaltar,
porm, que Redeckcer et al. (1997) fizeram estas observaes com espcies de Glomus
diferentes das encontradas na duna fixa.
De acordo com a tcnica de PCR-FRLP do rDNA, o maior polimorfismo foi
observado nas comunidades de FMA na duna semi-fixa, onde as avaliaes por mtodo
direto por meio dos diferentes ndices e dos modelos de abundncia, mostraram a menor
diversidade. Provavelmente, o carter intermedirio da composio das comunidades de
FMA e da vegetao, da posio da duna e da suas caractersticas edficas, assim como a
intensidade nos fatores biticos e abiticos, sinalizaram a necessidade de uma maior
diversidade gentica para a manuteno das espcies de FMA s condies desta duna.
60
FIGURA 6 - Eletroforese em gel de agarose 0.8% do DNA total. 1-DNA total
extrado de esporos de duna fixa. 2-DNA total extrado de esporos de
duna semi-fixa. 3-DNA total extrado de esporos de ante-duna. 4-DNA
total extrado de esporos Gigaspora albida. 5-DNA total extrado de
esporos de Acaulospora scrobiculata. M, marcador de tamanho: DNA
fago lambda clivado com Hin III / Eco R I.
61
FIGURA 7 - Eletroforese em gel de agarose 1.5% de DNA amplificado. As bandas
foram amplificadas utilizando-se os oligonucleotdeos ITS1 e ITS4
respectivamente. M, marcador de DNA plasmidial pUC18 clivado com Rsa
e Hinf 1. 1- esporos de duna fixa; 2 -esporos de duna semi-fixa; 3 -esporos
de ante-duna; 4 -Gigaspora albida; 5 -Acaulospora scrobiculata; 6 -duna
fixa; 7-semi-fixa; 8 -ante-duna; de esporos obtidos em outra poca de
coleta ( Maio 97 ). 9 -Pisolithus tinctorius (testemunha).
62
FIGURA 8 - Eletroforese em gel de agarose 2 % da regio ITS do rDNA de
populaes de fungos endomicorrzicos nos trs estgios de
estabilizao de dunas. A clivagem foi realizada com a enzima de
restrio Hiirri I. M, corresponde ao marcador pUC 18/ RSA-Hirri I. 1-
esporos de duna fixa; 2-esporos de duna semi-fixa; 3-esporos de
ante-duna; 4-Gigaspora albida; 5- Acaulospora scrobiculata;
Esporos de 6 -duna fixa; 7-semi-fixa; 8 -ante-duna em outra poca de
coleta. Q-Pisolithus tinctorius.
63
5 - CONCLUSES
Os resultados obtidos nas avaliaes da diversidade de FMA nos trs estgios de
estabilizao de dunas permitem as seguintes concluses:
1 - Foram identificadas 13 espcies de FMA, nos trs estgios de estabilizao
das dunas, aps coleta direta de esporos. Apenas G. albida, S. pellucida, e Acaulospora
sp 2 estiveram presentes em todos os estgios.
2 - Espcies de todas as famlias de FMA foram recuperadas das dunas, porm
nem todos os representantes das diversas famlias ocorreram nos trs estgios de
estabilizao. Membros da famlia Glomaceae no foram recuperados da ante-duna.
3 - A abundncia mdia das espcies de FMA aumentou com o estgio de
estabilizao, sendo o valor mdio de 20,5,169,5 e 215,2 esporos em cada lOOg de solo
da ante-duna, da duna semi-fxa e da fxa, respectivamente.
4 - A riqueza especifca tambm aumentou com o nvel de estabilizao, sendo,
entretanto, pequena a variao entre cada nvel. O ndice de Margalef, que avalia
tambm a riqueza, evidenciou a ocorrncia de uma maior diversidade na ante-dima.
Este ndice combina conjuntamente riqueza e abundncia, tendo, portanto, detectado
irai nmero proporcionalmente elevado de espcies na comunidade da ante-duna.
5 - A abundncia relativa das diferente famlias de FMA se modifcou medida
que aumentou a estabilizao. Na ante-duna, as espcies da famlia Gigasporaceae
representaram 78% do total das espcies identifcadas. J na duna semi-fxa, foram
observados membros das trs famlias, sendo Acaulosporaceae dominante com 54 % do
total dos esporos recuperados. Na duna fixa, a famlia das Glomaceae predominou com
83 % do total de esporos recuperados.
6 - Os modelos clssicos de distribuio da abundncia para os trs estgios de
estabilizao evidenciaram que a ante-duna se ajustou com maior probabilidade ao
modelo broken stick, da mesma forma que a dima fixa. J a duna semi-fixa se ajustou
preferencialmente ao modelo da srie log.
64
7 - Ao combinar a riqueza e a abundncia relativa nas diferentes expresses
matemticas, que resultam nos diversos ndices, obtiveram-se resultados que
confirmaram maior diversidade para a ante-duna, resultado tambm obtido aps anlise
do ndice de Margalef e dos modelos de distribuio da abundncia. Todos os ndices
de heterogeneidade calculados mostraram que a ante-duna foi o estgio de maior
diversidade em contraposio menor diversidade na duna semi-fixa.
8 - A riqueza especfica nos trs estgios, calculada aps a utilizao de mtodos
combinados, coleta direta de esporos e dois ciclos de culturas armadilhas, teve imi
acrscimo de 3 espcies. Sendo assim, foram identificadas 16 espcies de FMA, nos
trs estgios, quando mtodos diretos e indiretos foram combinados.
9 - 0 bioensaio avaliado no final de 40 dias permitiu concluir que ocorreu um
aumento no potencial de inoculo dos FMA com o estgio de estabilizao.
10 - A avaliao da diversidade gentica, por meio da tcnica de PCR-FRLP do
rDNA nos trs estgios, indicou maior polimorfismo para a comunidade recuperada na
duna semi-fixa, em contraposio com a menor diversidade especfica observada,
quando avaliada com os diferentes ndices e modelos de distribuio da abundncia.
65
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74
ANEXO - 1
FLUXOGRAMA DAS ATIVIDADES DESENVOLVIDAS
75
Locais de Amostragem
ANTE-DUNA
Om
DUNA SEMI-FIXA
40m
DUNA FIXA
650m
4 - 4 -
COLETA DAS AMOSTRAS NOS TR S EST GIOS DE DUNAS
Contagem e identificao
de esporos de FMA
Laboratrio de Micorrizas
MIP-UFSC
Culturas-armadilha
Casa-de-vegatao
MIP- UFSC
Avaliao
diversidade
especfica
4 -
Bioensaio
Casa-de-vegetao
MIP-UFSC
Taxa de colonizao
Lab. Micorrizas
MIP-UFSC
PCR-FRLPdorDNA
Laboratrio de Gentica
de microrganismos
Bioagro - UFV
Avaliao
diversidade
gentica
FIGURA A1 - Fluxograma apresentando os procedimentos realizados para a avaliao da
diversidade especfica e gentica dos fungos micorrzicos arbuscuiares e os
locais onde ocorreram os procedimentos (MIP - Departamento de Microbiologia
e Parasitologia, UFSC - Universidade Federal de Santa Catarina, UFV -
Universidade Federal de Viosa).
76
ANEXO - 2
NUMERO DE ESPOROS DE FMA NOS TRES ESTGIOS DE
ESTABILIZAO DAS DUNAS
77
TABELA A1 - Nmero de esporos na subamostra, abundncia mdia e freqncia das
espcies de fungos micorrzicos arbusculares (FI\/IA) associadas s plantas
nos trs estgios de estabilizao das dunas. Valores obtidos a partir de
seis subamostras de cada lote de coleta.
Espcie A1 A2 A3 A4 A5 A6 mdia F(%)
Ante-Duna
1 Gigaspora albida 2 2 2 1 2 1 0 1 0 6,33 1 0 0
2 Scutellospora weresubiae 0 1 2 7 5 6 3,50 83
3 Scutellospora pellucida 0 2 0 0 9 9 3,33 50
4 Acaulospora gerdemannii 0 2 4 8 2 2 3,00 83
5 Scutellospora coralloidea 0 1 2 3 5 6 2,83 83
6 Acaulospora n2 (*) 0 3 2 0 1 3 1,50 67
Total de esporos 2 11 1 2 30 32 36 20,50
Duna Semi-Fixa
1 Acaulospora scrobiculata 73 89 68 79 87 91 81,17 1 0 0
2 Gigaspora albida 57 44 53 60 46 44 50,67 1 0 0
3 Glomus constrictum 14 21 17 14 1 0 9 14,17 1 0 0
4 Scutellospora pellucida 1 0 1 2 9 7 5 8 8,50 1 0 0
5 Acaulospora appendiculata 9 1 2 4 7 11 6 8,17 1 0 0
6 Scutellospora coralloidea 4 6 4 7 3 4 4,67 1 0 0
7 Acaulospora n2 (*) 5 4 0 0 2 2 2,17 67
Total de esporos 172 188 155 174 164 164 169,50
Duna Fixa
1 Glomus sp1 (**) 93 105 98 96 101 92 97,50 1 0 0
2 Glomus sp2 (**) 43 47 55 44 57 48 49,00 1 0 0
3 Acaulospora n2 (*) 16 24 16 13 15 14 16,33 1 0 0
4 Glomus occultum 15 13 1 2 19 17 11 14,50 1 0 0
5 Gigaspora albida 15 6 5 1 0 1 2 15 10,50 1 0 0
6 Glomus constrictum 1 2 13 9 7 11 9 10,17 1 0 0
7 Glomus aggregatum 13 0 2 0 0 0 18 8,50 50
8 Acaulospora appendicula 5 4 9 1 0 7 6 6,83 1 0 0
9 Scutellospora pellucida 2 5 3 0 0 1 1,83 67
Total de esporos 214 217 227 199 2 2 0 214 215,17
A1, A2, A3, A4, A5 e A6 - subamostras de 100g retiradas das amostras de solo de cada lote.
mdia - abundncia mdia de cada espcie (mdia das seis subamostras).
F (%) - Percentual de freqncia de ocorrncia de cada espcie nas subamostras.
78
ANEXO - 3
CLCULO DOS NDICES
79
TABELA A2 - Valores necessrios para os clculos dos diversos ndices de dominncia,
diversidade e eqitatividade para a ante-duna.
Espcie ni ni (ni-1 )
pi (Pi)^ In (pi) pi In (pi)
1 Gigaspora albida 6,33 33,78 0,31 0,0954 -1,17 -0,36
2 Scutellospora weresubiae 3,50 8,75 0,17 0,0291 -1,77 -0,30
3 Scutellospora pellucida 3,33 7,78 0,16 0,0264 -1,82 -0,30
4 Acaulospora gerdemannii 3,00 6 , 0 0 0,15 0,0214 -1,92 -0.28
5 Scutellospora coralloidea 2,83 5,19 0,14 0,0191 -1,98 -0,27
6 Acaulospora n2 1,50 0,75 0,07 0,0054 -2,61 -0,19
S - Nmero de espcies ou Riqueza = 6 ;
ni - Nmero de indivduos por espcie ou Valor de Importncia de cada espcie = ;
A/ - Nmero total de indivduos na amostra ou Total dos Valores de Importncia =21;
rii
pi - Probabilidade de importncia de cada espcie definida por ;
Clculos dos ndices para a ante-duna
6
ndice de dominncia de Simpson c = = 0,20,
i=i
ndices de diversidade de Simpson D = \ - c = 0,84 D' = = 5,08,
c
D D'
ndice de eqitatividade de Simpson ^~"( / ^ ~ E' = ^ = 0 , S 5 .
6
ndice de diversidade de Shannon H - =1,71.
/ = ^ = 0 , 9 5 .
In5
ndice de eqitatividade de Shannon ou de Uniformidade de Pielou
80
diversidade e eqitatividade para a duna semi-fixa.
pi (Pif
In (pi) pi In (pi)
1 Acaulospora scrobiculata 81,17 6506,86 0,48 0,2293 -0,74 -0,35
3 Glomus constnctum 14,17 186,53 0,08 0,0070 -2,48 -0 , 2 1
4 Scutellospora pellucida 8,50 63,75 0,05 0,0025 -2,99 -0,15
5 Acaulospora ap 8,17 58,53 0,05 0,0023 -3,03 -0,15
6 Scutellospora coralloidea 4,67 17,11 0,03 0,0008 -3,59 -0 , 1 0
7 Acaulospora n2 2,17 2,53 0, 01 0 , 0 0 0 2 -4,36 -0,06
S - Nmero de espcies ou Riqueza = 7;
ni - Nmero de indivduos por espcie ou Valor de Importncia de cada espcie = ;
N - Nmero total de indivduos na amostra ou Total dos Valores de Importncia =170;
pi - Probabilidade de importncia de cada espcie definida por----- ;
N
In - logaritmo natural
Clculos dos ndices para a duna semi-fixa
=i
ndice de diversidade de Simpson D = 1- c = 0,67 D' = = 3,02.
c
D D'
ndice de eqitatividade de Simpson E = ------- - = 0,78 E' = = 0,43.
(1 - Vis') S
/
ndice de diversidade de Shannon H = ~ ' ^ p M { p i ) =1,37.
i=l
J = = 0,70
ln5
ndice de eqitatividade de Sharmon ou de Uniformidade de Pielou
81
diversidade e eqitatividade para a duna fixa.
pi In (pi) pi In (pi)
1 Glomus sp2 97,50 9408,75 0,45 0,2053 -0,79 -0,36
2 Glomus sp1 49,00 2352,00 0,23 0,0519 -1,48 -0,34
3 Acaulospora sp 16,33 250,44 0,08 0,0058 -2,58 -0 , 2 0
4 Glomus ocultum 14,50 195,75 0,07 0,0045 -2,70 -0,18
6 Glomus constrictum 10,17 93,19 0,05 0 , 0 0 2 2 -3,05 -0,14
7 Glomus agregatum 8,50 63,75 0,04 0,0016 -3,23 -0,13
8 Acaulospora appendicula 6,83 39,86 0,03 0 , 0 0 1 0 -3,45 -0 , 1 1
9 Scutellospora pellucida 1,83 1,53 0, 01 0 , 0 0 0 1 -4,77 -0,04
S - Nmero de espcies ou Riqueza = 9;
ni - Nmero de indivduos por espcie ou Valor de Importncia de cada espcie s n . ;
N - Nmero total de indivduos na amostra ou Total dos Valores de Importncia =215;
n,
pi - Probabilidade de importncia de cada espcie definida por
In - logaritmo natural
Clculos dos ndices de diversidade para a duna fixa
9
ndice de diversidade de Simpson D = 1 - c = 0,73 /)' = = 3,64.
c
D D'
ndice de eqitatividade de Simpson E = E' = = 0,40.
9
ndice de diversidade de Shannon H = - ^ A ln(/?, ) = 1,64
i=l
J = =0,75.
In5
ndice de eqitatividade de Shannon ou de Uniformidade de Pielou
82
TABELA A5 - Reclculo dos diversos ndices de diversidade, dominncia e eqitatividade
para a Ante-Duna.
ndices_________________________A1 a A6 A2 a A6 A3 a A6 A4 a A6 Variao Mx
Riqueza S 6 6 6 6 0 %
Abundncia (mdia) N 21 24 28 33 37%
Dominncia de Simpson c 0 , 2 0 0 , 2 0 0 , 2 2 0,23 16%
Diversidade de Simpson D 0,80 0,80 0,78 0,77 5%
D' 5,08 4,95 4,60 4,27 16%
Eqitatividade de Simpson E 0,96 0,96 0,94 0,92 5%
E 0,85 0,82 0,77 0,71 16%
Diversidade de Shannon H 1,71 1,74 1,73 1.72 1 %
Eqitatividade de Shannon J 0,95 0,97 0,96 0,96 1 %
Al a A6 - Valores dos ndices considerando as seis subamostras
A2 a A6 - Valores dos ndices eliminando a primeira subamostra
A3 a A6 - Valores dos ndices eliminando as duas primeiras subamostras
A4 a A6 - Valores dos ndices eliminando as trs primeiras subamostras
Na ante-duna foi observado um comportamento distinto quanto freqncia de
ocorrncia das espcies de FMA (ANEXO 2 ; TABELA Al). As trs primeiras
subamostras nesta duna, apresentaram uma variao acentuada na freqncia quando
comparadas s trs ltimas. Esta variao foi de aproximadamente 300%, indicando a
possibilidade de interferncia metodolgica tal como, a inadequada homogeneizao do
solo coletado previamente extrao das seis subamostras para a contagem dos esporos
de FMA, e tambm algum erro no processamento das amostras.
Para verificar se as oscilao nas contagens de esporos nas diferentes repeties
na ante-duna (TABELA A.1) poderiam ter influenciado os resultados obtidos nos
ndices, os clculos foram refeitos suprimindo-se os dados suspeitos. Para tal, foram
descartados sucessivamente a primeira, as duas primeiras e as trs primeiras repeties.
Os resultados obtidos foram resumidos na TABELA A5, evidenciando-se que no
resultou em mudana expressiva nos ndices.
83
ANEXO - 4
AJUSTE AOS MODELOS DE DISTRffiUIO DA ABUNDNCIA
84
TABELA A6 - Ajuste dos dados ao modelo de distribuio de abundncia das espcies,
Srie geomtrica, para os trs estgios de estabizao das dunas.
Ante Duna observado esperado
X2
1 Gigaspora albida
2 Scutellospora weresubiae
3 Scutellospora pellucida
4 Acaulospora gerdemannii
5 Scutellospora coralloidea
6 Acaulospora n2
Total de esporos
Ga 10,7 12,7
0.33
Sw 6 , 0 8.1 0.54
Sp
6 , 0 5,2 0.14
Ag
4,0 3,3 0.16
Sc 4.7
2,1 3.16
Ac2 1,3 1.3 0 . 0 0
32,7 32,7 Z X2 = 4.33
Probabilidade - P 50,00%
Duna Semi-Fixa observado esperado X2
1 Acaulospora scrobiculata As 81.2 90.1 0 , 8 8
2 Gigaspora albida Ga 50.7 42.8 1,46
3 Glomus constrictum Glc 14.2 20.3 1.85
4 Scutellospora pellucida Sp 8.5 9,6 0.13
5 Acaulospora appendiculata Aa 8 . 2 4,6 2.82
6 Scutellospora coralloidea Sc 4.7 2 , 2 2.87
7 Acaulospora n^2 Ac2 2 , 2 1 . 0 1,25
Total de esporos 169,5 170.5 ZX2 = 11,27
Probabilidade - P 5% < P < 10%
Duna Fixa observado esperado X2
1 Glomus sp2 Ac2 97,5 86.5 1,40
2 Glomus sp1 GI1 49.0 53.7 0,41
3 Acaulospora n2 Asp 16,3 33.4 8,69
4 Glomus occultum Glo 14,5 20.7 1,87
5 Gigaspora albida Ga 10,5 12.9 0.44
6 Glomus constrictum Glc 1 0 , 2 8 . 0 0.59
1 Glomus aggregatum Gla 8,5 5.0 2.52
8 Acaulospora appendicula Aa 6 ,8 3,1 4.56
9 Scutellospora pellucida Sp 1.8 1.9 0 . 0 0
Total de esporos 215,2 225,1 Z X2 = 20.49
Probabilidade - P 0,1% < P < 1%
85
Para a distribuio da srie geomtrica foram utilizados:
n, = NCi^ k(l-ky-^
onde k = proporo do espao do nicho ou recursos disponveis que cada espcie
ocupa
S = ao nmero total de espcies
= ao nmero de indivduos da i-sima espcie
N = s l o nmero total de indivduos
^min ^ nmero de indivduos da espcie menos abundante
s
Ck = [ ^- { ^- kf ] \ constante que garante que ^ n. = N .
i=l
o valor de k estimado resolvendo-se a seguinte equao
"mai _
s
Para a ante duna temos os dados
S = 6
Nmin= 1,333333333
N = 32,66731771
Nmin/N = 0,040815513
Para a estimativa de k resolvemos a equao
1 - ( i - k Y
usando o mtodo iterativo
8 6
k erro
0,25 0,031355559
0,5 -0,024942497
0,375 -0,00278599
0,3125 0,012847922
0,34375 0,004656365
0,359375 0,000840244
0,3671875 -0,000996844
0,36328125 -8,41343E-05
0,36132813 0,000376569
0,36230469 0,000145728
0,36279297 3,07039E-05
0,36303711 -2,67384E-05
0,36291504 1,9769E-06
Com o valor de k estimado em 0,363 calculamos o valor de C* usando a frmula
C^ = [ l - ( l - 0 , 3 6 3 / ] - = 1,072
e com isto podemos calcular o nmero de indivduos , para cada uma das 6 espcies
usando a formula
n , = 32,66 X1,072 x 0,363 x (1-0,363)'-'
Obtendo a seqncia dos valores esperados da tabela da ante duna.
Os valores do teste foram calculados usando-se
( Valor observado - Valor esperado f /Valores esperado.
87
TABELA A7 - Ajuste dos dados ao modelo de distribuio de abundncia das espcies, srie
log, para os trs estgios de estabilizao das dunas.
Ante-Duna
Nmero de indivduos Nmero Espcies Espcies
Limite superior de indivduos Observadas Esperadas X'^2
2,5 2 1 3.61 1, 88
4.5 4 4 1.07 8,06
8.5 8 1 0,80 0,05
16,5 16 0 0.41 0,41
32,5 32 0 0 , 11 0,11
0 0, 01 0, 01
Total de indivduos 62
Total de espcies 6 6 , 0 0
I X '^2 10,51
Duna Semi-Fixa
Limite superior de indivduos Observadas Esperadas X^2
2.5 2 1 2,18 0,64
4.5 4 1 0,83 0,03
8,5 8 2 0, 88 1,41
16.5 16 1 0 , 8 8 0 , 0 2
32.5 32 0 0,81 0.81
64.5 64 1 0 , 6 8 0.15
128,5 128 1 0,46 0.63
0 0,27 0,27
Total de espcies 7 7,00
EX' ' 2 3.70
Duna Fixa
Limite superior de indivduos Observadas Esperadas X'^2
2,5 2 1 2,80 1,16
4,5 4 0 1,07 1.07
8.5 8 2 1,14 0,65
16.5 16 4 1.32 5,44
32.5 32 0 1,05 1.05
64,5 64 1 0,87 0 . 0 2
128.5 128 1 0,59 0.28
0 0,16 0,16
SX' ' 2 9.67
8 8
EN^ = -------
i
e para isto temos que estimar os dois parmetros a e x
Para estimar o parmetro x temos que resolver a seguinte equao
^ = [ ( l - j r ) / x ] l - l n ( l - i ) ]
onde
S = ao nmero total de espcies
N=a.o nmero total de indivduos.
Com isto pode se calcular o valor de a usando a frmula
Para a ante duna temos os dados
S= 6
N= 20,5
S/N= 0,292682927
Para a estimativa de x resolvemos a equao
0,292682 = [ ( l - ; c ) / ; c ] [ - l n ( l - x ) ]
usando o mtodo iterativo da bisseo
Para a distribuio da srie log temos que calcular o nmero de espcies com i
indivduos dados por
89
X erro
0 , 8 0.109676551
0.9 -0.036840139
0.85 0,042102953
0.875 0,004380151
0,8875 -0,015736187
0.88125 -0,00556263
0.878125 -0.000563302
0.8765625 0.001925108
0,87734375 0,000677335
0.877734375 5.82455E-05
0,877929688 -0,000253214
0.877832031 -9.74568E-05
0.877783203 -1,95988E-05
Com o valor de x estimado em 0,8777 calculamos o valor de a usando a frmula
e com isto podemos calcular NE, , o nmero de espcies esperadas contendo /
indivduos. Obtivemos a seqncia dos valores esperados da tabela da ante duna.
Os valores do teste foram calculados usando-se
^ {Valor observado - Valor esperado)^! Valores esperado.
Os clculos para as dunas semi-fxa e fxa foram feitos de forma anloga.
90
TABELA A8 - Ajuste dos dados ao modelo de distribuio de abundncia das espcies,
broken stick, para os trs estgios de estabizao das dunas.
Ante-Duna
Classe Limite superior de indivduos Observadas Esperadas X^2
1 2,5 2 1 1,52 0,18
2 4,5 4 2 1,17 0,59
3 8,5 8 2 1,53 0,15
4 16,5 16 1 1,15 0 , 0 2
5 32,5 32 0 0,18 0,18
6 0 0,45 0,45
Total de espcies 6 6 , 0 0
SX'^2 1, 11
Duna Semi-FIxa
Classe Limite superior de indivduos Observadas Esperadas X' ' 2
1 2,5 2 1 0,47 0,59
2 4,5 4 1 0,45 0,69
3 8,5 8 2 0,81 1,73
4 16,5 16 1 1,35 0,09
5 32,5 32 0 1,83 1,83
6 64,5 64 1 1,56 0 , 2 0
7 128,5 128 1 0,40 0,91
8 0 0 , 1 2 0 , 1 2
Z X ' ' 2 4,77
Duna Fixa
Classe Limite superior de indivduos Observadas Esperadas X'^2
1 2,5 2 1 0,64 0 , 21
2 4,5 4 0 0,60 0,60
3 8,5 8 2 1,08 0,78
4 16,5 16 4 1,77 2,83
5 32,5 32 0 2,33 2,33
6 64,5 64 1 1,91 0,43
7 128,5 128 1 0,51 0,46
8 0 0,17 0,17
SX' ' 2 6 , 2 2
91
ANEXO - 5
RESUMO DOS RESULTADOS OBTIDOS DA
AVALIAO DA DIVERSIDADE A NVEL DE ESPCIE
APS COLETA DIRETA DE ESPOROS
92
TABELA A9 - (A) A diversidade dos trs estgios de estabilizao calculada atravs
dos diversos ndices de riqueza (I) e dos ndices de heterogeneidade
( II).
(B) Adaptao das distribuies da abundncia das espcies,
encontradas nos trs estgios de estabilizao das duna, a trs dos
modelos clssicos de distribuio de abundncia das espcies, srie
geomtrica, srie log, bro/cen stick.
(A) DIVERSIDADE
1- ndices de Riqueza
Riqueza S 6 7 9
Abundncia N 21 170 215
ndice de Margalef D Mg 1,64 1,16 1,48
II - ndices de Heterogeneidade
ndice de dominncia de Simpson C 0,20 0,33 0,27
ndice de diversidade de Simpson D 0,80 0,67 0,73
D' 5,08 3,02 3,64
ndice de eqitatividade de Simpson E 0,96 0,78 0,82
E' 0,85 0,43 0,40
ndice de diversidade de Shannon H 1,71 1,37 1,64
ndice de eqitatividade de Shannon J 0,95 0,70 0.75
(B) AJUSTE AOS MODELOS
Srie geomtrica sim no no
Srie log no sim sim
Broken stick sim sim sim

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ANALA SUSANA CRDOBA

AVALIAO DA DIVERSIDADE DE FUNGOS MICORRZICOS

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