DIAGNSTICO

MOLECULAR DE
DOENAS EM ANIMAIS
1
ESPCIES DE INTERESSE ECONMICO
2
DESAFIOS DA PRODUO ANIMAL
Gentica
Sanidade
Reproduo
Ambincia
Nutrio
Insumos
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
16
17
18
19
20
21
PREVENO + CONTROLE
http://www.oie.int/
2001: surto de febre aftosa no UK
! perdas US$ 25-30 milhes
2002-2003: surto de SARS (sndrome respiratria aguda
grave) na China, Hong Kong, Cingapura
! perdas US$ 30-50 milhes
DOENAS: PERDAS ECONMICAS
http://www.fao.org/
22
FEBRE AFTOSA: vrus
23
DOENA DA VACA LOUCA (BSE): pron
24
NEWCASTLE: vrus
25
FEBRE SUNA: vrus
26
DOENAS: COMO DIAGNOSTICAR?
DIAGNSTICO
SOROLGICO
DIAGNSTICO
MOLECULAR
E / OU
27
DIAGNSTICO SOROLGICO
precipitao e aglutinao
imunoensaio enzimtico (ELISA)
HPLC
imunofluorescncia
citometria de fluxo
Western blotting
VANTAGEM: facilidade tcnica na sua realizao
LIMITAO: falha na deteco de nveis mnimos de anticorpos
circulantes e no incio da doena os anticorpos podem no ser
detectados no soro
REVER
CONCEITOS DE
IMUNOLOGIA
28
DIAGNSTICO MOLECULAR
rea da biologia molecular que utiliza
tcnicas baseadas nos princpios de
hibridizao de cidos nucleicos para
deteco e caracterizao de agentes
infecciosos ou de caractersticas
genticas de interesse.
29
VANTAGENS
permite detectar doenas em estgios pr-clnicos
" chances de tratamento profiltico
# chances de epidemias
# perdas econmicas (carne, leite, ovos, etc)
# uso de medicamentos e contaminao dos produtos
# contaminao do meio ambiente
possibilita tratamentos especficos (dosagem e tempo)
dependendo do nvel de contaminao
rastreabilidade do produto de origem animal

30
FUNDAMENTOS
a identidade dos seres vivos determinada pela composio de
seu material gentico (DNA ou RNA).
tcnicas se baseiam nas caractersticas fsico-qumicas destas
molculas ! DNA e RNA possuem afinidade por molculas de
cidos nucleicos que possuem pareamento complementar
sua sequncia (A/T e C/G)
para detectar determinado alvo no genoma de interesse, utiliza-
se cadeia de DNA ou RNA complementar, que tender a ligar-se
de forma especfica (HIBRIDIZAO)
31
FUNDAMENTOS
cadeias complementares para fins de diagnstico (SONDAS E
PRIMERS): produo simples e de # custo ! clonagem ou
adquir-las de empresas que sintetizem quimicamente a sequncia
desejada
SONDA: fita complementar com marcao por meios fsico-
qumicos (radioatividade ou revelao cromognica)
PRIMER: sntese enzimtica de novas cadeias de cidos
nuclicos a partir da ligao de cadeias complementares
32
TCNICAS
amplificao enzimtica do DNA por PCR
digesto da fita de DNA genmico ou produto de PCR com
enzimas de restrio
separao eletrofortica do DNA ou do produto de PCR
hibridao do DNA ou fragmentos de PCR com sondas
oligonucleotdicas
Numa rotina de deteco molecular, a nica varivel a
PRESENA / AUSNCIA do DNA do patgeno (DNA ou RNA) 33
PCR
Consiste na sntese enzimtica in vitro de cpias de DNA
a partir de uma sequncia alvo
+ utilizada atualmente devido ESPECIFICIDADE e
SENSIBILIDADE
ESPECIFICIDADE: s amplifica DNA do patgeno
SENSIBILIDADE: aps 30-40 ciclos obtm-se bilhes de
cpias do alvo
34
ETAPAS DA PCR
preparo das amostras: bipsias, sangue, plasma,
fezes, swabs
extrao do material gentico total: processos fsico-
qumicos, centrifugao e utilizao de solventes
orgnicos
transcrio reversa: nos casos de anlise do RNA,
por meio da sntese do cDNA $ VRUS
deteco: se houver sntese in vitro ! eletroforese em
gel de agarose ou de poliacrilamida corados com
brometo de etdio e cloreto de prata; outros agentes que
emitem fluorescncia ou cor

35
COMPONENTES
* DNA
* Taq polimerase
* Iniciadores
* Tampo
* MgCl
2

* dNTPs
36
MATERIAIS E EQUIPAMENTOS
37
CURVA EXPONENCIAL
38
CICLOS DA PCR
39
VISUALIZAO EM GEL
40
PCR quantitativa
PCR convencional permite a deteco ou
no do pat geno, mas no a sua
quantificao
PCR quantitativa surge como alternativa
para alm de detectar, possibilitar a
quantificao dos patgenos presentes
41
qPCR com SYBR Green dye

corante torna-se
fluorescente (verdes)
quando se liga a dupla
fita de DNA
a cada novo ciclo a
f l u o r e s c n c i a
detectada e possvel
quantificar o produto
de PCR
42
PCR QUANTITATIVA
43
44
NESTED PCR
variao da PCR, em que dois pares (ao invs de
um par) de primers so usados para amplificar
um fragmento de DNA
1 par de primers amplifica um fragmento de DNA
de maneira idntica uma PCR padro
2 par de primers (primers nested) ligam-se dentro
do 1 fragmento amplificado para permitir a
amplificao de um 2 seguimento menor que o 1
45
NESTED PCR: VANTAGENS
se o 1 fragmento de DNA foi amplificado
errado, a probabilidade muito baixa que a
regio ser amplificada pela 2 vez usando
o 2 par de primers
amplificao mais especfica do que a PCR
convencional

46
47
TIPAGEM MOLECULAR
alm de indicar a presena do patgeno no campo, permite
a caract eri zao espec f i ca do agent e causal ,
diferenciando-o (caso de distino entre cepas vacinais e
de campo)
possibilita avaliao refinada, em que os testes sorolgicos
so menos especficos, e tambm a avaliao de
programas de vacinao
por no necessitar de cultivo ou isolamento, so tcnicas
que permitem a obteno de resultados em curto espao
de tempo 48
APLICAES
estudos de biodiversidade: doenas
a c o mp a n h a me n t o d e mi c r o r g a n i s mo s
geneticamente modificados e liberados para
comercializao
val i dao de mi crorgani smos usados em
processos bi ot ecnol gi cos e no cont rol e
microbiolgico de produtos farmacuticos
49
APLICAES
em Epidemiologia, dado o seu potencial para
esclarecer a origem e disseminao de uma
estirpe causadora de surto infeccioso
serve para identificar surtos infecciosos e de
episdios de transmisso cruzada de patgenos,
no reconhecimento da fonte de contaminao e de
estirpes particularmente infecciosas
50
rRNA: DESENHO DE INICIADORES
regio de diferenciao inter-
espcies
" conservada dentro de espcie
taxa de mutao de 5-10 vezes >
DNA que constituem os genes
80% rRNA
51
ALGUNS EXEMPLOS DE
DOENAS COM DIAGNSTICO
MOLECULAR J EM USO
52
53
S
U

N
O
S
54
HIPERTERMIA MALIGNA SUNA
doena gentica recessiva associada com a PSS
(Porcine Stress Syndrome) e com a PSE (Pale,
Soft, Exudative Meat Syndrom)
Diagnstico clssico baseado no anestsico
halotano e testes in vitro de contrao muscular
Diagnstico molecular: PCR-RFLP (Fujii et al.,
1991)
55
CARNE PSE
56
PCR-RFLP: HhaI
Gel de agarose low melting

Corta NN e Nn e no corta nn
NN Nn nn
2 T 1 T 0 T
81 pb
49 pb
32 pb
57
58
59
60
61
62
63
64
65
66
67
68
69
70
71
72
73
74
BOVINOS
75
DOENAS PRODUTIVAS
Febre aftosa
Clostridioses
Pasteurelose
Raiva
Tristeza parasitria
Tuberculose
Verminose
Ectoparasitose
76
DOENAS REPRODUTIVAS
Brucelose
BVD
IBR
Leptospirose
Campilobacteriose
Neosporose
Micotoxicose
77
COMPLEXO CARRAPATO
Anaplasma marginale (bact.), Babesia bovis e
B. bigemina (prot.)
Tristeza parasitria bovina (TPB): doena
hemoltica e febril, causando morte de bezerros
e adultos
78
OUTRAS
Rinotraquete infeccionsa bovina (IBR)
Diarria viral bovina (BVDB): Pestivirus spp.
Br ucel ose, l ept ospi r ose, f ebr e af t osa,
tuberculose, clostridiose, neosporose, BLAD,
Weaver
BSE: doena da vaca louca: pron
79
SINAIS E LESES
80
81
82
PREVENO
realizada atravs da adoo de um calendrio fixo
de vacinao
EXECUO DE RGIDO PROGRAMA SANITRIO
Como j dizia aquele velho ditado:
Prevenir melhor que remediar!
83
PROGRAMA SANITRIO
Quanto custa?

Exemplo para uma matriz bovina
Aftosa R$ 0,70 x 2 = R$ 1,40
Clostridiose R$ 0,50
IBR (rinotraquete infeccionsa bovina) + Leptospirose R$ 4,00
Leptospirose R$ 0,70
Dectomax

- 2 doses ano - R$ 4,00

Valbazen

- 1 dose ano - R$ 0,80

TOTAL: R$ 12,00
84
VERMIFUGAO
CUSTO DE UMA MATRIZ POR ANO
Mo de obra = R$ 25,00
Depreciao de pastagens = R$ 20,00
Depreciao de cercas e equipamentos = R$ 15,00
Custos da terra = R$ 30,00
Sal mineral = R$ 20,00
Sanidade = R$ 12,00
Assistncia tcnica = R$ 8,00
CUSTO TOTAL = R$ 130,00
Este custo considerado fixo, ou seja, ela produzindo
ou no um bezerro
% custo do programa sanitrio corresponde a 9,2%
85
AVES
86
VIROSES BACTERIOSES PARASITOSES METABLICAS
Doena de
Newcastle
Colibacilose Coccidiose Diatese
exsudativa
Bronquite
infecciosa
Salmonelose Entero-hepatite Encefalomalcia
nutricional
Bouba aviria Micoplasmose Verminoses e
ectoparasitoses
Raquitismo
Doena de
Marek
Coriza
infecciosa
Micotoxicoses
Leucose linfoide Pausteurelose Ascite
Encefalomielite
aviria
Botulismo
Estafilocose
Borreliose
Ornitose
Tuberculose
Aspergilose
PRINCIPAIS DOENAS
87
GRIPE AVIRIA: RT-PCR
88
DIVERSAS DOENAS
Leucose aviria (tipo J)
Mycoplasma ssp.
Salmonella spp.
Vrus Gumboro

89
SINAIS E LESES
90
91
PROGRAMA DE VACINAO
OVINOS
CAPRINOS
92
93
94
CES
GATOS
95
ANAPLASMA
Anaplasma platys: trombocitopenia cclica canina
febre (pode no aparecer em certos casos)
anorexia, letargia, depresso, perda de peso
corrimento nasal, mucosas plidas, trombocitopenia
alterao na agregao plaquetria, neutropenia
linfocitose e monocitose, presena de macroplaquetas
96
MICOPLASMA FELINO
Haemobartonella felis: patgeno hemotrpico parasita das
hemcias de felinos domsticos e silvestres
anemia infecciosa felina, anemia aguda ou crnica
febre, palidez das mucosas
ictercia
plasma ictrico ocasionalmente
fraqueza
anorexia/perda de peso
97
BABESIOSE CANINA
Babesia canis
anemia aguda ou crnica, febre
palidez das mucosas, ictercia
plasma ictrico ocasionalmente
fraqueza anorexia/perda de peso
98
CINOMOSE
vrus de RNA da famlia Paramyxoviridae
transmitidos principalmente por gotculas infectantes
provenientes de secrees do organismo de animais
infectados.
febre, anorexia, apatia, depresso, letargia, infeces
bacterianas oportunistas tosse, dispneia e pneumonia,
conjuntivite, corrimento ocular
queda dos membros posteriores (descadeirado) andar em
crculos. movimentos de pedalagem
99
PARVOVIROSE
transmisso pela via fecal-oral (ingesto ou inalao do vrus)
e por meio do contato do animal susceptvel (no vacinado
ou em perodo de vacinao) com as fezes de um co
infectado
vmitos, diarreia sanguinolenta de cor escura e ftida
depresso e letargia leucopenia (< 2.000 leuccitos)
anorexia e desidratao
febre varivel
100
LEPTOSPIROSE
bactrias Leptospira icterohaemorrhagiae, L. canicola e L.
grippotyphosa
febre (39 a 41 graus), anorexia e depresso, vmitos
desidratao
membranas mucosas plidas, sensibilidade a palpao renal
polidipsia, relutncia em se movimentar, anemia leucocitose
e trombocitopenia
ictercia pode ocorrer
101
102
103
OIE: ORGANIZAO INTERNACIONAL DE
EPIZOTIAS (ZOONOSES)
Lista completa de doenas
pel o mundo, i ncl ui ndo
nmero de casos por ano
para diversas espcies de
animais
104
PERSPECTIVAS
Excelente rea de atuao para Biotecnologistas
Desenvolvimento de kits de diagnstico molecular de
doenas de interesse econmico em animais: permitem a
deteco da doena em seu estdio inicial ou possibilitam
eliminar os animais doentes e reduzir os efeitos de
epidemias
Rastreabilidade: manuteno da liderana na exportao
de carnes bovinas e de aves
Rapidez, eficincia e preciso na deteco de doenas
ainda no introduzidas no Brasil
105
Questes