000591027

UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO GRANDE DO SUL
ESCOLA DE ENGENHARIA
DEPARTAMENTO DE ENGENHARIA QUMICA
PROGRAMA DE PS-GRADUAO EM ENGENHARIA QUMICA
Cultivo em Estado Slido: Modelagem e
Quantificao de Biomassa em Biorreator
Cilndrico Horizontal Agitado
DISSERTAO DE MESTRADO

Marcus Darci Rutsatz

Porto Alegre
2006
Cultivo em Estado Slido: Modelagem e
Quantificao de Biomassa em Biorreator
Cilndrico Horizontal Agitado
Marcus Darci Rutsatz

Dissertao de Mestrado apresentada como requisito
parcial para obteno do ttulo de Mestre em Engenharia

Orientador:
Prof. Dr. Argimiro Resende Secchi

Co-orientador:
Prof. Dr. Marco Antnio Zacchia Ayub

Porto Alegre
2006

A Comisso Examinadora, abaixo assinada, aprova a Dissertao Cultivo em Estado
Slido: Modelagem e Quantificao de Biomassa em Biorreator Cilndrico Horizontal
Agitado, elaborada por Marcus Darci Rutsatz, como requisito parcial para obteno do Grau
de Mestre em Engenharia.

Comisso Examinadora:

Prof. Dr. Marla Azrio Lansarin

Prof. Dr. Maurcio Moura da Silveira

Prof. Dr. Rosane Rech
Agradecimentos

A Deus, por sempre iluminar meu caminho.
UFRGS, instituio da qual fao parte h quase uma dcada, e qual devo alguns
dos melhores momentos da minha vida.
Ao Professor Argimiro Resende Secchi, meu orientador. Como falei h alguns dias a
um colega novo no mestrado: O Arge nunca vai te deixar na mo. Creio que isto define bem
o que ele representou durante o trabalho.
Ao Professor Marco Antnio Zacchia Ayub, que se revelou um timo amigo, uma
pessoa de posies claras, sempre se preocupando com a qualidade do trabalho.
Ao Professor Joo Henrique Zimnoch dos Santos, do Instituto de Qumica, cuja
ajuda foi bem alm das dvidas sobre cromatografia.
Ao futuro engenheiro qumico Wagner Bertuol Casagrande, que foi meu fiel
escudeiro durante os experimentos, enfrentando comigo os momentos de decepo e
compartilhando os de alegria.
Aos colegas do Bioteclab e do PPGEQ. Prefiro no cit- los individualmente, para
evitar cometer uma injustia. O apoio mtuo entre os colegas , sem dvida, uma das
principais foras motrizes do trabalho.
A meu pai, minha me e minhas irms, que me incentivaram a cursar o mestrado.
Sem seu apoio, certamente eu no teria sequer iniciado esta jornada.
Siomara, meu amor e companheira, o melhor motivo que tenho para querer ser
melhor. Dividimos, juntos, a experincia do mestrado, sempre ajudando um ao outro, sendo
compreensivos mesmo nos fins de semana em que no podamos estar juntos.
Finalmente, CAPES, pelo apoio financeiro.

V
Resumo
Em bioprocessos, cultivo em estado slido (CES) pode ser definido como o cultivo
envolvendo slidos insolveis na ausncia, ou quase, de gua livre. Desta forma, o CES se
distingue dos cultivos submersos (CSm), nos quais os substratos e microrganismos
encontram-se dissolvidos ou suspensos em grande quantidade de gua. Muitos aspectos
importantes de engenharia de processo ainda precisam ser desenvolvidos em CES, como a
quantificao de biomassa, a cintica de reaes e as transferncias de massa e energia. Neste
trabalho, estudou-se um processo de cultivo em estado slido em biorreator de tambor agitado
utilizando um resduo industrial fibroso de soja (RIFS) como substrato para o crescimento da
bactria Bacillus circulans BL53.
Inicialmente, foram realizados testes de mistura utilizando corantes alimentcios para
avaliar a eficincia da homogeneizao promovida pelas ps agitadoras. O teste utilizando
corantes espelha-se em outros encontrados na literatura, porm o substrato aqui utilizado tem
natureza pastosa, contra os de natureza particulada de outros trabalhos. Concluiu-se que a
homogeneizao satisfatria.
Foi realizada a estimao da biomassa no cultivo atravs da taxa de produo de
CO
2
, analisado por cromatografia gasosa. Com o uso de um modelo de correlao, obteve-se
bons resultados para as primeiras horas de cultivo, porm os erros de estimao tornaram-se
muito grandes aps 20 horas de cultivo. Este um resultado comum tambm em outros
trabalhos semelhantes encontrados, j que o erro da estimao cumulativo, e o nico
parmetro monitorado (produo de CO
2
) pode falhar na deteco de mudanas do
metabolismo microbiano.
Alm disso, foi desenvolvido um modelo cintico, que relaciona as concentraes de
biomassa, acares redutores totais e acetato, alm da produo de CO
2
, no cultivo. O acetato
um produto metablico com efeito bactericida. Por conseqncia deste efeito, houve queda
na contagem de clulas viveis aps aproximadamente 15 horas de cultivo. No geral, houve
boa correlao com dados experimentais, porm outros desenvolvimentos so necessrios
para aprimorar o modelo. A produo de CO
2
, por exemplo, no foi bem descrita pelo
modelo. A incluso de medies de consumo de oxignio, uma estequiometria de reao
definida e balanos de massa e energia podem trazer melhorias significativas s predies e
aplicabilidade do modelo.

VI
Abstract
Solid state cultivations (SSC) may be defined as the cultivation involving insoluble
solids in the absence, or near absence, of free water. Therefore, SSC is distinguished from
submerged cultivations (SmC), where substrates and microrganisms are dissolved or
suspended in large quantities of water. Many important engineering aspects of SSC are still to
be developed, like biomass quantification, reaction kinetics, mass and energy transfers. This
work dealt with a solid state cultivation process carried out in an agitated drum bioreactor,
using an industrial fibre soybean residue (IFSR) as substrate for the growth of the bacterium
Bacillus circulans BL53.
Mixing tests were carried out in order to evaluate the efficiency of the
homogeneization promoted by the mixing paddles. Common food grade dyes were used in
these experiments, similary to other works in the literature. However, the viscous nature of
ISFR greatly differs from the particulates used in other works. Homogeneization was
concluded to be satisfactory.
Biomass was estimated through the CO
2
production rate, which was determined by
gas chromatography. Using a correlation model, good results were obtained for the first hours
of the cultivation, but the estimation errors became too large after 20 hours. This is a common
result also in other works, since the estimation error is cumulative, and the only monitored
parameter (CO
2
production) may fail the detection of metabolic changes of the microrganism.
A kinetic model of the process was also developed, relating biomass, total reducing
sugars and acetate concentrations, in addition to CO
2
production. Acetate is a metabolic
product which has bactericidal effect. As a consequence, viable cell count dropped after
approximately 15 hours cultivation. A general good correlation with experimental data was
obtained, but the model may be further improved. For example, the model was unable to
describe the CO
2
production satisfactory. The inclusion of oxygen uptake measurements, a
defined reaction stoichiometry, together with mass and energy balances may significantly
improve model predictions and applicability.

VII
Sumrio
Resumo............................................................................................................................. V
Abstract ........................................................................................................................... VI
Sumrio .......................................................................................................................... VII
Lista de figuras.............................................................................................................. IX
Lista de tabelas .............................................................................................................. X
Lista de smbolos.......................................................................................................... XI
Introduo.........................................................................................................................1
Fundamentos e Reviso Bibliogrfica......................................................................4
2.1 Cultivo em Estado Slido ........................................................................................4
2.1.1 Uso de bactrias em CES................................................................................9
2.1.2 O pH em CES ...............................................................................................10
2.2 Quantificao de Biomassa em Cultivo em Estado Slido ...................................11
2.2.1 Mtodos diretos ............................................................................................13
2.2.2 Mtodos indiretos - Medida de componentes da biomassa..........................14
2.2.2.1 Nitrognio e Protena...........................................................................15
2.2.2.2 cidos nuclicos ..................................................................................16
2.2.2.3 Glicosamina .........................................................................................16
2.2.2.4 Ergosterol.............................................................................................17
2.2.3 Mtodos indiretos Medidas de atividade metablica.................................18
2.2.3.1 Respirometria.......................................................................................18
2.2.3.2 Massa seca do leito ..............................................................................21
2.2.3.3 Produo de enzimas extracelulares ....................................................21
2.2.3.4 Medidas de fluorescncia ....................................................................22
2.2.3.5 ATP ......................................................................................................22
2.2.3.6 cidos orgnicos .................................................................................23
2.2.4 Outras tcnicas ..............................................................................................23
2.3 Modelagem Matemtica de Biorreatores para Cultivo em Estado Slido.............24
2.3.1 Biorreatores de leito fixo ..............................................................................26
2.3.2 Biorreatores de bandejas ...............................................................................30
2.4 Biorreatores de leito fluidizado .......................................................................33
2.5 Biorreatores de tambor rotatrio......................................................................34
2.6 Biorreatores de Tambor Agitado .....................................................................37
2.7 Metabolismo e crescimento .............................................................................38
2.8 Estimao de biomassa atravs dos gases de sada .........................................43

VIII
Materiais e Mtodos.................................................................................................... 45
3.1 Instalaes e equipamentos....................................................................................45
3.2 Biorreator cilndrico horizontal agitado (BCHA) ..................................................46
3.3 Microrganismo.......................................................................................................47
3.4 Preservao da cultura ...........................................................................................47
3.5 Preparo de inculo .................................................................................................47
3.6 Preparo do meio de cultivo ....................................................................................48
3.7 Condies do cultivo .............................................................................................49
3.8 gua do encamisamento do biorreator ..................................................................49
3.9 Quant ificao de biomassa ....................................................................................50
3.10 pH do meio de cultivo..........................................................................................50
3.11 Anlises do extrato aquoso ..................................................................................51
3.11.1 Preparo do extrato aquoso ..........................................................................51
3.11.2 Acares redutores......................................................................................51
3.11.3 Acetato........................................................................................................51
3.12 Medio da umidade relativa do ar de sada do biorreator..................................52
3.13 Anlise de umidade do meio de cultura...............................................................52
3.14 Anlise do CO
2
liberado no cultivo .....................................................................52
3.14.1 Anlise por Cromatografia Gasosa.............................................................52
3.14.2 Calibrao da medida de CO
2
no CG.........................................................53
3.14.3 Anlise de CO
2
e O
2
em analisador de gases..............................................53
3.15 Testes de mistura no biorreator............................................................................54
3.16 Estimao de biomassa atravs da produo de CO
2
..........................................55
3.17 Modelagem do crescimento microbiano..............................................................57
3.18 Resoluo dos modelos e estimao de parmetros ............................................57
3.19 Seleo e estimao de parmetros......................................................................58
Resultados e Discusso............................................................................................ 60
4.1 Calibrao da medida de CO
2
no cromatgrafo a gs ...........................................60
4.2 Testes de mistura ...................................................................................................61
4.3 Temperatura da gua de encamisamento...............................................................63
4.4 Umidade do leito ao longo dos cultivos ................................................................64
4.5 Observaes gerais durante os cultivos .................................................................65
4.6 pH do meio de cultivo............................................................................................66
4.7 Quantificao de biomassa por contagem em placas ............................................67
4.8 Acares Redutores ...............................................................................................70
4.9 Modelagem do crescimento microbiano................................................................71
4.10 Estimao da biomassa atravs da taxa de produo de CO
2
..............................72
4.11 Desenvolvimento de modelo cintico..................................................................75
4.12 Estimao dos parmetros do modelo cintico....................................................77
Concluses e Perspectivas....................................................................................... 85
Referncias Bibliogrficas ........................................................................................ 88
Obras Consultadas .......................................................................................................94
Apndice A - Problemas enfrentados durante os experimentos.................... 96
Anexo I Algoritmo SELEST.................................................................................. 100

IX
Lista de figuras
Figura 2.1: rvore decisria para validao de mtodo indireto baseado em componente da
biomassa. .................................................................................................................... 15
Figura 2.2: Exemplo do aumento do erro de estimao da biomassa....................................... 20
Figura 2.3: Classificao dos biorreatores de CES em funo das caractersticas de
agitao e aerao. ...................................................................................................... 26
Figura 2.4: Descrio dos fenmenos de transferncia de energia em biorreatores de leito
fixo tradicional e Zymotis. ......................................................................................... 27
Figura 2.5: Comparao entre modelos para biorreatores de bandejas. ................................... 31
Figura 2.6: Esquema de biorreator de leito fluidizado. ............................................................ 33
Figura 2.7: Efeitos considerados em modelos de biorreatores de leito fluidizado. .................. 34
Figura 2.8: Possveis regimes de movimentao do leito em biorreatores de tambor
rotatrio. ..................................................................................................................... 35
Figura 2.9: Efeitos considerados em modelo para biorreator de tambor rotatrio. .................. 35
Figura 2.10: Os vrios perfis cinticos empricos utilizados em CES...................................... 40
Figura 3.1: Vises externa e interna do BCHA. ....................................................................... 46
Figura 3.2: Disposio inicial da fibra nos testes de mistura. .................................................. 55
Figura 3.3: Descrio simplificada do algoritmo SELEST. ..................................................... 59
Figura 4.1: Curva de calibrao obtida para anlise de CO
2
em CG. ....................................... 60
Figura 4.2: Comparao entre as medidas de concentrao de CO
2
(em %) obtidas pelo
cromatgrafo a gs e pelo analisador de gases. .......................................................... 61
Figura 4.3: Aspecto do biorreator ao incio e aps 15 minutos no teste de mistura radial. ...... 62
Figura 4.4: Aspecto do biorreator ao incio e aps 45 minutos no teste de mistura axial. ....... 62
Figura 4.5: Temperatura de entrada e sada da gua de encamisamento. ................................. 64
Figura 4.6: Evoluo da umidade no meio de cultivo .............................................................. 65
Figura 4.7: Variao do pH ao longo dos cultivos. .................................................................. 67
Figura 4.8: Evoluo da biomassa ao longo dos cultivos. ........................................................ 67
Figura 4.9: Evoluo do pH e da concentrao de biomassa ao longo dos cultivos. ............... 68
Figura 4.10: Comparao entre concentrao de biomassa e de cido actico. ....................... 69
Figura 4.11: Comparao entre concentrao de biomassa e de acares redutores................ 71
Figura 4.12: Ajuste dos dados de biomassa ao modelo logstico. ............................................ 72
Figura 4.13: Exemplo de cromatograma obtido na anlise de CO
2
no ar de sada do
biorreator. ................................................................................................................... 72
Figura 4.14: Taxa de produo de CO
2
. ................................................................................... 73
Figura 4.15: Resultados da estimao de biomassa a partir da taxa de produo de CO
2
,
para trs experimentos. ............................................................................................... 74
Figura 4.16: Predies do modelo desenvolvido em comparao com os dados
experimentais.............................................................................................................. 81
Figura 4.17: Predies do modelo com relao produo de CO
2
. ....................................... 82
Figura 4.18: Estimao de biomassa atravs dos parmetros
X CO
Y
/
2
e
2
CO
m do modelo
cintico. ...................................................................................................................... 83
Figura A.1: Curva de porcentagem de CO
2
no ar de sada do biorreator apresentando efeito
da variao da vazo de ar. ......................................................................................... 97
Figura A.2: Aspecto de colnias colabadas de Bacillus circulans BL53. ................................ 99

X
Lista de tabelas
Tabela 2.1: Comparao entre CES e CSm................................................................................ 6
Tabela 2.2: Algumas aplicaes de CES. ................................................................................... 7
Tabela 3.1: Composio do Luria Broth................................................................................... 47
Tabela 3.2: Composio do RIFS............................................................................................. 48
Tabela 3.3: Composio do meio mineral................................................................................ 48
Tabela 3.4: Composio do meio PCA utilizado...................................................................... 50
Tabela 3.5: Modelos cinticos de crescimento em CES ........................................................... 57
Tabela 4.1: Parmetros do modelo cintico presentes nos balanos de biomassa, acares
redutores e acetato. ..................................................................................................... 78
Tabela 4.2: Parmetros estimados para o modelo cintico....................................................... 79
Tabela 4.3: Efeito dos parmetros sobre as sadas do modelo cintico. ................................... 79
Tabela 4.4: Matriz de correlao para os parmetros estimados do modelo cintico .............. 80
Tabela 4.5: Parmetros
X CO
Y
/
2
e
2
CO
m estimados para o modelo cintico. ............................. 81

XI
Lista de smbolos
Smbolo Unidade Significado
A................g
S
.h
-1
.............. Taxa para reao enzimtica de hidrlise de polissacardeos
A
ba
.............m
2
.................. rea de troca convectiva de calor entre leito e headspace do
biorreator
A
bp
.............m
2
.................. rea de troca convectiva de calor entre leito e parede do biorreator
Ac..............g
Ac
.g
-1
............ Concentrao de acetato
A
pa
.............m
2
.................. rea de troca convectiva de calor entre parede e headspace do
biorreator
A
pe
.............m
2
.................. rea de troca convectiva de calor entre parede do biorreator e o
exterior
A
S
...............m
2
.................. rea superficial do leito
a
x
...............m
-1
................. rea da interface ar/biofilme por unidade de volume do biorreator
B
1
...............[adim]............ Constante da equao de Hougen-Watson
B
2
...............[adim]............ Constante da equao de Hougen-Watson
b ................C.................. Parmetro de sensibilidade da taxa de crescimento mudana de
temperatura
Bi ...............[adim]............ Nmero de Biot
c
1
...............K
-1
................. Constante emprica da equao de Ratkowsky
c
2
...............K
-1
................. Constante emprica da equao de Ratkowsky
2
CO
C ..........g
CO2
.g
-1
.......... Concentrao de CO
2

2
CO
in
C ..........L
CO2
.L
ar
-1
....... Concentrao de CO
2
no ar de entrada
2
CO
out
C ..........L
CO2
.L
ar
-1
....... Concentrao de CO
2
no ar de sada
2
O
C ...........g
O2
.g
-1
............ Concentrao de O
2

2
O
C ............g
O2
.g
gs
-1
........ Concentrao de O
2
na fase gs
2
O
in
C ...........L
O2
.L
ar
-1
......... Concentrao de O
2
no ar de entrada
2
O
out
C ...........L
O2
.L
ar
-1
......... Concentrao de O
2
no ar de sada
f
O
C
2
............g
O2
.g
-1
2
no biofilme
x
O
C
2
............g
O2
.g
gs
-1
........ Concentrao de O
2
no headspace entre bandejas
b
O
C
2
............g
O2
.g
-1
2
no leito
Cp
a
............J.g
-1
.K
-1
......... Calor especfico do ar

XII
Cp
b
............J.g
-1
.K
-1
......... Calor especfico mdio do leito
Cp
G
............J.g
-1
.K
-1
......... Calor especfico da fase gasosa
Cp
p
............J.g
-1
.K
-1
......... Calor especfico parede do biorreator
Cp
s
.............J.g
-1
.K
-1
......... Calor especfico das partculas slidas
Cp
VAP
.........J.g
-1
.K
-1
......... Calor especfico do vapor de gua
Cp
w
............J.g
-1
.K
-1
......... Calor especfico da gua
C
VAP
...........g
W
.g
-1
............. Concentrao de vapor de gua nos poros do leito
CPR...........g
CO2
.g
-1
.h
-1
..... Taxa de produo de CO
2

C
W
.............g
W
.g
-1
............. Concentrao de gua no leito
b
O
D
2
...........m
2
.h
-1
............. Difusividade efetiva do O
2
nos poros do leito
*
VAP
D ..........m
2
.h
-1
............. Difusividade efetiva do vapor de gua no leito
E
D
..............J.mol
-1
........... Energia de ativao para o decaimento (morte ou inativao)
celular
E
G
..............J.mol
-1
........... Energia de ativao para o crescimento celular
f .................K
-1
................. Coeficiente linear na aproximao equao de Antoine.
F................g.h
-1
............... Vazo de ar
F
in
..............L.h
-1
............... Vazo de entrada de ar
F
out
.............L.h
-1
............... Vazo de sada de ar
F
w
..............g.h
-1
............... Vazo de gua (entrando ou saindo)
G
D
...........J.mol
-1
........... Variao de energia livre para inativao celular
h ................J.h
-1
.m
-2
.K
-1
... Coeficiente de troca convectiva de calor
H...............J..................... Entalpia
H
b
..............m................... Altura do leito
h
ba
..............J.h
-1
.m
-2
.K
-1
... Coeficiente de troca convectiva de calor entre leito e headspace do
biorreator
h
bp
..............J.h
-1
.m
-2
.K
-1
... Coeficiente de troca convectiva de calor entre leito e parede do
biorreator
h
pa
..............J.h
-1
.m
-2
.K
-1
... Coeficiente de troca convectiva de calor entre parede e headspace
do biorreator
h
pe
..............J.h
-1
.m
-2
.K
-1
... Coeficiente de troca convectiva de calor entre parede do biorreator
e o exterior
2
O
H ...........[adim]............ Constante da Lei de Henry para o O
2

k.................h
-1
.................. Constante de decaimento exponencial de primeira ordem
K................UFC.g
-1
.h
-1
.... Taxa de crescimento linear
k
1
...............(g
Ac
.g
-1
)
-n
.h
-1
.. Taxa de reao de inativao celular devido ao acetato
k
2
...............(g
Ac
.g
-1
)
-p
.h
-1
.. Taxa de reao de hidrlise de polissacardeos

XIII
K
a
..............m.h
-1
.............. Coeficiente de transferncia mssica de O
2
na interface ar/biofilme
k
a
...............J.h
-1
.m
-1
.K
-1
... Condutividade trmica do ar
k
b
...............J.h
-1
.m
-1
.K
-1
... Condut ividade trmica mdia do leito
k
D
...............h
-1
.................. Velocidade especfica de decaimento (morte ou inativao) celular
k
exp
.............[adim]............ Parmetro emprico
K
i
...............g
S
.g
-1
.............. Constante de inibio pelo substrato
k
s
................J.h
-1
.m
-1
.K
-1
... Condutividade trmica dos slidos secos
K
S
..............g
S
.g
-1
.............. Constante de Monod para o substrato S
2
O
K ...........g
O2
.g
-1
............ Constante de Monod para o O
2

k
w
...............g.m
-2
.h
-1
......... Coeficiente de transferncia de massa
L................[adim]............ Razo entre a taxa de crescimento especfico no incio da fase de
desacelerao e a taxa de crescimento especfico na fase de
acelerao
m...............g.UFC
-1
.h
-1
.... Taxa de produo/consumo para manuteno (no-associada ao
crescimento)
M
B
.............g .................... Massa do leito
M
G
.............g .................... Massa da fase gasosa
M
S
..............g .................... Massa seca do leito
2
CO
m ..........g.UFC
-1
.h
-1
.... Velocidade especfica de produo de CO
2
para manuteno celular
(no-associada ao crescimento)
2
O
m ...........g.UFC
-1
.h
-1
.... Velocidade especfica de consumo de O
2
para manuteno celular
(no-associada ao crescimento)
2
CO
M .........g.mol
-1
........... Massa molar do CO
2

2
O
M ..........g.mol
-1
........... Massa molar do O
2

n ................[adim]............ Ordem da reao de morte celular em relao ao acetato
p ................[adim]............ Ordem da reao de hidrlise de polissacardeos em relao
biomassa
R................J.mol
-1
.K
-1
..... Constante universal dos gases
r.................m................... Coordenada radial
R
b
...............m................... Raio do leito
r
x
................UFC.g
-1
.h
-1
.... Taxa de crescimento
r
Q
...............J.m
-3
.h
-1
......... Taxa de gerao de energia metablica
O H
r
2
...........g.h
-1
............... Taxa de gerao metablica de gua
2
O
r .............g
O2
.g
-1
.h
-1
....... Taxa de consumo de O
2

S ................g
S
.g
-1
.............. Concentrao de substrato

XIV
T................C.................. Temperatura
t .................h .................... Tempo
t
a
................h .................... Instante de tempo de troca de fase de crescimento (da acelerao
rpida para a desacelerao lenta)
T
a
...............C.................. Temperatura do ar
T
b
...............C.................. Temperatura do leito
T
in
..............C.................. Temperatura do ar na entrada
T
max
............C.................. Temperatura mxima para crescimento
T
min
............C.................. Temperatura mnima para crescimento
T
opt
.............C.................. Temperatura tima para crescimento
T
out
.............C.................. Temperatura do ar na sada
T
p
...............C.................. Temperatura da parede do biorreator
T
viz
.............C.................. Temperatura da vizinhana
T
w
..............C.................. Temperatura da gua de resfriamento
V................L.................... Volume utilizado do biorreator
V
p
...............m
3
.................. Volume da parede do biorreator
V
z
...............m.h
-1
.............. Velocidade superficial do ar na direo vertical
2
CO
v ...........L.mol
-1
.......... Volume molar do CO
2

2
O
v .............L.mol
-1
.......... Volume molar do O
2

W...............g
W
.g
-1
............. Umidade do leito (em base seca)
X................UFC.g
-1
......... Concentrao de biomassa
x.................m................... Coordenada cartesiana horizontal
X
max
...........UFC.g
-1
......... Concentrao mxima de biomassa na equao logstica
y
a
...............g
W
.g
-1
............. Concentrao de vapor no ar do headspace
y
EQ
.............g
W
.g
-1
............. Concentrao de vapor em equilbrio com o leito
y
in
...............g
W
.g
-1
............. Concentrao de vapor no ar na entrada
y
out
.............g
W
.g
-1
............. Concentrao de vapor no ar na sada
Y
Ac/X
...........g
Ac
.UFC
-1
...... Razo de produo de acetato por biomassa formada
2
/ O X
Y .........UFC.g
O2
-1
...... Razo de formao de biomassa por O
2
consumido
2
/ CO X
Y ........UFC.g
CO2
-1
.... Razo de formao de biomassa por CO
2
produzido
Y
X/P
............UFC.g
P
-1
........ Razo de biomassa formada por produo/consumo de
produto/substrato
Y
Q/X
............J.UFC
-1
.......... Razo de gerao de calor metablico por biomassa formada
Y
S/X
............g
S
.UFC
-1
........ Razo de consumo de substrato por biomassa formada
z.................m................... Coordenada vertical

XV
................g
Ac
.UFC
-1
...... Parmetro de proporcionalidade entre reduo da concentrao de
acetato e a velocidade de morte celular
................[adim]............ Emissividade das paredes do biorreator
.................[adim]............ Porosidade do leito
w
..............J.g
-1
................ Calor latente de evaporao da gua
................h
-1
.................. Velocidade especfica de crescimento
max
...........h
-1
.................. Velocidade especfica mxima de crescimento
opt
.............h
-1
.................. Velocidade especfica de crescimento microbiano sob condies
timas
0
T
............h
-1
.................. Velocidade especfica de crescimento na temperatura de referncia
a
...............g.m
-3
.............. Massa especfica do ar
b
...............g.m
-3
.............. Massa especfica mdia do leito
p
...............g.m
-3
.............. Massa especfica da parede do biorreator
s
...............g.m
-3
.............. Massa especfica dos slidos secos
................J.h
-1
.m
-2
K
-4
.... Constante de Stefan-Boltzmann

Captulo 1
Introduo
Nas ltimas dcadas, o crescimento populacional, com o conseqente aumento do
consumo dos limitados recursos naturais do planeta, tem obrigado o homem a buscar
alternativas aos processos produtivos tradicionais. Estas alternativas devem-se caracterizar
pela substituio de fontes no-renovveis por renovveis, pela minimizao do uso de
energia e da gerao de resduos, e pela eficincia produtiva.
Nesse contexto, os bioprocessos tm-se apresentado como uma alternativa aos
tradicionais processos qumicos estudados na Engenharia Qumica, com a vantagem de serem
mais ecologicamente corretos e utilizarem recursos naturais renovveis.
Entretanto, a viabilidade econmica dos bioprocessos depende, a exemplo dos
processos qumicos, de um entendimento da relao entre a cintica de reao e os fenmenos
de transporte associados converso de reagentes em produtos, tanto em micro como em
macro escala. Assim, importante perceber o papel que engenheiros qumicos, juntamente
com bilogos, devem desempenhar no desenvolvimento desses processos.
INTRODUO 2

Esta aplicao de princpios de engenharia qumica aos processos biolgicos
importante especialmente no caso de produtos de baixo valor agregado e grande volume de
produo, nos quais o sucesso depende de pequenos ganhos que se pode obter no processo.
Os cultivos em estado slido (CES) se caracterizam por utilizarem substratos
insolveis, em geral resduos agroindustriais, e reduzida quantidade de gua. Assemelham-
se, assim, aos processos fermentativos que ocorrem na natureza. Apresentam algumas
vantagens em relao aos cultivos submersos (CSm), que utilizam grande quantidade de gua
e substratos mais refinados.
Por outro lado, ainda necessrio ampliar muito o desenvolvimento tecnolgico dos
CES, especialmente quanto engenharia do processo. Exatamente os aspectos de cintica de
reao e fenmenos de transporte, to importantes para a viabilidade da produo, esto muito
pouco caracterizados para as condies de CES.
O Brasil um dos maiores produtores agrcolas do mundo, e a agro- indstria
brasileira teve forte expanso nos ltimos anos, destacando-se como grande exportadora e
geradora de renda longe dos tradicionais centros metropolitanos, levando assim dinamismo
econmico para as regies do interior do territrio, outrora economicamente dormentes. Logo,
nosso pas tambm um importante gerador de resduos agroindustriais, que, em geral, ainda
esto subaproveitados, por vezes configurando inclusive problemas ambientais.
Alm disso, o Brasil lder mundial na produo de produtos biotecnolgicos de
grande volume, devido ao lcool combustvel. H dcadas o Pas tem-se destacado na busca
de fontes alternativas de energia, produzidas a partir de fontes renovveis, sendo o lcool o
principal exemplo, seguido pelos recentes investimentos na produo de biodiesel.
Analisando esses argumentos, fica claro o grande potencial apresentado por nosso
pas no ramo da biotecnologia industrial, em especial para os cultivos em estado slido. Estes
processos ainda esto muito pouco desenvolvidos, mas surgem como uma alternativa muito
INTRODUO 3

promissora. Desta forma, o esforo de trabalhos como este se justifica pela necessidade de
maior entendimento dos aspectos de engenharia envolvidos nestes cultivos.
Este trabalho teve por objetivo estudar um processo de cultivo em estado slido que
utiliza um resduo agroindustrial como substrato para o desenvolvimento de uma bactria do
gnero Bacillus, isolada de ambiente amaznico, produtora de enzimas de interesse comercial.
Especificamente, objetivou-se:
estudar a transferncia de massa e a dinmica de mistura em um biorreator cilndrico
horizontal agitado (BCHA), utilizando um substrato slido pastoso, diferente daqueles j
estudados na literatura, que so particulados.
desenvolver metodologia para estimao da biomassa no processo a partir da sua taxa de
produo de CO
2
.
monitorar o comportamento de diferentes parmetros mensurveis durante o cultivo,
buscando o entendimento dos fenmenos fsicos e qumicos envolvidos no processo.
iniciar o desenvolvimento de modelos matemticos para descrever o processo, baseando-se
nas variveis monitoradas nos experimentos.
Esta dissertao foi dividida em 5 captulos, um apndice e um anexo, sendo que esta
Introduo corresponde ao primeiro captulo. O Captulo 2 compe-se de uma reviso
bibliogrfica sobre cultivos em estado slido, quantificao de biomassa e modelagem
matemtica destes processos. O terceiro captulo trata da metodologia adotada nos
experimentos em laboratrio e durante a fase de modelagem do sistema, enquanto o quarto
traz os resultados obtidos e a discusso de seu significado. No Captulo 5, so apresentadas as
concluses do trabalho e perspectivas para trabalhos futuros. Finalmente, no Apndice A
esto listados alguns problemas enfrentados na realizao do trabalho, que prejudicaram os
resultados finais; e no Anexo I h uma informao adicional sobre a metodologia do trabalho.
Captulo 2
Fundamentos e Reviso Bibliogrfica
2.1 Cultivo em Estado Slido
Mitchell e Lonsane (1992) j apontavam a dificuldade de se definir precisamente o
conceito de cultivo em estado slido. Pandey (2003) definiu cultivo em estado slido (CES)
como o cultivo de microrganismos em substratos slidos insolveis na ausncia (ou quase
ausncia) de gua livre. Esta definio, ainda que um tanto vaga e incapaz de delimitar
fronteiras claras entre cultivos slidos e submersos (CSm), estabelece a diferena bsica entre
estes dois conceitos: a quantidade de gua (Mitchell et al., 2000).
Exemplos clssicos de CES so as fermentaes do po e de alguns queijos. J o
conceito de CSm est representado nas fermentaes alcolicas para produo de bebidas ou
lcool combustvel.
Nos CES, uma matriz slida adsorve a quantidade (limitada) de gua que fornecida
para o processo, diferentemente dos CSm, em que os substratos e microrganismos se
encontram dissolvidos ou suspensos em grande quantidade de gua. Entretanto, tambm em
CES, o substrato deve conter umidade suficiente para sustentar o crescimento e o
2.1 CULTIVO EM ESTADO SLIDO 5

metabolismo microbiano (Pandey, 2003), mas a gua encontra-se fundamentalmente
adsorvida em uma matriz slida.
O CES imita o crescimento de microrganismos na natureza em slidos midos e
considerado responsvel pelo incio das tcnicas fermentativas na Antigidade (Mitchell e
Lonsane, 1992).
Gervais e Molin (2003) lembram que, mesmo em CES, os microrganismos esto em
meio lquido, j que as transferncias de massa ocorrem em um filme lquido que circunda os
microrganismos. Assim, em geral, trs fases esto presentes nos CES (slido, lquido e gs),
em oposio aos sistemas bifsicos (gs + lquido) do CSm. Os autores apontam ainda que
uma das principais diferenas entre CES e CSm a possibilidade de agitao. Os cultivos
lquidos costumam ser tratados como reaes em meio homogneo, perfeitamente misturado,
enquanto a alta viscosidade do meio no CES reduz a possibilidade de agitao, j que as
tenses de cisalhamento originadas poderiam danificar o microrganismo.
Mltiplos termos j foram utilizados na literatura em referncia a cultivos em estado
slido, p.ex.: fermentao em meio slido, fermentao em fase slida, processo em estado
slido, fermentao de slidos midos, fermentao semi-slida, cultivo semi- slido, cultura
de superfcie, fermentao koji, entre outros (Mitchell e Lonsane, 1992).
Pandey (1994) aponta que, embora os registros da utilizao de CES venham desde a
Antigidade, na fabricao de pes, queijos e koji (alimento fermentado tpico do Extremo
Oriente), os processos em meio slido foram completamente negligenciados no Ocidente a
partir da dcada de 1940, em benefcio dos processos submersos. O autor afirma ainda que
no houve uma razo clara para esta opo, mas talvez tenha sido decorrncia do sucesso da
produo da penicilina em CSm. Conforme Mitchell e Lonsane (1992), no foi realizada
nenhuma comparao entre os aspectos econmicos das duas tcnicas ao se optar pelo
desenvolvimento em CSm. Pandey (1994) complementa que, nas dcadas seguintes, poucos

trabalhos foram realizados em CES, at que na dcada de 1980 ressurgiu o interesse por estes
processos.
A Tabela 2.1 apresenta algumas diferenas importantes entre cultivos submersos e
cultivos em estado slido.
Tabela 2.1: Comparao entre CES e CSm
Cultivo em estado slido Cultivo submerso
Meio de cultivo no fluido Meio de cultivo fluido
Profundidade do leito costuma ser limitante Profundidade sempre maior
Substrato slido adsorve gua, e nutrientes
consumidos provm destes slidos midos
Nutrientes esto dissolvidos na gua
A formao de gradientes de concentrao e
temperatura comum nos processos
Agitao garante uniformidade do meio.
Quantidade de gua restrita, apenas
suficiente para manter os nveis de
crescimento.
A gua abundante, sem uma
padronizao.
Sistema envolve trs fases: slido, lquido e
gs.
Sistema envolve apenas fases lquida e
gasosa.
Fase lquida descontnua Fase lquida contnua
Inculo grande
Inculos menores, a no ser que o processo
demande.
Bactrias e leveduras crescem aderindo-se
s partculas de substrato
Clulas ficam uniformemente distribudas
no lquido em culturas agitadas.
Exemplos: po, queijos Exemplos: bebidas alcolicas
Fonte: Adaptado de Mitchell e Lonsane, 1992.
Vrios processos de cultivo em estado slido tm sido pesquisados e desenvolvidos.
As aplicaes so bastante diversificadas, indo das de baixa tecnologia, como o aumento de
valor nutricional e produo de biomassa, e chegando at algumas de alta tecnologia como
produo de enzimas, compostos orgnicos e antibiticos. Os tipos de resduos agroindustriais
utilizados tambm so extremamente diversificados. A Tabela 2.2 apresenta algumas
aplicaes desenvolvidas de CES.

Tabela 2.2: Algumas aplicaes de CES.
Aplicao/Produto Substrato Microrganismo Referncia
Enriquecimento
protico
Palha de trigo
Trichoderma reesei
e Endomycopsis
fibuliger
Laukevics et al.
(1984)
Amiloglucosidase
Farelo de trigo e farinha
de milho
Aspergillus niger Ghildyal et al. (1985)
Celulase Farelo de trigo
Trichoderma reesei
e Sporotrichum
cellulophilum
Kim et al. (1985)
Delignificao
Madeira de vidoeiro
(btula)
Phanerochaete
chrysosporium
Mudgett e Paradis
(1985)
-amilase Farelo de trigo
Bacillus
licheniformis
Lonsane e Ramesh
(1990)
Delignificao Palha de trigo
Trametes versicolor
e Pleurotus ostreatus
Valmaseda et al.
(1991)
Etanol
Meio lquido adsorvido
em bagao de cana
Schwanniomyces
castellii
Saucedo-Castaeda et
al. (1992a)
Protease Farelo de trigo Aspergillus niger
Padmanabhan et al.
(1993)
-galactosidade
Soro de leite
desproteinado adsorvido
em grits de milho ou
farelo de trigo
Kluyveromyces lactis
Becerra e Gonzlez
Siso (1996)
Inulinase
Farelos de arroz e trigo,
bagao de cco e farinha
de milho
Staphylococcus sp. e
Kluyveromyces
marxianus
Selvakumar e Pandey
(1999)
cido giberlico
Meio lquido adsorvido
em amberlite
Gibberela fujikuroi Gelmi et al. (2002)
cido ctrico Bagao de mandioca Aspergillus niger Prado et al. (2004)
Xilanase Fibra de soja Bacillus coagulans Heck et al. (2005)

Robinson et al. (2001) afirmam que o CES tem potencial para, no futuro, substituir
com vantagens o CSm na produo de metablitos secundrios.
Vrios trabalhos apontam vantagens na utilizao de CES em comparao a CSm
(Mitchell e Lonsane, 1992; Lonsane, 1994; Raimbault, 1998), como:

utilizao de substratos mais baratos (que no precisam ser solveis), em geral, resduos
agroindustriais;
como a atividade de gua (Aw) mais baixa que em CSm, h menor risco de
contaminao, reduzindo a necessidade de condies asspticas (por vezes o substrato sequer
esterilizado), e tambm a necessidade de mo-de-obra especializada;
menor gasto energtico;
menor uso de gua, que leva a uma menor gerao de efluentes lquidos, alm de menor
volume de equipamento e, conseqentemente, menor capital inicial;
maior transferncia de oxignio, favorecendo processos aerbios;
maior concentrao final de produtos, reduzindo custos do processamento downstream;
alguns parmetros no precisam ser controlados com o mesmo rigor que em CSm;
Ramesh e Lonsane (1991) relatam que a produo de -amilase por Bacillus
licheniformis M27 em CES minimizou o efeito de inibio por substrato que era observado
em CSm.
Apesar de a reduo de custos ser muito citada por aqueles que defendem os CES,
falta na literatura um nmero maior de comparaes de ordem econmica entre CES e CSm
(Mitchell e Lonsane, 1992; Raimbault, 1998), ficando como exemplo o trabalho de Ghildyal
et al. (1985), sobre a produo de amiloglucosidase por Aspergillus niger. Estes autores
concluram que, para este caso, o processo em CES era economicamente vantajoso.
Entretanto, Mitchell e Lonsane (1992) e Pandey (2003) tambm apontam algumas
desvantagens nos CES em comparao aos CSm:
o cultivo em estado slido restrito a microrganismos que se adaptem s condies de
baixa disponibilidade de gua;

a transferncia de massa e energia menos efetiva no meio slido, o que pode gerar
gradientes considerveis de concentrao e temperatura, que podem vir a limitar o
crescimento;
os tempos de cultivo costumam ser mais longos;
extratos obtidos pela lixiviao (leaching) dos produtos do cultivo costumam ser bastante
viscosos, o que pode dificultar algumas etapas downstream;
muitos importantes aspectos cientficos e de engenharia ainda esto pouco caracterizados
em CES, sendo a maior parte do trabalho ainda qualitativa ou emprica, devido s dificuldades
encontradas na quantificao de parmetros importantes do cultivo, como biomassa;
vrios tipos de sensores (pH, concentrao) utilizados em CSm so inadequados para
CES;
ainda no h informao suficiente sobre a cintica de reaes em CES e a modelagem
dos processos ainda precisa ser muito estudada;
Raimbault (1998) afirma que, devido dificuldade em medir e controlar os
parmetros ambientais, como feito em CSm, os microrganismos que tm sido selecionados
para CES so mais tolerantes em relao s condies de cultivo.
2.1.1 Uso de bactrias em CES
Os trabalhos desenvolvidos em CES esto ligados principalmente utilizao de
fungos filamentosos. Este fato deve-se principalmente idia de que as tcnicas de CES no
seriam aplicveis ao cultivo de bactrias, devido ao maior requerimento de gua por parte
destas. Alm disso, fungos so capazes de formar hifas que penetram nos poros dos substratos
slidos, enquanto bactrias, em geral, no tm esta habilidade (Lonsane e Ramesh, 1990).
Mitchell (1992a) afirma que os processos de CES envolvendo bactrias e leveduras
so poucos em nmero, mas so de grande importncia na natureza e na indstria de
alimentos. Exemplos so a compostagem (bactrias termoflicas), a ensilagem (Lactobacilli),

a produo de alimentos orientais como o natto (Bacillus subtilis), a microflora secundria de
queijos (Lactobacillus e Propionibacterium) e a produo de po (levedura Saccharomyces).
O desenvolvimento de processos no-tradicionais com bactrias ainda escasso,
destacando-se processos para produo de -amilase com bactrias do gnero Bacillus
(Ramesh e Lonsane, 1991) e a produo de inulinase por Staphylococcus sp (Pandey et al.,
2000).
2.1.2 O pH em CES
O pH do meio de cultura pode variar em resposta ao metabolismo microbiano. O
caso mais bvio a excreo de cidos orgnicos, como actico ou ltico, que faro o pH cair.
Por outro lado, o consumo destes mesmos cidos presentes no meio pode causar o aumento do
pH (Prior et al., 1992).
A utilizao da fonte de nitrognio tambm pode causar alterao no pH. Com sais
de amnio (
+
4
NH ), o pH tende a cair durante o cultivo, j que o metabolismo deste ction
libera um on hidrognio. Por outro lado, quando a fonte de nitrognio nitrato (

3
NO ), ons
hidrognio do meio so consumidos para reduzir o nitrato a
+
3
NH R . O pH tambm aumenta
quando aminas orgnicas so deaminadas (Prior et al., 1992).
Normalmente, o pH em CES determinado pela medida tomada em suspenses ou
extratos aquosos da amostra slida (Raghavarao et al., 2003).
Conforme Prior et al. (1992), em alguns trabalhos, utiliza-se pH baixo como meio de
impedir o desenvolvimento de contaminantes, especialmente em processos onde o substrato
no esterilizado.
Os mesmos autores afirmam ainda que o controle de pH pela adio de solues
concentradas de cido ou base, como comumente se faz em CSm, impraticvel em CES.
Porm possvel obter certo grau de controle de pH em CES utilizando diferentes propores
2.2 QUANTIFICAO DE BIOMASSA EM CULTIVO EM ESTADO SLIDO 11

de sais de amnio e uria no substrato (Raimbault, 1998). O nitrato de amnio (NH
4
NO
3
),
isoladamente, tambm tem sido utilizado para este fim. Os mesmos autores afirmam ainda
que os maiores problemas em termos de controle de pH podem-se dar em biorreatores
estticos, onde difcil evitar mudanas locais de pH.
Muitos trabalhos, entretanto, no apresentam nenhum tipo de preocupao com o
controle do pH. Considera-se que o prprio substrato slido possui propriedades tamponantes,
o que eliminaria a necessidade do controle (Lonsane e Ramesh, 1990).
Prado et al. (2004), estudando a produo de cido ctrico em CES, adicionaram
uria ao meio para controle do pH nas primeiras 24h, quando se formava a maior parte da
biomassa. Aps este perodo, o pH do meio comeava a cair.
Considerando estes aspectos, pode-se afirmar que a dificuldade em controlar o pH
em CES configura outra desvantagem em relao aos CSm, j que a falta deste controle pode
impedir a obteno de alguns produtos especficos, de alto valor agregado.
2.2 Quantificao de Biomassa em Cultivo em Estado
Slido
A biomassa um parmetro fundamental na caracterizao do crescimento
microbiano, logo, sua medida essencial para estudos cinticos de cultivos em estado slido.
Entretanto, a medida direta da biomassa em CES bastante difcil, devido dificuldade de
separar o microrganismo do substrato, especialmente no caso de fungos filamentosos
(Mitchell, 1992b), e pela natureza insolvel do meio de cultivo, que impede o uso de tcnicas
tradicionais dos CSm, como peso-seco e turbidimetria (Madrid e Felice, 2005). A cintica e a
modelagem matemtica do crescimento fngico em CES tm recebido pouca ateno devido
dificuldade em estimar a biomassa (Lekha e Lonsane, 1994).

Mitchell (1992b) aponta ainda a questo de como expressar a quantidade de
biomassa em CES: em termos absolutos (gramas de peso seco) ou como concentrao (grama
de peso seco por grama de meio de cultivo). Esses valores iro diferir porque normalmente a
massa do meio diminui significativamente ao longo do cultivo devido converso do
substrato em dixido de carbono. Alm disso, h a questo de se usar base seca ou mida para
a concentrao de biomassa no meio. De qualquer forma, importante que o mtodo de
expressar estes valores seja cuidadosamente descrito, para que comparaes possam ser feitas.
Segundo o mesmo autor, mtodos ideais para estimar biomassa em CES devem
apresentar as seguintes caractersticas:
obteno de resultados com rapidez, de forma a permitir tomada de decises durante o
processo.
ser barato, tanto em termos de aparelhagem como de reagentes.
ser simples em sua execuo, j que operadores devero precisar apenas de treinamento
bsico.
ser reprodutvel, preciso e no-suscetvel interferncia por componentes do substrato.
H uma grande variedade de metodologias que so utilizadas para quantificar
biomassa, a grande maioria se destina aos cultivos envolvendo fungos filamentosos. Percebe-
se que cada trabalho pode exigir uma metodologia diferente, de acordo com o sistema
trabalhado (substrato, microrganismo).
As metodologias utilizadas se encaixam basicamente nestas categorias (Lekha e
Lonsane, 1994; Mitchell, 1992b; Raimbault, 1998):
Mtodos diretos:
Separao direta da biomassa da matriz slida;
Mtodos indiretos:
Medida de algum componente da biomassa; e

Medidas de atividade metablica.
2.2.1 Mtodos diretos
Em geral, envolvem a separao da biomassa do substrato e, por isso, dificilmente
podem ser utilizados para fungos filamentosos. No caso de culturas com bactrias e leveduras,
a quantificao de biomassa pode ser mais fcil, j que a separao de microrganismo e
substrato mais simples (Lekha e Lonsane, 1994). Entretanto, os mtodos diretos so todos
destrutivos e no-aplicveis on- line.
Saucedo-Castaeda et al. (1992a) produziram etanol com a levedura
Schwanniomyces castellii em meio lquido absorvido num suporte inerte de bagao de cana
modo com granulometria de 0,3-0,8 mm. Para a quantificao de biomassa, o meio era
sonicado com gua esterilizada e filtrado em peneira de 50 m, sendo o filtrado utilizado para
contagem de clulas em hemocitmetro e para determinar peso seco. A granulometria
controlada do suporte inerte permitia o uso desta tcnica.
Sugama e Okazaki (1979) utilizaram tcnica semelhante. Para quantificao de
biomassa, o seu substrato, farinha de arroz, foi digerido com um preparado enzimtico e ento
filtrado. Entretanto, resduos no-digerveis do substrato interferiam na estimao, e este
mtodo no apropriado para substratos com teores considerveis de insolveis.
Sato et al. (1983) homogeneizaram amostras de Candida lipolytica cultivadas em
arroz. A suspenso foi filtrada para remover os slidos e as clulas de levedura foram
quantificadas por contagem em placas ou hemocitmetro.
Alguns estudos levaram ao desenvolvimento de meios de cultivo modelo, nos quais
possvel recuperar totalmente a biomassa, mas cuja aplicabilidade se limita pesquisa
laboratorial, como na calibrao de mtodos indiretos. Mitchell et al. (1989) utilizaram
cultivos em membranas, as quais retiam a biomassa, enquanto permitiam a passagem de
nutrientes do substrato. Weber et al. (1999) desenvolveram um meio slido base de -

carragena, o qual pode ser solubilizado com gua desmineralizada, permitindo a recuperao
total da biomassa.
Estudos em escala laboratorial, utilizando placas de Petri, permitem estimar a
biomassa fngica pela extenso linear do miclio. Smits et al. (1996) utilizaram esta medida
para validar mtodos indiretos de estimao da biomassa em CES.
Para bactrias e leveduras, apesar do reduzido nmero de trabalhos que utilizam estes
microrganismos em CES, diversos autores concordam que os mtodos de contagem em placas
so apropriados para quantificar biomassa (Mitchell, 1992b; Lekha e Lonsane, 1994;
Raimbault, 1998). Madrid e Felice (2005) classificam a contagem em placas, juntamente com
peso-seco, como mtodos de referncia para desenvolvimento de tcnicas de estimao de
biomassa. Pirt (1975) afirma que a contagem em placas o mtodo mais sensvel para
quantificar biomassa, e que deve-se utilizar meio rico nas placas ao invs de meio mnimo.
Cita como desvantagem do mtodo, entretanto, erros inevitveis de amostragem.
Mitchell (1992b) frisa que as tcnicas de contagem em placas tambm j foram
testadas para fungos filamentosos, porm, os resultados so questionveis, uma vez que no
h uma relao direta entre a quantidade de biomassa e o nmero de fragmentos de miclio
formados durante a homogeneizao. Alm disso, este processo levaria morte de muitos
fragmentos de miclio. Por fim, esporos fngicos contariam como clulas vivas, apesar de
estarem inativas no momento da amostragem.
2.2.2 Mtodos indiretos - Medida de componentes da biomassa
No caso do cultivo de fungos, que representa a grande maioria dos trabalhos em
CES, a biomassa no pode ser estimada de forma confivel pelos mtodos diretos, e por isso
foram desenvolvidas metodologias que quantificam um determinado componente do
microrganismo e relacionam quantidade total de biomassa. Tomaselli Scotti et al. (2001)

apontam que as metodologias que se baseiam na medida de um componente da biomassa
devem satisfazer algumas condies, conforme mostrado na Figura 2.1.

Figura 2.1: rvore decisria para validao de mtodo indireto baseado em componente da biomassa.
Fonte: Adaptado de Tomaselli Scotti et al. (2001).
2.2.2.1 Nitrognio e Protena
So os componentes da biomassa de medio mais imediata. Diferentes mtodos j
foram testados: Kjeldahl, Lowry e Biureto. No considerado um mtodo muito apropriado,
j que a protena presente no substrato interfere na medida, e diferentes trabalhos mostram
que o contedo protico da biomassa no constante (Mitchell, 1992b). S recomendado
para substratos com baixo teor de protena. Como exemplo, h o trabalho de Carrizales et al.
(1981), que utilizaram farinha de mandioca, de baixo contedo protico, suplementada com
sulfato de amnio como nica fonte de nitrognio, o que permitia separar nitrognio orgnico
de inorgnico durante a anlise.

2.2.2.2 cidos nuclicos
Bajracharya e Mudgett (1980) utilizaram a medida de DNA para estimar biomassa de
Aspergillus oryzae em arroz. O contedo inicial de DNA do substrato foi descontado das
medidas, j que pde ser provado que o fungo no produzia DNA-ases extracelulares. Porm,
em cultivos submersos, percebeu-se que o contedo de DNA da biomassa do fungo caa na
fase estacionria. Assim, para o CES, os autores utilizaram a quantidade mdia para converter
a medida de DNA em biomassa.
Mtodos baseados na determinao de DNA ou RNA, alm de serem caros, s so
viveis se o substrato no contiver quantidades significativas destes componentes, nem
interferentes (Lekha e Lonsane, 1994). Exemplos de substrato seriam alguns materiais
celulsicos. Ainda assim, no h trabalhos recentes utilizando esta tcnica.
Conforme Priest (1977) bactrias do gnero Bacillus so produtoras de vrias
enzimas hidrolticas extracelulares, incluindo nucleases, enquanto o RIFS, por ser um resduo
de componentes vegetais, certamente possui cidos nuclicos. Estes fatos j impedem a
utilizao dessa tcnica neste trabalho.
2.2.2.3 Glicosamina
A N-acetilglicosamina (NAG) o monmero da quitina (poli-N-acetilglicosamina),
componente da parede celular de fungos. A medida envolve a hidrlise qumica da quitina e
quantificao da glicosamina liberada (Lekha e Lonsane, 1994).
Pode ocorrer interferncia na medida no caso do cultivo em resduos agrcolas
complexos, que podem conter glicosamina em glicoprotenas. Nestes substratos, entretanto, a
quantidade de glicosamina presente deve permanecer constante (Mitchell, 1992b).
A preciso do mtodo depende de se estabelecer um fator de converso confivel
entre o contedo de glicosamina e o peso seco da biomassa. A principal desvantagem do
mtodo exatamente que este fator de converso varia de acordo com o meio e as condies

de cultivo, e fatores obtidos de cultivos submersos podem no ser apropriados para o cultivo
em meio slido. Alm disso, o procedimento analtico longo e tedioso, podendo levar at 24
horas (Lekha e Lonsane, 1994).
Ooijkaas et al. (1998) verificaram aumento no contedo de glicosamina em
Coniothyrium minitans, cultivado em placas de Petri, ao longo do tempo de cultivo.
Ainda assim, o mtodo mais comumente utilizado para estimar biomassa fngica
em CES.
Recentemente, alguns trabalhos de modelagem em CES tm utilizado o contedo de
glicosamina diretamente como parmetro de biomassa, sem fazer uso de fatores de converso
(Smits et al., 1996; Smits et al., 1998).
Na literatura no citado nenhum componente celular de bactrias que possa ser
utilizado como parmetro de biomassa em CES com a mesma eficincia que a glicosamina de
fungos.
2.2.2.4 Ergosterol
Ergosterol o esterol predominante na membrana celular de fungos. Compostos da
membrana celular so interessantes para realizar estimao de biomassa, j que costumam ser
rapidamente degradados aps a morte celular e porque se assume que a rea da membrana
bem correlacionada ao volume celular. Alm disso, o contedo de esteris parece manter-se
aproximadamente constante na biomassa fngica. Assim, o ergosterol bastante utilizado
para determinar biomassa fngica no solo, em gros de cereais e em material em
decomposio (Olsson et al., 2003), bem como em CES (Lekha e Lonsane, 1994).
Matcham et al. (1985) compararam diferentes tcnicas de estimao de biomassa
para Agaricus bisporus e afirmaram que a anlise de ergosterol mais simples e rpida do que
a de glicosamina, j que aquele pode ser separado por cromatografia lquida (HPLC) e

quantificado facilmente por espectrofotometria em UV. Alm disso, afirmam ainda que o
mtodo do ergosterol foi mais sensitivo para nveis baixos de crescimento do miclio.
Entretanto, outros trabalhos indicam que o contedo especfico de ergosterol pode
variar muito com idade da cultur a, composio do meio e condies de cultivo, tornando a
tcnica inadequada (Mitchell, 1992b).
2.2.3 Mtodos indiretos Medidas de atividade metablica
2.2.3.1 Respirometria
A respirao o processo metablico pelo qual os microrganismos aerbios obtm a
maior parte de sua energia para o crescimento, consumindo O
2
e produzindo CO
2
. Estas
atividades so, portanto, associadas ao crescimento e podem ser utilizadas para a estimao da
biomassa (Mitchell, 1992b; Raimbault, 1998).
A determinao do consumo de O
2
(OUR oxygen uptake rate) e da produo de
CO
2
(CPR carbon dioxide production rate) envolve a medida da concentrao destes gases
no ar de entrada e de sada do biorreator. Conhecendo-se a vazo de ar que entra e que sai,
alm da quantidade de meio de cultivo contida no biorreator, obtm-se os valores de OUR e
CPR.
Tem a grande vantagem de ser uma tcnica on-line e no-destrutiva (Raimbault,
1998), mas para ser utilizada na estimao de biomassa, precisa ser calibrada por algum outro
mtodo de referncia.
Conforme Mitchell (1992b), as medidas do consumo de O
2
ou da produo de CO
2

so mais poderosas quando acopladas a um modelo matemtico para correlao. O termo
modelo de correlao indica um modelo que relacione a quantidade de biomassa a um
parmetro mensurvel. Modelos de correlao no so, assim, modelos de crescimento, j que
no fazem predio sobre o comportamento do parmetro medido. A utilidade destes modelos

reside no fato de que, acompanhando-se o perfil do parmetro medido, pode-se construir um
perfil de biomassa.
J que CO
2
e O
2
so produto gerado e substrato consumido pelo metabolismo celular,
a correlao entre CPR ou OUR e biomassa costuma ser descrita por variantes do modelo de
Luedeking-Piret (Luedeking e Piret, 1959), considerando um termo associado ao crescimento
e outro termo de manuteno, no associado ao crescimento (Sugama e Okazaki, 1979; Sato
et al., 1983; Mitchell, 1992b), conforme as Equaes 2.1 e 2.2:
X m
dt
dX
Y
CPR
CO
CO X
+
2
2
/
1
(2.1)
X m
dt
dX
Y
OUR
O
O X
+
2
2
/
1
(2.2)
Raimbault (1998) afirma que a razo entre produo de CO
2
e consumo de O
2
,
chamado de quociente respiratrio (RQ), pode mudar com a fase de crescimento. E, segundo
Sato et al. (1983), se o RQ no constante, ento os parmetros do modelo de correlao
entre OUR ou CPR e biomassa tambm no seriam constantes, o que representa uma
limitao da tcnica.
Trabalhando em CSm, Petkov e Davis (1996) desenvolveram uma taxa de consumo
de oxignio modificada (OUR
X
), que levava em conta dois diferentes estados da biomassa de
Corynebacterium glutamicum: crescimento puro (RQ = 1,05) e fase de produo de L- lisina
(RQ = 2,0). A Equao 2.2 foi reescrita utilizando esta taxa modificada (Equao 2.3).
OUR
RQ
OUR
X

,
_
05 , 1 0 , 2
0 , 2
(2.3)
X m
dt
dX
Y
OUR
O
O X
X
+
2
2
/
1
(2.4)
Conforme Lekha e Lonsane (1994), o CPR sozinho falha em reconhecer o incio da
fase estacionria no desenvolvimento de fungos, sendo a preciso da tcnica maior nos

estgios iniciais do crescimento. De fato, o erro na estimativa tende a aumentar ao longo do
processo (Figura 2.2) pela natureza cumulativa deste erro; visto que, utilizando os modelos
apresentados, a estimativa da biomassa em qualquer instante de tempo depender sempre das
estimativas feitas nos instantes de tempo anteriores.

Figura 2.2: Exemplo do aumento do erro de estimao da biomassa.
A regio hachurada representa o intervalo de confiana da estimao, que aumenta ao longo do tempo.
Fonte: Adaptado de Biagiola et al. (2001).
De qualquer forma, o monitoramento do consumo de O
2
e da produo de CO
2

produz uma tima medida da atividade metablica do microrganismo, sendo muito
interessante como ferramenta inclusive no controle do processo. Saucedo-Castaeda et al.
(1992b) desenvolveram sistema de controle para um biorreator de leito fixo, tendo como
parmetro de controle a taxa de aerao do leito, de forma a manter a concentrao de CO
2
no
ar de sada constante em nveis baixos e assim conseguir rendimentos timos na produo de
biomassa em todas as alturas do leito.
A concentrao de oxignio pode ser medida atravs de medidores especficos,
paramagnticos ou polarogrficos. Em experimentos de escala laboratorial, Ramstack et al.
(1979) e Ooijkaas et al. (1998) utilizaram cromatgrafo a gs conectado on-line ao processo,
equipado com coluna tipo peneira molecular 5 e detector de condutividade trmica (TCD).
possvel tambm utilizar o mtodo manomtrico, como Kim et al. (1985), onde a amostra
colocada em uma cmara que contm ainda uma soluo alcalina. O metabolismo microbiano

ir consumir O
2
e liberar CO
2
. Este ltimo ser absorvido pela soluo alcalina, gerando uma
queda de presso na cmara, que pode ser relacionada ento OUR.
O mtodo mais indicado para medir a concentrao de CO
2
um medidor por
infravermelho, por sua resposta rpida (Saucedo-Castaeda et al., 1992b). A anlise por
cromatografia a gs tambm vivel em escala laboratorial (Ramstack et al., 1979; Saucedo-
Castaeda et al., 1992a; Ooijkaas et al., 1998). Sugama e Okazaki (1979) e Carrizales et al.
(1981) borbulharam o ar de sada do biorreator em solues alcalinas, as quais absorviam o
CO
2
e eram posteriormente tituladas para se obter a quantidade de gs carbnico liberada pelo
sistema.
interessante notar que a maioria dos trabalhos na literatura utiliza a medio de
apenas um dos dois gases (oxignio e gs carbnico) na estimao de biomassa.
2.2.3.2 Massa seca do leito
Terebiznik e Pilosof (1999) relacionaram biomassa perda de massa seca do leito.
Esta relao esperada, uma vez que, conforme Smits et al. (1996 e 1998), a perda de massa
seca do leito diretamente proporcional produo de CO
2
. Entretanto, esta tcnica tem
pouca aplicabilidade para sistemas maiores que a escala laboratorial.
2.2.3.3 Produo de enzimas extracelulares
Vrios autores apontam relaes lineares entre a produo de determinadas enzimas
extracelulares, em geral hidrolases, e o crescimento microbiano (Mitchell, 1992b). Entretanto,
poucos trabalhos utilizam a atividade enzimtica diretamente para estimar biomassa.
Matcham et al. (1985) apontam que a produo da enzima laccase por Agaricus
bisporus em CES foi proporcional extenso do miclio ao longo de 30 dias de cultivo. Smits
et al. (1996) concluram que as atividades de protease e xilanase de uma linhagem de
Trichoderma reesei em farelo de trigo estavam associadas ao crescimento da biomassa ao
longo das 125 horas de cultivo.

2.2.3.4 Medidas de fluorescncia
Fluorescncia o resultado de um processo em trs estgios que ocorre em certas
molculas (em geral, hidrocarbonetos poliaromticos ou heterocclicos) chamadas de corantes
fluorescentes. O processo responsvel pela fluorescncia est relacionado aos nveis de
energia das molculas e ao salto de um eltron de um estado de alta energia para um de
energia mais baixa, emitindo simultaneamente um fton (Madrid e Felice, 2005).
A absoro de radiao UV por uma molcula excita um eltron a um estado de
energia mais elevado. A molcula tende a rapidamente perder este excesso de energia, por
exemplo por colises com molculas vizinhas. A fluorescncia ocorre quando a molcula
retorna ao estado fundamental pela liberao de um fton.
Conforme Madrid e Felice (2005), fluroescncia a tcnica on-line de determinao
de biomassa mais utilizada. Pode ser utilizada in-situ nos cultivos submersos.
Hisiger e Jolicoeur (2005) utilizaram sensores de fluorescncia para quantificar
NAD(P)H, triptofano e riboflavinas em cultivo submerso. As concentraes destas
substncias puderam ser correlacionadas concentrao de biomassa.
Outra forma de utilizar a fluroescncia envolve a marcao do meio com algum
corante fluorescente adicionado ao meio de cultura. Soderstrom (1977) utilizou diacetato de
fluoroscena (FDA). Esta substncia no fluorescente at ser enzimaticamente hidrolisada
por esterases. Esta tcnica , portanto, uma medida de atividade enzimtica, e apenas regies
ativas do miclio iro fluorescer. Vrias culturas fngicas foram testadas isoladamente, e uma
boa correlao pde ser obtida entre a fluorescncia, crescimento e respirao.
2.2.3.5 ATP
Assumindo que clulas vivas de determinado microrganismo possuam quantidade
aproximadamente constante de ATP, o qual rapidamente perdido quando da morte celular,

esta medio pode ser um bom parmetro para estimar biomassa. Uma forma rpida de
quantificar ATP por bioluminescncia (Madrid e Felice, 2005).
Entretanto, Mitchell (1992b) afirma que a medida de ATP no CES pode fornecer
apenas uma estimativa grosseira da biomassa, j que algumas regies da biomassa podem
estar mais ativas que outras.
2.2.3.6 cidos orgnicos
Raimbault (1998) afirma que, freqentemente, a produo de cidos orgnicos est
associada ao crescimento. A medida pode ser efetuada pelo monitoramento do pH, por
titulao ou anlise em HPLC de extratos aquosos.
Porm, no h trabalhos que utilizem esta medida diretamente como parmetro para
estimar a biomassa.
2.2.4 Outras tcnicas
Pealoza et al. (1991) estimaram o crescimento micelial baseando-se na diferena de
condutividade eltrica entre substrato e biomassa, obtendo boa correlao e propondo um
modelo.
Auria et al. (1993) estudaram a relao entre a queda de presso do ar soprado em
um biorreator de leito fixo e o crescimento de um fungo filamentoso. O aumento do miclio
reduz porosidade do leito, aumentando a perda de carga do ar. Foi possvel criar uma relao
entre o crescimento microbiano e a queda de presso, que um parmetro facilmente
mensurvel on-line. Um ponto interessante da tcnica o fato de ser sensvel ao incio da
formao dos condios. Sua aplicabilidade, porm, bastante restrita.
Dubey et al. (1998) desenvolveram um mtodo ELISA (enzyme- linked
immunosorbent assay), que quantifica a reatividade de um anti-corpo contra o miclio de
Aspergillus niger. O mtodo foi avaliado como rpido, especfico e bastante sensvel.
2.3 MODELAGEM MATEMTICA DE BIORREATORES PARA CULTIVO EM ESTADO SLIDO 24

Bellon-Maurel et al. (2003), em seu artigo de reviso, apontam vrias tcnicas que
poderiam servir estimao de biomassa em CES, algumas j testadas, outras apenas
idealizadas, como:
SEM (Microscopia Eletrnica de Varredura), que permitiria acompanhar visualmente
crescimento do microrganismo.
FTIR (Infra-Vermelho) e FTIR PAS (Foto-Acstico) podem ser utilizados para
quantificar determinados compostos presentes no meio, como um componente da biomassa
que possa ser relacionado ao crescimento. Conforme Lekha e Lonsane (1994), a ligao
amida das protenas produz uma absoro caracterstica no espectro infravermelho. So
utilizados on-line em CSm, mas em CES ainda demandam amostragem do meio.
a viso artificial, com o uso de um analisador de imagens, permitiria acompanhar
crescimento dos microrganismos, e poderia ainda ser acoplada utilizao de marcadores
fluorescentes.
sensores de aroma, como narizes artificiais (e-noses) ou cromatgrafos a gs, para
quantificar produtos volteis associados ao crescimento.
sensores capazes de realizar tomografia, ou seja, o mapeamento 3-D do cultivo, utilizando
ressonncia magntica, por exemplo.
2.3 Modelagem Matemtica de Biorreatores para Cultivo em
Estado Slido
Mitchell et al. (2000a) revisaram os fenmenos que devem ser levados em conta no
desenvolvimento de modelos para processos de cultivo em estado slido, dividindo-os em de
micro e macroescala.
a) Fenmenos em microescala:
Crescimento microbiano e taxa de morte em resposta s condies ambientais.

A forma de crescimento microbiana, especialmente se o crescimento ocorrer na forma de
um miclio ou de um biofilme de organismos unicelulares.
O efeito do crescimento microbiano sobre o ambiente, pela liberao de enzimas e
produtos, e pelo consumo de nutrientes.
Difuso intra-partculas de compostos como O
2
, CO
2
, prtons (pH), enzimas, nutrientes
solveis, produtos de hidrlise e do metabolismo.
Transferncia entre as regies interparticulares e a partcula de substrato ou biomassa de
compostos como O
2
, CO
2
, gua, e produtos volteis do metabolismo.
Destruio da partcula devido ao crescimento, se a fonte de carbono contribui estrutura
fsica da partcula slida.
b) Fenmenos em macroescala:
Fluxo de ar para dentro e para fora do biorreator, levando energia e compostos como O
2
,
CO
2
, e gua.
Se o bioreactor operado com aerao forada ou agitao, fluxo de ar no espao inter-
partculas, levando energia e compostos como O
2
, CO
2
e H
2
O.
Conveco natural, difuso, e conduo, que so normalmente sem importncia na direo
de corrente de ar, mas podem ser importante na direo normal corrente de ar ou na
ausncia de aerao forada.
Conduo pela parede do biorreator e resfriamento convectivo para a vizinhana, que
pode ser ar ou uma camisa de gua.
Efeitos de cisalhamento causados pela agitao dentro do biorreator, inclusive dano para o
microrganismo em si, ou para a integridade das partculas de substrato.
Os modelos apresentados na literatura utilizam vrias simplificaes destes
fenmenos, at porque muitos so de difcil quantificao. Os trabalhos na rea tm se
preocupado principalmente com o balano energtico. Muitos ignoram os balanos de massa,

seja de substrato, seja de gua, no leito. As cinticas de crescimento e a estequiometria dos
processos tambm tm recebido ateno limitada.
Vrios tipos de biorreatores tm sido utilizados em CES. Conforme sua construo e
operao (agitao, aerao, etc.), os modelos utilizados para descrev-los mudam bastante. A
Figura 2.3 apresenta uma classificao simples de biorreatores para CES de acordo com as
caractersticas de agitao do leito (infreqente ou ausente, ou contnua) e aerao (forada ou
no- forada).

Figura 2.3: Classificao dos biorreatores de CES em funo das caractersticas de agitao e aerao.
As setas retas indicam o sentido da aerao.
Fonte: Adaptado de Mitchell et al. (2000a).
2.3.1 Biorreatores de leito fixo
Os biorreatores de leito fixo representam um dos tipos mais simples de biorreatores
para CES. A natureza esttica do leito o torna prprio para o desenvolvimento de organismos
sensveis s tenses de cisalhamento decorrentes da agitao, como os fungos. Sua
aplicabilidade em escala industrial, porm, ainda difcil, mas boas alternativas, como o

biorreator Zymotis, tm surgido (Mitchell et al., 2000a). As dificuldades para scale-up surgem
da prpria natureza esttica do leito, reduzidas transferncias de massa e energia, e da
compactao do substrato em leitos de grandes dimenses.
A Figura 2.4 apresenta um esquema dos fenmenos de transferncia de massa e
energia comuns em biorreatores de leito fixo. A ocorrncia de gradientes de temperatura no
leito praticamente inevitvel, e o grande desafio de engenharia minimizar estes gradientes.

Figura 2.4: Descrio dos fenmenos de transferncia de energia em biorreatores de leito fixo tradicional e
Zymotis.
Fonte: Mitchell et al. (2003).
No caso de leitos cilndricos, costuma-se ignorar a conduo axial, j que os
gradientes de temperatura mais pronunciados esto na direo radial, e a transferncia axial se
d principalmente pela adveco do ar. No biorreator Zymotis, onde placas resfriadoras
verticais esto colocadas paralelamente a pequena distncia, para manter uma maior
homogeneidade de temperatura no leito, a conduo na direo vertical desprezvel frente
horizontal.

O balano energtico macroscpico em coordenadas cilndricas, segundo
Sangsurasak e Mitchell (1998), dado por:
( )
Q b b z w a a b b
r
z
T
k
r
T
k r
r r z
T
V f Cp
t
T
Cp +
,
_
+
1
]
1
,
_

,
_
+ +
,
_

2
2
1
(2.5)
Os termos da Equao 2.5 correspondem variao de entalpia no leito, remoo de
calor pelo ar e por evaporao de gua, conduo nas direes radial e axial e gerao de
calor metablico.
Conforme Mitchell et al. (2003), caso o leito seja largo o suficiente, a conduo
radial pode ser insignificante para a remoo de calor, e o termo entre colchetes na Equao
2.5 pode ser eliminado.
Considera-se que o ar mantm-se saturado em vapor ao longo do leito, e o termo
f
W
, presente nos balanos de massa e energia, surge desta considerao, j que a evaporao
de gua aumenta o calor especfico aparente do ar. Esta relao deveria ser descrita pela
equao de Antoine, mas a aproximao linear aceitvel em uma faixa de variao de
temperatura de aproximadamente 20C, como nos cultivos (Mitchell et al., 2003).
O balano est sujeito s seguintes condies de contorno:
Na base do leito (entrada de ar):
a
T T z 0 (2.6)
No topo do leito (sada do ar):
0

z
T
H z
b
(2.7)
No centro do biorreator:
0 0

r
T
r (2.8)
Na parede do biorreator:
( ) T T
R
Bi
r
T
R r
w
b
b

(2.9)

Sendo:
b
b
k
R h
Bi

(2.10)
As propriedades devem ser calculadas como mdias ponderadas dos valores no ar e
no slido:
( )
s a b
+ 1 (2.11)
( )
s a b
k k k + 1 (2.12)
( ) ( ) ( )
b
s s w a a
b
Cp f Cp
Cp
+ +
1
(2.13)
Para o biorreator de leito- fixo do tipo Zymotis, entretanto, este balano deve ser feito
em coordenadas retangulares, conforme Mitchell e Meien (2000). A conduo axial
desprezada, j que as placas resfriadoras removem a maior parte do calor gerado.
( )
Q b z w a a b b
r
x
T
k
z
T
V f Cp
t
T
Cp +
,
_

,
_
+ +
,
_

2
2
(2.14)
Este balano est sujeito s seguintes condies de contorno:
Na base do leito (entrada de ar):
a
T T z 0 (2.15)
No centro do espao entre placas:
0 0

x
T
x (2.16)
Na superfcie das placas:
( )
w b
T T h
x
T
k L x
(2.17)
Os biorreatores de leito fixo, se ainda encontram dificuldade de aplicao na escala
industrial, so extremamente teis em escala laboratorial, nas fases iniciais de
desenvolvimento de processos, podendo fornecer valiosas informaes sobre cintica de
crescimento e metabolismo do microrganismo.

2.3.2 Biorreatores de bandejas
Biorreatores de bandejas consistem em uma cmara, que pode ser pequena como
uma incubadora ou grande como uma sala, na qual so colocadas bandejas de substrato
inoculado. O ambiente controlado atravs da temperatura e da umidade do ar que soprado
para dentro da cmara. Constituem, portanto, sistemas no-agitados com aerao no-forada.
Bastante simples, so empregados h sculos no Oriente na fabricao de alimentos
tradicionais (shoyu, miso). A dificuldade em automatizar o trabalho com as bandejas,
entretanto, cria uma demanda por grande quantidade de mo-de-obra (Mitchell et al., 2000a).
Conforme Mitchell et al. (2003), os primeiros modelos de biorreatores de bandejas
assumiam estado pseudo-estacionrio para escrever os balanos de oxignio ou energia no
leito. Os modelos mais recentes, de Rajagopalan e Modak (1994) e Smits et al. (1999)
consideram os balanos de massa e energia, sem assumir o estado pseudo-estacionrio.
O modelo de Rajagopalan e Modak (1994) considera uma bandeja com aerao no
forada. O fluxo de ar passa no topo da bandeja, na direo x
+
(Figura 2.5), e o oxignio
difunde para dentro do leito poroso. Admite-se a existncia de um biofilme de biomassa
cobrindo as partculas no leito, e o consumo de O
2
no biofilme foi equacionado atravs de
uma aproximao do estado pseudo-estacionrio. A taxa de crescimento seguiu uma equao
logstica, considerando ainda o oxignio como nico limitante, segundo cintica de Monod.
As equaes para representar este modelo so:
b
H z
O
h
b
O
x
O
X
x
O
z
C
z
D
x
C
V
t
C
2 2 2 2
(2.18)
( )
f
O O O x a
O
b
O
O
C H C a K
z
C
D
t
C
2 2 2
2
2
2
2
2

(2.19)
( )
X X O s
f
O O O x a
r Y C H C a K
/
2 2 2 2
(2.20)
( )

,
_

+

max
max
1
2 2
2
X
X
X
C K
C
r
f
O O
f
O
X
(2.21)

X
r
t
X
(2.22)
Na Equao 2.19, a transferncia de oxignio para dentro do leito se d por difuso,
apenas, enquanto a concentrao do gs na superfcie do biofilme est em equilbrio com a
concentrao nos poros seguindo a lei de Henry.

Figura 2.5: Comparao entre modelos para biorreatores de bandejas.
A Rajagopalan e Modak (1994); B Smits et al. (1999).
1) Difuso de O
2
, 2) transferncia de O
2
entre o meio e o biofilme, 3) difuso e consumo de O
2
no biofilme,
4) liberao de calor metablico, 5) conduo de calor, 6) difuso de O
2
, 7) evaporao, 8) difuso de gua,
9) conduo de calor, 10) consumo de O
2
e produo de gua e calor na reao de crescimento.
Fonte: Mitchell et al. (2003).
Conforme Mitchell et al. (2000b), assumir a existncia de um biofilme na superfcie
das partculas mais apropriado para microrganismos unicelulares (bactrias e leveduras) do
que para fungos.

Note-se que a porosidade do leito pode ser descrita como varivel no tempo. No
trabalho em questo, um balano semelhante foi desenvolvido para o CO
2
.
A taxa especfica de crescimento mxima foi considerada dependente da temperatura
e descrita por uma equao polinomial de quinta ordem.
Nenhum balano de gua foi escrito e o balano de energia envolvia apenas
conduo e gerao metablica de calor, conforme Equao 2.23.
Q b s s
r
z
T
k
t
T
Cp +

2
2
(2.23)
As condies de contorno para o problema so:
Na superfcie do leito:
x
O O
C C
2 2
(2.24)
( ) T T h
z
T
k
a b

(2.25)
J o modelo de Smits et al. (1999) no utiliza o conceito de biofilme (Figura 2.5) e
faz uma descrio mais simples do balano de O
2
no leito (Equao 2.26), novamente
havendo apenas difuso para dentro do leito, com consumo pelo microrganismo. Apresenta,
entretanto, um avano no sentido de levar em conta as possveis mudanas na umidade,
incluindo um balano de gua (Equao 2.27), composto de gerao metablica de gua,
variao na concentrao de vapor no ar dos poros devido variao de temperatura
(considera-se que o ar se mantm saturado) e difuso de vapor dgua nos poros. Por fim,
conduo, gerao metablica de calor e evaporao de gua entram no balano entlpico
(Equao 2.28).
2
2
2
2
2
2
O
b
O
b
O
b
O
r
z
C
D
t
C
(2.26)
1
]
1
2
2
*
2
z
C
D
t
C
r
t
C
VAP
VAP
VAP
O H
W
(2.27)
2
2
*
2
2
z
C
D r
z
T
k
t
H
VAP
VAP W Q b
+ +
(2.28)

O balano de gua, entretanto, de necessidade duvidosa, uma vez que as
simulaes mostraram que a difuso de gua pode ser pouco significativa (Smits et al., 1999).
2.4 Biorreatores de leito fluidizado
Neste biorreator, as partculas de substrato so fluidizadas por ar (ou outro gs)
soprado verticalmente a uma velocidade suficientemente alta. importante notar que este
design no aplicvel a todos os tipos de substrato, uma vez que a aplicabilidade depende das
caractersticas de fluidizao das partculas (Mitchell et al., 2000a).
Este modelo consiste basicamente de uma cmara vertical, a qual alargada na parte
superior para impedir que as partculas sejam carregadas para fora do biorreator. Na parte
inferior costuma haver um misturador, que quebra eventuais agregados de partculas que se
formam. Um esquema deste tipo de biorreator pode ser visualizado na Figura 2.6.

Figura 2.6: Esquema de biorreator de leito fluidizado.
Fonte: Mitchell et al. (2000b).
Segundo Mitchell et al. (2000a), j foram construdos biorreatores de leito fluidizado
para CES relativamente grandes, utilizados industrialmente. Entretanto, h poucos trabalhos
na literatura aberta que utilizam este tipo de equipamento.

A modelagem bastante simplificada, j que o alto fluxo de ar sobre partculas
pequenas torna a transferncia de calor intensa no leito, enquanto que eventuais perdas de
umidade podem ser repostas por asperso. A preocupao maior nos modelos so os
fenmenos intra-partcula. A Figura 2.7 apresenta de forma simplificada os efeitos
comumente considerados no desenvolvimento de modelos para biorreatores de leito
fluidizado.
A praticidade no estudo deste tipo de biorreator, pela possibilidade de utilizar
modelos mais simplificados, contrabalanada por um aumento nos custo de operao devido
s altas taxas de aerao necessrias, o que pode tornar o processo menos interessante
(Mitchell et al., 2000a).

Figura 2.7: Efeitos considerados em modelos de biorreatores de leito fluidizado.
1 Entrada de ar; 2 Gerao metablica de calor; 3 Mistura; 4 Transferncia convectiva de calor atravs
das paredes do biorreator; 5 Sada de ar; 6 Evaporao de gua.
Fonte: Mitchell et al. (2000a).
2.5 Biorreatores de tambor rotatrio
Os biorreatores de tambor rotatrio consistem de um cilindro horizontal que gira ao
redor de seu eixo. A entrada de ar costuma ser localizada em uma das extremidades do
cilindro, e a sada na oposta. Este tipo de equipamento tem despertado interesse porque
2
3
4
1
6 5

proporciona uma agitao suave no leito, o que muito importante quando se trabalha com
fungos filamentosos, por exemplo.
Hardin et al. (2002) estudaram a dinmica de mistura nestes biorreatores e citaram
seis possveis regimes de movimentao do leito, cuja ocorrncia dependente da velocidade
de rotao do cilindro. Estes regimes so apresentados na Figura 2.8.

Figura 2.8: Possveis regimes de movimentao do leito em biorreatores de tambor rotatrio.
Fonte: Adaptado de Hardin et al. (2002).
A literatura apresenta modelos que dividem o espao interno do biorreator em leito
slido, headspace e parede (Hardin et al., 2002; Mitchell et al., 2003), conforme apresentado
na Figura 2.9.

Figura 2.9: Efeitos considerados em modelo para biorreator de tambor rotatrio.
1 Entrada de ar; 2 Gerao de calor metablico; 3 Transferncia advectiva de calor entre leito e o ar;
4 Evaporao de gua do leito, com retirada de energia; 5 Conduo entre leito e parede do biorreator;
6 Adveco entre ar e parede do biorreator; 7 Perda advectiva de calor para o ambiente; 8 Sada de ar;
9 Mistura no leito; 10 Mistura no ar; 11 Homogeneidade trmica na parede do biorreator.
Fonte: Mitchell et al. (2000a).
Conforme Mitchell et al. (2003), para esta situao, o balano de energia no leito
fica:

( )
( )
( ) ( )
( ) ( ) [ ]
VAP a b W W b a EQ ba W
a b ba ba p b bp bp Q
S b
W S
Cp T T Cp T y y A k
T T A h T T A h r
dt
M T d
W Cp Cp
+
+
(2.29)
O termo do lado esquerdo da Equao 2.29 descreve a variao de entalpia do leito.
Os termos do lado direito representam a gerao de calor metablico, as trocas convectivas do
leito com a parede do biorreator e o ar de headspace, e a remoo de calor por evaporao de
gua.
O balano de energia no ar de headspace :
( )
( )
( )
( )
( )
( ) ( )
a p pa pa a b ba ba
VAP a a EQ ba W
a VAP G out a
in VAP G in in
G a
a VAP G
T T A h T T A h
Cp T y y A k
y Cp Cp F T
y Cp Cp F T
dt
M T d
y Cp Cp
+ +
+ +
+ +
+ +
+
(2.30)
Novamente, o termo do lado esquerdo descreve a variao de entalpia do sistema
considerado. J os dois primeiros termos do lado direito representam a entrada e sada de
energia com o ar, o terceiro termo, a energia adquirida atravs da gua evaporada do leito, e
os dois ltimos contabilizam as trocas convectivas do ar com o leito e a parede do biorreator.
Na parede, considerando as trocas convectivas com o leito, o ar de headspace e ainda
com o meio externo, o seguinte balano de energia foi escrito:
( ) ( ) ( )
e p pe pe a p pa pa p b bp bp
p
p p p
T T A h T T A h T T A h
dt
dT
Cp V (2.31)
O balano de gua no leito, considerando evaporao e gerao metablica, :
( )
( )
O H a EQ ba W
S
r y y A k
dt
W M d
2
+
(2.32)
J o balano de gua no ar de headspace pode ser descrito pela Equao 2.33, que
leva em conta a entrada e a sada de gua com o ar e a evaporao de gua do leito.
( )
( )
a EQ ba W a out in in
a G
y y A k y F y F
dt
y M d
+
(2.33)

Hardin et al. (2002) desenvolveram um modelo que levava em conta o tipo de
agitao e o conseqente regime de movimentao do leito (conforme Figura 2.8). Alm
disso, compararam diferentes formas para descrever o comportamento do ar de headspace:
mistura perfeita;
considerando plug- flow;
empregando o conceito de Central Jet Residence Time Distribution (RTD), que divide o
headspace em duas regies: uma central de plug- flow, ao longo do eixo de rotao, e uma
zona morta junto s paredes;
Concluram que o conceito de Central Jet RTD oferece uma alternativa mais simples
e realista para a soluo do problema.
2.6 Biorreatores de Tambor Agitado
Biorreatores de tambor agitado possuem ps para agitao interna, promovendo uma
maior homogeneizao dos perfis de temperatura e de concentrao no leito. Apesar de seu
grande potencial para aplicao em escala industrial, tm recebido pouca ateno em termos
de modelagem para CES. Conforme atesta Mitchell et al. (2000a), apenas tambores rotatrios
tm recebido ateno, pois o tipo de movimento destes causa menor dano ao miclio de
fungos filamentosos. Entretanto, bactrias so menos sensveis tenso de cisalhamento
gerada pelo movimento das ps, e tambores agitados apresentam-se como uma alternativa
bastante vivel neste caso. interessante notar que vrios elementos considerados na
modelagem de tambores rotatrios tambm so aplicveis em tambores agitados.
Muitas vezes, biorreatores de tambor permitem a instalao de bicos aspersores de
gua, alm de encamisamento. Estes dispositivos, junto com a prpria agitao, permitem um
melhor controle e homogeneidade da temperatura no leito (Nagel et al., 2001), atravs do
resfriamento evaporativo e troca convectiva nas paredes.

Boa parte da modelagem fenomenolgica destes biorreatores pode se basear nas
consideraes aplicadas aos tambores rotatrios: trs regies homogneas (leito, headspace e
parede) que trocam massa e energia entre si. Assim, modelos similares ao representado pelas
Equaes 2.29 a 2.33 podem ser utilizados.
Pena y Lillo et al. (2001) utilizaram um modelo que assume mistura perfeita,
utilizando medies on-line (temperatura e umidade relativa do ar que entra e sai do
biorreator) para estimar o contedo de gua do leito. O balano de energia utilizado foi:
( ) ( )
( ) ( )
( ) ( ) [ ] ) (
4 4
exp
b w w w viz b viz b S
in out w in out b VAP
in in out out VAP in out a
Q
b
b
T T Cp F T T T T A h
y y y y T Cp
T y T y Cp T T Cp
F r
dt
dT
k Cp
+ +
+
1
]
1
(2.34)
Este balano considera gerao metablica de calor, diferenas na entalpia do gs na
entrada e na sada do biorreator, resfriamento evaporativo, trocas convectivas e radiativas, e o
ltimo termo da equao conta por escoamento de gua saindo e adio de gua por asperso
temperatura T
w
. A incluso do parmetro emprico k
exp
foi necessria para corrigir distores
produzidas pela considerao de homogeneidade do leito.
No mesmo trabalho, o balano de gua no leito foi expresso por:
( )
( )
in out w O H
S
y y F F r
dt
W M d
+
2
(2.35)
Leva-se em conta, assim, a gerao metablica de gua, entrada por asperso e sada
por escoamento, evaporao e alterao no contedo slido seco no biorreator.
2.7 Metabolismo e crescimento
Sendo os microrganismos os operrios em ao durante um cultivo, consumindo a
matria-prima para gerar os produtos de interesse, o conhecimento de sua cintica de
crescimento e de metabolismo torna-se importante para a modelagem matemtica de
processos biotecnolgicos. Entretanto, o desenvolvimento deste tipo de trabalho tm se dado
base de equaes essencialmente empricas.

Basicamente, 4 tipos de cinticas de crescimento so utilizadas em modelagem de
CES (Mitchell et al., 2004):
Linear
K
dt
dX
(2.36)
onde K a taxa de crescimento linear.
Exponencial
X
dt
dX
(2.37)
onde a taxa de crescimento especfico.
Logstica
,
_

max
1
X
X
X
dt
dX
(2.38)
onde X
max
a mxima quantidade de biomassa possvel.
Duas fases (acelerao rpida e desacelerao lenta)
X
dt
dX
t t
a
< (2.39)
( )
[ ] X e L
dt
dX
t t
a
t t k
a

(2.40)
onde t
a
o instante de tempo de troca de fase de crescimento (da acelerao rpida
para a desacelerao lenta), L a razo entre a taxa de crescimento especfico no incio da
fase de desacelerao e a taxa de crescimento especfico na fase de acelerao, e k uma
constante de decaimento exponencial de primeira ordem, a qual causa a desacelerao do
crescimento.
Essas equaes de crescimento produzem curvas como as apresentadas na Figura
2.10.

Ainda segundo os mesmos autores, a maioria dos pesquisadores tem empregado
equaes logsticas para descrever cinticas de crescimento.
Alm da forma da equao cintica, importante tambm levar em considerao a
influncia dos fatores ambientais sobre os parmetros de crescimento. Estes fatores incluem
concentrao das fontes de nutrientes (carbono e nitrognio, p.ex.), concentrao de oxignio,
concentrao de produtos, temperatura, pH e atividade de gua (Mitchell et al., 2000a). A
influncia ambiental comumente includa no valor da taxa de crescimento microbiano ().

Figura 2.10: Os vrios perfis cinticos empricos utilizados em CES.
(A) exponencial, (B) logstico, (C) linear, (D) duas fases.
Fonte: Adaptado de Mitchell et al. (2004).
Diferentes propostas existem para o equacionamento desta influncia. A equao
mais conhecida a de Monod, onde um nico nutriente considerado como limitante do
crescimento:
S K
S
S
+

max
(2.41)
onde
max
a taxa mxima de crescimento especfico, S a concentrao do nutriente
limitante e K
S
a constante de saturao de Monod.
Nessa equao, caso o nutriente seja inibidor do crescimento a altas concentraes,
pode-se incluir um termo de inibio por substrato, atravs da constante de inibio pelo
substrato, K
i
(Andrews, 1968):

i
S
K
S
S K
S
2
max
+ +
(2.42)
Para a temperatura, considerada em muitos casos o principal limitante do
crescimento em CES, as propostas existentes costumam se relacionar tradicional equao de
Arrhenius, como a equao de Hougen-Watson, utilizada por Mitchell e Meien (2000):
,
_
,
_

T R
G
B
T R
E
B
D
G
exp 1
exp
2
1
max
(2.43)
onde E
G
representa a energia de ativao para o crescimento celular, e G
D
a
variao de energia livre para a inativao celular.
Szewczyk e Myszka (1994) dividiram a biomassa em viva e morta, incluindo um
termo de morte relacionado temperatura.
,
_

,
_

T R
E
k
T R
E
D
D
G
T
exp exp
0
(2.44)
Smits et al. (1998) cita a equao de Ratkowsky (Ratkowsky et al., 1983):
( ) ( ) ( ) [ ] { }
2
max 2 min 1 max
exp 1 T T c T T c (2.45)
onde T
max
e T
min
so as temperaturas mxima e mnima, alm das quais teoricamente
no possvel haver crescimento, e c
1
e c
2
so parmetros empricos.
Sangsurasak e Mitchell (1998) propuseram as seguintes equaes empricas para
descrever o efeito da temperatura sobre a taxa de crescimento:
opt opt
T T (2.46)
( )
( )
( )
( )

,
_
,
_
+

T T b
T T
T T
T T b
T T T
opt
opt
opt
opt
max
max
max
max
max

(2.47)
0
max
T T (2.48)

onde o parmetro b representa a sensibilidade da taxa de crescimento mudana de
temperatura, T
opt
a temperatura tima para o crescimento e
opt
a taxa de crescimento
especfico nesta temperatura.
Os efeitos de atividade de gua (Aw) e pH so ainda mais complexos para
equacionar, e raramente so levados em conta nos modelos. Costumam ser deixados de lado, e
os modelos consideram que os cultivos ocorrem sem variao nestes parmetros. Outras reas
de estudo, como a Microbiologia de Alimentos, modelam a influncia do pH no
desenvolvimento de microrganismos atravs de relaes polinomiais (Gibson e Hocking,
1997), parablicas (Pitt, 1993) ou lineares (Ratkowsky et al., 1982).
A combinao de efeitos sobre a taxa de crescimento possvel, mas surge a questo
de como realizar esta operao. Tipicamente, os efeitos so multiplicados, utilizando-se a
forma da Equao 2.49 (Mitchell et al., 2000a):
) ( ) ( ) ( ) ( ) ( ) (
2 max
Aw f pH f T f O f X f S f (2.49)
Alm disso, no se pode esquecer a prpria influncia do microrganismo sobre o
meio, como pela gerao de calor metablico. Este efeito deve ser considerado para os
balanos energticos e costuma ser descrito por uma equao que o associa ao crescimento
(Sangsurasak e Mitchell, 1998):
( )
dt
dX
Y r
X Q s Q

/
1 (2.50)
onde
S
a massa especfica seca do leito, a porosidade do leito, e Y
Q/X
representa
a gerao de calor metablico na reao de crescimento.
Cooney et al. (1968) mostraram que a gerao de calor metablico relaciona-se
linearmente com a produo de CO
2
e o consumo de O
2
, em diferentes microrganismos (E.
coli, C. intermedia, B. subtilis, A. niger).

2.8 Estimao de biomassa atravs dos gases de sada
O consumo de oxignio e produo de dixido de carbono resultam da respirao, o
processo metablico pelo qual microrganismos aerbios obtm a maior parte de sua energia
para o crescimento. Sendo assim, estas atividades metablicas esto associadas ao
crescimento e podem ser utilizadas para estimar a formao de biomassa (Raimbault, 1998).
As quantidades de CO
2
produzido e O
2
consumido podem ser quantificadas pelo
acompanhamento dos gases de sada do biorreator.
Conforme Mitchell (1992b), as medidas de CPR ou OUR so mais teis quando
associadas utilizao de um modelo de correlao. A aplicao destes modelos, que
envolvem predio do crescimento atravs do CPR e do OUR, demanda o uso de mtodos
numricos para resolver as equaes diferenciais geradas (Raimbault, 1998).
Considerando que o CO
2
um produto metablico e o O
2
um nutriente consumido,
costuma-se utilizar modelos do tipo Luedeking-Piret (Luedeking e Piret, 1959). Descreve-se a
produo e o consumo de substncias pelo metabolismo microbiano utilizando uma nica
equao, composta de um termo associado ao crescimento e um termo de manuteno.
X m
dt
dX
Y dt
dp
P X
+
/
1
(2.51)
ou ento:
X m
Y dt
dp
P X

,
_
+
/
(2.52)
Para o caso da produo de gs carbnico e consumo de oxignio, obtm-se:
X m
dt
dX
Y dt
dC
CPR
CO
CO X
CO
+
2
2
2
/
1
(2.53)
ou
X m
Y dt
dC
CPR
CO
CO X
CO
,
_
+
2
2
2
/
(2.54)

e
X m
dt
dX
Y dt
dC
OUR
O
O X
O
+
2
2
2
/
1
(2.55)
ou
X m
Y dt
dC
OUR
O
O X
O
,
_
+
2
2
2
/
(2.56)
As consideraes do modelo assim construdo so, basicamente:
Fluxos de entrada e de sada de ar so iguais.
CO
2
e O
2
no se acumulam no meio.
Koutinas et al. (2003) calcularam a CPR e a OUR, em meio lquido, por:
2
2
2 2
) (
CO
CO
CO
in
CO
out
v
M
V
C C F
CPR

(2.57)
2
2
2 2
) (
O
O
O
out
O
in
v
M
V
C C F
OUR

(2.58)
Para o meio slido, substitui-se o volume do biorreator (V) pela massa do leito (M
B
),
que mais representativa neste sistema.
2
2
2 2
) (
CO
CO
B
CO
in
CO
out
v
M
M
C C F
CPR

(2.59)
2
2
2 2
) (
O
O
B
O
out
O
in
v
M
M
C C F
OUR

(2.60)
A anlise de gases de sada uma tcnica on- line de estimao de biomassa em CES,
e suas grandes vantagens so a natureza no- intrusiva e no-destrutiva da tcnica, as
possibilidades de controlar o quociente respiratrio, garantindo um nvel timo de oxidao
do substrato, e de incorporar controles automticos para o processo atravs da taxa de aerao
(Raimbault, 1998).

Captulo 3
Materiais e Mtodos
Para atingir os objetivos propostos, foram realizados alguns experimentos em
biorreator, procurando estudar a dinmica da mistura e a relao entre crescimento do
microrganismo, produo e consumo de alguns compostos durante o cultivo.
3.1 Instalaes e equipamentos
O trabalho foi desenvolvido nos Laboratrios de Biotecnologia (BioTecLab) I e II do
Instituto de Cincia e Tecnologia de Alimentos (ICTA) e no Laboratrio de Computao da
Ps-Graduao (LACOP) do Departamento de Engenharia Qumica da Universidade Federal
do Rio Grande do Sul (UFRGS).
Leituras de ensaios espectrofotomtricos foram realizadas em aparelho marca
Hitachi modelo U-1100 (Japo). Este aparelho foi utilizado na anlise de acares redutores
totais e na padronizao do inculo.
Equipamentos, materiais e meios de cultura foram esterilizados em autoclaves
verticais: Phoenix Equipamentos modelo AV75 (Brasil) ou Ralf Winter (Brasil).
3.2 BIORREATOR CILNDRICO HORIZONTAL AGITADO (BCHA) 46
Operaes que demandam ambiente estril, como o preparo de inculo e a anlise de
contagem em placa, foram realizadas em capela de fluxo marca Trox (Technik do Brasil).
3.2 Biorreator cilndrico horizontal agitado (BCHA)
O biorreator utilizado nos experimentos do tipo tambor horizontal agitado e est
apresentado na Figura 3.1. Fabricado por uma metalrgica da regio, a partir de projeto
desenvolvido no Laboratrio, compe-se de um corpo cilndrico em ao inox 304, com
encamisamento que permite circulao de gua para o controle de temperatura. As dimenses
do cilindro so 40cm de comprimento e 20cm de dimetro, perfazendo um volume interno de
aproximadamente 12 litros. O volume aproximado do encamisamento de 2,5 litros.
H ps de agitao retas, sem inclinao, ligadas a um eixo central. Por este eixo
central entra tambm o fluxo de ar, que distribudo ao longo de todo o comprimento do
cilindro. A aerao , assim, no forada, j que o ar no impulsionado atravs do leito.
Figura 3.1: Vises externa e interna do BCHA.
Atravs de duas escotilhas localizadas no corpo do biorreator possvel, com uma
concha longa e esterilizada, retirar amostras do meio de cultivo.
3.3 MICRORGANISMO 47
3.3 Microrganismo
O microrganismo utilizado neste trabalho foi Bacillus circulans BL53, isolado de
ambiente amaznico e j utilizado em outros estudos no laboratrio (Heck, 2001; Heck,
2005).
3.4 Preservao da cultura
Para estocagem prolongada, o microrganismo foi inicialmente cultivado em meio
Luria-Bertani (LB) por 18 horas, e 0,5 mL deste meio foi adicionado a 0,5 mL de glicerol
previamente esterilizado em tubos Eppendorf e estocado a -20C. O microrganismo tambm
foi mantido em tubos de gar inclinado contendo meio LB, a partir dos quais realizava-se a
inoculao nos experimentos.
A composio do meio LB est apresentada na Tabela 3.1.
Tabela 3.1: Composio do Luria Broth
Peptona 10,0 g.L
-1
Extrato de levedura 5,0 g.L
-1
NaCl 5,0 g.L
-1
3.5 Preparo de inculo
O inculo foi preparado em meio LB. O meio foi esterilizado a 121C por 15min,
resfriado temperatura ambiente e inoculado com Bacillus circulans BL53. O inculo cresceu
durante 18 a 20h em incubadora orbital agitada (Nova Tcnica Ind. e Com. Ltda. - Brasil) a
37C com agitao orbital.
3.6 PREPARO DO MEIO DE CULTIVO 48
3.6 Preparo do meio de cultivo
O meio de cultivo utilizado foi o resduo industrial fibroso de soja (RIFS),
subproduto da produo de protena isolada de soja, que foi obtido junto a uma empresa da
regio. A composio do RIFS, determinada por Heck (2001), est apresentada na Tabela 3.2.
Tabela 3.2: Composio do RIFS
Protena 29,4%
Carboidratos 56,7%
Hemicelulose 23,5%
Celulose 16,3%
Acares totais 16,9%
Umidade 10,1%
Fonte: Adaptado de Heck (2001)
O preparo do meio de cultivo foi realizado de forma similar apresentada por Heck
(2005): 800g de RIFS (granulometria mdia mesh 30) adicionados a 4000mL de meio
mineral. O meio foi transferido para o biorreator e o conjunto foi esterilizado a 120C por
30min.
O meio mineral composto de sais dissolvidos em gua de acordo com a Tabela 3.3.
O meio foi resfriado at 37C, sendo ento adicionados 800mL de inculo
padronizado OD
620
= 1,0.
Tabela 3.3: Composio do meio mineral
MgSO
4
7H
2
O 0,41 g.L
-1
CaCl
2
0,02 g.L
-1
KH
2
PO
4
1,00 g.L
-1
K
2
HPO
4
1,00 g.L
-1
NH
4
NO
3
1,00 g.L
-1
FeCl
3
6H
2
O 0,05 g.L
-1
Fonte: Heck (2005)
3.7 CONDIES DO CULTIVO 49
3.7 Condies do cultivo
A agitao do biorreator foi ajustada a 4 rpm, o fluxo de gua no encamisamento foi
mantido a 37C, e a aerao foi feita com ar estril umidificado a 37C, a uma vazo de
4L.min
-1
. O ar foi aquecido pela passagem em uma serpentina de cobre (3mm de dimetro
interno por 2m de comprimento) mergulhada em banho termosttico a 37C, e umidificado
pelo borbulhamento em um frasco contendo gua destilada estril, colocado dentro de uma
estufa mantida a 37C. A mangueira de ar possua 2 metros de comprimento dentro da estufa,
de forma a garantir a temperatura do ar, e um pequeno trecho externo (aproximadamente
20cm), que foi coberto com isolante, at o biorreator.
Em intervalos regulares, pequenas amostras (30 a 50 g) foram retiradas do biorreator
para quantificao de biomassa, determinao de pH, de umidade do meio e demais anlises
off-line.
Para garantir a ausncia de microrganismos contaminantes no cultivo, realizou-se
teste de Gram, e, alm disso, foi observada a morfologia das colnias desenvolvidas nas
placas de contagem.
3.8 gua do encamisamento do biorreator
A gua para controle de temperatura no encamisamento do biorreator foi fornecida
por um banho termosttico Frigomix B (B.Braun Int. - Alemanha), mantido a 37C. As
temperaturas de entrada e sada da gua do encamisamento foram medidas automaticamente a
cada 2 minutos por 2 termorresistncias Pt-100 e armazenadas em um sistema de aquisio de
dados LogBox Standard (Novus Brasil) para coleta posterior.
3.9 QUANTIFICAO DE BIOMASSA 50
3.9 Quantificao de biomassa
A quantificao de biomassa foi realizada atravs da contagem em placas. Em capela
de fluxo, tomaram-se 3g da amostra do cultivo, que foram adicionados a 27mL de gua
peptonada previamente esterilizada em tubo de ensaio. A mistura foi agitada em sonicador
(B.Braun Int. - Alemanha) por 3 minutos, de forma a garantir que a biomassa fosse separada
da fibra e suspensa no lquido. Deste tubo tomou-se 1mL para novo tubo com 9mL de gua
peptonada, procedendo-se assim diluio seriada at 10
-6
ou 10
-7
. O plaqueamento foi feito em
triplicata em meio PCA (Plate Count Agar) pela tcnica de espalhamento com ala de
Drigalski. As placas foram armazenadas em estufa a 37C, a contagem das colnias foi feita
aps 12 e 18h, e a biomassa foi expressa em termos de unidades formadoras de colnias
(UFC) por grama de meio mido.
A composio do meio PCA utilizado est apresentada na Tabela 3.4.
Tabela 3.4: Composio do meio PCA utilizado
Peptona 5,0 g.L
-1
Extrato de levedura 2,5 g.L
-1
Glicose 1,0 g.L
-1
gar bacteriolgico 24,0 g.L
-1
3.10 pH do meio de cultivo
O pH foi analisado em amostra do meio de cultivo ressuspendida a 10% em gua
destilada (Instituto Adolfo Lutz, 1985). As medidas foram feitas em potencimetro da marca
"Ren Graf".
3.11 ANLISES DO EXTRATO AQUOSO 51
3.11 Anlises do extrato aquoso
3.11.1 Preparo do extrato aquoso
Seguindo a metodologia de Heck (2001), o extrato aquoso foi produzido atravs da
extrao de componentes solveis presentes no meio de cultivo, incluindo-se substncias
como as enzimas hidrolticas e acares redutores. Para tanto, 10g da amostra do cultivo
foram adicionados de igual quantidade de gua destilada a 4C em erlenmeyer de 125mL.
Aps 30 minutos em agitador orbital Certomat MO (B.Braun Int. Alemanha) a 240rpm, a
mistura foi centrifugada a 2.500g por 20 minutos na temperatura de 4C em centrfuga Sygma
modelo 4K15 (Alemanha). O sobrenadante foi recolhido e congelado para posterior anlise.
3.11.2 Acares redutores
Os acares redutores foram quantificados no extrato aquoso pelo mtodo do cido
3,5-dinitrosaliclico (DNS). Adicionaram-se 100L de amostra a 1mL de soluo de DNS,
agitou-se a mistura rapidamente e levou-se a banho de gua fervente por 10 minutos. Aps
resfriamento, leu-se a absorbncia da amostra a 570nm (Chaplin, 1986). Curvas-padro foram
construdas utilizando glicose.
3.11.3 Acetato
A anlise de acetato foi realizada por cromatografia gasosa, com tcnica adaptada de
Williams e Onwudili (2005). Utilizou-se cromatgrafo a gs marca Shimadzu modelo GC-
14B, equipado com coluna capilar Carbowax de 60m x 0,25mm e detector de chama ionizante
(FID). O gs de arraste utilizado foi H
2
, a 100kPa. O perfil de temperatura na coluna foi 1
minuto a 100C; aquecimento a 5C por minuto at 200C; manuteno nessa temperatura por
3 minutos. O acetato era eludo em aproximadamente 6,5 minutos. O volume de amostra
injetado foi de 1L. A calibrao da medida foi realizada pela tcnica de padro externo
(Smith, 1988).
3.12 MEDIO DA UMIDADE RELATIVA DO AR DE SADA DO BIORREATOR 52
3.12 Medio da umidade relativa do ar de sada do
biorreator
Para monitorar a umidade relativa e temperatura na sada do biorreator foi utilizado
um termo-higrmetro marca Center modelo 310, ligado a um computador para aquisio de
dados on-line. O sensor foi instalado no primeiro trap, logo aps a sada do biorreator, o qual
foi envolvido com isolante trmico, bem como o curto trajeto at ele (alguns centmetros).
Para determinar a umidade relativa do ar de entrada, realizou-se um teste no qual o
medidor de umidade relativa e temperatura foi instalado aps os umidificadores, na posio
onde estaria o biorreator. Esta umidade relativa foi considerada constante ao longo da durao
do cultivo, como foi possvel verificar durante esse teste.
3.13 Anlise de umidade do meio de cultura
A umidade do leito foi medida conforme mtodo descrito em Carvalho e Jong
(2002). Tomaram-se aproximadamente 5g de amostra, que foram misturados com areia
tratada em cpsula previamente seca (mnimo 3h em estufa a 80C) e pesada. A cpsula, aps
pesada com amostra, foi levada estufa a 80C por 6 horas, resfriada em dessecador e
novamente pesada. Essa operao foi repetida at se obter pesagens consecutivas iguais. A
diferena entre o peso inicial e o peso seco foi atribuda umidade da amostra.
3.14 Anlise do CO
2
liberado no cultivo
3.14.1 Anlise por Cromatografia Gasosa
O ar de sada do biorreator foi continuamente conduzido a um cromatgrafo a gs
(CG) modelo Shimadzu GC-14B, equipado com uma vlvula de injeo automtica marca
VICI, coluna Supelco Carboxen 1006 Plot 30m x 0,53mm, detector TCD (a 230C). O gs de
3.14 ANLISE DO CO2 LIBERADO NO CULTIVO 53
arraste e referncia utilizado foi hlio a 30mL.min
-1
(arraste) e 10mL.min
-1
(referncia),
medidos com a coluna a 35C. O perfil de temperatura na coluna iniciou com 6 minutos a
35C, seguindo-se aquecimento de 25C.min
-1
at 110C. Esta temperatura era mantida por 3
minutos. Nessas condies, o tempo de reteno do CO
2
foi de aproximadamente 4 minutos.
A amostragem automtica do gs de sada do biorreator foi realizada a cada 20 minutos.
Para garantir condies padronizadas do ar que era amostrado pelo CG, a sada de ar
do biorreator foi conectada a dois traps: um primeiro para reter material slido que
eventualmente saa do biorreator e outro resfriado para condensao de gua. Em seguida, o
ar passava ainda por uma coluna de slica, que retirava a umidade ainda no condensada, de
forma a enviar apenas ar seco ao cromatgrafo.
Para quantificar o CO
2
no ar que entra no biorreator, necessrio para calcular a taxa
de produo do gs, foram feitas anlises cromatogrficas do ar vindo do compressor antes e
depois do cultivo.
3.14.2 Calibrao da medida de CO
2
no CG
A calibrao do CG para a medio do CO
2
foi realizada pela tcnica de padro
externo (Smith, 1988), com injeo de volumes conhecidos de gs puro (Dixido de Carbono
USP White Martins, Brasil), utilizando-se seringa de injeo comum de cromatografia. O
volume injetado foi convertido em concentrao de CO
2
dividindo-se pelo volume do loop do
injetor automtico (280L). Assim, o sinal gerado no cromatograma foi relacionado com a
concentrao de CO
2
. Para obter maior preciso, as injees foram repetidas vrias vezes para
cada volume utilizado.
3.14.3 Anlise de CO
2
e O
2
em analisador de gases
O ar conduzido at o CG foi tambm analisado utilizando-se um analisador de gases
Mocon Pac Check Model 650 (Minneapolis, EUA). Este instrumento, comumente utilizado
3.15 TESTES DE MISTURA NO BIORREATOR 54
para anlise de gs em embalagens de alimentos, realiza medies simultneas de CO
2
e O
2
.
A concentrao do primeiro determinada por um eletrodo infra-vermelho, e a do segundo,
por um eletrodo polarimtrico de xido de zircnio.
As anlises utilizando este aparelho foram realizadas em intervalos de
aproximadamente 1 hora, durante os cultivos.
Entretanto, o uso do analisador de gases ficou prejudicado devido baixa resoluo
das medies do aparelho, da ordem de dcimos de %, enquanto que as variaes na
concentrao de CO
2
e O
2
durante o processo no passavam de 1%.
3.15 Testes de mistura no biorreator
Com o objetivo de obter uma avaliao qualitativa da agitao proporcionada pelas
ps do biorreator, foram realizados testes de mistura utilizando corantes alimentcios, de
forma a desenvolver trabalho semelhante aos de Nagel et al. (2001) e Schutyser et al. (2001).
Nesses trabalhos, entretanto, os substratos utilizados eram particulados (gros de trigo), o que
diferencia este trabalho daqueles.
Utilizaram-se duas pores de 400g de RIFS com 2000mL de gua. Uma foi colorida
com 0,3g de corante azul brilhante, e a outra com 0,3g de corante amarelo tartrazina. Aps
esterilizao a 120C por 20min, ambas foram resfriadas at a temperatura ambiente.
Adicionaram-se mais 400mL de gua a cada poro, misturando bem. Este procedimento
buscava reproduzir aquele normalmente adotado nos cultivos, sem inoculao de
microrganismo.
Dois tipos de teste de mistura foram realizados, buscando qualificar as velocidades
de mistura radial e axial.
Para avaliar a mistura radial, as pores de fibra reconstituda foram distribudas,
sem se misturar, no sentido longitudinal dentro do biorreator. No caso da avaliao da mistura
3.16 ESTIMAO DE BIOMASSA ATRAVS DA PRODUO DE CO2 55
axial, as pores de fibra foram distribudas na outra direo, conforme mostrado na Figura
3.2.
Em ambos os casos, o biorreator foi fechado e a agitao foi ajustada a 4rpm (rotao
normal utilizada nos cultivos). Em intervalos regulares, parou-se a agitao e observou-se o
grau de mistura das duas cores (azul e amarelo) dentro do biorreator. Fotografias foram
obtidas utilizando uma cmera digital Olympus C-960 Zoom.
Este teste simples forneceu dados qualitativos sobre os padres de mistura do
biorreator.
Figura 3.2: Disposio inicial da fibra nos testes de mistura.
Esquerda: teste de mistura radial; Direita: teste de mistura axial.
3.16 Estimao de biomassa atravs da produo de CO
2
A relao entre a taxa de produo de CO
2
e a biomassa foi descrita por uma equao
do tipo Luedeking-Piret (Luedeking e Piret, 1959), como comumente feito na literatura
(Sugama e Okazaki, 1979; Sato et al., 1983; Mitchell, 1992b).
X m
dt
dX
Y
CPR
dt
dC
CO
CO X
CO
+
2
2
2
/
1
(3.1)
3.16 ESTIMAO DE BIOMASSA ATRAVS DA PRODUO DE CO2 56
Ressalte-se que a forma apresentada pela Equao 2.54 no seria aplicvel aqui, pois
os dados experimentais permitiriam a obteno apenas de uma taxa de crescimento especfica
() aparente. O uso da forma que inclui a derivada da quantidade de biomassa em relao ao
tempo mais apropriada, pois se reorganiza a Equao 3.1 para isolar a taxa de crescimento,
obtendo-se:
( ) X m CPR Y
dt
dX
CO CO X

2 2
/
(3.2)
O valor da taxa de produo de CO
2
foi calculado conforme Koutinas et al. (2003):
2
2
2 2
) (
CO
CO
B
CO
in
CO
out
v
M
M
C C F
CPR

(3.3)
As consideraes do modelo so, basicamente:
1. CO
2
no se acumula no meio.
2. Fluxos de entrada de ar e de sada de gs so iguais.
3. A massa do leito no se altera significativamente durante o cultivo.
A primeira considerao bastante plausvel, dada a baixa solubilidade do gs.
A segunda costuma ser utilizada na literatura e, neste trabalho, produz um erro
inferior a 2%, pois a taxa de produo de CO
2
baixa ao longo de todo o cultivo, e , ao
menos em parte, contrabalanada por consumo de O
2
. Medir o fluxo de gs na sada do
biorreator, neste caso, alm de naturalmente impreciso seria prejudicado pela existncia de
vazamentos de gs no biorreator (ver Apndice).
A terceira considerao justifica-se novamente pela baixa produo de CO
2
. Ao
longo de 40 horas de cultivo, a quantidade acumulada de CO
2
gerado foi de aproximadamente
65g. Mesmo considerando diferentes rotas metablicas possveis, esta quantidade de gs
corresponderia perda de menos de 1% da massa seca inicial do leito. Complementando isto,
as anlises mostraram que a umidade do leito no se alterou significativamente ao longo do
tempo (ver Captulo 4).
3.17 MODELAGEM DO CRESCIMENTO MICROBIANO 57
3.17 Modelagem do crescimento microbiano
Os dados de biomassa obtidos nos experimentos foram ajustados aos quatro
diferentes modelos cinticos citados por Mitchell et al. (2004) para CES (Tabela 3.5):
Tabela 3.5: Modelos cinticos de crescimento em CES
Tipo de modelo Forma diferencial Parmetros a estimar
Linear K
dt
dX
K
Exponencial X
dt
dX

Logstico

,
_

m
X
X
X
dt
dX
1 , X
m
Duas fases
( )
[ ] X e L
dt
dX
t t
X
dt
dX
t t
a
t t k
a
a

<

, L , k , t
a
Fonte: Mitchell et al. (2004)
3.18 Resoluo dos modelos e estimao de parmetros
Os modelos, constitudos por sistemas de equaes diferenciais ordinrias, foram
resolvidos utilizando-se o mtodo da retrodiferenciao (BDF) com ordem e passo varivel
(Brenan et al., 1995), com tolerncia relativa de 10
-5
e tolerncia absoluta de 10
-6
nas
variveis.
Para todos os modelos testados, a estimao dos parmetros foi realizada de forma a
minimizar a soma dos quadrados dos erros de predio, utilizando o mtodo Particle Swarm
Optimization (PSO) de busca aleatria para obteno de solues aproximadas, refinadas pelo
mtodo de Levenberg-Marquardt com atualizao da matriz Hessiana pela tcnica de BFGS
(Edgar e Himmelblau, 1988), ambos implementados em MATLAB v.5.3. Utilizou-se uma
tolerncia relativa de 10
-6
para as variveis de deciso e para a funo-objetivo.
3.19 SELEO E ESTIMAO DE PARMETROS 58
A utilizao de um mtodo de busca aleatria, nestes problemas de estimao,
justifica-se, pois os modelos, e, por conseqncia, as funes-objetivo, so relativamente
simples, mas apresentam mnimos locais, o que pode prejudicar o desempenho dos mtodos
de busca multivarivel e analticos, muito dependentes de uma boa estimativa inicial.
3.19 Seleo e estimao de parmetros
As estimativas dos parmetros foram refinadas pelo uso do algoritmo SELEST,
desenvolvido por Secchi et al. (2006). Com base na matriz de sensibilidade do sistema, o
algoritmo calcula o efeito de cada parmetro nas variveis medidas e a sua independncia
linear em relao aos demais parmetros. O produto destas duas grandezas definido como a
identificabilidade (identifiability) do parmetro, a qual pode ser entendida como a capacidade
que se tem, com os dados experimentais disponveis, de estimar o parmetro com preciso.
A maior identificabilidade determina qual parmetro ser estimado em cada etapa do
processo. O algoritmo prev critrios de parada quando as condies do sistema j no
permitirem uma estimao precisa dos parmetros.
A Figura 3.3 apresenta uma descrio simples dos passos do algoritmo SELEST.
Uma descrio mais detalhada fornecida no Anexo I.
3.19 SELEO E ESTIMAO DE PARMETROS 59
Figura 3.3: Descrio simplificada do algoritmo SELEST.
Modelo identificado
com np parmetros
Estimao inicial
dos parmetros
Clculo das mdias dos
valores experimentais e da
matriz de covarincia
Matriz de
sensibilidade global
Decomposio em valores
singulares ou caractersticos
Clculo do efeito do
parmetro sobre as medidas
Seleo de
parmetro
Estimao do
parmetro
ndices de degradao da
predio e de correlao
dos parmetros
Critrios de
parada
Fim
Medida de
independncia linear
ndice de
identificabilidade
Sim
No
Captulo 4
Resultados e Discusso
4.1 Calibrao da medida de CO
2
no cromatgrafo a gs
A Figura Erro! Fonte de referncia no encontrada. mostra a curva de calibrao
para a medio de CO
2
no CG, obtida pelo mtodo de calibrao com padro externo, com
injeo de volumes conhecidos de gs puro. O mtodo mostrou-se bastante reprodutvel, o
que foi comprovado pelo alto coeficiente de correlao.
0 2000 4000 6000 8000 10000
0,0
0,2
0,4
0,6
0,8
1,0
1,2
1,4
1,6
1,8
%CO
2
= 1,46.10
-4
x Area + 0,232
r
2
= 0,993
C
O
2

(
%
)
rea de pico (V.s)

Figura 4.1: Curva de calibrao obtida para anlise de CO
2
em CG.

4.2 TESTES DE MISTURA 61

Medies de CO
2
realizadas paralelamente no cromatgrafo e no analisador de gases
vieram a confirmar a boa qualidade da calibrao feita no primeiro, conforme mostrado na
Figura 4.2.
0,0 0,5 1,0 1,5 2,0 2,5 3,0
0,0
0,5
1,0
1,5
2,0
2,5
3,0
r
2
= 0,992
A
n
a
l
i
s
a
d
o
r

d
e

G
a
s
e
s
Cromatgrafo

Figura 4.2: Comparao entre as medidas de concentrao de CO
2
(em %) obtidas pelo cromatgrafo a gs e
pelo analisador de gases.

4.2 Testes de mistura
Nos testes de mistura, verificou-se que o biorreator possui tima capacidade de
mistura na direo radial, sendo que em menos de 15 minutos de agitao a 4 rpm (total de 60
revolues) no h mais diferenas de cor no leito, conforme pode ser observado na Figura
4.3.
Porm, foram identificadas zonas mortas dentro do biorreator, que no so atingidas
pelas ps e, por isso, acumulam pequena quantidade de substrato que no se mistura muito
rapidamente com o resto do leito. Estas zonas mortas localizam-se na fina camada que reveste
as paredes do biorreator, com aproximadamente 3mm de espessura e nas extremidades do
eixo. Entretanto, estima-se que estas regies correspondam a menos de 5% do volume do
leito.
4.2 TESTES DE MISTURA 62

Figura 4.3: Aspecto do biorreator ao incio e aps 15 minutos no teste de mistura radial.

J na direo axial, a mistura mais lenta, conforme esperado devido configurao
das ps. A Figura 4.4 mostra o aspecto interno do biorreator as 45 minutos de agitao a 4
rpm (180 revolues). Percebe-se que a massa est bem misturada, entretanto, as zonas
mortas, como o fundo do cilindro, ainda no se misturaram. Esta mistura mais completa s
ser obtida aps quase duas horas de agitao.

Figura 4.4: Aspecto do biorreator ao incio e aps 45 minutos no teste de mistura axial.

Estes resultados concordam com os de Nagel et al. (2000), que tambm perceberam
que a homogeneizao na direo radial se d muito mais rapidamente que na direo axial.
Entretanto, cabe ressaltar que a mistura completa no sistema particulado daquele trabalho se
deu muito mais rapidamente (6 revolues em teste de mistura radial e 120 revolues em
4.3 TEMPERATURA DA GUA DE ENCAMISAMENTO 63

teste de mistura axial), j que foram usadas ps em V e o substrato era particulado (gros de
trigo).
Com estes resultados, decidiu-se, a exemplo dos demais trabalhos encontrados na
literatura (Nagel et al., 2000; Heck, 2005), tratar o leito do biorreator como homogneo, pois
a dinmica da mistura no biorreator mais rpida que a dinmica de processos biolgicos. O
fato da mistura axial ser mais lenta que a radial compensado pela distribuio do ar de
entrada ao longo de toda a extenso do cilindro e pela homogeneidade inicial do biorreator.
Este resultado, entretanto, unicamente qualitativo, j que no era possvel fazer
nenhum tipo de quantificao do grau de mistura do sistema. Tentando aprimorar este
aspecto, entrou-se em contato com o Laboratrio de Processamento de Sinais e Imagens
(LAPSI) da UFRGS, para avaliar a possibilidade de desenvolver um trabalho visando
quantificar o grau de mistura ao longo do tempo.
Instalando-se uma cmera com uma fonte de luz em uma das escotilhas, poder-se-
iam obter imagens em intervalos regulares, as quais seriam processadas para determinar a
freqncia de ocorrncia de cada tonalidade entre o amarelo e o azul. A partir da, seria
necessrio desenvolver uma regra que determinasse o grau de mistura a partir da distribuio
de freqncia de ocorrncia de cada tonalidade.
At o momento, foi realizado apenas um teste com fotografias tiradas com uma
cmera digital comum, no qual j foi confirmada a viabilidade do trabalho.
4.3 Temperatura da gua de encamisamento
As medies de temperatura da gua na entrada e na sada do encamisamento do
biorreator mostraram que a camisa se mantm praticamente constante a 37C (Figura 4.5).
Variaes nas medies so atribudas impreciso do instrumento. Devido ao alto fluxo de
4.4 UMIDADE DO LEITO AO LONGO DOS CULTIVOS 64

gua (aproximadamente 6 L.min
-1
, correspondente a uma velocidade linear de 70 cm.s
-1
na
mangueira), a diferena de temperatura entre entrada e sada foi praticamente nula.
Alm disso, verifica-se que no houve nenhum pico de temperatura da gua. Espera-
se um pico de gerao de calor metablico no instante de mximo crescimento da biomassa
(Mitchell e Meien, 2000; Mitchell et al., 2000; Mitchell et al., 2003), o qual poderia se refletir
na temperatura da gua de encamisamento, caso a transferncia de calor fosse limitada.
A partir desta observao pode-se concluir que a utilizao de um modelo isotrmico
para descrever o biorreator adequada.
0 10 20 30 40 50
30
32
34
36
38
40
T
e
m
p
e
r
a
t
u
r
a

(
C
)
Tempo (h)
0,0
3,0x10
8
6,0x10
8
9,0x10
8
1,2x10
9
1,5x10
9
B
i
o
m
a
s
s
a

(
U
F
C
.
g
-
1
)

Figura 4.5: Temperatura de entrada e sada da gua de encamisamento.
Linha pontilhada: Temperatura na entrada; Linha contnua: Temperatura na sada;
Linha contnua com crculos: Biomassa
4.4 Umidade do leito ao longo dos cultivos
A umidade do leito muito importante em CES. A Figura 4.6 apresenta os resultados
obtidos para este parmetro durante os cultivos. A umidade do leito manteve-se estvel dentro
4.5 OBSERVAES GERAIS DURANTE OS CULTIVOS 65

de uma faixa estreita, entre 85% e 88%. Algumas consideraes utilizadas nos modelos
desenvolvidos baseiam-se na constncia da umidade do leito.
0 5 10 15 20 25 30
80
82
84
86
88
90
U
m
i
d
a
d
e

(
%
)
Tempo (h)

Figura 4.6: Evoluo da umidade no meio de cultivo
Resultados so a mdia de trs experimentos.

4.5 Observaes gerais durante os cultivos
Vrios aspectos interessantes do processo puderam ser observados, de forma
basicamente qualitativa, durante os experimentos.
Ao incio dos experimentos, o substrato apresentava-se como uma pasta mida,
porm consistente. Ao longo do cultivo, entretanto, o substrato foi se tornando mais
liquefeito, apesar de o teor de umidade manter-se praticamente inalterado.
Esta alterao de aspecto do substrato pode ser explicada pela ao das enzimas
hidrolticas (celulases, xilanases, proteases), que hidrolisaram componentes do RIFS,
reduzindo sua capacidade de reteno de gua. O microrganismo Bacillus circulans BL53
sabidamente produtor destas enzimas (Heck, 2001 e 2005).
Conforme Mitchell et al (2000), estas alteraes estruturais do substrato so comuns
em CES, e, no caso de trabalhos de modelagem do processo, pode ser necessrio levar este
fato em considerao. Uma conseqncia desta alterao a reduo dos espaos vazios no
4.6 PH DO MEIO DE CULTIVO 66

meio de cultivo (porosidade), o que, segundo os mesmos autores, prejudicaria a transferncia
de oxignio.
Os extratos produzidos a partir das amostras do cultivo apresentaram certa
viscosidade, o que, segundo Mitchell e Lonsane (1992), representa inclusive uma
desvantagem comum em CES, que pode trazer dificuldades no processamento downstream.
Entretanto, Heck (2005) purificou a enzima xilanase a partir deste mesmo extrato, utilizando
procedimentos de precipitao fracionada com sulfato de amnio, cromatografia e gel-
filtrao. Nenhuma meno foi feita a dificuldades encontradas devido viscosidade do
extrato.
4.6 pH do meio de cultivo
Foi observada variao significativa no pH do meio de cultivo ao longo dos
experimentos (Figura 4.7). O inculo, produzido em meio lquido LB, chegava ao final da
incubao com pH entre 7,5 e 8,0. Aps a inoculao, o cultivo iniciava-se com pH do meio
em 6,5. Aps aproximadamente 10 horas de cultivo, nas quais o pH foi estvel, verificou-se
sistematicamente a queda do pH do meio para valores prximos a 5,5. Cabe ressaltar que a
natureza do substrato, slido e de composio complexa, impede o controle do pH como
realizado em cultivos submersos (Prior et al., 1992).
4.7 QUANTIFICAO DE BIOMASSA POR CONTAGEM EM PLACAS 67

0 5 10 15 20 25 30
5,0
5,2
5,4
5,6
5,8
6,0
6,2
6,4
6,6
6,8
7,0
p
H
Tempo (h)

Figura 4.7: Variao do pH ao longo dos cultivos.

4.7 Quantificao de biomassa por contagem em placas
Paralelamente queda de pH, observou-se tambm, em todos os experimentos, que a
contagem de UFC no meio de cultivo atingia um mximo aps aproximadamente 15 horas de
cultivo, e ento passava a declinar, conforme se observa na Figura 4.8. H certa variabilidade
nos resultados, mas pode-se distinguir claramente que a biomassa atingiu um valor mximo a
aproximadamente 15 horas de cultivo, passando a um declnio pouco depois.
0 5 10 15 20 25 30
0,0
4,0x10
8
8,0x10
8
1,2x10
9
1,6x10
9
2,0x10
9
B
i
o
m
a
s
s
a

(
U
F
C
.
g
-
1
)
Tempo (h)

Figura 4.8: Evoluo da biomassa ao longo dos cultivos.
Resultados so mdia de trs experimentos.


Unindo os grficos das Figuras 4.7 e 4.8, pode-se visualizar como a queda do pH est
associada ao crescimento do microrganismo, conforme preconiza a literatura (Figura 4.9).
Estas quedas no pH e na concentrao de biomassa no eram esperados, mas
repetiram-se em todos os experimentos, e ento buscou-se possveis explicaes para o
fenmeno.
0 5 10 15 20 25 30 35
0,0
3,0x10
8
6,0x10
8
9,0x10
8
1,2x10
9
1,5x10
9
B
i
o
m
a
s
s
a

(
U
F
C
.
g
-
1
)
Tempo (h)
5,0
5,2
5,4
5,6
5,8
6,0
6,2
6,4
6,6
6,8
7,0
p
H

Figura 4.9: Evoluo do pH e da concentrao de biomassa ao longo dos cultivos.
= biomassa (UFC.g
-1
); w = pH
A queda no pH poderia inibir o crescimento do microrganismo, mas o pH alcanado
(5,5) no seria capaz de causar morte celular.
tambm pouco provvel que a carncia de algum nutriente essencial tenha causado
este fenmeno. Havia ainda grande quantidade de fibra no consumida, o que garante fonte de
carbono e nitrognio (protena). Porm a biodisponibilidade destes recursos no pode ser
garantida. Por outro lado, ainda, devido perda de estrutura da fibra, provvel que a
transferncia de oxignio no meio de cultivo tenha se tornado limitante.
Vrios micronutrientes so fornecidos pela adio do meio mineral. Alguns destes
sais so pouco solveis, como o CaCl
2
e o FeCl
3
, e poderiam estar presentes no meio em
concentrao de fato menor que a desejada. Entretanto, outros trabalhos utilizando bactrias
do gnero Bacillus no se preocupam em fornecer tantos micronutrientes minerais ao
microrganismo (Paavilainen et al., 1995; Asensi et al., 1997; Paavilainen et al., 1999).

A explicao mais provvel para a queda da biomassa parece ser a produo de
algum metablito txico durante o cultivo. Paavilainen et al. (1995 e 1999) estudaram as rotas
metablicas de Bacillus circulans var. alkalophilus e concluram que a utilizao de glicose
ocorria quase que exclusivamente (90-93%) pela rota de Embden-Meyerhof-Parnas (EMP),
sendo que o piruvato formado era convertido principalmente a cido actico e frmico. Asensi
et al. (1997) identificaram que o cido actico tem efeito bactericida in vitro sobre Bacillus
subtilits, uma espcie prxima ao B. circulans. Este efeito dependente do pH, sendo que, em
pH 5,5, uma concentrao de 17,4 M (1 mg.L
-1
) j produziu ao bactericida in vitro,
enquanto que em pH 6 esta mesma concentrao no se apresenta txica. Os autores
procuraram explicar o efeito pela alterao do pH intracelular, causada pela entrada de
molculas de cido no-dissociadas pela membrana, as quais se dissociam no ambiente neutro
do citoplasma, reduzindo o pH interno da clula.
De fato, anlise em extratos de um dos cultivos apontou a produo de acetato
durante a fase de crescimento, chegando concentrao de 1,86 g.L
-1
no extrato aquoso
(correspondendo a 3,71 g.kg
-1
no leito do biorreator) s 18 horas de cultivo, momento em que
tambm se iniciou a queda da contagem de microrganismos, conforme Figura 4.10.
0 5 10 15 20 25 30 35
0,0
3,0x10
8
6,0x10
8
9,0x10
8
1,2x10
9
1,5x10
9
B
i
o
m
a
s
s
a

(
U
F
C
.
g
-
1
)
Tempo (h)
0,0
4,0x10
-4
8,0x10
-4
1,2x10
-3
1,6x10
-3
2,0x10
-3
A
c
e
t
a
t
o

(
g
A
c
.
g
-
1
)

Figura 4.10: Comparao entre concentrao de biomassa e de cido actico.
= biomassa (UFC.g
-1
); w = acetato (g.kg
-1
) no leito.

4.8 ACARES REDUTORES 70

Cabe ressaltar, porm, que a queda na concentrao de biomassa no acompanhada
de alterao na tendncia da curva de produo de CO
2
, como seria esperado, uma vez que se
afirma relao entre produo de gs carbnico e crescimento microbiano. Esta discrepncia
conduz idia de possveis erros de amostragem no biorreator. Biorreatores de tambor
agitado tm sido tradicionalmente estudados como sistemas homogneos, mas cultivos
slidos, por definio, caracterizam-se por heterogeneidade do meio.
O microrganismo poderia estar se desenvolvendo mais rapidamente junto s paredes
do biorreator, numa fina camada (aproximadamente 3mm) formada pela fibra no incio do
cultivo, e mais lentamente no bulk do leito, onde era realizada a amostragem. Esta camada de
parede poderia ter melhor acesso ao oxignio. Porm, ao longo dos cultivos percebeu-se que a
fibra perdia a capacidade de aderir s paredes do biorreator, desaparecendo a camada de
parede.
Uma outra possibilidade levantada para explicar o fenmeno seria a formao de
aglomerados de microrganismos no desmanchados com a agitao no sonicador. Estes
aglomerados dariam origem a apenas uma colnia nas placas de contagem, ainda que
formados por um nmero maior de clulas.
4.8 Acares Redutores
A variao da concentrao de acares redutores no meio de cultivo acompanhou,
aproximadamente, o desenvolvimento da biomassa, conforme pode ser observado na Figura
4.11. Desta observao conclui-se que a hidrlise dos polissacardeos presentes no RIFS
ocorre a velocidade maior que o consumo dos acares redutores formados pelo metabolismo
bacteriano.
Apesar de no ter sido realizada a quantificao das enzimas hidrolticas (celulases,
xilanases) no meio, pode-se inferir, pela gerao de acares redutores, que a produo
4.9 MODELAGEM DO CRESCIMENTO MICROBIANO 71

daquelas est associada ao crescimento, como citado em alguns trabalhos na literatura
(Mitchell, 1992b; Matcham, 1985; Smits et al., 1996).
0 5 10 15 20 25 30 35
0,0
5,0x10
-3
1,0x10
-2
1,5x10
-2
2,0x10
-2
2,5x10
-2
0,0
3,0x10
8
6,0x10
8
9,0x10
8
1,2x10
9
1,5x10
9
A
c
a
r
e
s

R
e
d
u
t
o
r
e
s

(
g
S
.
g
-
1
)
Tempo (h)
B
i
o
m
a
s
s
a

(
U
F
C
.
g
-
1
)

Figura 4.11: Comparao entre concentrao de biomassa e de acares redutores.
= biomassa (UFC.g
-1
); = acares redutores (g.kg
-1
) no leito.

4.9 Modelagem do crescimento microbiano
A queda na quantidade de biomassa medida, aps algumas horas de cultivo,
prejudica o ajuste da curva de crescimento aos modelos normalmente utilizados em trabalhos
de modelagem de CES. O modelo logstico obtm resultados satisfatrios somente nas
primeiras 20 horas, ou seja, antes da queda da biomassa (Figura 4.12), uma vez que no
capaz de descrever este tipo de comportamento. Os parmetros e X
max
assim estimados
foram:
= 0,780 t 0,0386 h
-1
X
max
= 1,4010
9
t 6,0710
7
UFC.g
-1

Os demais modelos citados por Mitchell et al. (2004) apresentaram-se ainda menos
adequados para descrever a cintica observada, pois nenhum deles inclui um termo de morte
microbiana.
4.10 ESTIMAO DA BIOMASSA ATRAVS DA TAXA DE PRODUO DE CO2 72

0 5 10 15 20 25 30
0,0
4,0x10
8
8,0x10
8
1,2x10
9
1,6x10
9
2,0x10
9
B
i
o
m
a
s
s
a

(
U
F
C
.
g
-
1
)
Tempo (h)

Figura 4.12: Ajuste dos dados de biomassa ao modelo logstico.
= dados experimentais; Linha = predio do modelo

4.10 Estimao da biomassa atravs da taxa de produo
de CO
2

Os cromatogramas obtidos para o CO
2
tiveram resoluo satisfatria. Um exemplo
est apresentado na Figura 4.13.

Figura 4.13: Exemplo de cromatograma obtido na anlise de CO
2
no ar de sada do biorreator.

A Figura 4.14 mostra os resultados obtidos para a taxa de produo de CO
2
durante
os cultivos. As curvas de CPR foram bastante reprodutveis e seguiram o mesmo padro
apresentado por outros trabalhos encontrados na literatura (Sato et al., 1983; Kim et al., 1985;
Smits et al., 1996; Koutinas et al., 2003; Prado et al., 2004): um rpido aumento inicial,

atingindo mximo com aproximadamente 8 horas de cultivo (prximo metade da fase de
crescimento), seguido de uma lenta reduo, que se prolongava por dias. Em alguns
experimentos, pode-se acompanhar esta lenta reduo na taxa de produo de CO
2
, que
continuou por pelo menos mais seis dias, at atingir praticamente zero.
0 5 10 15 20 25 30
0,0
2,0x10
-4
4,0x10
-4
6,0x10
-4
8,0x10
-4
1,0x10
-3
C
P
R

(
g
C
O
2
.
g
-
1
.
h
-
1
)
Tempo (h)

Figura 4.14: Taxa de produo de CO
2
.
Resultados so mdia de trs experimentos.
Os resultados de uma triplicata do cultivo em BCHA foram utilizados para estimar os
parmetros do modelo representado pela Equao 3.2, que relaciona a produo de CO
2

biomassa.
Os valores obtidos para os parmetros foram:

X CO
Y
/
2
= 2,7610
-12
g
CO2
.UFC
-1

2
CO
m = 2,3610
-13
g
CO2
.UFC
-1
.h
-1

Os grficos da Figura 4.15 comparam os resultados preditos pelo modelo, a partir dos
dados de produo de CO
2
, com a biomassa medida para trs experimentos. Percebe-se que o
modelo s conseguiu descrever satisfatoriamente a evoluo da curva de biomassa durante as
primeiras 20h de cultivo, ou seja, at a fase estacionria. Aps este perodo, foi observada
queda na contagem de clulas viveis, o que o modelo utilizado no foi capaz de descrever.

0 5 10 15 20 25 30 35
0,0
5,0x10
8
1,0x10
9
1,5x10
9
2,0x10
9
2,5x10
9
C
P
R

(
g
C
O
2
.
g
-1
.
h
-
1
)
B
i
o
m
a
s
s
a

(
U
F
C
.
g
-
1
)
Tempo (h)
0,0
2,0x10
-4
4,0x10
-4
6,0x10
-4
8,0x10
-4
1,0x10
-3

0 5 10 15 20 25 30 35
0,0
5,0x10
8
1,0x10
9
1,5x10
9
2,0x10
9
2,5x10
9
B
i
o
m
a
s
s
a

(
U
F
C
.
g
-
1
)
Tempo (h)
0,0
2,0x10
-4
4,0x10
-4
6,0x10
-4
8,0x10
-4
1,0x10
-3

C
P
R

(
g
C
O
2
.
g
-1
.
h
-
1
)

0 5 10 15 20 25 30 35
0,0
5,0x10
8
1,0x10
9
1,5x10
9
2,0x10
9
2,5x10
9
B
i
o
m
a
s
s
a

(
U
F
C
.
g
-
1
)
Tempo (h)
0,0
2,0x10
-4
4,0x10
-4
6,0x10
-4
8,0x10
-4
1,0x10
-3

C
P
R

(
g
C
O
2
.
g
-1
.
h
-
1
)

Figura 4.15: Resultados da estimao de biomassa a partir da taxa de produo de CO
2
, para trs experimentos.
Linha slida = predio do modelo (UFC.g
-1
); = biomassa medida (UFC.g
-1
);
w = taxa de produo de CO
2
(g
CO2
.g
-1
.h
-1
)).
Este um resultado comum nos trabalhos que buscam estimar biomassa em CES a
partir de dados de atividade metablica (produo de CO
2
, consumo de O
2
, atividade
enzimtica). Mitchell (1992) j apontava a dificuldade de estimar a biomassa a partir dos
dados de produo de CO
2
aps a fase de crescimento exponencial.
Matcham et al. (1984) mostraram que a atividade da enzima laccase bom parmetro
para estimao de biomassa de Agaricus bisporus apenas nas primeiras 56h de cultivo.
Smits et al. (1996), utilizando tambm um modelo do tipo Luedeking-Piret para
estimar biomassa a partir da produo de CO
2
e a produo de O
2
, encontraram desvios entre
a estimativa da equao e as medidas experimentais nos pontos de baixa e alta concentrao
de biomassa. Os primeiros, devido menor dimenso, tm pouco efeito sobre a estimao da
biomassa ao longo do cultivo e foram atribudos a erro experimental. Entretanto, os autores
no encontraram explicao para os desvios nas altas concentraes de biomassa e sugeriram,
para trabalhos futuros, extender a equao para compensar tais desvios.
4.11 DESENVOLVIMENTO DE MODELO CINTICO 75

4.11 Desenvolvimento de modelo cintico
A partir dos dados experimentais de biomassa, acares redutores, acetato e
produo de CO
2
, foi desenvolvido um modelo cintico para descrever a evoluo destas
grandezas.
As seguintes observaes puderam ser realizadas a partir dos resultados obtidos
experimentalmente:
A curva de crescimento do microrganismo atingiu um mximo aps aproximadamente 15
horas de cultivo, passando a declinar.
Sugere-se que este declnio esteja relacionado ao acmulo de acetato no meio de cultivo,
estando este fenmeno de acordo com outros trabalhos da literatura.
A concentrao de acares redutores no meio aumenta juntamente com a biomassa, sendo
fruto da atividade enzimtica do microrganismo.
O leito no sofre alteraes significativas de massa seca e umidade ao longo do cultivo.
Com base nestas observaes, foi desenvolvido o modelo, cujas principais
consideraes so:
1) Microrganismo possui cintica de crescimento do tipo Monod, sendo os acares
redutores seu substrato limitante.
2) Os acares redutores so consumidos pelos microrganismos e, concomitantemente,
produzidos pela atividade enzimtica (xilanases, celulases) destes.
3) Os produtos finais do metabolismo microbiano considerados so o gs carbnico e o cido
actico, sendo que este possui efeito bactericida.
4) Leito do biorreator no sofre alteraes significativas de massa seca, umidade ou atividade
de gua ao longo do cultivo.
5) Influncias do pH sobre a velocidade de crescimento e do metabolismo microbiano sobre
o pH so desprezadas.
4.11 DESENVOLVIMENTO DE MODELO CINTICO 76

Com base nestas consideraes, foi desenvolvido o equacionamento do modelo. A
biomassa cresce dependente do nutriente limitante (acares redutores), com a velocidade
especfica de inativao celular dependente da concentrao de acetato no meio.
X k X
dt
dX
D
(4.1)
S K
S
S
+

max
(4.2)
n
D
Ac k k
1
(4.3)
Os acares redutores so consumidos pelo microrganismo e produzidos pela sua
atividade enzimtica, que considerada proporcional somente concentrao de biomassa.
Portanto, os polissacardeos hidrolisados por esta atividade enzimtica so considerados em
excesso, o que gera uma simplificao da equao da velocidade de reao (A).
A X Y
dt
dS
X S
+
/
(4.4)
p
X k A
2
(4.5)
O acetato produzido pelo metabolismo microbiano, mas possui efeito bactericida
descrito pela Equao 4.3. A curva experimental de acetato, entretanto, apresentou queda na
concentrao da substncia a partir das 18 horas de cultivo (Figura 4.10). Para tentar explicar
este fenmeno, foi introduzido um termo para representar esta reduo da quantidade de
acetato no meio, sendo o efeito proporcional inibio causada pelo acetato no crescimento.
X k X Y
dt
dAc
D X Ac

/
(4.6)
Este termo mostrou-se indispensvel para que o modelo conseguisse se aproximar
dos dados experimentais.
O gs carbnico produzido pelo metabolismo microbiano, estando associado ao
crescimento e manuteno.
4.12 ESTIMAO DOS PARMETROS DO MODELO CINTICO 77

X m
dt
dX
Y CPR
dt
dC
CO X CO
CO
+
2 2
2
/
(4.7)
Aqui a utilizao da Equao 2.54 seria justificada, e provavelmente at mais
indicada. Entretanto, este balano de CO
2
no influencia os demais, e, como ser explicado
mais adiante o uso da Equao 4.7 permite melhores comparaes com os resultados obtidos
para a estimao da biomassa a partir da taxa de produo de CO
2
.
4.12 Estimao dos parmetros do modelo cintico
Os parmetros
X CO
Y
/
2
e
2
CO
m foram estimados separadamente dos demais parmetros
do modelo, utilizando a predio de biomassa obtida com o modelo. Este procedimento
facilitou a resoluo do problema de estimao, sem prejuzos qualidade da soluo, uma
vez que o balano de CO
2
no influencia os demais. Por este motivo, a discusso sobre a
estimao dos parmetros tambm iniciar pelos balanos de biomassa, acares redutores e
acetato; para depois lidar com o balano de CO
2
.
Assim, inicialmente se tinha um sistema de trs equaes diferenciais (Equaes 4.1,
4.4 e 4.6) e nove parmetros a estimar, que so apresentados na Tabela 4.1.
No processo de estimao, percebeu-se que, mesmo impondo limites mximos e
mnimos para os parmetros, era possvel obter vrios conjuntos de valores diferentes para os
nove parmetros, sendo que o modelo apresentava resposta similar em todos os casos, ou seja,
erros de predio semelhantes.

Tabela 4.1: Parmetros do modelo cintico presentes nos balanos de biomassa, acares
redutores e acetato.
Parmetro Significado
max
Velocidade especfica mxima de crescimento
K
S
Constante de saturao de Monod
k
1
Taxa de reao de inativao celular devido ao acetato
n Ordem da reao de morte celular em relao ao acetato
Y
S/X
Razo de consumo de substrato por biomassa formada
k
2
Taxa de reao de hidrlise de polissacardeos
p
Ordem da reao de hidrlise de polissacardeos em relao
biomassa
Y
Ac/X
Razo de produo de acetato por biomassa formada

Parmetro de proporcionalidade entre reduo da
concentrao de acetato e taxa de morte celular

A anlise realizada com o algoritmo SELEST revelou alto grau de correlao entre
os parmetros, ou seja, imprecises da estimao de um parmetro so compensadas por
imprecises nas estimaes dos demais, de forma que o modelo fornea uma resposta que,
com os dados disponveis, parece satisfatria. A reduzida quantidade de dados experimentais
disponveis que permite esta distoro e prejudica a estimao. Esta carncia de dados
aproveitveis explicada por problemas enfrentados durante os experimentos, descritos no
Apndice.
O algoritmo apontou que o parmetro
max
, por exemplo, possui grande efeito sobre
as sadas do modelo. Isto esperado, uma vez que a velocidade especfica de crescimento ,
que aparece nas trs equaes diferenciais, diretamente proporcional a
max
. Entretanto, a
alta correlao deste parmetro com os demais faz com que sua identificabilidade seja a mais
baixa e ele no possa ser estimado com preciso.
Buscando melhorar a estimativa dos parmetros, decidiu-se fixar o valor de
max
em
0,78 h
-1
, valor este que fora obtido anteriormente no ajuste ao modelo de crescimento

logstico, para estimar somente os outros oito parmetros, com mais preciso. Esta medida
surtiu efeito, e sete parmetros puderam ser estimados com boa preciso (Tabela 4.2). Apenas
o parmetro K
S
no pode ser refinado, permanecendo com uma estimativa grosseira. De
qualquer forma, este o parmetro de menor efeito sobre as sadas do sistema (Tabela 4.3), o
que uma garantia de que, ainda assim, as incertezas do modelo esto minimizadas.
Tabela 4.2: Parmetros estimados para o modelo cintico
Parmetro Valor Unidade
max
0,78 h
-1

K
S
0,674 g
S
g
-1

k
1
0,154 t 1,0610
-2
h
-1

n 1,50 t 6,8410
-2

Y
S/X
9,7510
-8
t 1,2710
-9
g
S
UFC
-1

k
2
7,10 t 0,941 g
S
h
-1

p 1,01 t 3,1310
-3

Y
Ac/X
1,0210
-9
t 6,9710
-11
g
Ac
UFC
-1

8,9210
-10
t 7,2610
-11
g
Ac
UFC
-1

Tabela 4.3: Efeito dos parmetros sobre as sadas do modelo cintico.
Parmetro Efeito
p 0,8318
k
2
0,3615
n 0,3593
Y
Ac/X
0,0346
k
1
0,0275
Y
S/X
0,0244
0,0208
K
S
0,0151

A Tabela 4.4 representa a matriz de correlao dos parmetros estimados com o
algoritmo SELEST. O diagnstico final foi de que os parmetros so muito correlacionados.

Ressalte-se ainda que, caso K
S
ou
max
tambm tivessem sido estimados, as correlaes
aumentariam consideravelmente.
O parmetro p foi o que apresentou o menor grau de correlao em relao aos
demais. Aliando-se isso ao seu alto efeito sobre as sadas do modelo, este parmetro torna-se
o de maior identificabilidade. Alm disso, o valor de p, praticamente igual a 1, mostra que a
velocidade da reao de hidrlise dos polissacardeos controlada pela transferncia de massa
no leito.
Os parmetros k
2
e Y
S/X
possuem alta correlao pois, uma vez que o valor de p
quase igual a 1 (e p o parmetro de maior identificabilidade), eles se contrabalanam na
equao dos acares redutores. O aumento de um implica o aumento do outro, para manter o
equilbrio. Isto remete a um problema j na proposio do modelo, que no foi previsto.
semelhante a explicao para o caso do par Y
Ac/X
e , fortemente correlacionados por se
compensarem no balano de acetato.
J k
1
e n, que tambm apresentam forte correlao, possuem dependncia inversa: os
aumentos de um acarretam reduo do outro. A causa da forte correlao o fato e o modo de
ambos participarem da equao que define a taxa de morte, k
D
.
Tabela 4.4: Matriz de correlao para os parmetros estimados do modelo cintico
p k
2
n Y
Ac/X
k
1
Y
S/X

p 1 0,150 0,028 0,185 -0,049 0,212 0,190
k
2
0,150 1 -0,525 0,377 0,544 0,998 0,381
n 0,028 -0,525 1 -0,829 -0,979 -0,514 -0,826
Y
Ac/X
0,185 0,377 -0,829 1 0,812 0,380 0,995
k
1
-0,049 0,544 -0,979 0,812 1 0,531 0,799
Y
S/X
0,212 0,998 -0,514 0,380 0,531 1 0,385
0,190 0,381 -0,826 0,995 0,799 0,385 1


Os resultados obtidos na simulao do modelo podem ser confrontados com os dados
experimentais na Figura 4.16. Percebe-se que o modelo proposto apresentou boa concordncia
com os dados experimentais, conseguindo descrever de forma satisfatria o comportamento
das variveis biomassa, acares redutores e acetato no sistema.
0 5 10 15 20 25 30 35
0,0
3,0x10
8
6,0x10
8
9,0x10
8
1,2x10
9
1,5x10
9
B
i
o
m
a
s
s
a

(
U
F
C
.
g
-1
)
Tempo (h)
0 5 10 15 20 25 30 35
0,0
4,0x10
- 3
8,0x10
- 3
1,2x10
- 2
1,6x10
- 2
2,0x10
- 2
A
c
a
r
e
s

r
e
d
u
t
o
r
e
s

(
g
S
.
g
-
1
)
Tempo (h)

0 5 10 15 20 25 30 35
0,0
1,0x10
- 3
2,0x10
- 3
3,0x10
- 3
4,0x10
- 3
A
c
e
t
a
t
o

(
g
A
c
.
g
-
1
)
Tempo (h)

Figura 4.16: Predies do modelo desenvolvido em comparao com os dados experimentais.
= Dados experimentais; Linhas = Predies do modelo.

As predies da biomassa do modelo cintico, obtidas na primeira fase da estimao,
conforme foi descrito, foram utilizadas para estimar os parmetros
X CO
Y
/
2
e
2
CO
m . Os valores
obtidos constam na Tabela 4.5. Percebe-se que ambos divergem ligeiramente dos valores
estimados diretamente a partir dos dados experimentais.
Tabela 4.5: Parmetros
X CO
Y
/
2
e
2
CO
m estimados para o modelo cintico.
Y
CO2/X
2,1110
-12
g
CO2
UFC
-1

m
CO2
4,9210
-13
g
CO2
UFC
-1
.h
-1


A Figura 4.17 apresenta a comparao entre a produo de CO
2
verificada
experimentalmente e a predio feita pelo modelo. A curva obtida no acompanhou
satisfatoriamente as tendncias desenvolvidas pela curva experimental.
0 5 10 15 20 25 30 35
0,0
3,0x10
-3
6,0x10
-3
9,0x10
-3
1,2x10
-2
1,5x10
-2
C
P
R

A
c
u
m
u
l
a
d
o

(
g
C
O
2
.
g
-
1
)
Tempo(h)

Figura 4.17: Predies do modelo com relao produo de CO
2
.
= Dados experimentais; Linhas = Predies do modelo.

A dificuldade em descrever satisfatoriamente a produo de CO
2
pode ser
decorrncia direta do ainda limitado poder de caracterizao dos sistemas em CES. A
descrio ofertada pelo modelo bastante simples em comparao com a complexidade do
processo.
Possveis problemas difusionais, causados pela alterao da estrutura do RIFS
durante o cultivo, poderiam levar limitao de oxignio no processo. Isto, juntamente com a
composio complexa do meio de cultivo, implica em diferentes rotas metablicas utilizadas
pelo microrganismo, as quais no poderiam ser corretamente consideradas no modelo pelas
prprias limitaes analticas ainda presentes nos estudos de processo de CES.
Com os parmetros
X CO
Y
/
2
e
2
CO
m , aqui obtidos para o modelo cintico, foi realizada
a estimao indireta da biomassa, como comparao ao resultado apresentado anteriormente,
quando esses parmetros foram estimados diretamente a partir das medies experimentais de
biomassa. A Figura 4.18 apresenta os resultados obtidos.

0 5 10 15 20 25 30 35
0,0
3,0x10
8
6,0x10
8
9,0x10
8
1,2x10
9
1,5x10
9
B
i
o
m
a
s
s
a

(
U
F
C
.
g
-
1
)
Tempo (h)
0,0
2,0x10
-4
4,0x10
-4
6,0x10
-4
8,0x10
-4
1,0x10
-3
C
P
R

(
g
C
O
2
.
g
-
1
.
h
-
1
)

Figura 4.18: Estimao de biomassa atravs dos parmetros
X CO
Y
/
2
e
2
CO
m do modelo cintico.
= Medies de biomassa; w = Medies de CPR.
Linha pontilhada = Biomassa predita pelo modelo cintico.
Linha contnua = Biomassa estimada atravs dos parmetros
X CO
Y
/
2
e
2
CO
m do modelo cintico.

De acordo com o procedimento utilizado para a estimao dos parmetros
X CO
Y
/
2
e
2
CO
m , a biomassa estimada deveria coincidir com aquela predita pelo modelo cintico.
Entretanto, os resultados foram pouco satisfatrios, o que pode ser decorrncia da j
mencionada desvinculao do balano de CO
2
em relao aos demais presentes no modelo.
Alm disso, o meio slido contm vrias fontes de carbono diferentes, cujo consumo gera
CO
2
, mas apenas o teor de acares redutores foi monitorado.
Est claro, assim, que o modelo proposto pode ser aperfeioado. Alm da
necessidade de mais dados experimentais, o modelo ainda carece de relaes estequiomtricas
para melhor descrever o sistema. As produes de acetato e CO
2
, conforme o modelo,
ocorrem sem haver uma relao direta com o consumo de substrato.
O prprio substrato, que complexo, constitudo de polissacardeos e seus derivados
por hidrlise, apresentado de forma bastante simplificada: acares redutores derivados de
polissacardeos presentes em excesso. A caracterizao extremamente simplificada do

substrato, ou at a falta de caracterizao, comum nos modelos propostos para CES, o que
nos remete a uma das desvantagens do CES em relao ao CSm: a dificuldade na
quantificao de parmetros importantes do cultivo (Mitchell e Lonsane, 1992; Pandey,
2003).
Captulo 5
Concluses e Perspectivas
Apesar de os cultivos em estado slido apresentarem, por definio,
heterogeneidades, os testes de mistura realizados mostraram que o biorreator utilizado realiza
uma homogeneizao adequada para os propsitos do trabalho. Os poucos trabalhos
encontrados na literatura que tambm utilizavam este tipo de biorreator adotaram igualmente
a considerao de homogeneidade do leito.
A quantificao de biomassa, apesar de ser um parmetro fundamental para o
desenvolvimento de bioprocessos, ainda tem de ser muito estudada em CES. As tcnicas
desenvolvidas tm-se destinado basicamente aos processos envolvendo fungos filamentosos,
enquanto a anlise por contagem em placas, tradicionalmente recomendada para bactrias,
ainda no mostra a preciso desejada. A literatura carece do desenvolvimento de trabalhos
que apontem componentes da biomassa bacteriana de fcil medio e que sejam adequados na
estimao indireta de biomassa.
Neste trabalho, a estimao de biomassa atravs da produo de CO
2
apresentou
bons resultados nas primeiras horas do cultivo, mas a queda na contagem de microrganismos
no foi acompanhada por similar queda na produo de CO
2
. De qualquer forma, sempre
CONCLUSES E PERSPECTIVAS 86

esperado que a estimao da biomassa atravs da atividade metablica perca eficincia ao
longo do tempo nos experimentos, quer pela natureza cumulativa do erro de estimao, quer
por mudanas metablicas do microrganismo, que no so corretamente detectadas quando se
tem um nico parmetro mensurvel.
Alguns trabalhos, em geral em CSm, j procuram utilizar um maior nmero de
medies on-line simultaneamente para gerar uma estimativa melhor da biomassa. A
obteno de tais medies depende do desenvolvimento de sensores adequados, e a tecnologia
disponvel para CES ainda est aqum da utilizada em CSm.
O modelo cintico desenvolvido para representar o processo apresentou resultados
satisfatrios, realizando boas predies das concentraes de biomassa, acares redutores e
acetato no meio. A predio da produo de CO
2
, por outro lado, no apresentou a mesma
qualidade.
Porm, ficou claro que o modelo ainda pode ser bastante aprimorado, como pela
obteno de uma maior quantidade de dados experimentais. Alm disso, o estabelecimento de
relaes estequiomtricas no processo pode tornar o modelo mais parcimonioso, reduzindo o
nmero de parmetros a estimar.
Cabe ressaltar que, neste trabalho, procurou-se desenvolver o conhecimento ligado a
alguns dos pontos que a literatura cita como desvantagens dos CES em relao aos CSm: a
pouca caracterizao de aspectos de engenharia do processo, dificuldade de medio de
parmetros do processo (biomassa, substrato, produtos), cintica de reaes e modelagem
matemtica.
Por fim, os resultados deste trabalho podem servir como guias para o
desenvolvimento de novos estudos que aprofundem mais o conhecimento dos aspectos de
engenharia dos cultivos em estado slido, para que estes atinjam o mesmo nvel tecnolgico j
alcanado pelos cultivos submersos.
CONCLUSES E PERSPECTIVAS 87

O trabalho apresentado nesta dissertao serve como um primeiro esforo no sentido
de desenvolver modelos no-empricos para o cultivo em estado slido utilizando o resduo
industrial fibroso de soja para o crescimento de bactrias. Novos estudos so possveis a partir
deste trabalho.
Para desenvolver o estudo da transferncia de massa no biorreator, est sendo
estudada a possibilidade do uso de anlise de imagens nos testes de mistura com corantes,
para determinar um coeficiente efetivo de transferncia de massa. Esta informao seria til
no momento de propor modelos adequados para descrever os fenmenos de transferncia de
massa no processo.
Na estimao de biomassa, sugere-se o desenvolvimento de novos mtodos indiretos
de estimao, atravs de componentes da biomassa, que sejam aplicveis a bactrias. A
literatura cita apenas exemplos para fungos (glicosamina e ergosterol).
Medies on-line de O
2
, com a preciso necessria, acopladas s medies atuais de
CO
2
, podem permitir uma estimao de biomassa mais precisa e robusta que a obtida
atualmente.
O modelo cintico desenvolvido seria bastante aprimorado se fosse possvel
estabelecer uma estequiometria do processo. A prpria incorporao de um balano de
oxignio ao modelo atual pode auxiliar nesse intuito.
Um nmero maior de experimentos utilizando este sistema, porm variando-se as
condies de cultivo (temperatura, pH inicial, umidade relativa do ar, umidade inicial do
leito) pode representar uma grande evoluo no modelo atual, com a incorporao de
balanos de massa (gua) e energia.
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Apndice A - Problemas enfrentados durante
os experimentos
Durante a execuo dos experimentos, houve vrios problemas com o aparato
experimental, que dificultaram o desenvolvimento do trabalho. Alguns deles, juntamente com
uma breve discusso sobre suas conseqncias, sero apresentados aqui.
O compressor responsvel pelo fornecimento de ar para o biorreator tem
funcionamento intermitente, ou seja, trabalha para gerar uma determinada presso de ar na
linha e pra, sendo novamente acionado quando a presso cai abaixo de determinado nvel.
Como o aparato experimental no contava com vlvulas reguladoras de presso, apenas
vlvulas simples e rotmetros, ocorriam leves variaes na presso e, conseqentemente, na
vazo de ar no biorreator. Como efeito, nos grficos da porcentagem de CO
2
no ar de sada,
medida pelo CG, observa-se um perfil em forma de serrote, com periodicidade, inclusive.
Entretanto, a amplitude das variaes provocadas por este fenmeno pequena, como
observado na Figura A.1.
O biorreator utilizado impedia a instalao de sensores de temperatura em contato
direto com o leito, para monitorar a temperatura do meio de cultura ao longo do cultivo. As
ps de agitao no deixam nenhum espao entre suas trajetrias, e apenas 3 mm para a
parede do cilindro.
Atravs de um teste de submerso do corpo do biorreator, percebeu-se que ele possui
pontos de vazamento de ar. O principal no eixo, mas pode vazar ar tambm pelas escotilhas
e pela tampa do biorreator. A grande preocupao neste caso que os pontos de vazamento se
tornem pontos de entrada de microrganismos contaminantes.
APNDICE A - PROBLEMAS ENFRENTADOS DURANTE OS EXPERIMENTOS 97

0 10 20 30 40
0,0
0,2
0,4
0,6
0,8
1,0
1,2
C
O
2

(
%
)
Tempo (h)

Figura A.1: Curva de porcentagem de CO
2
no ar de sada do biorreator apresentando efeito da variao da vazo
de ar.

De fato, a despeito das afirmaes de vrios autores sobre a menor possibilidade de
contaminao em CES, vrios experimentos foram perdidos devido ao desenvolvimento de
microrganismos estranhos.
As operaes de amostragem do biorreator ofereciam uma boa oportunidade para a
entrada de contaminantes, j que era necessrio abrir uma escotilha do biorreator e introduzir
uma colher para coleta da amostra. Por mais que se utilizasse material esterilizado, e o
procedimento fosse feito junto chama, a possibilidade de contaminao era alta, pois no era
possvel realizar a amostragem numa capela de fluxo.
O prprio teste de Gram, comumente utilizado para identificar contaminantes em
meio de cultivo, no muito adequado quando se trata de CES, exatamente pela grande
quantidade de slidos que dificultam a visualizao ao microscpio. A forma que foi mais
utilizada para detectar a presena de contaminantes foi a observao das colnias formadas
nas placas de contagem.
A sada de ar do biorreator consistia de um pequeno orifcio com aproximadamente 7
mm de dimetro. Por vrias vezes, verificou-se que a fibra acabava entrando neste orifcio e
causando seu entupimento. Isto ocorria principalmente nas primeiras horas do cultivo, quando

a fibra ainda tinha maior capacidade de reteno de gua e consistncia. Para desentupir a
sada de ar podia ser necessrio abrir o sistema, o que possibilitava novamente a entrada de
contaminantes.
O Campus do Vale da UFRGS tambm sofre eventuais quedas de energia, que,
muitas vezes, acabam encerrando experimentos precocemente.
Na etapa final do trabalho, o motor do biorreator comeou a apresentar problemas.
Por vezes, no respondia ao acionamento, rodava em velocidade lenta ou at mesmo parava
sozinho. Isto acabou impedindo que mais experimentos pudessem ser realizados.
O termo-higrmetro utilizado tambm apresentou problemas no funcionamento.
Primeiramente, tais medidores j costumam perder preciso nas condies de alta umidade
relativa do ar utilizadas nos experimentos. Alm disso, nesta situao de ar saturado, pode
ocorrer condensao de gua no sensor. De fato, estas condies s quais ele foi exposto
durante os cultivos parecem ter afetado o aparelho, o qual, aparentemente, perdia a calibrao
aps algumas horas de medio, marcando valores de temperatura e umidade relativa
sabidamente incorretos. Em outras oportunidades, o aparelho simplesmente acusava erro de
medio, e, por fim, perdeu a estabilidade das medies, que variavam continuamente, sem
estabilizar em um valor.
O controle de umidade relativa no ar de entrada do biorreator, que fora planejado,
acabou no funcionando. Embora fosse possvel ajustar a umidade relativa do ar por meio de
solues saturadas de sais, o pequeno trecho (aproximadamente 20 cm) de mangueira de ar
fora da estufa era suficiente para reduzir um pouco a temperatura do ar. Esta pequena reduo
na temperatura era suficiente para causar um aumento significativo na umidade relativa do ar.
A prpria anlise de contagem de colnias em placas mostrou peculiaridades no caso
do Bacillus circulans BL53. A bactria apresentou crescimento muito rpido no meio PCA,
com suas colnias aumentando de tamanho rapidamente, chegando ao ponto de se juntarem,

dificultando a contagem (Figura A.2). Por este motivo era necessrio realizar a contagem das
colnias j com apenas 12 horas de incubao.
H trabalhos na literatura tratando deste crescimento das colnias de Bacillus
circulans (Eiha et al, 2002; Komoto et al, 2003). As colnias desta bactria so capazes de
migrar sobre o meio de cultura, e inclusive formar subcolnias. Komoto et al (2003)
concluram que o aumento da quantidade de gar no meio de cultura reduz esta capacidade,
pois o gar cria uma rede que impede o deslocamento das clulas.
Com esta informao, decidiu-se aumentar a quantidade de gar adicionada aos
meios de cultura utilizados neste trabalho.

Figura A.2: Aspecto de colnias colabadas de Bacillus circulans BL53.

Anexo I Algoritmo SELEST
A seguir so descritos em detalhe os passos do algoritmo SELEST, utilizado na
estimao e no clculo de desvios-padro dos parmetros. Adaptado de Secchi et al. (2006),
com autorizao.
Partindo-se de um sistema dinmico:
( ) ( ) ( )
) ; , (
; ; 0 ; , , ,
0 0

u x H y
x t x u x x t F
&
(I.1)
onde x, x&
nx
so as variveis de estado e suas derivadas em relao varivel
independente, t; u
nu
so as entradas do sistema (variveis cujo valor controlado parte
do sistema considerado, p.ex., temperatura); y
ny
so as sadas medidas e
np
so os
parmetros do modelo.
1) Avaliam-se os valores mdios de y e u para cada experimento com r repeties:
N ny
r
k
k
y
r
y

1
1
(I.2)
N ny
r
k
k
u
r
u

1
1
(I.3)
E a matriz de covarincia experimental normalizada (V
y

nyN nyN
):
T
T
r r
y
y y
r
y y y y
V
1 , 1 , 1
1
) 1 )( 1 (

(I.4)
onde
-1
significa diviso elemento-por-elemento,
r , 1
1 um vetor-coluna de uns, e
y
nyN

r
.
2) Calcula-se a matriz de sensibilidade normalizada das sadas do sistema em relao
aos parmetros, S
nyN np
, utilizando uma estimativa inicial dos parmetros do modelo,
o
:
T T
N
T T
S S S S ] [
2 1
L (I.5)
ANEXO I ALGORITMO SELEST 101

onde
o j j j
S y S

) (
1

ny np
, () a matriz diagonal de um vetor,
j
y
ny
a
predio do modelo para o j-simo ponto experimental, utilizando a mdia dos valores das
entradas
j
u :
) ; , (
) 0 ( , 0 ) ; , , , (
o j j
o o j j
u x H y
x x u x x t F
&
(I.6)
e
j
S
a matriz de sensibilidade normalizada das sadas do sistema em relao aos

parmetros avaliada no j-simo ponto:

H
W
x
H
S
x j
(I.7)
A matriz de sensibilidade dos estados em relao aos parmetros,

x
W
x
, obtida
resolvendo-se o seguinte problema de valor inicial para processos dinmicos:

o
x x x
x
W
F
W
x
F
W
x
F
) 0 ( , 0
&
&
(I.8)
ou o sistema linear:

,
_
F
x
F
W
x
1
(I.9)
para processos estacionrios.
3) Toma-se m = min {np, ny N} e procede-se a decomposio em valores singulares
da S ponderada pelo desvio-padro das medies,
i i y i
V
,
) (
:
( )
T
V U S
1
(I.10)
ou, de forma similar, procede-se a decomposio em valores caractersticos da matriz
de informao de Fisher:

T T
y
T
V V S V S F ; ) (
1
(I.11)
onde V
y
a matriz diagonal composta pelos elementos da diagonal de V
y
. Ento,
determina-se o efeito de cada parmetro nas sadas utilizando os primeiros m componentes

principais (primeiros m vetores coluna da matriz V, designados por V
m

np m
) e a medida
de magnitude E:
np
m
j
j
m
V
E
(I.12)
onde |V
m
| a matriz dos valores absolutos de V
m
, e so os primeiros m maiores
valores caractersticos em .
4) Seleciona-se o parmetro de maior efeito p
1
= {
k
| E
k
= max
j
E
j
}, ajusta-se o
nmero de parmetros selecionados para n = 1 e o vetor- ndice dos parmetros
n
= {k},
representando o vetor- ndice dos melhores parmetros possveis de estimar com os dados
disponveis (em ordem decrescente).
5) Calcular matriz de informao de Fisher reduzida, F
n
, em relao aos parmetros
selecionados p e as matrizes de covarincia dos parmetros, V
p
, e da predio,
y
V
:
n N ny
y
T
n
S V S F

) (
1
(I.13)
1
n p
F V (I.14)
T
p y
S V S V

(I.15)
onde S
a sub-matriz de S contendo apenas as colunas

n
. Alm disso, calcula-se
os coeficientes de correlao destas matrizes de covarincia,
p
e
y
, e o condicionamento
da F
p
:
T
p p p p
V V V
1
|| ||
n p p
I (I.16)
T
y y y y
V V V

1

|| ||
ny y y
I (I.17)
p n
V F (I.18)

onde I
n
a matriz identidade de tamanho n, e
|| || designa o maior elemento de

valor absoluto de uma matriz. Com esta definio de norma,
p
a maior correlao entre os
parmetros.
6) Mantendo os demais parmetros com a estimativa inicial
o
, obtm-se novo vetor
estimativa
n
p para os parmetros p atravs de estimao por mnimos quadrados (ou mxima
verossimilhana). Tambm se calculam os resduos normalizados, ; o ndice de degradao
da preditabilidade,
n
, e o ndice de degradao por correlao de parmetros
n
.

N ny
k
r
k
n k k
y p y y
r

)] ( [
1
1
1
(I.19)
+ || ||

y n
(I.20)
n p n , 1
+ (I.21)
onde
i,j
a funo delta de Kronecker. A adio de
1,n
na Equao I.21 necessria
para impedir uma parada prematura no passo 7 quando n = 2.
7) Aplicam-se os seguintes critrios de parada, definindo a mxima correlao dos
parmetros permitida,
max
:
7.a) Se n > 1 e (((
n-1
< 1 ou (
n-1
<
max
e
n
>
max
)) e
n-1
<
n
) ou
-1
< ), ento
n-1
o vetor- ndice da soluo e
1
n
p o vetor de parmetros estimados correspondente,
terminando-se o algoritmo. a preciso computacional da mquina.
7.b) Se n = np, ento
n-1
o vetor- ndice da soluo e
1
n
p o vetor de parmetros
estimados correspondente, terminando-se o algoritmo.
8) Se n < m, ento se calcula a medida de independncia linear d
j
para cada
parmetro em relao aos anteriormente selecionados:
n
1

|| || || ||
cos sin
1
1
]
1
,
_

j
s V s
s V s
d
j j
j
T
j
j
(I.22)

onde ( )
T T
S S S S V

1
. Caso contrrio, i.e., n m, calcula-se a medida de
independncia linear d
q,j
para cada parmetro restante em relao a todos os possveis (m1)-
tuplos
q
dos parmetros previamente selecionados, para
)! 1 ( )! 1 (
!
1
+

m n m
n
q , (I.23)
onde
q

n
e |
q
| = m1, utilizando a Equao I.24:
n
1
,

|| || || ||
cos sin
1
1
]
1
,
_

j
s V s
s V s
d
j q j
j q
T
j
j q
(I.24)
onde ( )
T
q q
T
q q q
S S S S V

1
. Determina-se, ento, o pior valor, que a menor
independncia linear: d
j
= min
q
d
q,j
.
9) Calcula-se o ndice de identificabilidade I
j
para cada parmetro
j
remanescente:
I
j
= E
j
d
j
j
n
. (I.25)
Seleciona-se o prximo melhor parmetro p
n+1
= {
k
| I
k
= max
j
I
j
}, ajusta-se o
nmero de parmetros selecionados para n = n + 1, o vetor- ndice para
n
= {
n-1
, k}, e
retorna-se ao passo 5.
ainda possvel adicionar os seguintes diagnsticos nas condies de parada do
passo 7, avaliadas no estgio (n 1) (7.a) ou n (7.b):
Se
max

y
e
max
<
p
, ento as sadas esto muito correlacionadas devido a
possvel alta correlao nas entradas;
Se
max

y
e
max

p
, ento as sadas esto muito correlacionadas devido alta
correlao dos parmetros;
Se
max

p
ento os parmetros esto muito correlacionados.

A constante
max
do algoritmo um limite superior para o grau de correlao dos
parmetros. Este limite muito mais fcil de determinar do que um limite para o ndice de
identificabilidade I
j
, cujo valor depende mais de experimentos do que de valores estatsticos.
Ao final do algoritmo, o desvio-padro () da estimativa de cada parmetro n
selecionado pode ser obtido a partir dos valores da diagonal principal da matriz
p
, calculada
no passo 5:
n n
p n
,
) ( (I.26)

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UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO GRANDE DO SUL

= Dados experimentais; Linhas = Predies do modelo.

a matriz de sensibilidade normalizada das sadas do sistema em relao aos

a sub-matriz de S contendo apenas as colunas

|| || designa o maior elemento de

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