Anda di halaman 1dari 8

BAB V

PEMBAHASAN
Uji konfirmasi merupakan uji lanjutan dari uji screening narkotika / psikotropika dimana
uji konfirmasi merupakan pemeriksaan yang lebih akurat karena hasil yang diperoleh merupakan
hasil yang sudah definitif menunjukkan jenis zat narkotika / psikotropika dalam suatu sampel
yang dianalisis. Dalam uji konfirmasi narkotika / psikotropika, sampel yang digunakan adalah
sampel urine pasien yang dicurigai mengandung zat narkotika / psikotropika. Penggunaan
sampel urine dikarena dalam sampel urine obat, racun, dan metabolit ada dalam konsentrasi yang
lebih besar dibandingkan dalam darah. Sebelum melakukan uji konfirmasi terhadap jenis
narkotika / psikotropika, dilakukan suatu pemisahan zat narkotika / psikotropika terlebih dahulu
dari sampel yang akan dianalisis. Pemisahan tersbut dilakukan dengan menggunakan proses
ekstraksi.
Ekstraksi merupakan proses pemisahan analit dari suatu matriks sampel menggunakan
pelarut dimana analit tersebut sangat larut dalam pelarut yang digunakan namun zat pengotornya
tidak larut. Dalam proses ekstraksi, setelah analit dalam sampel larut dalam pelarut organik yang
digunakan, kemudian dilakukan suatu proses penguapan untuk menghilangkan pelarut tersebut
sehingga diperoleh analitnya saja untuk selanjutnya dianalis, dimana hal ini disebut dengan tahap
isolasi. Dalam proses ekstraksi, syarat untuk pelarut sesuai yang dapat digunakan yaitu memiliki
kakuatan mengekstraksi yang baik sehingga analit yang akan diekstraksi dapat dipisahkan
sepenuhnya dari matriks sampel dan zat pengotor, kelarutannya rendah dalam air, memiliki
kerapatan yang rendah dalam air, memiliki volalitas moderat agar mudah diuapkan saat akan
memperoleh analit yang larut dalam pelarut tersebut namun pelarut tersebut tidak boleh terlalu
volatile sehingga pada saat digunakan untuk melarutkan analit atau preparasi sampel pelarut
tersebut tidak cepat menguap seluruhnya, bersifat stabil dan tidak mudah terbakar, murah,
kemurniannya tinggi, tidak mengabsorpsi sinar UV atau tdak memiliki aktivitas elektrokimia
sehingga tidak mengganggu proses analisis analit.
Dalam praktikum yang dilakukan, proses ekstraksi dilakukan untuk memperoleh obat
obat golongan Amfetamin dan Opiat dari sampel urine yang selanjutkan akan dianalisis dengan
menggunakan spektrofotodensitometri. Dalam proses analisis obat golongan Amfetamin, yang
menjadi sasaran dalam proses analisis yaitu amfetamin, metamfetamin, methylendioxy
amfetamin (MA) dan methylendioxy metamfetamin (MDMA). Sedangkan untuk obat golongan
Opiat, yang menjadi sasaran dalam proses analisis yaitu kodein dan morfin.
Ada beberapa metode ekstraksi, yaitu ekstraksi padat cair, ektraksi cair cair, dan
ekstraksi fase padat (Solid Phase Extraction/ SPE). Dalam praktikum yang dilakukan, metode
ekstraksi yang digunakan yaitu ekstraksi cair cair.

Ekstraksi Cair-Cair (liquid extraction, solvent extraction)
Ekstraksi cair-cair yaitu pemisahan solute dari cairan pembawa (diluen) menggunakan
solven cair. Campuran diluen dan solven tersebut bersifat heterogen (immiscible, tidak saling
campur), dan jika dipisahkan terdapat 2 fase, yaitu fase residu (rafinat), berisi diluen dan sisa
solut dan fase solven (ekstrak), berisi solute dan solven (Anonim, 2011).Pada ekstraksi cair-cair,
satu komponen bahan atau lebih dari suatu campuran dipisahkan dengan bantuan pelarut. Proses
ini digunakan secara teknis dalam skala besar misalnya untuk memperoleh vitamin, antibiotika,
bahan-bahan penyedap, produk-produk minyak bumi dan garam-garam logam. Proses inipun
digunakan untuk membersihkan air limbah dan larutan ekstrak hasil ekstraksi padat cair
(Anonim, 2011).
Ekstraksi cair cair merupakan ekstraksi suatu analit yang didasarkan atas distribusi zat
terlarut dengan perbandingan tertentu antara dua pelarut yang tidak saling bercampur. Dalam
proses ektraksi cair cair terdapat beberapa tahap, yaitu adjust pH (penyesuaian pH), partition,
dan separated phase. Pada proses pengerjaannya, sampel urine yang akan dianalisis diambil
sebanyak 1 ml dan dimasukkan ke dalam tabung centrifuge, kemudian ditambahkan dengan
buffer fosfat pH 9,3 sebanyak 1 ml dengan tujuan untuk mengkondisikan pH sampel agar sesuai
dengan pH yang baik untuk proses ekstraksi (basa) karena semakin tinggi pH larutan akan
semakin tinggi pula jumlah analit yang akan dperoleh. Setelah itu ditambahkan dengan 2 ml
campuran kloroform isopropanol yang sebelumnya telah dicampurkan dengan perbandingan
3:1, dimana campuran kloroform isopropanol berfungsi sebagai pelarut yang akan membuat
analit dalam sampe diperoleh kembali dengan jumlah yang lebih tinggi dibandingkan dengan
menggunakan yang lain. Sampel urine, buffer fosfat pH 9,3 dan campuran kloroform
isopropanol dalam tabung centrifuge tersbut kemudian di vortex dengan kecepatan 2500 rpm
selama 30 menit agar terbentuk emulsi yang sempurna sehingga analit atau sasaran zat dalam
proses analisis dapat larut dengan baik hingga selanjutnya dilakukan proses centrifugasi dengan
kecepatan 3000 rpm selama 10 menit untuk memperoleh hasil pemisahan antara fase kloroform
dan fase airnya. Fase kloroform merupakan fraksi yang mengandung analit yang diinginkan.
Setelah proses centrifuge, fase kloroform akan berada dibagian bawah tabung centrifuge karena
kloroform memiliki berat jenis yang lebih besar dibandingkan dengan berat jenis air. Fase
kloroform tersbut kemudian di pipet dan dipindahkan ke dalam tabung reaksi yang lain.
Sedangkan fase air yang tersisa dalam tabung centrifuge diekstraksi kembali. Hal ini dilakukan
karena diduga dalam fase air tesbut masih terdapat analit / zat yang diinginkan. Oleh karenanya,
dilakukan kembali penambahan buffer fosfat dengan pH yang lebih tinggi dari pH buffer fosfat
sebelumnya yaitu 10,5 untuk memaksimalkan perolehan analit yang terdapat dalam fase air
tersbut. Kemudian ditambahkan campuran kloroform isopropanol kembali dan dilakukan
proses vortex dan centrifugasi dengan waktu dan kecepatan yang sama. Dari proses tersebut juga
akan diperoleh fase kloroform dimana fase kloroform ini ditambahkan pada fase kloroform
pertama yang terdapat dalam tabung reaksi untuk selanjutnya dipindahkan ke dalam botol vial
dan di uapkan pada suhu 60 - 70
0
C menghilangkan pelarut pelarut organik yang sebelumnya
digunakan untuk proses elusi sehingga diperoleh analit murni dari target yang diinginkan.
Analit yang telah diperoleh baik dengan ekstraksi cair cair direkonstitusi dengan
methanol sebanyak 25l dengan tujuan untuk melarutkan analit tersebut sehingga diperoleh
dalam bentuk cairan sehingga memudahkan analit untuk selanjutnya dilakukan uji konfirmasi
dengan metode KLT Spektrodensitometri.
Setelah diperoleh analit dari sampel urine yang akan dianalisis, kemudian analisis analit
tersebut dilanjutkan pada uji konfirmasi. Dalam praktikum yang dilakukan, uji konfirmasi
dilakukan dengan menggunakan metode KLT (Kromatografi Lapis Tipis)
Spektrofotodensitometri
Penyiapan Fase Diam
Setelah diperoleh analit dari sampel urine yang akan dianalisis, kemudian analisis analit
tersebut dilanjutkan pada uji konfirmasi. Dalam praktikum yang dilakukan, uji konfirmasi
dilakukan dengan menggunakan metode KLT (Kromatografi Lapis Tipis)
Spektrofotodensitometri. Hal pertama yang dilakukan dalam uji konfirmasi dengan KLT
Spektrodensitometri adalah menyiapkan plat lapis tipis yang akan digunakan untuk menotolkan
noda analit yang telah diperoleh sebelumnya. Preparasi plat lapis tipis sangat penting untuk
dilakukan karena akan menentukan hasil dari proses selanjutnya dari uji konfirmasi ini. Plat lapis
tipis yang digunakan mengandung silika gel yang berperan sebagai fase diam. Plat umumnya
berukuran 20X20 cm, namun pada praktikum yang dilakukan, plat yang diperlukan berukuran 5
X 10 cm, sehingga harus dilakukan pemotongan terlebih dahulu sebelum plat tersebut digunakan.
Dalam pemotongan plat, ada beberapa syarat yang harus dipenuhi, antara lain:
Alas yang digunakan untuk memotong plat harus bersih, halus serta terbuat dari keramik
atau kaca.
Alat pemotong yang digunakan harus tajam dan tidak boleh berkarat.
Dalam pemotongan plat, tidak harus dipaksakan pemotongan tersebut dilakukan dalam
sekali tahap pemotongan. Pengulangan pemotongan boleh dilakukan hingga plat benar
benar terputus dengan sempurna.

Hal tersebut dilakukan agar diperoleh plat yang tidak bergerigi, dan bebas dari
kontaminas, karena plat yang bergerigi dapat mengganggu proses elusi sehingga menghasilkan
elusi analit yang tidak lurus sempurna (miring), berekor (tailing) serta terbentuk jalur elusi baru.
Plat yang telah dipotong dengan baik, harus diberi identitas berupa kode arah elusi dipojok kanan
atau kiri atas dengan menggunakan pensil dan tidak boleh menggunakan ballpoint. Walapun
pensil dan ballpoint sama sama mengandung bahan kimia, tetapi bahan kimia yang terkandung
dalam pensil masih bisa ditoleransi oleh plat dibanding bahan kimia yang terkandung dalam
ballpoint. Selain itu, apabila menggunakan ballpoint, saat plat dicuci dengan menggunakan
methanol, kemungkinan tinta dari ballpoint tersebut akan luntur dan mengotori plat. Fungsi dari
pemberian kode arah elusi adalah agar proses pencucian plat dan proses elusi dapat berjalan
kearah yang sama, sebab apabila arah pencucian plat dengan arah elusi berbanding terbalik, akan
menyebabkan kotoran plat yang telah dibawa ke bagian atas plat saat pencucian plat dengan
methanol akan turun kembali ke daerah uji saat proses elusi yang menyebabkan analit yang
dielusikan akan terelusi bersama pengotor pengotor tersebut sehingga mengganggu proses
analisis analit. Selain itu, plat yang telah dipotong harus diberi batas atas dengan menggunakan
pensil sekitar 1 cm dengan tujuan agar titik akhir elusi dari masing masing noda dapat diamati
dengan jelas. Selain itu juga untuk memastikan agar masing masing noda tidak menyentuh
pengotor pengotor hasil pencucian plat yang terkumpul dibagian atas plat.
Sebelum digunakan, plat yang telah dipotong tersebut dicuci dan diaktivasi. Pencucian
harus dilakukan sebab plat kemungkinan mengandung pengotor karena faktor internal maupun
eksternal. Faktor internal yang dimaksud adalah pada saat proses pembuatan plat tersebut,
sedangkan faktor eksternal adalah pada saat penyimpanan plat itu sendiri. Pencucian dilakukan
dengan menggunakan larutan methanol yang merupakan pelarut polar / semi polar yang dapat
melarutkan banyak senyawa. Arah proses pencucian harus disesuaikan dengan kode arah elusi
yang telah ditetepkan sebelumnya karena methanol itu ikut bermigrasi bersama pengotor kearah
pencucian. Sebenarnya larutan yang lebih baik digunakan untuk proses pencucian plat adalah
fase geraknya sendiri karena fase geraknya tersebut akan secara langsung membawa zat yang
dianggap sebagai pengotor oleh fase gerak itu sendiri sehingga plat tersebut akan terbebas dari
semua pengotor yang dapat mengganggu proses elusi. Sedangkan apabila menggunakan
methanol, zat yang tidak larut dalam methanol namun merupakan pengotor bagi fase gerak,
maka pada saat proses elusi analit dengan fase geraknya tersebut proses elusi akan diganggu oleh
pengotor tersebut. Namun, dalam praktikum yang dilakukan, pencucian dilakukan dengan
menggunakan methanol mengingat methanol merupakan pelarut yang umum digunakan dan
mudah diperoleh dipasaran serta dapat melarukan banyak zat. Untuk memastikan telah
tercucinya plat dengan sempurna, perlu diperhatikan bahwa saat bagian paling atas plat telah
terbasahi semua maka perlu ditunggu lagi selama 10 menit sehingga meyakinkan area
penotolan dan elusi analit dan standar telah bebas dari kotoran dan zat-zat pengganggu.
Tahap selanjutnya dilakukan proses aktivasi plat dengan pemanasan plat pada suhu 60
0
C
selama 10 menit di dalam oven. Hal ini bertujuan untuk menghilangkan uap air dan pengotor
yang menempel pada sisi aktif plat karena methanol yang digunakan untuk pencucian plat terdiri
atas campuran air dan methanol sehingga kemungkinan air tersebut terjerat dalam silika gel dan
menyebabkan silika gel tersebut menjadi jenuh dan harus diaktivasi. Oleh karenanya proses
aktivasi dilakukan dengan menghilang air yang terjerat dalam silika gel tersebut sehingga silika
gel tersebut tidak jenuh dan agar plat dapat memberikan respon baseline yang lebih baik serta
mengurangi ratio gangguan (noise ratio).


Penyiapan larutan Pengembang
Selain memilih fase diam (TLC plate), memilih eluen pengembang kromatografi lapis
tipis (KLT) juga merupakan faktor yang berpengaruh besar, karena hanya beberapa kasus solvent
pengembang yang hanya terdiri dari satu komponen saja. Pada umumnya campuran larutan
pengembang KLT (solvent system) bisa sampai enam komponen dengan perbandingan tertentu.
Campuran larutan/eluen pengembang KLT ini berfungsi untuk :
Melarutkan campuran bahan
Mengangkut bahan untuk dipisahkan pada lapisan fase diam (sorben)
Memberikan nilai hrf senyawa yang terpisah
Memberikan selektivitas yang memadai untuk campuran bahan untuk dipisahkan.

Adapun syarat eluen KLT (mobile phase) antara lain :
Kemurnian yang memadai
Stabilitas yang memadai
Viskositas rendah
Partisi/pemisahan linier
Tekanan uap sedang
Daya toksik yang serendah mungkin

Dalam pelaksanaannya, yang paling sulit dilakukan adalah bagaimana memilih solvent
system/fase gerak yang cocok agar komponen senyawa terpisah baik. Cara memilih fase gerak
KLT bisa dilakukan sendiri dengan orientasi dari beberapa komponen pelarut dan perbandingan.
Namun demikian untuk mendapat hasil yang memuaskan juga butuh waktu lama. Optimasi fase
gerak KLT ini bisa juga sesuai mengambil dari literatur. Apabila dari literatur belum cocok
pemisahan senyawanya, bisa dirubah rasio/perbandingan solvennya. Namun terkadang juga dari
literature masih menuliskan sistem pelarut pengembang yang sangat beracun atau karsinogenik,
misalnya benzene. Jika menggunakan komponen pengembang seperti ini perlu diperhatikan alat
safety bagi pengguna.
Seri buku eluotropic memperkenalkan pengganti benzena yang bisa diganti toluene yang
sesuai dengan kekuatan elusi dan koefisien kecepatannya. Tips praktis memilih eluen
pengembang KLT adalah mencari dari literatur. Apabila tidak ditemukan fase gerak yang cocok,
bisa mencoba mulai dari solvent tunggal yang mempunyai kekuatan elusi menengah. Biasanya
sebagai fase diam dicoba dulu menggunakan silica gel 60, sebelum dilanjutkan pengujian lain
atau perubahan.
Larutan pengembang yang digunakan dalam praktikum ini adalah larutan pengembang
sistem TB dan TAEA. Larutan pengembang TB dibuat dengan mencampurkan sikloheksana,
toluene, dan dietilamin dengan perbandingan 75:15:10 dalam sebuah labu ukur. Sedangkan
larutan pengembang TAEA dibuat dengan mencampurkan toluene: aseton: etanol: ammonia
(45:45:7:3), dimasukan ke labu ukur dan dikocok sampai homogen.


Penjenuhan Bejana Kromatografi
Tahapan selanjutnya adalah penjenuhan chamber, tujuan dari penjenuhan chamber adalah
untuk mengoptimalisasi proses pengembang fase gerak. Sebelum dijenuhkan, dipilih terlebih
dahulu chamber yang sesuai dengan ukuran plat. Karena Plat yang digunakan berukuran 5 X 10
cm, maka chamber yang digunakan adalah chamber dengan ukuran yang sesuai dengan ukuran
plat. Kemudian penjenuhan chamber dilakukan dengan cara memasukkan 10 ml larutan
pengembang TB ke dalam chamber yang telah di berisi sebuah kertas saring kemudian chamber
ditutup rapat dengan penutupnya selama kurang lebih 30 menit. Fungsi penambahan kertas
saring ke dalam chamber saat proses penjenuhan chamber adalah untuk mengetahui chamber
tersebut sudah jenuh atau belum. Apabila chamber telah jenuh, maka kertas saring dalam
chamber tersebut akan terbasahi seluruhnya oleh larutan pengembang TB. Namun, dalam
prakteknya tentu saja akan sangat sulit melihat kejelasan penjenuhan ini. Sebab terdapat
beberapa faktor yang mempengaruhi, seperti ukuran kertas saring yang digunakan bervariasi
sehingga kecepatan terbasahinya kertas saring juga akan berbeda pula. Semakin kecil ukurannya
akan semakin cepat terbasahi dan diasumsikan telah terjenuhinya chamber. Namun jika ukuran
kertas saring yang digunakan lebih besar maka tentu saja akan menyebabkan lebih lamanya
kertas saring itu terbasahi sehingga waktu penjenuhan chamber akan lebih lama. Oleh karena itu
digunakan parameter waktu saja yaitu waktu penjenuhan selama 30 menit. Untuk volume
larutan pengembang (eluen) TB yang dimasukkan ( 10 mL) harus lebih rendah dari spot noda
pada plat (< 1cm) nantinya saat plat dimasukkan ke dalam chamber agar spot noda yang
ditotolkan tidak larut ke bawah dan dapat terelusi sempurna. Selain itu penjenuhan chamber
harus dilakukan pada tempat yang datar dan bebas dari getaran sehingga penjenuhan berjalan
lebih efektif.