ISOLASI DNA TANAMAN

Metode yang digunakan untuk mengisolasi DNA dari berbagai jenis tanaman, organ tanaman,
maupun jaringannya dapat dilakukan dengan berbagai cara. ada intinya terdapat tiga !aktor
utama yang sangat penting untuk dalam melakukan puri!ikasi dan ekstraksi DNA secara
maksimal. ertama adala" cara dalam meng"omogenkan jaringan tanaman k"ususnya adala"
dinding selnya. #edua adala" komposisi dari larutan bu!!er yang ditamba"kan dalam
penggerusan jaringan tanaman dan yang ketiga adala" peng"ilangan en$im peng"ambat%
polisakarida.
Sampel daun tanaman
&ntuk memuda"kan peng"ancuran sampel dari daun tanaman, umumnya ekstraksi DNA
menggunakan nitrogen cair. Ta"apan yang dilakukan untuk mendapatkan DNA tanaman pisang
adala" penggerusan atau "omogenasi daun pisang dengan penamba"an nitrogen cair. 'ungsinya
adala" untuk mempermuda" penggerusan dan menjaga agar DNA tidak mengalami kerusakan.
(al ini dilakukan sampai didapatkan daun tanaman pisang yang tela" "ancur. Selanjutnya
dilakukan penamba"an bu!!er ekstrak yang ber!ungsi untuk melisiskan membran sel dan
membran !os!olipid bilayer
#emudian dilakukan inkubasi sampel dalam )ater bat" bersu"u *+ derajat , selama *+ menit.
(al ini dilakukan untuk optimalisasi kerja bu!!er ekstrak. Selanjutnya dilakukan sentri!ugasi
sampel dengan kecepatan -++++ rpm selama -+ menit dalam su"u . derajat ,. "al ini dilakukan
untuk memisa"kan debris dan komponen sel lain yang menjadi pengotor dengan DNA. (asilnya
didapatkan ba")a supernatan ber)arna "ijau sedangkan pelet ber)arna puti" ke"ijauan.
Supernatan yang tela" diperole" selanjutnya diambil dan ditamba"kan dengan larutan
"enol/,"loro!orm/Isolamyl Alko"ol 0,I1. (al ini dilakukan untuk mengekstraksi DNA dari
kontaminan. 'enol merupakan pelarut organik yang dapat melarutkan protein, lipid dan molekul
lain sepergi polisakarida se"ingga di"arapkan akan didapatkan supernatan yang berisi DNA
bebas kontaminan. Setela" pencampuran, "omogenat tersebut di2orteks untuk optimalisasi
"omogenasi.
Selanjutnya dilakukan sentro!ugasi "omogenat dengan ,I tersebut dengan kecepatan -++++
rpm selama -+ menit dalam su"u . derajat ,. "asil yang didapatkan adala" supernatan dan pelet
yang berada pada tiga lapisan lapisan atas ber)arna "ijau jerni", lapisan tenga" ber)arna "ijau
keru" dan pelet yang ber)arna "ijau tua. #emudian diambil supernatan pada lapisan paling atas
dan ditamba"kan larutan ,"loro!orm/Isoamyl Alko"ol untuk presipitasi lanjutan. #emudian
kembali dilakukan 2orteks dan sentri!ugasi.
Namun, masala" akan muncul bila lokasi penelitian jau" dari pusat industri se"ingga sulit
mendapatkan nitrogen cair. Ole" karena itu, perlu metode isolasi DNA yang muda" dan tidak
memerlukan nitrogen cair, tetapi dapat meng"asilkan DNA yang berkualitas tinggi untuk proses
ampli!ikasi 0Imran, 3++31.
rotokol yang digunakan merupakan prosedur ekstraksi berbasis ,TA4 yang dikembangkan
ole" Doyle dan Doyle 0-5671 dan dimodi!ikasi ole" Santoso 03++81, serta dilaksanakan secara
preparasi mini. ,onto" daun dikeluarkan dari !ree$er dan ditimbang -++ mg tanpa tulang daun
lalu diletakkan dalam mortar pestel dan ditamba" +,8 ml bu!er ekstraksi ,TA4 0,TA4/ .,- g
Na,l, -+ g ,TA4, +,8 M 9DTA p( 6,+ 0Sumiati, 3++51.
9kstraksi DNA menggunakan nitrogen cair untuk melisis dinding sel dapat mengeluarkan semua
isi sel yang kemudian ditampung dalam larutan penyangga yang berisi Tris (,l dan 9DTA.
Dinding sel juga dapat dipeca"kan dengan penggerusan menggunakan bu!er ekstraksi diikuti
dengan peng"angatan pada su"u *8:,. Detergen seperti sodium dodecil sul!at 0SDS1, sarkosil,
dan ,TA4 dapat digunakan untuk proses lisis 0Subandri, 3++*1.
enggunaan bu!er ,TA4 sebagai pengganti nitrogen cair untuk ekstraksi dapat meng"asilkan
produk DNA yang berkualitas yang ditunjukkan ole" pita DNA genom Dengan demikian, bu!er
,TA4 dapat digunakan untuk mengisolasi DNA pada tanaman jeruk. roduk ekstraksi DNA
yang berkualitas baik ditunjukkan dengan pita DNA yang terli"at tebal dan bersi" bila
di2isualisasi menggunakan image gel elektro!oresis 0Anonim, 3++61.
Sampel 4ua" Tanaman
Meskipun isolasi DNA dapat dilakukan dengan berbagai cara, akan tetapi pada setiap
jenis atau bagian tanaman dapat memberikan "asil yang berbeda, "al ini dikarenakan adanya
senya)a poli!enol dan polisakarida dalam konsentrasi tinggi yang dapat meng"ambat pemurnian
DNA. ;ika isolasi DNA dilakukan dengan sample bua", maka kadar air pada masingmasing
bua" berbeda, dapat memberi "asil yang berbedabeda pula. Semakin tinggi kadar air, maka sel
yang terlarut di dalam ekstrak akan semakin sedikit, se"ingga DNA yang terpretisipasi juga akan
sedikit.
Langka" pertama untuk mengisolasi DNA adala" dengan memblender bua" yang akan
digunakan sebagai sumber DNA. roses ini bertujuan untuk merusak dinding sel, membran sel,
dan membran inti secara mekanik. #emudian, "asil pemblenderan bua" tersebut disaring lalu di
tuangkan dalam larutan detergent yang tela" diberi garam. <aram memiliki !ungsi yang sama
dengan SDS pada isolasi DNA genom sel dara" puti", yaitu untuk memberikan kondisi ionik,
se"ingga reaksi berjalan lebi" stabil. 0(arley 3++8/ .-+1. Selain itu, garam ber!ungsi untuk
meng"ilangkan protein dan karbo"idrat karena garam dapat menyebabkan keduanya
terpresipitasi, dan bersama%sama dengan detergen, keduanya ber!ungsi seperti "alnya lysing
buffer. <aram juga digunakan untuk melarutkan DNA, karena ion Na= yang dikandung ole"
garam mampu memblokir 0membentuk ikatan1 dengan kutub negati! !os!at DNA, yaitu kutub
yang bisa menyebabkan molekul%molekul saling tolak mnolak satu sama lain se"inggga pada
saat ion Na= membentuk ikatan dengan kutub negati! !os!at DNA, DNA akan terkumpul
0Dollard, -55. dalam ;amila", 3++8/3-1. Dari pernyataan tersebut, dapat disimpulkan ba")a
selain digunakan untuk meng"ilangkan protein dan karbo"idrat dan menjaga kesetabilan p(
lysing bu!!er, garam juga membantu proses pemekatan DNA.
Sedangkan detergent ber!ungsi untuk melisiskan barrier 0peng"alang1 sel secara kimia
sebagai pengganti senya)a kimia yang mampu merusak dinding dan membran sel antara lain
liso$im yang dapat mendegesti senya)a polimerik yang menyebabkan kekakuan sel dan etil
endiamintetra asetat 09DTA1 yang ber!ungsi untuk meng"ilangkan ion Mg3= yang penting untuk
memperta"ankan keseluru"an struktur selubung sel, serta meng"ambat en$im%en$im seluler ynag
dapat merusak DNA 0ion Mg3= merupakan ko!aktor penting bagi DNAse yang bisa >memakan?
DNA1. Detergen bisa menyebabkan kerusakan membran sel dengan mengemulsi lipid dan
protein sel serta menyela interaksi polar yang menyatukan membran sel karena detergen
mengandung disodium 9DTA dan lauryl sul!at yang memiliki !ungsi yang sama dengan dodesil
sul!at 0;amila", 3++8/--1. Sedangkan menurut Mac"mud 03++*1, penamba"an deterjen dalam
isolasi DNA dapat dilakukan karena deterjen dapat menyebabkan rusaknya membran sel, melalui
ikatan yang dibentuk melalui sisi "idro!obik deterjen dengan protein dan lemak pada membran
membentuk senya)a ?lipid protein%deterjen kompleks?. Senya)a tersebut dapat terbentuk
karena protein dan lipid memiliki ujung "idro!ilik dan "idro!obik, demikian juga dengan
deterjen, se"ingga dapat membentuk suatu ikatan kimia.
,ampuran tersebut diaduk perla"an agar tidak timbul bui". engadukan larutan bertujuan
untuk untuk memperbesar pergerakan partikel sel dan detergen agar reaksi berlangsung cepat,
karena detergent merupakan ba"an yang dapat merusak membran sel. Tetapi jika pengadukannya
terlalu cepat akan menimbulkan bui" yang dapat menyebabkan terganggunya proses isolasi
DNA. DNA akan sulit diamati karena ter"alangnya penyatuan DNA di daera" atas antara alko"ol
dengan campuran ekstrak bua", detergent dan garam akibat adanya rongga udara yang
ditimbukan ole" adanya bui".
Setela" itu, campuran dari ekstrak bua", detergent dan garam tersebut dimasukkan dalam
tabung reaksi, ditetesi dengan alko"ol dingin "ingga terli"at adanya cincin seperti kabut puti"
yang terbentuk di antara campuran dengan alko"ol. Alko"ol ber!ungsi untuk pengikatan strand
DNA yang tela" terkumpul karena pemekatan ole" garam. ;amila" 03++8/ -.1 menyebutkan
ba")a pemekatan dilakukan dengan penamba"an et"anol pada lapisan atas sampel se"ingga
terjadi prespitasi DNA pada perbatasan kedua larutan. Seperti yang tela" diketa"ui ba")a
kerapatan alko"ol lebi" kecil dibandingkan kerapatan air, se"ingga alko"ol akan berada di
bagian atas dari larutan dalam tabung reaksi. DNA yang terikat ole" alko"ol akan nampak seperti
cincin kabut puti" yang terbentuk di antara campuran dengan alko"ol.
Alko"ol yang ditamba"kan "arus dalam kondisi dingin. ;ika dibandingkan dengan
pernyataan ;amila" 03++8/ -.1, dengan adanya garam 0kation ko2alen seperti Na
=
1 dan pada su"u
di ba)a" 3+
+
, atau kurang, et"anol absolut akan mempresipitasikan asam nukleat polimerik
dengan baik dan dalam ;amila" 03++8/ 3-1 juga disebutkan ba")a semakin dingin et"anol, DNA
yang terpresipitasi semakin pekat. Dari pernyataan%pernyataan tersebut dapat diketa"ui ba")a
semakin dingin alko"ol, maka konsentrasi DNA yang akan terikat ole" alko"ol tersebut akan
semakin pekat atau tinggi se"ingga DNA yang terisolasi dapat terli"at dengan jelas.