Anda di halaman 1dari 27

KROMATOGRAFI CAIR KINERJA TINGGI

Kromatografi Cair Kinerja Tinggi (KCKT) dikenal juga dengan istilah High Performance Liquid
Chromatography (HPLC). KCKT merupakan perangkat peralatan yang penting dalam perkembangan
dunia analisis bahan baku maupun bahan pencemar. Fungsi utama KCKT pada dasarnya adalah
kemampuannya dalam memisahkan berbagai komponen penyusun dalam suatu sampel. Kinerja
tinggi dari kromatografi awalnya ditentukan oleh ketinggian tekanannya, namun perkembangan
teknologi telah menghasilkan produk kromatografi cair berkinerja tinggi dengan tekanan yang tidak
terlalu tinggi.

KCKT merupakan teknik pemisahan yang masih menjadi idola di dunia analisis saat ini. KCKT
digunakan secara luas dalam pemisahan dan pemurnian berbagai sampel dalam berbagai bidang
seperti farmasi, lingkungan, industri makanan dan minuman, industri polimer dan berbagai bahan
baku. KCKT lebih banyak digunakan untuk keperluan identifikasi (analisis kualitatif), kecuali jika
KCKT ini dihubungkan dengan sebuah spektrometri massa (Mass Spectrometer (MS)), maka
penggunaannya akan lebih memungkinkan dalam analisis kuantitatif.

Secara umum KCKT digunakan dalam kondisi-kondisi berikut:
1. Pemisahan berbagai senyawa organik maupun anorganik, ataupun spesimen biologis
2. Analisis ketidakmurnian (impurities)
3. Analisis senyawa-senyawa yang tak mudah menguap (non-volatil)
4. Penentuan molekul-molekul netral, ionik maupun zwitter ion
5. Isolasi dan pemurnian senyawa
6. Pemisahan senyawa-senyawa dengan struktur kimia yang mirip
7. Pemisahan senyawa-senyawa dalam jumlah kecil (trace elements)
Komponen KCKT

Komponen utama dalam KCKT adalah juga komponen dalam kromatografi lainnya yaitu
wadah/kemasan fase gerak, fase gerak, pompa KCKT, kolom, fase diam, detektor, dan perangkat
komponen pendukung lainnya.

Wadah Fase Gerak

Wadah fase gerak dalam KCKT harus terbuat dari bahan yang bersih dan inert. Wadah ini dapat
menampung sekurang-kurangnya 1-2 liter fase gerak, dan terlebih dahulu harus dibebasgaskan.
Kehadiran gas dalam wadah fase gerak ini akan menimbulkan gelembung gas pada pompa dan
detektor yang akan sangat mengacaukan hasil analisis.

Fase Gerak

Fase gerak dalam KCKT harus berupa pelarut, buffer, ataupun reagen dengan tingkat kemurnian
yang sangat tinggi, yaitu suatu cairan yang berderajat KCKT (HPLC grade). Adanya pengotor dalam
fase gerak akan menyebabkan gangguan pada sistem kromatografi. Partikel-partikel kecil yang
terdapat dalam fase gerak yang kurang murni dapat mengakibatkan kekosongan kolom KCKT.

Fase gerak atau dikenal juga dengan istilah eluen umumnya merupakan campuran pelarut yang
berperan dalam daya elusi dan resolusi analisis. Daya elusi dan resolusi KCKT ditentukan oleh
polaritas keseluruhan pelarut, polaritas fase diam, dan sifat-sifat komponen dalam sampel.

Secara umum ada 2 tipe fase gerak:
1. Fase gerak/eluen isokratik, yaitu eluen dengan komposisi pelarut yang tidak berubah selama
percobaan kromatografi
2. Fase gerak/eluen gradien, yaitu fase gerak dengan komposisi pelarut yang berubah selama
masa kromatografi
Ada begitu banyak pilihan fase gerak yang dapat kita gunakan (pelarut/larutan) serta kemungkinan
gradiennya akan menghasilkan kesempatan untuk mengoptimalkan pemisahan-pemisahan campuran
kompleks dari segi resolusi maupun waktu. Secara normal elusi isokratik akan lebih mudah
dikerjakan daripada elusi gradien.

Seringkali campuran pelarut merupakan fase gerak yang lebih baik daripada cairan murni, namun
pekerjaan optimasi berbagai komposisi pelarut untuk fase gerak secara coba-coba tentu tidak mudah
dilakukan.

Berdasarkan kepolaran fase gerak dibandingkan fase diamnya, fase gerak dibedakan menjadi:
1. Fase normal, yaitu fase diam lebih polar dari fase gerak. Kemampuan elusinya akan
meningkat seiring peningkatan polaritas fase gerak.
2. Fase terbalik, yaitu bila fase diam kurang polar dibanding fase geraknya. Kemampuan elusi
akan menurun seiring peningkatan kepolaran fase geraknya.
Deret eluotrofik yang merupakan deretan nama-nama pelarut yang disusun berdasarkan
kepolarannya, akan sangat membantu kita dalam pemilihan fase gerak.

Dalam KCKT dengan fase terbalik, fase gerak yang paling sering digunakan adalah campuran larutan
buffer-metabol atau campuran air-asetonitril. Sedangkan dalam fase normal sering digunakan adalah
campuran pelarut-pelarut hidrokarbon dengan pelarut terklorinasi atau menggunakan pelarut jenis-
jenis alkohol.

Pompa

Pompa KCKT harus terbuat dari bahan yag inert terhadap fase gerak. Bahan pompa dapat terbuat
dari: gelas, baja tahan karat, teflon maupun batu nilam.

Pompa yang digunakan sebaiknya mampu memberikan tekanan hingga 5000 psi dan mamp
mengalirkan fase gerak dengan kecepatan 3 ml/menit. Untuk keperluan preparatif, pompa yang
digunakan harus mampu mengalirkan fase gerak dengan kecepatan hingga 20 ml/menit. Ada 2 tipe
pompa:
1. Pompa dengan tekanan konstan
2. Pompa dengan aliran fase gerak yang konstan. Pompa tipe ini lebih umum digunakan.

Kolom

Ada 2 jenis kolom pada KCKT, yaitu kolom konvensional dan kolom mikrobor. Untuk mengetahui
perbedaan kolom konvensional dan kolom mikrobor klik disini.

Dalam beberapa hal kolom mikrobor lebih menguntungkan, diantaranya:
1. Kolom mikrobor mengkonsumsi fase gerak hanya 80% dari konsumsi kolom konvensional.
Hal ini disebabkan karena kolom mikrobor mempunyai kecepatan alir yang lebih lambat (10-
100 ul/menit)
2. Aliran fase gerak pada mikrobor yang lebih lambat membuat kolom mikrobor lebih ideal untuk
digabungkan dengan spektrometer massa
3. Sensitivitas kolom mikrobor lebih tinggi karena pelarut yang lebih pekat, sehingga cocok
digunakan dalam analisis sampel berskala kecil, seperti sampel klinis.
Perbedaan kolom konvensional dan mikrobor dapat anda lihat disini.

Fase Diam

Kebanyakn fase diam berupa silika yang dimodifikasi secara kimiawi, silika yang tak dimodifikasi atau
polimer-polimer stiren dan divinil benzena.

Daftar fase diam dapat dilihat disini.

Detektor

Detektor KCKT dikelompokkan menjadi dua golongan yaitu detektor yang bersifat universal, yaitu
detektor yang dapat mendeteksi zat secara umum, tidak bersifat spesifik, dan tidak bersifat selektif.
Contoh detektor yang bersifat universal adalah detektor indeks bias dan spektrometri massa. Dan
jenis detektor lainnya adalah detektor spesifik yang hanya akan mendeteksi analit secara spesifik dan
selektif, seperti detektor UV-Vis, fluoresensi dan elektrokimia.

Detektor yang ideal akan mempunyai karakteristik berikut:
1. Mempunyai respon terhadap analit yang cepat dan reproduksible
2. Mempunyai sensitivitas yang tinggi, yakni mampu mendeteksi analit pada kadar yang sangat
kecil
3. Stabil dalam pengoperasiannya
4. Mempunyai sel volume yang kecil sehingga mampu meminimalkan pelebaran pita. Untuk
kolom konvensional 8 ul atau lebih kecil dan 1 ul atau lebih kecil pada kolom mikrobar.
5. Signal yang dihasilkan berbanding lurus dengan konsentrasi analit pada kisaran yang luas
6. Tidak peka terhadap perubahan suhu dan kecepatan alir fase gerak
Detektor merupakan bagian integral dari peralatan analitik kromatografi cair ini. Ada beberapa jenis
detektor yang digunakan, dengan pemilihan yang umumnya didasarkan pada persyaratan
sensitivitas, jenis senyawa yang ada dalam sampel, dan faktor-faktor lain seperti biaya. Detektor yang
paling umum didasarkan pada indeks bias dari eluat kolom, karena hampir semua zat terlarut akan
menghasilkan larutan dengan indeks bias yang berbeda dengan indeks bias pelarut murni. Detektor
ini mampu menginderai perbedaan tersebut dan menghasilkan sinyal-sinyal listrik yang proporsional
yang kemudian diperkuat dan direkam untuk menghasilkan kromatogram. Batasan utamanya adalah
sensitivitas; batasan pendeteksian akan bervariasi sesuai dengan keadaan, yang umumnya sekitar
satu mikrogram zat terlarut.

Detektor Spektrofotometri
Deteksi spektrofotometri umumnya hanya dalam daerah ultraviolet. Idealnya, spektrofometri yang
nyata dengan pemilihan panjang gelombang yang sempurna akan memberikan fleksibilitas yang
maksimal untuk mendeteksi berbagai macam zat terlarut dengan sensitivitas yang sangat baik.

Detektor fluorometri
Merupakan detektor yang didasarkan atas fluoresens.

Detektor elektrokimia
Lazimnya, larutan efluen dari dalam kolom memasuki sebuah sel dimana larutan tersebut mengalir
diatas permukaan sebuah elektroda yang diberi potensial pada satu harga, dimana komponen-
komponen sampel mengalami reaksi transfer elektron.

Perangkat Pendukung Lainnya

Perangkat pendukung lain yang digunakan dalam KCKT dapat berupa komputer, integrator dan
rekorder.
Kromatografi Cair Kinerja Tinggi (KCKT)
Kromatografi Cair Kinerja Tinggi (KCKT)
High Performance Liquid Chromatography (HPLC) yang lebih dikenal dibandingkan dengan
kromatografi cairan kinerja tinggi (KCKT) merupakan teknik analisis pemisahan sekaligus penentuan
kualitatif maupun kuantitatif yang banyak digunakan pada senyawa-senyawa yang mempunyai titik
didih tinggi yang tidak dapat dilakukan dengan analisis secara kromatografi gas.
Prinsip pemisahannya sama dengan prinsip kromatografi pada umumnya yaitu berdasarkan pada
perbedaan sifat dalam distribusi kesetimbangan (K) dari 2 komponen yang berbeda fasanya (fasa
diam dan fasa gerak). HPLC terdiri dari fasa diam dengan permukaan aktifnya yang berupa padatan,
resin penukar ion, atau polimer berpori yang ditempatkan pada kolom serta dialiri fase gerak cair
dengan aliran yang diatur oleh suatu pompa. Analisis dengan HPLC dilakukan pada temperatur
rendah serta dengan adanya kompetisi 2 fase (gerak dan diam). Migrasi dari molekul komponen
akan sebanding dengan koefisien distribusinya, maka komponen dengan distribusi tinggi pada fase
diam akan bergerak lebih perlahan didalam kolom sehingga dapat terpisah dari komponen yang
distribusinya rendah.
Setiap komponen campuran yang keluar dari kolom dideteksi oleh detektor kemudian direkam
dalam bentuk kromatogram. Jumlah peak pada kromatogram menyatakan jumlah komponen,
sedangkan luas peak menyatakan konsentrasi komponen dalam campuran. Komputer dapat
digunakan untuk mengontrol kerja sistem HPLC dan mengumpulkan serta mengolah data hasil
pengukuran HPLC.
Teknik dalam HPLC :
a. Sebagai fase mobil/fase gerak berbentuk cairan.
b. Sebagai fase stasioner/fase diam, dapat berbentuk padatan atau cairan.
Secara sistematik diagram alat HPLC dapat digambarkan sebagai berikut:


Keunggulan HPLC diantaranya adalah:
a. Dapat menganalisis senyawa organik yang terurai (labil) pada suhu tinggi karena HPLC dilakukan
pada suhu kamar.
b. Dapat menganalisis cuplikan yang berasal dari senyawa-senyawa anorganik.
c. Dapat menganalisis cuplikan yang memiliki berat molekul tinggi atau titik didihnya sangat tinggi
seperti polimer.
Jenis-jenis kromatografi cairan kinerja tinggi (HPLC) yaitu :
a. Kromatografi adsorbsi
Kromatografi adsorbsi sangat cocok untuk pemisahan senyawa-senyawa yang bersifat agak polar.
Partikel-partikel silika atau alumina biasanya digunakan sebagai adsorben. Jenis kromatografi ini
menggunakan fasa gerak non polar seperti heksana dan disebut jugakromatografi fasa normal.
b. Kromatografi partisi
Kromatografi partisi sangat cocok untuk pemisahan senyawa-senyawa non polar. Jenis kromatografi
ini disebut dengan kromatografi fasa terbalik karena fasa geraknya lebih polar daripada fasa diam.
Salah satu kendala kromatografi ini adalah keterbatasan selektivitas sebagai ketidakcampuran kedua
fasa. Karena keterbatasan ini maka kromatografi partisi tidak digunakan lagi sebagai teknik analisis
rutin.
c. Kromatografi fasa terikat
Kromatografi fasa terikat merupakan teknik HPLC yang paling penting dan paling banyak digunakan
saat ini. Dalam hal penerapann kromatografi fasa terikat dan kromatografi partisi memiliki
persamaan. Akan tetapi, sorben fasa terbalik terdiri dari partikel silika yang dimodifikasi secara kimia
dengan rantai alkil sebaliknya, fasa diam pada kromatografi partisi terdiri dari partikel yang dilapisi
secara fisik dengan zat cair non polar.
Keuntungan kromatografi fasa terikat, yaitu :
1) Merupakan fasa yang stabil
2) Kepolaran fasa gerak dapat diubah selama proses pemisahan berlangsung bila kepolaran solut-
solut bervariasi.
3) Kolom mempunyai umur panjang.
4) Memiliki keterulangan waktu retensi yang baik.
5) Lebih ekonomis.
d. Kromatogarfi penukar ion
Kromatografi penukar ion merupakan teknik pemisahan campuran ion-ion atau molekul-molekul
yang dapat diionkan. Ion-ion bersaing dengan ion-ion fase gerak untuk memperebutkan tempat
berikatan dengan fasa diam. Dasar pemisahan kromatografi ini berasal dari perbedaan afinitas
senyawa bermuatan terhadap permukaan penukar ion.
e. Kromatografi ekslusi ukuran
Ukuran molekul merupakan kriteria utama dalam pemisahan dengan kromatografi ekslusi ukuran.
Pemisahan terjadi karena solut-solut berdifusi masuk dan keluar pori-pori paking kolom. Molekul-
molekul yang lebih besar dari diameter pori-pori akan melewati kolom secara cepat dan dikenal
dengan istilah volume terekslusi begitu pula sebaliknya. Teknik ini berguna untuk mengkarakterisasi
distribusi berat molekul polimer, pemurnian cuplikan biologis dan pemisahan senyawa-senyawa
dengan berat molekul 2000 atau lebih.
Di bawah ini beberapa komponen-komponen KCKT secara umum, antara lain :
a. Eluen (pelarut)
Tempat pelarut biasanya menggunakan suatu botol yang tahan terhadap pelarut-pelarut organik dan
larutan yang digunakan untuk KCKT haruslah terbebas dari partikel-partikel dari gas/udara. Hal ini
dikarenakan:
1) Adanya partikel dalam larutan bisa terbawa masuk ke dalam pompa, hal ini dapat mengakibatkan
tersumbatnya aliran pelarut tersebut.
2) Udara yang masuk ke dalam pompa dapat mengganggu kestabilan pemompaan dan jumlah
volume tetap yang dipakai akan terganggu.
3) Selain itu pada kolom dan detektor akan mengalami gangguan.
Adapun ciri-ciri yang harus dimiliki oleh fase gerak pada KCKT, yaitu :
1) Kemurnian tinggi (high purity), yaitu cairan eluen yang tidak terkontaminasi.
2) Kestabilan tinggi, yaitu eluen yang tidak bereaksi dengan sampel atau zat yang berfungsi sebagai
fase diam.
3) Kekentalan rendah, yaitu kerapatan eluen sekecil mungkin.
4) Dapat melarutkan sampel, tidak mengubah kolom dan sifat kolom serta cocok dengan detektor.
b. Sistem Pemompaan
Peralatan yang digunakan sebagai pompa dalam sistem KCKT memiliki beberapa persyaratan :
1) Menghasilkan tekanan hingga 6000 psi
2) Keluaran yang bebas denyut
3) Kecepatan alir dalam kisaran 0, 1 10 ml/menit
4) Pengaturan kecepatan alir dengan keterulangan setara dengan 0,5 % atau lebih baik
5) Tahan terhadap korosi.
Tiga jenis pompa yang sering digunakan dalam sistem KCKT yaitu :
1) Pompa Bolak-balik (reciprocating pump)
Jenis pompa yang paling banyak digunakan. Kelebihan pompa jenis ini adalah volume internalnya
kecil sekitar 35 400 l, tekanan hingga 10.000 psi, kemampuan untuk adaptasi menggunakan elusi
gradien, aliran yang konstan sehingga terbebas dari tekanan balik kolom dan akibat dari kekentalan
solven.
2) Pompa Sistem Penggantian (displacement pump)
Sistem penggantian menggunakan sebuah wadah besar seperti syringe dengan sebuah penekan
yang digerakan oleh motor. Menghasilkan aliran yang bebas tekanan balik, tidak dipengaruhi
kekentalan dan bebas denyut. Kekurangan pompa jenis ini adalah kapasitas pompa terbatas hanya
250 ml dan cukup sulit saat solven harus mengalami penggantian.
3) Pompa Tekanan Udara (pneumatic pump)
Bentuk paling sederhana sebuah pompa pneumatik merupakan wadah yang ditekan oleh gas
bertekanan tinggi. Harga relatif murah dan bebas denyut merupakan kelebihan jenis pompa ini.
Kekurangannya terletak pada kapasitas terbatas, tekanan keluaran terbatas hanya sekitar 2000 psi,
dipengaruhi oleh tekanan balik dan kekentalan solven dan tidak dapat digunakan untuk sistem elusi
gradien.
c. Injeksi sampel
Sistem injeksi sampel merupakan keterbatasan dari sistem kromatografi cair. Masalah ini dapat
menyebabkan pelebaran puncak sebagai akibat kolom yang kelebihan kapasitas. Sebagai akibatnya,
volume injeksi harus dibatasi hingga kisaran maksimum 500 l.
Proses injeksi pada awalnya menggunakan syringe melalui sebuah katup elastomer. Syringeyang
digunakan memiliki kemampuan melawan tekanan 1500 psi. Aliran dihentikan sementara saat injeksi
dan dikembalikan setelah sampel masuk ke aliran fasa gerak.
Metode pemasukkan sampel yang paling umum digunakan adalah dengan menggunakansampling
loop. Seringkali disatukan dalam sistem KCKT dengan kapasitas beragam 0,5 hingga 500 l (Skoog et
al., 1998)
d. Kolom KCKT
Kolom KCKT secara umum dibuat dari bahan tabung stainless steel, walaupun untuk tekanan di
bawah 600 psi kolom kaca dapat digunakan. Kolom untuk analisis KCKT memiliki ukuran panjang
kolom berkisar dari 10 30 cm berbentuk lurus dan jika diperlukan dapat disambung dengan kolom
yang lain. Diameter dalam kolom 4 10 mm dengan ukuran partikel 5 10 m. Kolom dari jenis ini
mempunyai 40.000 hingga 60.000 lempeng/meternya.
Saat ini, pabrik pembuat kolom telah merancang dan memproduksi kolom dengan kecepatan dan
kinerja tinggi. Beberapa kolom hanya memiliki panjang 1 hingga 4,6 cm dengan ukuran partikel 3 5
m. Beberapa jenis kolom memiliki jumlah lempeng hingga 100.000 hanya dengan panjang 3 sampai
7,5 cm dengan kelebihan pada kecepatan dan sedikitnya solven yang diperlukan dalam pemisahan.
Jumlah solven minimum menjadi pertimbangan penting karena mahalnya solven dengan tingkatan
kromatografi (chromatography grade).
Dua jenis kolom digunakan dalam kromatografi cair yaitu jenis pellicular dan partikel berpori (porous
particle). Jenis pellicular terdiri dari partikel dengan bentuk bola, tidak berpori berbahan dasar gelas
atau polimer dengan diameter 30 hingga 40 m. Lapisan tipis berpori silika, alumina, divinil benzen
sintetis polystirena atau resin penukar ion dilapiskan pada permukaannya.
Jenis kolom dengan partikel berpori berisi partikel berpori dengan diameter partikel 3 10m
terbuat dari silika, alumina, resin sintetis divinil benzen polystirena atau resin penukar kation yang
kemudian dilapisi lapisan tipis film berbahan organik sehingga berikatan secara kimia atau fisika
terhadap permukaannya. (Skoog et al., 1998)
e. Detektor
Detektor ideal pada sistem KCKT mempunyai persyaratan :
1) Memiliki sensitifitas yang memadai. Kisaran umum sensitifitas berkisar dari 10
-8
hingga 10
-15
gram
zat terlarut per pembacaan
2) Stabil dan memiliki keterulangan yang baik
3) Respon yang linear terhadap kenaikan konsentrasi
4) Waktu respon yang singkat
5) Kemudahan pada penggunaan
6) Memiliki volume internal yang kecil untuk mengurangi pelebaran puncak
Beberapa jenis detektor yang digunakan pada sistem KCKT :
1) Detektor Absorban (UV-Vis)
Pada detektor absorban, aliran akan mengalir melalui detektor dari kolom kromatografi. Untuk
meminimalkan pelebaran puncak, detektor dirancang dalam volume yang sekecil mungkin. Ukuran
volume dibatasi 1 10 l dengan panjang sel 2 10 mm. Umumnya sel detektor mampu menahan
tekanan hingga 600 psi sehingga peralatan pengurang tekanan diperlukan sebelum aliran memasuki
detektor.
2) Detektor Fluorescens
Detektor fluorescens yang digunakan sama halnya dengan detektor pada spektrofluoro-fotometer.
Detektor paling sederhana menggunakan lampu merkuri sebagai sumber cahaya dan filter untuk
mengisolasi panjang gelombang emisi radiasi. Lampu Xenon digunakan pada instrumen yang lebih
baik dengan gratting sebagai monokromatornya.
3) Detektor Refraktif Indeks
Detektor jenis ini bekerja dengan mengukur nilai indeks bias yang senyawa yang melalui sel. Sel akan
mengukur indeks bias solven fasa gerak sebagai blanko dan sampel secara bersamaan untuk
mendapatkan nilai indeks bias relatif.
4) Detektor Elektrokimia
Detektor dengan mendasarkan kerjanya pada pengukuran arus listrik. Perubahan arus akan dideteksi
terhadap waktu dan ditampakkan dalam bentuk kromatogram. Contoh penggunaan detektor adalah
pada penetapan senyawa tiol dan disulfida.
5) Detektor Spektra Massa
Sejumlah fraksi kecil cairan dari kolom dimasukkan ke dalam spektrometer massa pada kecepatan
alir 10 50 l per menit atau menggunakan termospray. Analat akan diionisasikan, dipisahkan pada
analisator, dibaca oleh detektor dan menghasilkan spektrum massa.
KROMATOGRAFI CAIR KINERJA TINGGI (KCKT)

MAKALAH KROMATOGRAFI

KROMATOGRAFI CAIR KINERJA TINGGI (KCKT)

PENDAHULUAN

Kromatografi merupakan pemisahan fisiko kimiawi. Pemisahan ini dapat terjadi kalau interaksinya
berulang. Kita dapat mengetahuinya dengan kuantitas ulangan yang dinyatakan dengan teori plate
(terjadi pada setiap lempeng, banyaknya lempeng dinyatakan dengan N).
N =
Makin banyak N, pemisahan akan mengalami peningkatan dengan kesetimbangan interaksi.
Makin banyak N terjadi pelebaran puncak, karena :
Senyawa tersebut berjalan ke bawah mengalami difusi kalau dibawa fase gerak.
Persamaan Van Deemter :
H =
Dasar yang digunakan dalam pemisahan adalah :
1. Pemisahan secara fisiko - kimiawi yang melibatkan interaksi antar fase gerak, fase diam, dan
sampel.
2. Fase diam dan fase gerak yang digunakan.

Solute


fase gerak fase diam

Kalau fase geraknya gas :
Solute


fase gerak fase diam

Interaksi yang terjadi pada kromatografi, yaitu :
1. Adsorbsi, dengan melihat perbedaan stereochemistry
2. Partisi, dengan melihat kelarutan
3. Afinitas, dengan melihat BM
4. Ion Exchange, berdasrkan perbedaan muatan
KROMATOGRAFI CAIR KINERJA TINGGI (KCKT)

Kromatografi Cair Tenaga Tinggi (KCKT) atau biasa juga disebut dengan High Performance Liquid
Chromatography (HPLC) merupakan metode yang tidak destruktif dan dapat digunakan baik untuk
analisis kualitatif dan kuantitatif. KCKT paling sering digunakan untuk : menetapkan kadar senyawa-
senyawa tertentu seperti asam-asam amino, asam- asam nukleat, dan protein-protein dalam cairan
fisiologis; menetukan kadar senyawa-senyawa aktif obat, produk hasil samping proses sintesis, atau
produk-produk degradasi dalam sediaan farmasi.
Pada HPLC terdapat kolom terbuka yaitu :
1. Low pressure (tekanan rendah)
2. High pressure (tekanan tinggi 76 bar biasanya memakai satuan kpa/kilo paskal).
Pada HPLC terdapat oven untuk pemanas karena pada partikel kecil, cairan ditekan terjadi gesekan
maka digunakan pendingin dan tekanan tinggi (cairan ditekan menggunakan pompa kemudian
didorong, jika ditarik cairan masuk). Tekanan harus 76 bar, antara fase diam dan fase gerak terjadi
gesekan sehingga temperatur meningkat maka harus diturunkan (dengan pendingin liebig/ ion
exchange) karena ikatannya bisa lepas dan bisa juga terjadi bleeding.
Temperatur pada HPLC digunakan untuk menjaga temperatur dalam kolom konstan sehingga KD
tetap.

A. Prinsip kerja
Kerja HPLC pada prinsipnya adalah pemisahan analit-analit berdasarkan kepolarannya, alatnya
terdiri dari kolom (sebagai fasa diam) dan larutan tertentu sebagai fasa geraknya. Yang paling
membedakan HPLC dengan kromatografi lainnya adalah pada HPLC digunakan tekanan tinggi untuk
mendorong fasa gerak. Campuran analit akan terpisah berdasarkan kepolarannya, dan kecepatannya
untuk sampai ke detektor (waktu retensinya) akan berbeda, hal ini akan teramati pada spektrum
yang puncak-puncaknya terpisah.
Urutan skala polaritas : golongan fluorocarbon < golongan hidrokarbon < senyawa terhalogenasi <
golongan eter < golongan ester < golongan keton < golongan alkohol < golongan asam.

B. Instrumentasi
1. Pompa
Pompa pendesakan tetap dapat dibedakan menjadi pompa torak dan pompa semprit. Pompa torak
menghasilkan aliran yang berdenyut jadi memerlukan peredam denyut atau peredam elektronik
untuk menghasilkan garis alas detektor yang stabil jika detektor peka terhadap aliran. Pompa
semprit menghasilkan aliran yang tak berdenyut, tetapi tandonnya terbatas.

2. Injektor
Cuplikan harus dimasukkan ke dalam pangkal kolom (kepala kolom), diusahakan agar sesedikit
mungkin terjadi gangguan pada kemasan kolom. Ada dua ragam utama aliran henti dan pelarut
mengalir. Ada 3 macam system injector, yaitu :
a. stop flow : aliran dihentikan, injeksi dilakukan padakinerja atmosfir, system tertutup, dan aliran
dilanjutkan lagi. Teknik ini bisa digunakan karena difusi di dalam cairan kecil dan resolusi tidak
diperngaruhi.
b. Septum : septum yang digunakan pada kckt sama dengan yang digunakan pada kromatografi gas.
Injector ini dapat digunakan pada kinerja sampai 60-70 atmosfir. Tapi septum ini tidak tahan dengan
semua pelarut-pelarut kromatografi cair. Partikel kecil dari septum yang terkoyak (akibat jarum
injector) dapat menyebabkan penyumbatan.
c. Loop valve : tipe injector ini umumnya digunakan unutk menginjeksi volume lebih besar dari 10
dan dilakukan dengan cara automatis (dengan menggunkan adaptor yang sesuai, volume yang lebih
kecil dapat diinjeksikan secara manual). Pada posisi load, sampel diisi ke dalam loop pada kinerja
atmosfir, bila valve difungsikan, maka sampel akan masuk dalam kolom.

3. Kolom
Kolom merupakan jantung kromatograf. Keberhasilan atau kegagalan analisis bergantung pada
pilihan kolom dan kondisi kerja yang tepat. Kolom dapat dibagi menjadi kolom analitik dan kolom
preparatif.

4. Detektor
Detektor diperlukan untuk mengindera adanya komponen cuplikan di dalam eluen kolom dan
mengukur jumlahnya. Detektor yang baik sangat peka, tidak banyak berderau, rentang tanggapan
liniernya lebar dan menanggapi semua jenis senyawa.
Jenis-jenis detektor :
- UV / Vis
- Retraktif indeks (RI) Detector
- konduktifitas detector
- Elektrokimia Detector
- PDA
- ELSD
- MS Detector

5. Fase gerak
Fase gerak memiliki syarat-syarat :
- murni, tanpa cemaran
- tidak bereaksi dengan kemasan
- sesuai dengan detektor
- dapat melarutkan cuplikan
- mempunyai viskositas rendah
- memungkinkan memperoleh dengan mudah cuplikan jika diperlukan
- harganya wajar

Gambar Instrumentasi :



C. Macam Macam Optimasi
Tujuan Optimasi : Memisahkan sampai baseline dengan waktu seminimal mungkin. Rs yang bagus
1,5.
1. Optimasi Efisiensi Kolom
Adalah jumlah keterulangan interaksi. Efisiensi kolom dapat diukur N, yaitu kemampuan
memberikan small bath. N akan maximal bila H minimal.
Efisiensi kolom dapat dilakukan dengan Van Deemter equation :
N = L / HETP
N = 5,54 ( tR / W)2
N dapat diperoleh dari hasil kromatogram dengan menginjeksikan suatu senyawa
sehingga mendapatkan puncak.
Cara meminimalkan HETP :
1. difusi eddy ( A )
o supaya cairan tidak kemana-mana perlu memperkecil partikel
o kerapatannya diperbesar
2. difusi longitudinal (B)
o memperkecil diameter partikel, kerapatan diperkecil
o u dipercepat, u = kecepatan alir fase gerak
o temperatur kolom diturunkan untuk mengatasi difusi laminer
3. non equilibrium mass transfer ( C )
terjadi karena fase gerak ditambah terus sebelum terjadi keseimbangan
o partikel diperkecil, luas area makin besar
o ketebalan fase diam cair makin tipis
o kerapatan diperbesar, u diperlambat supaya terjadi kesetimbangan
o temperatur dinaikkan

2. Optimasi Selektivitas
Untuk menentukan kemampuan kolom memisahkan. Tergantung dari sifat-sifat senyawa dan
memilih berbagai interaksi yang ada dalam kolom.
- adsorpsi
perbedaan pada stereokimia ( orto : lebih cepat dilepaskan ke fase gerak sedangkan para : paling
lama dilepaskan 2 tangan terikat)
- partisi
perbedaan pada kelarutan senyawa-senyawa yang akan dipisahkan
- ion exchange
pada muatan senyawa-senyawa

3. Optimasi Kapasitas
K = ns / nm
ns = jumlah molekul dalam fase diam
nm = jumlah molekul dalam fase gerak
dengan mengubah komposisi fase gerak kelarutan dalam fase gerak senyawa
tersebut akan berbeda.


D. Jenis-jenis KCKT
Dilihat dari jenis fase diam dan fase gerak, KCKT (kolomnya) dibedakan menjadi:
a. Kromatografi fase normal
Kromatografi dengan kolom konvensional dimana
Fase diam : normal (bersifat polar), misalnya Silika gel
Fase gerak : bersifat non polar
b. Kromatografi fase terbalik
Fase diam : sifatnya non polar, misalnya Silika gel direaksikan dengan klorosilan
Fase gerak : bersifat polar
Keuntungan kromatografi fase terbalik :
Senyawa yang polar akan lebih baik pemisahannya
Senyawa ionic dapat dipisahkan
Air dapat digunakan sebagi pelarut

E. Keuntungan dan Kerugian
a. Keuntungan

Cepat : Waktu analisis umumnya kurang dari 1 jam. Banyak analisis yang dapat diselesaikari sekitar
15-30 menit. Untuk analisis yang tidak rumit (uncomplicated), waktu analisi kurang dari 5 menit bisa
dicapai

Selektif : Berbeda dengan KG, Kromatografi Cair mempunyai dua rasa dimana interaksi selektif
dapat terjadi. Pada KG, gas yang mengalir sedikit berinteraksi dengan zat padat; pemisahan
terutama dicapai hanya dengan rasa diam. Kemampuan zat padat berinteraksi secara selektif dengan
rasa diam dan rasa gerak pada KCKT memberikan parameter tambahan untuk mencapai pemisahan
yang diinginkan.

Peka : Detektor absorbsi UV yang biasa digunakan dalam KCKT dapat mendeteksi kadar dalam
jumlah nanogram (10-9 gram) dari bermacam- macam zat. Detektor-detektor Fluoresensi dan
Elektrokimia dapat mendeteksi jumlah sampai picogram (10-12 gram). Detektor-detektor seperti
Spektrofotometer Massa, Indeks Refraksi, Radiometri, dll dapat juga digunakan dalam KCKT.


Kolom dapat dipakai lagi : Berbeda dengan kolom kromatografi klasik, kolom KCKT dapat
digunakan kembali (reusable) . Banyak analisis yang bisa dilakukan dengan kolom yang sama
sebelum dari jenis sampel yang diinjeksi, kebersihan dari solven dan jenis solven yang digunakan.

Ideal untuk molekul besar dan ion : zat zat yang tidak bisa dianalisis dengan KG karena volatilitas
rendah , biasanya diderivatisasi untuk menganalisis psesies ionik. KCKT dengan tipe eksklusi dan
penukar ion ideal sekali untuk mengalissis zat zat tersebut.

Mudah memperoleh kembali sampel : Umumnya setektor yang digunakan dalam KCKT tidak
menyebabkan destruktif (kerusakan) pada komponen sampel yang diperiksa, oleh karena itu
komponen sampel tersebut dapat dengan mudah sikumpulkan setelah melewati detector. Solvennya
dapat dihilangkan dengan menguapkan ksecuali untuk kromatografi penukar ion memerlukan
prosedur khusus.


b. Kerugian
Mahal
Sampel yang digunakan jumlahnya sedikit
Perlu tenaga ahli untuk mengoperasikan
Kromatografi Cair Kinerja Tinggi
Kata Kunci: fase gerak, Kromatografi Cair
Ditulis oleh Adam Wiryawan pada 29-03-2011
Tujuan :
Untuk mengenalkan teknik high performance liquid cromatography, termasuk operasional
dasar instrumen dan mempelajari pengaruh pengaturan sejumlah parameter.
Pendahuluan
HPLC adalah metode kromatografi yang menggunakan fase gerak cair dan fase diam padat /
bahan pendukung untuk melakukan pemisahan suatu jenis molekul. Terdapat dua variasi
utama yaitu, HPLC yang terdiri dari eluen polar dan fase diam non-polar atau eluen non-polar
dan fase diam polar. Keduanya diklasifikasikan sebagai metode reversed-phase dan normal-
phase. Metode reversed-phase yang akan dipakai dalam eksperimen ini menggunakan kolom
octadecylsilane (ODS) dan partisi absorptif (dapat menyerap) utnuk memisahkan komponen-
komponen dalam campuran.
Syarat pemilihan utama setelah memilih metode HPLC yang sesuai adalah menentukan
sistem pelarut untuk analisa. Kriteria pemilihan melibatkan waktu analisa, (tR atau k),
efisiensi keseluruhan (jumlah plate, N atau n), atau mungkin resolusi (Rs). Percepatan aliran
eluen akan memainkan peranan dalam parameter ini, akan tetapi pemilihan yang bijaksana
atau optimisasi komposisi pelarut akan diperlukan.
Polaritas pelarut adalah dasar yang berguna untuk menentukan bagaiman nilai k dapat
diubah, dan tentunya akan mengubah waktu analisa. Untuk menggunakn parameter ini, maka
sangatlah penting untuk mengukur polaritas pelarut dan hubungkan dengan k. Dapat dilihat
seperti dibawah ini :
Indeks Polaritas dari Pelarut Terpilih

Indeks polaritasdari campuran dua pelarut akan diberikan sebagai :
P
ab
=
a
P
a
+
b
P
b

dimana = fraksi volume tiap pelarut.
Sebuah aturan yang berguna bahwa untuk setiap perubahan polaritas dua unit terdapat
perkiraan 10 kali lipat perubahan dalam rasio partisi (faktor kapasitas) k

Darihubungan ini dapat terlihat bahwa k=64 dalam 30/70 MeOH/pelarut air, kemudian
komposisi pelarut yang mana akan memberikan nilai k =5 dalam 73/27 MeOH/aiir
Prosedur
A.Operasional Kromatografi Cair
Catatan : Jangan pernah membiarkan pompa beroperasi tanpa filter pelarut terendam dalam
pelarut
Pilih panjang gelombang UV-sinar tampak dan nyalakan detektor untuk standby. Setelah 1
menit nyalakan detektor ke posisi ON. Pengaturan 0,04AUFS akan cukup.
Jika pompa belum dinyalakan, pertama pilih solvent line yang diperlukan (solvent select dial)
dan keluarkan solvent line dengan gambar sekitar 20 mL pelarut keluar melalui flush outlet
(berada dibawah solvent select dial). Lakukan ini dengan menggunakan syringe, masukkan
dalam outlet, buka katup dan keluarkan solvent. Tutup katup kembali.
Pada saat pelarut telah terpilih dengan tepat, turn on pompa dan secara perlahan naikkan laju
aliran pada level yang diinginkan. Tunggu sekitar 15-20 detik antara tiap kenaikkan dalam
pengaturan aliran. Bila aliran telah di-set, tunggu paling tidak 15 menit agar kolom
menyesuaikan dengan pelarut yang baru sebelum menginjeksikan sampel.
Bila aliran pelarut diubah pada saat running, misal dari 0,8 ke 1,2 mL/menit, lakukan
pengaturan ke aliran yang baru dengan perlahan dan tunggu 5-10 menit hingga stabil.
Jika aliran pelarut harus dihentikan, kurangi thumbwheel setting dengan perlahan ke angka
nol, dan switch off pompa. Pada saat ini, pelarut dapat diubah ke pilihan selanjutnya.
Melakukan Injeksi : Semua volume injeksi yang akan dilakukan adalah 10L. Bilas syringe
beberapa kali dengan pelarut dan sampel sebelum mengambil 10L aliquot. Pastikan tidak
terdapat gelembung udara dalam tabung syringe yang mungkin masuk. Putar katup injeksi ke
load, putar retaining arm kebawah untuk melepas plug stopper dan cabut plug. Masukkan
jarum syringe ke dalam injection loop dan injeksikan larutan. Kembalikan plug, putar
retaining arm untuk mengencangkan plug, dan selesaikan injeksi dengan cara memutar katup
ke posisi inject. Pencatat (recorder) akan start secara otomatis.
Pengaturan recorder : Menggunakan Shimadzu recorder. Atur speed pada 5, dan attenuation
pada 3.
Shut-down procedure : Pada saat kromatogram terakhir telah terekam kolom sebaiknya
dikembalikan ke kondisi yang sesuai untuk storing, yang mana ini berarti kolom harus
disiram dengan 50/50 MeOH/air pada 1 mL/menit selama sekitar 20-30 menit dan kemudian
laju aliran dikembalikan ke nol. Maka ganti dengan pelarut ini dengan mengguankan
prosedur sebelumnya dan lakukan seperi diatas.
B.Studi Kromatografi
Dua sampel yang akan dianalisa ;
SAMPEL 1:Uracil dan acenaphthene
SAMPEL 2:Naphtalene, phenanthrene dan anthracene
Uracil umumnya dipakai untuk menunjukkan kekosongan volume atau waktu untuk puncak
yang tidak tertahan (to), dan akan mengelusi layak dengan cepat. Hal ini akan membantu
dalam perhitungan nilai k. Phenanthrene dan anthracene elute sebagai sepasang puncak yang
berdekatan, sehingga akan berguna jika kita akan memperkirakan resolving power dari suatu
kolom. Berikut eksperimen yang akan dilaksanakan :
Tetapkan aliran dari 60/40 acetonitrile/air pada 0,8 mL/menit
1. Injeksikan 10 L air. Catat water dip
2. Injeksikan 10 L acetonitrile. Catat respon yang terjadi
3. Injeksikan 10 L sampel 1 Naikkan laju aliran ke 1,2 mL/menit
4. Injeksikan 10 L sampel 1 Naikkan laju aliran ke 1,6 mL/menit
5. Injeksikan 10 L sampel 1
6. Injeksikan 10 L sampel 2 Ubah pelarut ke 75/25 acetonitrile/air dan laju aliran ke 1,6
mL/menit. Biarkan kolom untuk menyeimbangkan.(Catatan : Periksa dengan asisten
lab sehubungan dengan perubahan pelarut)
7. Injeksikan 10 L sampel 1
8. Injeksikan 10 L sampel 2
Bila semua prosedur di atas telah diselesaikan, lakukan prosedur shutdown.
Perhitungan dan Pertanyaan
1. Untuk setiap kromatogram sampel 1, hitung k, total plates (n, N), tinggi plate (h,H)
dan tinggi reduced plate.
2. Untuksetiap kromatogram sampel 2, hitung nilai k, dan resolusi (Rs) dari pasangan
puncak yang berdekatan.
3. Hitung asimetri puncak dari acenaphthene dalam satu kromatogram (ditentukan
dengan mengambil rasio jarak dari peak maximum, atau mode, ke trailing edge
puncak, jarak dari peak mode ke leading edge puncak, pada 10% tinggi puncak) Ini
mungkin akn berguna untuk penyimpanan kemampuan dari recording inegrator
sehingga puncak dapat dinalisa kembali pada chart speed yang lebih cepat untuk
pengukuran akurat dari jarak yang terlibat. ( Acuan pada diagram di bawah).
4. Beri komentar pada pengamatan dari solvents dip.
5. Beri komentar tentang bagaimana k bervariasi dengan laju aliran dan komposisi
pelarut. Apakah k bervariasi sesuai dengan yang Anda harapkan ?
6. Beri komentar tentang bagaimanaefisiensi bervariasi dengan laju aliran.
7. Beri komentar tentang bagaimana Rs bervariasi dengan komposisi pelarut, dan
nyatakan bagaimana Rs mungkin bervariasi dengan laju aliran.
8. Bandingkan dengan teliti hasil yang diperoleh dalam eksperimen 5 dan 7, berkenaan
dengan area puncak dan tinggi puncak dari uracil dan acenaphthene. Jelaskan
pengamatan Anda. Aplikasikan alasan Anda pada perbandingan hasil dalam
eksperimen 6 dan 8.
9. Apakah Anda percaya bahwa uracil merupakan bahan terlarut
(solute) efektif untuk estimasi ?

kromatografi cairan kinerja tinggi (HPLC)
PEMBAHASAN

2.1 PENGERTIAN KROMATOGRAFI CAIR KINERJA TINGGI (HPLC)
HPLC adalah alat yang sangat bermanfaat dalam analisis. Bagian ini menjelaskan bagaimana
pelaksanaan dan penggunaan serta prinsip HPLC yang sama dengan kromatografi lapis tipis dan
kromatografi kolom. HPLC secara mendasar merupakan perkembangan tingkat tinggi dari
kromatografi kolom. Selain dari pelarut yang menetes melalui kolom dibawah grafitasi, didukung
melalui tekanan tinggi sampai dengan 400 atm. Ini membuatnya lebih cepat. HPLC memperbolehkan
penggunaan partikel yang berukuran sangat kecil untuk material terpadatkan dalam kolom yang
mana akan memberi luas permukaan yang lebih besar berinteraksi antara fase diam dan molekul-
molekul yang melintasinya. Hal ini memungkinkan pemisahan yang lebih baik dari komponen-
komponen dalam campuran.

http://www.idonbiu.com/2009/10/mengenal-kromatografi-cair-kinerja.html

2.2 JENIS HPLC
Pemisahan dengan HPLC dapat dilakukan dengan fase normal (jika fase diamnya lebih polar
dibanding dengan fase geraknya) atau fase terbalik (jika fase diamnya kurang non polar dibanding
dengan fase geraknya). Berdasarkan pada kedua pemisahan ini, sering kali HPLC dikelompokkan
menjadi HPLC fase normal dan HPLC fase terbalik. Selain klasifikasi di atas, HPLC juga dapat
dikelompokkan berdasarkan pada sifat fase diam dan atau berdasarkan pada mekanisme sorpsi
solut, dengan jenis-jenis HPLC sebagai berikut:


1. Kromatografi Adsorbsi
Prinsip kromatografi adsorpsi telah diketahui sebagaimana dalam kromatografi kolom dan
kromatografi lapis tipis. Pemisahan kromatografi adsorbsi biasanya menggunakan fase normal
dengan menggunakan fase diam silika gel dan alumina, meskipun demikian sekitar 90% kromatografi
ini memakai silika sebagai fase diamnya. Pada silika dan alumina terdapat gugus hidroksi yang akan
berinteraksi dengan solut. Gugus silanol pada silika mempunyai reaktifitas yang berbeda, karenanya
solut dapat terikat secara kuat sehingga dapat menyebabkan puncak yang berekor.

2. Kromatografi fase terikat
Kebanyakan fase diam kromatografi ini adalah silika yang dimodifikasi secara kimiawi atau fase
terikat. Sejauh ini yang digunakan untuk memodifikasi silika adalah hidrokarbon-hidrokarbon non-
polar seperti dengan oktadesilsilana, oktasilana, atau dengan fenil. Fase diam yang paling populer
digunakan adalah oktadesilsilan (ODS atau C18) dan kebanyakan pemisahannya adalah fase terbalik.
Sebagai fase gerak adalah campuran metanol atau asetonitril dengan air atau dengan larutan bufer.
Untuk solut yang bersifat asam lemah atau basa lemah, peranan pH sangat krusial karena kalau pH
fase gerak tidak diatur maka solut akan mengalami ionisasi atau protonasi. Terbentuknya spesies
yang terionisasi ini menyebabkan ikatannya dengan fase diam menjadi lebih lemah dibanding jika
solut dalam bentuk spesies yang tidak terionisasi karenanya spesies yang mengalami ionisasi akan
terelusi lebih cepat.

3. Kromatografi penukar ion
KCKT penukar ion menggunakan fase diam yang dapat menukar kation atau anion dengan suatu fase
gerak. Ada banyak penukar ion yang beredar di pasaran, meskipun demikian yang paling luas
penggunaannya adalah polistiren resin. Kebanyakan pemisahan kromatografi ion dilakukan dengan
menggunakan media air karena sifat ionisasinya. Dalam beberapa hal digunakan pelarut campuran
misalnya air-alkohol dan juga pelarut organik. Kromatografi penukar ion dengan fase gerak air,
retensi puncak dipengaruhi oleh kadar garam total atau kekuatan ionik serta oleh pH fase gerak.
Kenaikan kadar garam dalam fase gerak menurunkan retensi solut. Hal ini disebabkan oleh
penurunan kemampuan ion sampel bersaing dengan ion fase gerak untuk gugus penukar ion pada
resin.

4. Kromatografi Pasangan ion
Kromatografi pasangan ion juga dapat digunakan untuk pemisahan sampel-sampel ionik dan
mengatasi masalah-masalah yang melekat pada metode penukaran ion. Sampel ionik ditutup
dengan ion yang mempunyai muatan yang berlawanan.

5. Kromatografi Eksklusi Ukuran
Kromatografi ini disebut juga dengan kromatografi permiasi gel dan dapat digunakan untuk
memisahkan atau menganalisis senyawa dengan berat molekul > 2000 dalton.
Fase diam yang digunakan dapat berupa silika atau polimer yang bersifat porus sehingga solut dapat
melewati porus (lewat diantara partikel), atau berdifusi lewat fase diam. Molekul solut yang
mempunyai BM yang jauh lebih besar, akan terelusi terlebih dahulu, kemudian molekul-molekul
yang ukuran medium, dan terakhir adalah molekul yang jauh lebih kecil. Hal ini disebabkan solut
dengan BM yang besar tidak melewati porus, akan tetapi lewat diantara partikel fase diam. Dengan
demikian, dalam pemisahan dengan eksklusi ukuran ini tidak terjadi interaksi kimia antara solut dan
fase diam seperti tipe kromatografi yang lain.

6. Kromatografi Afinitas
Dalam kasus ini, pemisahan terjadi karena interaksi-interaksi biokimiawi yang sangat spesifik. Fase
diam mengandung gugus-gugus molekul yang hanya dapat menyerap sampel jika ada kondisi-kondisi
yang terkait dengan muatan dan sterik tertentu pada sampel yang sesuai (sebagaimana dalam
interaksi antara antigen dan antibodi). Kromatografi jenis ini dapat digunakan untuk mengisolasi
protein (enzim) dari campuran yang sangat kompleks.
http://lansida.blogspot.com/2010/07/hplc-kromatografi-cair-kinerja-tinggi.html

2.3 PRINSIP DASAR HPLC
Prinsip kerja HPLC adalah sebagai berikut :
Dengan bantuan pompa fasa gerak cair dialirkan melalui kolom ke detektor. Cuplikan dimasukkan ke
dalam aliran fasa gerak dengan cara penyuntikan. Di dalam kolom terjadi pemisahan komponen-
komponen campuran. Karena perbedaan kekuatan interaksi antara solut-solut terhadap fasa diam.
Solut-solut yang kurang kuat interaksinya dengan fasa diam akan keluar dari kolom lebih dulu.
Sebaliknya, solut-solut yang kuat berinteraksi dengan fasa diam maka solut-solut tersebut akan
keluar kolom dideteksi oleh detektor kemudian direkam dalam bentuk kromatogram kromatografi
gas. Seperti pada kromatografi gas, jumlah peak menyatakan konsentrasi komponen dalam
campuran. Computer dapat digunakan untuk mengontrol kerja sistem HPLC dan mengumpulkan
serta mengolah data hasil pengukuran HPLC.

2.4 INSTRUMENTASI KROMATOGRAFI CAIRAN KINERJA TINGGI

Instrumentasi Kromatografi Cairan Kinerja Tinggi, yaitu:



A. Fasa Gerak
Fasa gerak dalam HPLC adalah berupa zat cair dan disebut juga eluen atau pelarut. Berbeda dengan
kromatografi gas, HPLC mempunyai lebih banyak pilihan fasa gerak, dibandingkan dengan fasa gerak
untuk kromatografi gas. Dalam kromatografi gas, fasa gerak hanya sebagai pembawa solute
melewati kolom menuju detektor. Sebaliknya dalam HPLC,fasa gerak selain berfungsi membawa
komponen-komponen campuran menuju detector, fasa gerak dapat berinteraksi dengan solute-
solut. Oleh karena itu, fasa gerak dalam HPLC merupakan salah satu faktor penentu keberhasilan
proses pemisahan.

PERSYARATAN FASA GERAK HPLC
Zat cair yang akan digunakan sebagai fasa gerak HPLC harus memenuhi beberapa persyaratan
berikut:
Zat cair harus bertindak sebagai pelarut yang baik untuk cuplikan yang akan di analisis.
Zat cair harus murni sekali untuk menghindarkan masuknya kotoran yang dapat menganggu
interpretasi kromatogram.
Zat cair harus jernih sekali untuk menghindarkan penyumbatan pada kolom.
Zat cair harus mudah diperoleh, murah, tidak mudah terbakar, dan tidak beracun.
Zat cair tidak kental.
Sesuai dengan detektor.

JENIS FASA GERAK
Fasa gerak untuk kromatografi partisi, adsorpsi, dan penukar ion bersifat interaktif dalam arti fasa
gerak berinteraksi dengan komponen-komponen cuplikan. Akibatnya, waktu retensi sangat
dipengaruhi oleh jenis pelarut. Sebaliknya fasa gerak untuk kromatografi eksklusi bersifat non
interaktif. Oleh karena itu, waktu retensi dengan kromatografi ini tidak bergantung pada komposisi
fasa gerak.
B. Pompa
Pompa dalam HPLC dapat dianalogikan dengan jantung pada manusia yang berfungsi untuk
mengalirkan fasa gerak cair melalui kolom yang berisi serbuk halus. Pompa yang dapat digunakan
dalam HPLC harus memenuhi persyaratan :
1. Menghasilkan tekanan sampai 600 psi
2. Keluaran bebas pulsa
3. Kecepatan alir berkisar antara 0,1-10 mL/menit
4. Bahan tahan korosi
Dikenal tiga jenis pompa yang masing-masing memiliki kenutungan dan kekurangannya yaitu pompa
reciprocating, displacement dan pneumatic.

Pompa reciprocating
Jenis pompa ini sekarang banyak dipakai. Pompa ini terdiri dari ruangan kecil tempat pelarut yang
dipompa dengan cara gerakan piston mundur-maju yang dijalankan oleh motor. Piston berupa
batang gelas dan berkontak langsung dengan pelarut.
Pompa displacement
Pompa ini menyerupai syringe (alat suntik) terdiri dari tabung yang dilengkapi pendorong yang
digerakan oleh motor. Pompa ini juga menghasilkan aliran yang cenderung tidak bergantung tekanan
baik kolom dan viskositas pelarut. Selain itu, keluaran pompa ini bebas pulsa. Akan tetapi pompa ini
keterbatasan kapasitas pelarut (250 mL) dan tidak mudah untuk melakukan pergantian pelarut.
Pompa pneumatic
Dalam pompa ini pelarut di dorong oleh gas bertekanan tinggi. Pompa jenis ini murah dan bebas
pulsa. Akan tetapi mempunyai keterbatasan kapasitas dan tekanan yang dihasilkan (<2000 psi) serta
kecepatan alir bergantung pada viskositas pelarut dan tekanan balik kolom.


C. Unit Sistem Penyuntikan Atau Penginjeksian Sampel

Gambar 2. Tipe injektor katup putaran

Kadang kala, faktor ketidaktepatan pengukuran HPLC terletak pada keterulangan pemasukan
cuplikan ke dalam peking kolom. Masalahnya, kebanyakan memasukan cuplikan ke dalam kolom
dapat menyebabkan band broadening. Oleh karena itu, cuplikan yang dimasukkan harus sekecil
mungkin, beberapa puluh mikroliter. Selain itu, perlu diusahakan tekanan tidak menurun ketika
memasukkan cuplikan ke dalam aliran fasa gerak. Berikut beberapa teknik pemasukan cuplikan ke
dalam sistem HPLC :
1. Injeksi Syringe
Alat yang paling dulu dan paling mudah untuk memasukkan cuplikan adalah syringe. Syringe
disuntikkan melalui septum (seal karet) dan untuk ini dirancang syringe yang tahan tekanan sampai
1500 psi. akan tetapi keterulangan injeksi syringe ini sedikit lebih baik dari 2-3 % dan sering lebih
jelek.
2. Injeksi stop-flow
Injeksi stop-flow adalah jenis injeksi syringe kedua tapi di sini aliran pelarut dihentikan sementara,
sambungan pada ujung kolom dibuka dan cuplikan disuntikan langsung ke dalam ujung kolom.
Setelah menyambungkan kembali kolom maka pelarut dialirkan kembali.
3. Kran Cuplikan
Jenis pemasukan cuplikan ini disebut juga loop dan paling banyak digunakan. Untuk memasukkan
cuplikan ke dalam aliran fasa gerak perlu dua langkah: (a) sejumlah volume cuplikan disuntikkan ke
dalam loop dalam posisi load, cuplikan masih berada dalam loop, (b) kran diputar untuk mengubah
posisi load menjadi posisi injeksi dan fasa gerak membawa cuplikan ke dalam kolom. Loop dapat
diganti-ganti dan tersedia berbagai ukuran volume dari 5 hingga 500L. Dengan sistem pemasukan
cuplikan ini memungkinkan memasukkan cuplikan pada tekanan 7000 psi dengan ketelitian tinggi.
Juga loop mikro tersedia dengan volume 0,5 hingga 5 L.
D. Kolom
Ada 2 jenis kolom pada HPLC yaitu kolom konvensional dan kolom mikrobor. Kolom merupakan
bagian HPLC yang mana terdapat fase diam untuk berlangsungnya proses pemisahan solut/analit.
Kolom mikrobor mempunyai 3 keuntungan yang utama dibanding dengan kolom konvensional,
yakni:
Konsumsi fase gerak kolom mikrobor hanya 80% atau lebih kecil dibanding dengan kolom
konvensional karena pada kolom mikrobor kecepatan alir fase gerak lebih lambat (10 -100 l/menit).
Adanya aliran fase gerak yang lebih lambat membuat kolom mikrobor lebih ideal jika digabung
dengan spektrometer massa.
Sensitivitas kolom mikrobor ditingkatkan karena solut lebih pekat, karenanya jenis kolom ini sangat
bermanfaat jika jumlah sampel terbatas misal sampel klinis.
Kebanyakan fase diam pada HPLC berupa silika yang dimodifikasi secara kimiawi, silika yang tidak
dimodifikasi, atau polimer-polimer stiren dan divinil benzen. Permukaan silika adalah polar dan
sedikit asam karena adanya residu gugus silanol (Si-OH). Silika dapat dimodifikasi secara kimiawi
dengan menggunakan reagen-reagen seperti klorosilan. Reagen-reagen ini akan bereaksi dengan
gugus silanol dan menggantinya dengan gugus-gugus fungsional yang lain.
Oktadesil silika (ODS atau C18) merupakan fase diam yang paling banyak digunakan karena mampu
memisahkan senyawa-senyawa dengan kepolaran yang rendah, sedang, maupun tinggi. Oktil atau
rantai alkil yang lebih pendek lagi lebih sesuai untuk solut yang polar. Silika-silika aminopropil dan
sianopropil (nitril) lebih cocok sebagai pengganti silika yang tidak dimodifikasi. Silika yang tidak
dimodifikasi akan memberikan waktu retensi yang bervariasi disebabkan karena adanya kandungan
air yang digunakan.
E. Detektor
Detektor pada HPLC dikelompokkan menjadi 2 golongan yaitu: detektor universal (yang mampu
mendeteksi zat secara umum, tidak bersifat spesifik, dan tidak bersifat selektif) seperti detektor
indeks bias dan detektor spektrometri massa; dan golongan detektor yang spesifik yang hanya akan
mendeteksi analit secara spesifik dan selektif, seperti detektor UV-Vis, detektor fluoresensi, dan
elektrokimia.

Idealnya, suatu detektor harus mempunyai karakteristik sebagai berikut:
1. Mempunyai respon terhadap solut yang cepat dan reprodusibel.
2. Mempunyai sensitifitas yang tinggi, yakni mampu mendeteksi solut pada kadar yang sangat kecil.
3. Stabil dalam pengopersiannya.
4. Mempunyai sel volume yang kecil sehingga mampu meminimalkan pelebaran pita.
5. Signal yang dihasilkan berbanding lurus dengan konsentrasi solut pada kisaran yang luas (kisaran
dinamis linier).
6. Tidak peka terhadap perubahan suhu dan kecepatan alir fase gerak.
Beberapa detektor yang paling sering digunakan pada HPLC antara lain :

http://lansida.blogspot.com/2010/07/hplc-kromatografi-cair-kinerja-tinggi.html

2.5 CARA KERJA HPLC
Mula-mula solven diambil melalui pompa. Solven ini dikemudian masuk ke dalam katup injeksi
berbutar, yang dipasang tepat pada sampel loop. Dengan pertolongan mikrosiring, sampel
dimasukan ke dalam sampel loop yang kemudian bersama-sama dengan solven masuk ke dalam
kolom. Hasil pemisahan dideteksi oleh detector, yang penampakannya ditunjukan oleh perekam
(pencatat = recorder). Tekanan solven di atur dengan pengatur dan pengukur tekanan. Pompa
pemasuk solven pada tekanan konstan hingga tekanan kurang lebih 4500 psi dengan laju alir rendah,
yakni beberapa milliliter per menit.
Rekorder menghasilkan kromatogram zat-zat yang dipisahkan dari suatu sampel. Tahap pemekatan
dengan ekstraksi solven dan penguapan untuk memperkecil volum sering kali diperlukan sebelum
pengerjaan sampel dengan HPLC. Hal ini terutama sering dilakukan untuk analisis senyawa-senyawa
hidrokarbon aromatic polisiklik (PAH) atau residu pestisida dalam makanan.
Sebagai alternative lain, sampel air dapat di absorpsi oleh suatu adsorben padat (C8 atau C18 yang
terikat pada silica gel), diikuti dengan desorpsi dalam suatu solven yang kemudian langsung
dimasukan kedalam kolom. Suatu solven dengan polaritas rendah, misalnya CH3 berair yang secara
bertingkat mengalami perubahan menjadi CH3OH murni, menjamin pemisahan yang baik pada C-18
yang terikat pada silica gel.
http://yi2ncokiyute.blogspot.com/2010/12/blog-post.html

2.6 KELEBIHAN HPLC
KCKT dapat dipandang sebagai pelengkap Kromatografi Gas (KG). Dalam banyak hal kedua teknik ini
dapat digunakan untuk memperoleh efek pemisahan yang sama membaiknya. Bila derivatisasi
diperlukan pada KG, namun pada KCKT zat-zat yang tidak diderivatisasi dapat dianalisis. Untuk zat-
zat yang labil pada pemanasan atau tidak menguap, KCKT adalah pilihan utama. Namun demikian
bukan berarti KCKT menggantikan KG, tetapi akan memainkan peranan yang lebih besar bagi para
analis laboratorium. Derivatisasi juga menjadi populer pada KCKT karena teknik ini dapat digunakan
untuk menambah sensitivitas detektor UV Visibel yang umumnya digunakan.
KCKT menawarkan beberapa keuntungan dibanding dengan kromatografi cair klasik, antara lain:
Cepat: Waktu analisis umumnya kurang dari 1 jam. Banyak analisis yang dapat diselesaikari sekitar
15-30 menit. Untuk analisis yang tidak rumit (uncomplicated), waktu analisi kurang dari 5 menit bisa
dicapai
Resolusi : Berbeda dengan KG, Kromatografi Cair mempunyai dua rasa dimana interaksi selektif
dapat terjadi. Pada KG, gas yang mengalir sedikit berinteraksi dengan zat padat; pemisahan
terutama dicapai hanya dengan rasa diam. Kemampuan zat padat berinteraksi secara selektif dengan
rasa diam dan rasa gerak pada KCKT memberikan parameter tambahan untuk mencapai pemisahan
yang diinginkan.
Sensitivitas detektor : Detektor absorbsi UV yang biasa digunakan dalam KCKT dapat mendeteksi
kadar dalam jumlah nanogram (10-9 gram) dari bermacam- macam zat. Detektor-detektor
Fluoresensi dan Elektrokimia dapat mendeteksi jumlah sampai picogram (10-12 gram). Detektor-
detektor seperti Spektrofotometer Massa, Indeks Refraksi, Radiometri, dll dapat juga digunakan
dalam KCKT
Kolom yang dapat digunakan kembali : Berbeda dengan kolom kromatografi klasik, kolom KCKT
dapat digunakan kembali (reusable). Banyak analisis yang bisa dilakukan dengan kolom yang sma
sebelum dari jenis sampel yang diinjeksi, kebersihan dari solven dan jenis solven yang digunakan
Ideal untuk zat bermolekul besar dan berionik: zat-zat yang tidak bisa dianalisis dengan KG karena
volatilitas rendah , biasanya diderivatisasi untuk menganalisis psesies ionik. KCKT dengan tipe
eksklusi dan penukar ion ideal sekali untuk mengalissis zat-zat tersebut.
Mudah rekoveri sampel: Umumnya setektor yang digunakan dalam KCKT tidak menyebabkan
destruktif (kerusakan) pada komponen sampel yang diperiksa, oleh karena itu komponen sampel
tersebut dapat dengan mudah sikumpulkan setelah melewati detector. Solvennya dapat dihilangkan
dengan menguapkan ksecuali untuk kromatografi penukar ion memerlukan prosedur khusus.
www.pdf.com/kromatografi-cair-kinerja-tinggi.html

2.7 APLIKASI HPLC DALAM KEHIDUPAN
Beberapa aplikasi HPLC dalam kehidupan :
o HPLC dengan prinsip kromatografi banyak digunakan pada industri farmasi dan pestisida.
o Zat- zat dengan kepolaran berbeda yaitu antara sedikit polar sampai polar dapat dipisahkan
dengan HPLC berdasarkan partisi cair-cair.
o Asam-asam nukleat dapat dipisahkan dengan kolom penukar ion yang dikombinasikan dengan
kolom butiran berlapis zat berpori
o Morfin, heroin dan semacamnya telah dapat dipisahkan dengan rezin Zipax-SAX.
o Dapat memisahkan vitamin-vitamin yang larut dalam air.
o Digunakan untuk menentukan berat molekul polimer dan masalah-masalah biokimia.
o Kromatografi cairan kinerja tinggi (KCKT/HPLC) digunakan untuk memisahkan golongan-golongan
takatsiri, misalnya terpenoid tiggi, segala jenis senyawa fenol, alkaloid, lipid dan gula.
o HPLC cocok digunakan untuk memisahkan minyak atsiri. Minyak atsiri terdiri atas campuran yang
sangat rumit menjadi golongan-golongan senyawa atau memisahkan golongan senyawa menjadi
komponen-komponennya.
http://yi2ncokiyute.blogspot.com/2010/12/blog-post.html
Kromatografi Cair Kinerja Tinggi (HPLC)
Ditulis oleh Jim Clark pada 06-10-2007
HPLC adalah alat yang sangat bermanfaat dalam analisis. Bagian ini menjelaskan bagaimana
pelaksanaan dan penggunaan serta prinsip HPLC yang sama dengan kromatografi lapis tipis dan
kromatografi kolom.
Pelaksanaan HPLC

Pengantar

HPLC secara mendasar merupakan perkembangan tingkat tinggi dari kromatografi kolom. Selain dari
pelarut yang menetes melalui kolom dibawah grafitasi, didukung melalui tekanan tinggi sampai
dengan 400 atm. Ini membuatnya lebih cepat.

HPLC memperbolehkan penggunaan partikel yang berukuran sangat kecil untuk material
terpadatkan dalam kolom yang mana akan memberi luas permukaan yang lebih besar berinteraksi
antara fase diam dan molekul-molekul yang melintasinya. Hal ini memungkinkan pemisahan yang
lebih baik dari komponen-komponen dalam campuran.

Perkembangan yang lebih luas melalui kromatografi kolom mempertimbangkan metode
pendeteksian yang dapat digunakan. Metode-metode ini sangat otomatis dan sangat peka.
Kolom dan pelarut

Membingungkan, ada dua perbedaan dalam HPLC, yang mana tergantung pada polaritas relatif dari
pelarut dan fase diam.
Fase normal HPLC

Ini secara esensial sama dengan apa yang sudah anda baca tentang kromatografi lapis tipis atau
kromatografi kolom. Meskipun disebut sebagai normal, ini bukan merupakan bentuk yang
biasa dari HPLC.
Kolom diisi dengan partikel silika yang sangat kecil dan pelarut non polar misalnya heksan. Sebuah
kolom sederhana memiliki diameter internal 4.6 mm (dan mungkin kurang dari nilai ini) dengan
panjang 150 sampai 250 mm.

Senyawa-senyawa polar dalam campuran melalui kolom akan melekat lebih lama pada silika yang
polar dibanding degan senyawa-senyawa non polar. Oleh karena itu, senyawa yang non polar
kemudian akan lebih cepat melewati kolom.

Fase balik HPLC

Dalam kasus ini, ukuran kolom sama, tetapi silika dimodifikasi menjadi non polar melalui pelekatan
rantai-rantai hidrokarbon panjang pada permukaannya secara sederhana baik berupa atom karbon 8
atau 18. Sebagai contoh, pelarut polar digunakan berupa campuran air dan alkohol seperti metanol.

Dalam kasus ini, akan terdapat atraksi yang kuat antara pelarut polar dan molekul polar dalam
campuran yang melalui kolom. Atraksi yang terjadi tidak akan sekuat atraksi antara rantai-rantai
hidrokarbon yang berlekatan pada silika (fase diam) dan molekul-molekul polar dalam larutan. Oleh
karena itu, molekul-molekul polar dalam campuran akan menghabiskan waktunya untuk bergerak
bersama dengan pelarut.

Senyawa-senyawa non polar dalam campuran akan cenderung membentuk atraksi dengan gugus
hidrokarbon karena adanya dispersi gaya van der Waals. Senyawa-senyawa ini juga akan kurang
larut dalam pelarut karena membutuhkan pemutusan ikatan hydrogen sebagaimana halnya
senyawa-senyawa tersebut berada dalam molekul-molekul air atau metanol misalnya. Oleh
karenanya, senyawa-senyawa ini akan menghabiskan waktu dalam larutan dan akan bergerak
lambat dalam kolom.

Ini berarti bahwa molekul-molekul polar akan bergerak lebih cepat melalui kolom.

Fase balik HPLC adalah bentuk yang biasa digunakan dalam HPLC.Melihat seluruh proses

Diagram alir HPLC

Injeksi sampel

Injeksi sample seluruhnya otomatis dan anda tidak akan mengharapkan bagaimana mengetahui apa
yang terjadi pada tingkat dasar. Karena proses ini meliputi tekanan, tidak sama halnya dengan
kromatografi gas (jika anda telah mempelajarinya).

Waktu retensi

Waktu yang dibutuhkan oleh senyawa untuk bergerak melalui kolom menuju detektor disebut
sebagai waktu retensi. Waktu retensi diukur berdasarkan waktu dimana sampel diinjeksikan sampai
sampel menunjukkan ketinggian puncak yang maksimum dari senyawa itu.
Senyawa-senyawa yang berbeda memiliki waktu retensi yang berbeda. Untuk beberapa senyawa,
waktu retensi akan sangat bervariasi dan bergantung pada:
tekanan yang digunakan (karena itu akan berpengaruh pada laju alir dari pelarut)
kondisi dari fase diam (tidak hanya terbuat dari material apa, tetapi juga pada ukuran
partikel)
komposisi yang tepat dari pelarut
temperatur pada kolom
Itu berarti bahwa kondisi harus dikontrol secara hati-hati, jika anda menggunakan waktu retensi
sebagai sarana untuk mengidentifikasi senyawa-senyawa.
Detektor
Ada beberapa cara untuk mendeteksi substansi yang telah melewati kolom. Metode umum yang
mudah dipakai untuk menjelaskan yaitu penggunaan serapan ultra-violet.

Banyak senyawa-senyawa organik menyerap sinar UV dari beberapa panjang gelombang. Jika anda
menyinarkan sinar UV pada larutan yang keluar melalui kolom dan sebuah detektor pada sisi yang
berlawanan, anda akan mendapatkan pembacaan langsung berapa besar sinar yang diserap.

Jumlah cahaya yang diserap akan bergantung pada jumlah senyawa tertentu yang melewati melalui
berkas pada waktu itu. Anda akan heran mengapa pelarut yang digunakan tidak mengabsorbsi sinar
UV. Pelarut menyerapnya! Tetapi berbeda, senyawa-senyawa akan menyerap dengan sangat kuat
bagian-bagian yang berbeda dari specktrum UV.

Misalnya, metanol, menyerap pada panjang gelombang dibawah 205 nm dan air pada gelombang
dibawah 190 nm. Jika anda menggunakan campuran metanol-air sebagai pelarut, anda sebaiknya
menggunakan panjang gelombang yang lebih besar dari 205 nm untuk mencegah pembacaan yang
salah dari pelarut.
Interpretasi output dari detektor
Output akan direkam sebagai rangkaian puncak-puncak, dimana masing-masing puncak mewakili
satu senyawa dalam campuran yang melalui detektor dan menerap sinar UV. Sepanjang anda
mengontrol kondisi kolom, anda dapat menggunakan waktu retensi untuk membantu
mengidentifikasi senyawa yang diperoleh, tentunya, anda (atau orang lain) sudah mengukur
senyawa-senyawa murninya dari berbagai senyawa pada kondisi yang sama.

Anda juga dapat menggunakan puncak sebagai jalan untuk mengukur kuanti?tas dari senyawa yang
dihasilkan. Mari beranggapan bahwa tertarik dalam senyawa tertentu, X.

Jika anda menginjeksi suatu larutan yang mengandung senyawa murni X yang telah diketahui
jumlahnya pada instrumen, anda tidak hanya dapat merekam waktu retensi dari senyawa tersebut,
tetapi anda juga dapat menghubungkan jumlah dari senyawa X dengan puncak dari senyawa yang
dihasilkan.

Area yang berada dibawah puncak sebanding dengan jumlah X yang melalui detektor, dan area ini
dapat dihitung secara otomatis melalui layar komputer. Area dihitung sebagai bagian yang berwarna
hijau dalam gambar (sangat sederhana).

Jika larutan X kurang pekat, area dibawah puncak akan berkurang meskipun waktu retensi akan
sama. Misalnya,

Ini berarti dimungkinkan mengkalibrasi instrumen sehingga dapat digunakan untuk mengetahu
berapa jumlah substansi yang dihasilkan meskipun dalam jumlah kecil.

Meskipun demikian, harus berhati-hati. Jika anda mempunyai dua substansi yang berbeda dalam
sebuah campuran (X dan Y), dapatkah anda mengatakan jumlah relatifnya? Anda tidak dapat
mengatakannya jika anda menggunakan serapan UV sebagai metode pendeteksinya.

Dalam gambar, area di bawah puncak Y lebih kecil dibanding dengan area dibawah puncak X. Ini
mungkin disebabkan oleh karena Y lebih sedikit dari X, tetapi dapat sama karena Y mengabsorbsi
sinar UV pada panjang gelombang lebih sedikit dibanding dengan X. Ini mungkin ada jumlah besar Y
yang tampak, tetapi jika diserap lemah, ini akan hanya memberikan puncak yang kecil.

Rangkaian HPLC pada spektrometer massa

Ini menunjukkan hal yang sangat menakjubkan! Pada saat detektor menunjukkan puncak, beberapa
senyawa sementara melewati detektor dan pada waktu yang sama dapat dialihkan pada
spektrometer massa. Pengalihan ini akan memberikan pola fragmentasi yang dapat dibandingkan
pada data komputer dari senyawa yang polanya telah diketahui. Ini berarti bahwa identifikasi
senyawa dalam jumlah besar dapat ditemukan tanpa harus mengetahui waktu retensinya.