INTRODUCCION

La cisticercosis es una infeccin causada por la Taenia solium del

cerdo, que comienza y termina su ciclo en los cerdos, pero por el
contacto con aguas contaminadas o el consumo de carne de cerdo
mal cocida, los humanos pueden ser accidentalmente huspedes para
el organismo. La infeccin en humanos empieza con la ingestin de
huevos, los cuales se incuban en el estmago y desarrollan las larvas
que penetran en el intestino y que viajan por la corriente sangunea
atravesando todo el organismo. El destino ms comn de las larvas
son el cerebro y los ojos, pero tambin se pueden encontrar en otros
tejidos. Un paciente puede pasar asintomtico por meses y aos
despus de la infeccin inicial, pero los signos y sntomas de la
enfermedad pueden ocurrir rpidamente dependiendo del nmero de
quistes y de su localizacin en el cuerpo. Los sntomas comienzan
cuando el quiste muere. El quiste muerto libera material antignico,
provocando una respuesta inflamatoria en el husped. Los quistes
localizados en el cerebro o neuroquistes, pueden provocar ataques,
meningoencefalitis, jaqueca, nusea, o cambios en el estado mental.
Los quistes oculares generalmente son vitreos, pero tambin pueden
ser subretinales. Los pacientes presentan disturbios de la visin y
visin borrosa, como tambin desprendimiento de la retina. El
diagnstico puede hacerse por resonancia magntica o tomografa
computarizada del cerebro, pero las pruebas serolgicas aumentan la
sensibilidad en el diagnstico.

El diagnostico clnico de la neurocisticercosis es difcil por la gran
variedad de signos y sntomas que presenta esta enfermedad en los
ltimos aos el uso de la tomografa axial computarizada y la
resonancia magntica nuclear han mejorado el diagnostico; sin
embargo, el uso es restringido para un sector de la poblacin por su
alto costo.




La tcnica de western blot con antgenos de la larva de tenia
solium, desarrollada en el Per ha demostrado ser sensible,
especfica y reproducible para la deteccin de anticuerpos en
pacientes con cisticercosis y est siendo aplicada con excelentes
resultados en estudios epidemiolgicos y como apoyo diagnostico de
la cisticercosis humana en el norte del Per.

PRINCIPIO DE LA PRUEVA

Las glicoprotenas de la forma larvaria de tenia solium son
separadas por electroforesis en geles de poliacrilamida de acuerdo a
su peso molecular y luego transferidas a papel de nitrocelulosa, el
cual es cortado en tiras de 3mm de ancho para evaluar sueros
individuales.
Cada tira de nitrocelulosa con las nueve glicoprotenas (antgenos),
se incuba con el suero de un paciente sospechoso, para formar un
complejo ag-ac cuando el suero es positivo, siendo el material no
ligado eliminado por lavado. Luego la tira es incubada con un
conjugado (IgG anthihumana con peroxidasa), para formar un
complejo constituido por el antgeno, el primer anticuerpo (suero) y
el segundo anticuerpo (conjugado), eliminndose el material no
ligado por lavado. El complejo es visualizado por la adicin del
sustrato cromogenico, el cual determina la aparicin de una banda
de color marrn en la zona donde se encuentran los antgenos. el
proceso bioqumico es el siguiente: la enzima acta sobre el sustrato
liberando oxigeno al medio , el cual determina el cambio de
coloracin del cromgeno y su precipitacin , siendo la reaccin
detenida lavando las tiras varias veces con agua destilada o
desionizada.









COMPONENTES DEL KIT

1. Tiras de nitrocelulosa (75 X 3 mm) con antgenos de la larva
de Taenia solium. 20 unidades
2. Suero control negativo concentrado (50x). 60uL.
3. Suero control positivo concentrado (50x) 60uL
4. Solucin de lavado concentrada (10x) 30 ml
5. Bloqueador en polvo. 5 sobres
6. Solucin detergente. 1.5ml
7. Conjugado enzimtico concentrado (100x). 150 uL
8. Sustrato A. 70uL
9. Sustrato B. 5 viales
10. Etiqueta para solucin de lavado
11. Inserto y hoja de resultados
12. Certificado de anlisis





METODO:

Wester blog IgG


FINALIDAD DE LA PRUEBA:

El CISTIBLOT es una prueba que permite detectar anticuerpos especficos de
tipo Ig G en suero o en liquido cefalorraqudeo de pacientes con cisticercosis
por la tcnica de Western blot.




MATERIALES:


1) AGITADOR DE PLACAS
2) AGUA DESIONIZADA O DESTILADA
3) CRONOMETRO/RELOJ
4) FRASCOS DE VIDRIO DE 500mL
5) MICROPIPETA AUTOMATICA VARIABLE HASTA 100uL
6) PINZA CON PUNTA SIN UA
7) PIPETAS PASTEUR CONCHUPON
8) PIPETAS DE VIDRIO DE 1mL Y 5mL
9) PUNTAS DESCARTABLES PARA PIPETA
10) PROBETAS GRADUADAS DE 500 Ml
11) TUBOS DEPRUEVA DE 2 A 10mL DE CAPACIDAD
12) UN PARDEGUANTES DESCARTABLES
13) UNA PLACA DE INCUBACION DE 8 CANALES







ADVETENCIA Y PRECAUCIONES

No pipetear los reactivos con la boca y evitar el contacto con la
piel
Usar pinzas y guantes cuando se manipulen las tiras, los sueros
y el sustrato
En los sueros controles positivos y negativos se ha descartado
la presencia de anticuerpos a los virus VIH, hepatitisB y
hepatitisC; sin embargo, se deben tomar las prevenciones de
bioseguridad respectiva.


PUNTOS CRITICOS DE LA TECNICA:

El tiempo mnimo de incubacin de la tira de nitrocelulosa
(antgenos) con el suero o el liquido cefalorraqudeo es 1
hora, pero puede prolongarse hasta 2 horas en caso de que
se haya pasado el tiempo indicado debido a algn
inconveniente
El tiempo de incubacin de la tira de nitrocelulosa (ag-ac
del suero) con el conjugado enzimtico debeser1hora
exacta.
La dilucin del conjugado de ser precisa, una inadecuada
medicin afectara el revelado de las bandas, las cuales se
evidenciaran dbilmente.
Antes de agregar el sustrato es requisito indispensable hacer
2 lavados con la solucin de lavado; pues, la solucin de
trabajo inactiva al sustrato. Un inadecuado lavado afectara
el revelado de las bandas, las cuales se evidenciaran
dbilmente.
Preparar la solucin de sustrato 5minutos antes de su uso.




PREPARACION DE LOS REACTIVOS

1. Solucin de lavado.- dejar que el frasco de la solucin de
lavado (10x) alcance temperatura ambiente, agitarlo por 30
segundos y vaciar su contenido a una probeta de 500ml.
Enjuagar 2 veces el frasco con agua destilada, vaciando su
contenido en la probeta. Enrasar con agua destilada hasta
alcanzar un volumen final de 300ml, solucin que debe ser
homogenizada con una pastilla magntica o por agitacin con
una bagueta, antes de ser vaciada a un frasco rotulado que debe
ser conservado de 2 a 8C.
2. Solucin de trabajo.- transferir 50ml de solucin de lavado a
un frasco y aadir 300ul de solucin detergente. Agitar la
mezcla hasta que se homogenice completamente. Esta solucin
se usa para todos los pasos siguientes (50ml alcanza para 8
muestras incluyndolos dos controles).
3. Buffer de dilucin de la muestra (bloqueador en polvo).-
disolver en un bazo de precipitacin el contenido de un sobre
de bloqueador con 5 ml de solucin de trabajo, agitando hasta
que se disuelva completamente.
4. Disolucin de sueros controles.-
a) marcar y poner en una gradilla un tubo de prueba con el
signo (+) y el otro (-) para los controles positivos y negativos
respectivamente.
b) colocar 0.5ml de buffer de disolucin de la muestra dentro
dcada tubo.
c) aadir 10ml de suero control positivo y 10ml de suero de
control negativo cada tubo.
d) mezclar bien antes de usar.
5. Disolucin de la muestra problema (pacientes).-
5.1.- Dilucin de los sueros:
a) marcar un tubo de prueba para cada suero problema y
colocarlo en una gradilla.
b) colocar 0.5ml de buffer de dilucin de la muestra encada
tubo de prueba.
c) aadir 20ul de suero problema a cada tubo marcado
previamente.
D) mezclar bien antes de usar.
5.2.-Dilucion de los lquidos cefalorraqudeos:
a) marcar cada tubo de prueba para cada l.c.r problema y
colocarlo en una gradilla.
b) colocar0.5ml de buffer de dilucin de la muestra en cada
tubo de prueba.
c) aadir 120ul de l.c.r problema a cada tubo marcado
previamente.
d) mezclar bien antes de usar

6. Conjugado enzimtico.- (preparar 5min antes de su uso)para
cada suero (controles y problemas) se prepara 0.5ml de
conjugado enzimtico, lo cual se consigue mezclando en un
tubo de ensayo limpio 0.5ml de solucin de trabajo y 5ul de
conjugado enzimtico concentrado. Por.ejm. para 5 sueros
mezclar 2.5ml de solucin de trabajo y 2.5ul de conjugado
concentrado (100x).
7. Solucin de sustrato.- en el frasco rotulado como sustrato B
agregar 10ml de solucin de lavado. agitar suavemente hasta
disolver completamente, luego agregar 5ul de sustrato A y
mezclar. Desechar la solucin sobrante.

PROCEDIMIENTO PARA EL REVELADO ENZIMATICO


1. Colocar 0.5ml de solucin de trabajo encada canal de la placa
de incubacin, de acuerdo al nmero de sueros a utilizar
(controles y problemas).
2. Sacar las tiras de nitrocelulosa (ag.) del tubo de ensayo con la
ayuda de una pinza para humedecerlas en la solucin de
trabajo contenida en los canales de la placa de incubacin a
razn de una tira por canal, verificar que las tiras estn
sumergidas y con la lnea negra hacia la parte numerada del
canal, agitar por 3min y dejar a temperatura ambiente por
15min.
3. Eliminar completamente el lquido de los canales de la placa,
por aspiracin o por inclinacin.
4. Colocar 0.5ml de la dilucin de control positivo en el canal
1,0.5ml de la dilucin control negativo en el canal 2 y 0.5ml
de la dilucin de cada suero problema en los canales
correspondientes segn su protocolo de trabajo.
5. Incubar a temperatura ambiente por 1hora en la plataforma de
agitacin o agitar manualmente por un periodo de3min cada
20mints.
6. Eliminar los sueros (controles y problemas) por aspiracin o
inclinacin de la placa, evitando contaminacin cruzada.
7. Evitando tocar la punta del tip con la placa aadir 0.5ml de
solucin de trabajo en cada canal para lavar las tiras en la
plataforma de agitacin por 3min y luego eliminar el lquido
por aspiracin de la placa evitando la contaminacin de un
canal a otro. cada lavada debe durar 5 min.
8. Repetir 2 veces el paso anterior.
9. Colocar 0.5ml de conjugado enzimtico preparado encada
canal e incubar por 1 hora a temperatura ambiente en la
plataforma de agitacin en periodos de 3 min cada 20 min.
10. Eliminar el conjugado por aspiracin de la placa y lavar las
tiras con 0.5ml de solucin de trabajo por 3 veces a temperatura
ambiente. Cada cambio debe durar 5min.
11. Aadir 0.5 ml de solucin de lavado a cada canal y colocar la
placa en la plataforma de agitacin por 5min eliminar el liquido
12. Repetir una vez ms el paso 11.
13. Colocar 0.5ml de la solucin de sustrato a cada canal,
evitando contacto de la piel con la solucin.
14. Colocar la placa en la plataforma de agitacin para visualizar
las bandas inmunoreactivas del suero control positivo.
15. Detener la reaccin a los 10min, eliminando el sustrato con
mucho cuidado en un depsito con leja y agregar 0.5mlde de agua
destilada a cada canal.
16. Lavar con agua destilada por 4veces mas.3
17. Transferir las tiras en orden a un papel absorbente de filtro,
bond, celofn o transparencias, usando pinzas. Dejar secar las tiras a
temperatura ambiente en la oscuridad, para luego poder interpretar
los resultados, comparndola ubicacin de las bandas de las tiras
problemas con la de los controles.




INTERPRETACION DE RESULTADOS

Las bandas inmunoreactivas de la tira de prueba se consideran
como positivas si concuerdan en sus posiciones con las bandas de
la tiras de referencia que se encuentran en la hoja de resultado.

Bandas significativas:
Usando la tcnica de western blog los sueros de pacientes con
cisticercosis reaccionan con los antgenos de
42,35,31,24,23,18,17,14,y 13kda,siendo la de 42kda inespecfica
por cruzar con algunos sueros de pacientes con hidatidosis.

RESULTADOS DE LA PRUEBA:

Positivo en la deteccin de anticuerpos











CONCLUSIONES:

El resultado de la reaccin es positivo el cual ha sido comparado
con las bandas de control que indican que es positivo ya que se
observa coloracin en las bandas.




REFERENCIAS BIBLIOGRAFICAS:
http://www.lablasamericas.com.co/site/index.php/examen/cisticerco
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