CROMATOGRAFIA LQUIDA

PRINCPIO BSICO DA CROMATOGRAFIA

Tcnica de separao e anlise de misturas por interao dos
seus componentes entre uma Fase Estacionria e uma Fase
Mvel.
Classificao dos mtodos cromatogrficos:
TIPO FASE MVEL FASE ESTACIONRIA MECANISMO DE SEPARAO
Gasosa Gasosa
Lquida Partio
Slida Adsoro
Lquida Lquida
Lquida Partio
Slida
Adsoro
Troca Inica
Excluso Molecular
Processo Cromatogrfico
Ocorre partio dos componentes de uma mistura entre a fase mvel (lquida) e a
fase estacionria (slida).
As foras elementares que agem sobre as molculas so de cinco tipos:
1) Foras de disperso de London ou foras de Van der Waals;
2) Interaes de dipolo induzido;
3) Pontes de hidrognio;
4) Interaes dieltricas;
5) Interaes eletrostticas e coulombianas
As foras fsicas e qumicas atuam entre os solutos (presentes na amostra
injetada junto com a fase mvel) e as duas fases (mvel e estacionria).
As interaes surgidas sero responsveis pela reteno dos solutos sobre a
coluna cromatogrfica.
A diferena na magnitude dessas foras que determina a resoluo e, portanto, a
separao dos solutos individuais.
FASE MVEL E FASE ESTACIONRIA
Existem diferentes tipos de cromatografia
lquida, sendo os mais importantes o de
coluna e empapel.
A Fase estacionria pode ser um slido ou um
lquido.
A Fase mvel um lquido, chamado, eluente.
Cromatografia de Camada Delgada
Thin Layer Chromatography (TLC)
Placa de Camada
Delgada
(Estacionria)
Solvente
(Mvel)
Vapor
Saturado
do
Solvente
Placa de Petri
Solvente
(Mvel)
Placa
Resultado em TLC
Distncia
Mxima
percorrida
pelo
solvente
Eluente
Ponto indicando a distncia
percorrida pelo soluto antes de
ser adsorvido pela placa
Vapor Saturado do Solvente no interior da cmara impede
que ocorra evaporao do eluente da superfcie da placa e
auxilia no mecanismo de reteno pela placa. Os solventes
so adsorvidos pela placa e ocorrer a interao entre o
soluto (amostra) e a placa de slica.
Clculo do Rf:
Mecanismo de Separao em TLC
A placa delgada a fase estacionria deste processo cromatogrfico
e constituda de slica gel ou alumina que, por sua vez, apresentam
alta polaridade.
O solvente comea a ser absorvido pela placa, dissolvendo os solutos
na linha de base. Os compostos presentes, ento, tendem a ser
arrastados para o alto da placa juntamente como solvente .
De acordo com a interao estabelecida entre o soluto e a placa o
tempo de reteno aumentar devido a forte adsoro que ocorrer
desta molcula de soluto na placa.
Exemplo de Cromatograma TLC
Separao dos componentes do leo de laranja doce
Fonte: Micronal S/A.
Reich, E.; Blatter, A.; Meier, B.; Milano, S. TLC PARA ANLISE DE DROGAS
HERBCEAS. REVISO CRTICA DO STATUS E PROPOSTA PARA O
APERFEIOAMENTO DAS MONOGRAFIAS.
Cromatografia Lquida de Alta Eficincia
(CLAE)
Tipo de cromatografia lquida que emprega pequenas
colunas, recheadas de materiais especialmente
preparados e uma fase mvel que eluda sobre altas
presses.
Constitui-se, portanto:
-Fase Mvel: lquido
-Fase Estacionria: material slido
Coluna
Empacotamento
Cromatgrafo (HPLC)
A composio bsica de um cromatgrafo lquido
(CLAE ou HPLC) :
Bomba
Injetor
Forno de coluna
Detector (UV, Fluorescncia)
Processador (Software)
Fonte: Shimadzu Co., Japan
Importncia
Realizao de separaes e anlises quantitativas
de uma grande quantidade de compostos presentes
em vrios tipos de amostras, em escala de tempo
de poucos minutos, com alta resoluo, eficincia e
sensibilidade
Pode ser acoplada a outros mtodos instrumentais
como o espectrmetro de massa para aumentar a
sensibilidade do resultado.
Vantagens e Desvantagens
Vantagens Desvantagens
Tempo de anlise Custo de Implantao
Alta resoluo Custo de operao
Sensibilidade (ppb ppm) Treinamento
Versatilidade (tamanho, orgnico,
inorgnico
Detectores
gua (grau HPLC) R$ 50,00 / litro
Acetonitrila (grau HPLC) R$ 250,00 / litro
Hexano (grau HPLC) R$ 212,00 / litro
Coluna C18 R$ 2230,00
Grau HPLC acima de 99% de pureza
Aplicaes
Tcnica verstil que permite a deteco de:
Vitaminas
Lipdios
Aminocidos / Protenas
Pesticidas
Antioxidantes
Drogas (antidoping)
Frmacos
Bactericidas
Surfactantes
cidos Graxos
Escalas Cromatogrficas
Existem duas escalas de operao de uma anlise cromatogrfica e sero
estabelecidas de acordo com a necessidade ou no de emprego posterior do material
separado pela coluna cromatogrfica: preparativa e analtica
Escala Preparativa:
O interesse , alm da separao e quantificao das molculas, que sejam coletadas fraes
de cada molcula para posterior uso.
Emprego:
-Confirmao da identidade de um compostos
-Determinao da atividade biolgica de um ou mais constituintes da frao
- Verificao da utilizao de uma frao isolada (por exemplo, como catalisador).
-Purificao de um frmaco atravs do isolamento das impurezas (ex. insulina) e
outras.
Execuo:
Colunas de comprimento e dimetro interno maiores que a analtica, uma vez que o objetivo
usualmente isolar grandes quantidades do(s) composto(s) de interesse. Estas colunas podem chegar
a vrios metros de comprimento e valores superiores a um metro para o dimetro interno.
O dimetro interno das colunas preparativas usualmente possui valores superiores a 10 cm, enquanto
que as colunas analticas possuem dimetro interno de no mximo 4,6mm. Portanto, existe uma
pequena faixa na qual o dimetro interno da coluna superior das analticas e inferior das
preparativas. Esta faixa intermediria usualmente denominada de coluna semi-preparativa, e sua
maior utilizao tem sido para o desenvolvimento e otimizao de separaes as quais so
posteriormente transferidas para a escala preparativa.
Fluxo
da Fase Mvel
Todos os analitos sero arrastados pela fase
mvel no interior da coluna (fase estacionria)
De acordo com a fora das interaes entre a
fase mvel, fase estacionria e o analito
ocorrer um espalhamento das molculas no
interior da coluna fazendo que ocorra uma
separao por afinidade qumica.
A velocidade de escoamento pela coluna
variar.
- menor interao, maior velocidade
(primeiro pico cromatogrfico)
- maior interao, menor velocidade
(ltimo pico cromatogrfico)
-
Mecanismo de Separao
Mecanismo de Separao
A interao (afinidade) entre a substncia analisada e as fases
mvel e estacionria far com que de acordo com sua
polaridade, ou caracterstica qumica, a substncia sofra um
perodo de reteno no interior da coluna.
Fase Estacionria
A fase estacionria pode conter diferentes recheios:
a) Slidos rgidos, semi-rgidos ou no rgidos;
b) Partculas porosas ou peliculares;
c) Partculas esfricas ou irregulares;
d) Partculas com diferentes dimetros.
Caractersticas da Fase Estacionria
- Slidos rgidos a base de slica so os recheios mais
usados atualmente pois so mais resistentes a presso.
-Slidos semi-rgidos so geralmente constitudos de
partculas porosas de poliestireno cruzadas com
divinilbenzeno. O semi-rgido tem sido usado para
presses at 350 bars.
- Slidos no-rgidos (dextrose ou agarose) tem sido
usados para excluso de molculas grandes.
-Pelicular ou Poroso: pode ser tratado quimicamente
para que tenham capacidade adsorvente (troca inica).
Importante: Eficincia garantida ao manter-se o
mesmo dimetro para todo o recheio.
Tamanho da Partcula
Em geral, menor que 30 mm (exceto em colunas de
troca inica).
Garante a difuso das molculas (amostra) ao
penetrar e ao sair dos poros das partculas.
Menor Partcula = Menor tempo para ocorrer a difuso
Anlise mais rpida
Partcula - Coluna
Fonte: Sigma-Aldrich Ltd., Germany
Fase Mvel
Duas Formas de Eluio dos Solventes:
Isocrtico: a proporo empregada de cada solvente
utilizado na fase mvel (eluente) mantida constante.
Gradiente: a proporo de cada solvente sofre
alterao durante o tempo de anlise.
Por qu?
Muitas vezes, devido a uma forte adsoro ou reteno
de alguns componentes da amostra no slido ativo,
necessrio aumentar a polaridade da fase mvel de uma
maneira constante e uniforme, com o qual se consegue
um incremento de solubilidade dos componentes da
amostra na fase mvel.
[Solvente]
Tempo
[Solvente]
Tempo
Mantm constante a composio da
fase mvel atravs da manuteno da
proporo de cada solvente empregado.
Varia a composio da fase mvel
atravs da variao da proporo de
cada solvente empregado.
Mtodo Isocrtico
Mtodo Gradiente
Equipamento
Exemplo de HPLC (Shimadzu, Japan)
Solventes Fase Mvel
Bomba e Desgaseificador
Injetor e Forno de Coluna
Detector
Solventes Fase Mvel
Desgaseificador
Remover as bolhas de ar e outros gases que podem estar presentes no
solvente e que podem interferir na resoluo do cromatograma alm
de, emsituaes extremas desempacotar a coluna.
Bombas Pistonadas
Vlvula de Purga
Dois Pistes em Paralelo
Promover o deslocamento da fase mvel mantendo a proporo de
solventes e vazo programadas.
Injetor
Loop utilizando micro seringa.
Volume de Injeo pequeno para evitar sobrecarga da
coluna.Evitar bolhas de entrar durante injeo
Fonte: Plasmatronics LTDA
Em geral de ao inoxidvel.
Existem dois tipos:
Pr-colunas: Introduzidas antes da coluna
de separao. Utilizada para promover
aumento da vida til devido a remoo de
material particulado e contaminantes.
Coluna de Separao: 10 a 30 cm de
comprimento. De 3 a 10 mm de dimetro.
Contm partculas de 3, 5 ou 10 mm.
Coluna
Forno de Coluna
Manter temperatura da coluna constante.
Diversas anlises so feitas sob controle rgido de
temperatura.
Absorbncia:
UV/Vis (l fixo)
Infravermelho
Fotodiodo (todo o espectro)
Fluorescncia
Substncias sensveis emisso de radiao (fluorescncia).
ndice de Refrao.
Espectrmetro de Massa:
Substncia ionizada.
ons so separados.
O feixe de ons atinge o detector.
O detector converte o feixe de ons em sinal eltrico.
Detectores
Absorbncia
Detector UV
Detector
Cromatograma
Exemplo de Cromatograma
Coluna C18 RP. Gradiente de Acetonitrila:gua. Vazo: 1,0 mL/min.
Tipos de Cromatografia Lquida
Interao Hidrofbica ou Adsoro
Princpio:
Adsorvente
Soluto Solvente
Baseia-se na competio que existe entre molculas
da amostra e as da fase mvel em ocupar os stios
ativos na superfcie de um slido (fase estacionria).
Para que uma molcula de soluto seja adsorvida pela
fase estacionria necessrio que uma molcula do
solvente seja deslocada.
Distribuio de equilbrio ser afetada por:
-Composio da fase mvel
-Composio da fase estacionria
-Temperatura de separao
-Vazo de Eluio
Tempo
Exemplo
Adsorvente Polar e soluto apolar:
A pouca afinidade entre o soluto e o adsorvente
(partcula na coluna) far com que no ocorra
deslocamento do solvente (fase mvel).
FASE NORMAL:
fase estacionria polar;
fase mvel apolar (n-alcanos,clorofrmio, acetato de etila);
solutos neutros;
polaridade soluto t. reteno;
mecanismo reteno: adsoro
FASE REVERSA: (inverso)
fase estacionria apolar (C18);
fase mvel polar (tampes, gua, metanol, acetonitrila, THF);
solutos apolares, no-inicos;
polaridade fase mvel tempo de reteno;
mecanismo reteno: partio
POLARIDADE RELATIVA DAS FASES:
Fase Normal
Tipos de Fase Estacionria
Principais Partculas empregadas em
CLAE por adsoro
Em Cromatografia de Fase Normal:
O componente menos polar eluir primeiro (maior solubilidade
na fase mvel).
Quanto maior a polaridade da fase mvel, menor o tempo de
reteno (picos saem em menos tempo e mais prximos entre si).
Interao por pontes de hidrognio (F, O, N).
Em Cromatografia de Fase Reversa:
O componente mais polar eluir primeiro (menor solubilidade na
fase mvel)
Quanto maior a polaridade da fase mvel, maior o tempo de
reteno (picos saem em maior tempo e mais distantes entre si).
Relao entre Eluio e Polaridade
Polaridade de Solventes
(Fase Mvel)
Polaridade de Solventes
(Fase Mvel)
Fase Normal
Fase Reversa
A afinidade maior em cromatografia de fase
normal quanto menos impedido for o grupo
polar da molcula.
Interao em Fase Normal (Ponte de Hidrognio)
Interao em Fase Reversa
Influncia do Solvente (Fase Mvel)
Influncia da Coluna (Fase Estacionria)
Ocorre atrao eletrosttica.
Interaes por Troca Inica
Aplicao:
Aminocidos
Nucleotdeos
Carbohidratos
protenas
Fase Estacionria:
Aninica / Catinica.
Fase Mvel: Solues
Salinas (Tamponada).
Interaes por Excluso
Fase Estacionria: Polmeros Porosos.
Fase Mvel: Solues Aquosas ou Solventes.
Aplicao:
Polmeros
Protenas
cidos Nucleicos
Mecanismo de Reteno:
Capacidade das molculas penetrarem nos
poros da fase estacionria.
Molculas menores penetram nos condutos da
fase estacionria e, com isso, diminuem sua
velocidade de eluio pela coluna. Em paralelo,
as molculas maiores conseguem eluir com
maior liberdade.