Anda di halaman 1dari 6

BAB 3

PERCOBAAN

Pada bab ini dijelaskan tentang bahan dan alat yang diperlukan serta hal yang dilakukan dalam penelitian sesuai dengan urutan pelaksanaannya.

3.1 Bahan dan Alat

Pada bagian ini disebutkan bahan dan alat yang digunakan dalam penelitian.

3.1.1 Bahan Bahan yang digunakan terdiri dari daun alpukat (Persea americana Mill.), air suling, kloral hidrat, asam hidroklorida, natrium hidroksida, besi (III) klorida, alumunium (III) klorida, natrium asetat, amonium hidroksida, eter, kloroform, toluena, serbuk magnesium, amil alkohol, pereaksi Dragendorff, pereaksi Steasny, pereaksi Liebermann-Burchard, pereaksi Mayer, etanol, etil asetat, n-heksana, metanol, asam sulfat, silika gel 60 H, silika gel GF 254 , kalium bromida.

3.1.2

Alat

Alat yang digunakan dalam penelitian ini terdiri dari seperangkat alat destilasi, seperangkat

alat penentuan kadar air, krus silikat, oven, tanur, seperangkat alat Soxhlet, seperangkat alat KCV, labu bersumbat, kertas saring bebas abu, kompor listrik, pelat tetes, corong pisah, mortir, stamper, cawan penguap, penguap hampa udara berputar (Buchi R-124), lemari pengering simplisia, alat penggiling simplisia, hair dryer, mikroskop, desikator, pelat KLT pralapis, pelat kaca KLT, pipa kapiler, bejana kromatografi, lampu ultraviolet (Desaga Sarstedt-Guppe), spektrofotometer ultraviolet-sinar tampak (Hewlett Packard AP 8452), spektrofotometer inframerah (FT/IR-4200 type A).

3.2 Penyiapan Simplisia

Tahap penyiapan simplisia meliputi proses pembuatan simplisia, terdiri dari pengambilan

bahan segar, pemilihan, pencucian, pengecilan ukuran, pengeringan, hingga pembuatan serbuk simplisia.

3.2.1

Pengumpulan Bahan dan Determinasi Bahan

Bahan dikumpulkan pada tanggal 3 Januari 2007 kecamatan Coblong, Bandung, Jawa Barat. Determinasi tanaman dilakukan di Herbarium Bandungense Sekolah Ilmu dan Teknologi Hayati Institut Teknologi Bandung.

3.2.2 Sortasi Basah dan Pencucian

Daun alpukat dipisahkan dari pengotornya, dicuci dengan air mengalir yang bersih.

3.2.3 Pengecilan Ukuran, Pengeringan, dan Sortasi Kering

Daun alpukat dikeringkan dengan lemari pengering pada suhu 40°C selama empat hari. Daun yang telah kering kemudian dipisahkan dari pengotornya.

3.2.4 Pembuatan Serbuk

Daun yang telah kering digiling dan diayak sehingga diperoleh serbuk simplisia dengan

ukuran 20 mesh.

3.3 Pemeriksaan Makroskopik dan Mikroskopik Simplisia

Pemeriksaan

karakteristik simplisia.

ini

digunakan

untuk

menguji

kebenaran

simplisia

dan

mengamati

3.3.1 Pemeriksaan Makroskopik Simplisia

Daun alpukat diperiksa secara visual dan organoleptik yang meliputi pemeriksaan bentuk, warna, rasa dan bau simplisia.

3.3.2 Pemeriksaan Mikroskopik Simplisia

Serbuk simplisia diperiksa di bawah mikroskop menggunakan pereaksi kloral hidrat

dengan perbesaran tertentu.

3.4 Karakterisasi Serbuk Simplisia

Uji mutu yang dilakukan untuk simplisia yang digunakan sebagai bahan percobaan selain pemeriksaan organoleptik, makroskopik, dan mikroskopik antara lain penetapan kadar air,

kadar abu total, susut pengeringan, kadar sari larut air, dan kadar sari larut etanol.

3.4.1

Penetapan Kadar Air

Ke dalam labu yang telah dicuci dengan air dan telah dikeringkan, dituangkan 200 mL toluena dan 2 mL air, kemudian disuling selama 2 jam. Setelah itu didinginkan selama 30 menit dan volume air dibaca dengan ketelitian 0,05 mL. Sejumlah 25 gram serbuk simplisia dimasukkan ke dalam labu lalu dipanaskan secara perlahan selama 15 menit. Setelah toluena mulai mendidih, kecepatan penyulingan mulai diatur lebih kurang dua tetes tiap detik sampai sebagian besar air tersuling. Kemudian kecepatan penyulingan dinaikkan sampai empat tetes tiap detik. Setelah semua air tersuling, bagian dalam pendingin dicuci dengan toluena. Penyulingan dilanjutkan selama 5 menit. Tabung penerima dibiarkan mendingin pada suhu kamar dan diusahakan tidak ada tetesan air yang melekat pada dinding tabung penerima. Setelah air dan toluena memisah sempurna, volume air dibaca.

Kadar air dihitung dalam persen dengan rumus sebagai berikut :

100 (n'-n)

25

dengan n’ = volume air hasil penyulingan kedua, dan n = volume air hasil penyulingan

pertama (mL) (WHO, 1998).

3.4.2 Penetapan Kadar Abu Total

Sebanyak 2 sampai 3 g sampel dalam bentuk serbuk diratakan dalam krus silikat yang telah dipijar dan ditara. Krus berisi sampel dipijarkan perlahan-lahan hingga arang habis, didinginkan, dan ditimbang. Jika arang tidak dapat dihilangkan, ditambahkan air panas ke sampel, kemudian disaring melalui kertas saring bebas abu. Sisa dan kertas saring dipijarkan dalam krus yang sama. Filtrat dimasukkan dalam krus, diuapkan, dan dipijarkan hingga bobot tetap. Kadar abu dihitung terhadap bahan yang telah dikeringkan di udara (Ditjen POM dan Depkes RI, 1995).

3.4.5 Penetapan Susut Pengeringan

Simplisia ditimbang 1-2 g. Disiapkan botol timbang dangkal dengan tutup kaca yang telah dikeringkan selama 30 menit pada kondisi percobaan, lalu ditara. Sampel dimasukkan ke dalam botol uji lalu ditimbang seksama botol beserta isinya. Sampel diratakan dengan cara botol digoyang-goyang secara perlahan hingga tinggi sampel 5-10 mm, kemudian dimasukkan ke dalam oven. Di dalam oven, sampel dikeringkan pada suhu 105°C dalam

keadaan botol terbuka hingga bobot tetap. Sebelum penimbangan, botol berisi sampel ditutup, dibiarkan mendingin dalam desikator hingga suhu sama dengan suhu kamar. (Ditjen POM dan Depkes RI, 1995).

3.4.6 Penetapan Kadar Sari Larut Air

Sejumlah 5 g serbuk dimaserasi selama 24 jam dengan 100 mL air-kloroform dengan menggunakan labu bersumbat sambil dikocok berkali-kali selama 6 jam pertama, kemudian dibiarkan 18 jam. Setelah itu, hasil maserasi disaring dan 20 mL filtrat diuapkan hingga kering dalam cawan penguap. Sisanya dipanaskan pada suhu 105° C hingga bobot tetap. Kadar sari larut air dihitung terhadap bahan yang telah dikeringkan di udara (Ditjen POM dan Depkes RI, 1995).

3.4.7 Penetapan Kadar Sari Larut Etanol

Sejumlah 5 g serbuk dimaserasi selama 24 jam dengan 100 mL etanol (95%) dengan menggunakan labu bersumbat sambil dikocok berkali-kali selama 6 jam pertama, kemudian dibiarkan 18 jam. Setelah itu, hasil maserasi disaring cepat dan 20 mL filtrat diuapkan hingga kering dalam cawan penguap. Sisanya dipanaskan pada suhu 105°C hingga bobot tetap. Kadar sari larut etanol dihitung terhadap bahan yang telah dikeringkan di udara (Ditjen POM dan Depkes RI, 1995).

3.5 Penapisan Fitokimia

Simplisia sebanyak 1 g dimasukkan dalam 100 mL air, dididihkan selama 5 menit, kemudian disaring. Hasil filtrat disebut larutan A yang akan digunakan untuk pemeriksaan

flavonoid, tanin, kuinon, dan saponin.

3.5.1 Flavonoid

Sebanyak 5 mL larutan A dimasukkan ke dalam tabung reaksi kemudian ditambah serbuk

magnesium, 2 mL HCl pekat. Kemudian ditambah 5 mL amil alkohol. Jika terbentuk warna merah, jingga, kuning, pada lapisan amil alkohol berarti flavonoid positif (Farnsworth, 1966).

3.5.2 Saponin

Sebanyak 10 mL larutan A dimasukkan ke dalam tabung reaksi, dikocok secara vertikal selama 10 detik kemudian didiamkan. Jika terbentuk busa yang stabil selama 10 menit,

ditambahkan 1 tetes asam hidroklorida 2 N. Jika busa tidak hilang berarti saponin positif

(Farnsworth, 1966).

3.5.3 Tanin

Sebanyak 5 mL larutan A dimasukkan ke dalam tabung reaksi kemudian ditambah besi

(III) klorida 1 % b/v beberapa tetes. Jika terbentuk warna hijau, biru, atau hitam, berarti

tanin positif. Sebanyak 5 mL larutan A ke dalam tabung reaksi ditambah larutan gelatin

dan terbentuk endapan putih jika mengandung tanin (Farnsworth, 1966).

a. Pemeriksaan Tanin Katekat

Sebanyak 5 mL larutan A dimasukkan ke dalam tabung reaksi, ditambahkan pereaksi

Steasny (campuran formalin 30 %-asam hidroklorida pekat (2:1)), kemudian dipanaskan

dalam tangas air dengan suhu 90°C. Jika terbentuk endapan merah merah muda, berarti

tanin katekat positif (Farnsworth, 1966).

b. Pemeriksaan Tanin Galat

Hasil penentuan tanin katekat disaring, kemudian filtratnya dijenuhkan dengan natrium asetat dan ditambah beberapa tetes besi (III) klorida 1 % b/v. Jika terbentuk warna biru tinta berarti tanin galat positif (Farnsworth, 1966).

3.5.4 Kuinon

Jika larutan A tidak mengandung tanin, maka sebanyak 5 mL larutan A dimasukkan dalam

tabung reaksi, kemudian ditambah NaOH 1 N. Jika terbentuk warna merah, berarti kuinon

positif.

Jika larutan A mengandung tanin, maka 5 mL larutan A ditambah gelatin kemudian

disaring. Kemudian filtrat ditambah NaOH 1 N. Jika terbentuk warna merah, berarti

kuinon positif.

3.5.5 Alkaloid

Serbuk simplisia sebanyak 2 g dilarutkan dalam asam hidroklorida kemudian disaring.

Filtratnya dibasakan dengan amonium hidroksida, ditarik dengan kloroform, lalu filtrat

diuapkan. Residu kloroform ditambah asam, kemudian diuji dengan menambah pereaksi

khusus. Jika ditambah pereaksi Dragendorff terbentuk endapan jingga, maka alkaloid

positif (Farnsworth, 1966).

3.5.6

Steroid/ Triterpenoid

Serbuk simplisia sebanyak 1 g dimaserasi dengan eter selama 2 jam lalu disaring. Filtratnya diuapkan kemudian ditambahkan pereaksi Liebermann-Burchard dan diamati perubahan warnanya. Jika berwarna biru hijau menunjukkan adanya steroid, sedangkan

bila warnanya merah ungu berarti terdapat triterpenoid (Farnsworth, 1966).

3.6 Ekstraksi dan Pemantauan Ekstrak

Ekstraksi dilakukan dengan cara panas secara bertingkat dengan alat Soxhlet. Pelarut yang

digunakan berturut-turut n-heksana, etil asetat, dan etanol. Terhadap ekstrak dilakukan pemantauan menggunakan KLT dengan penjerap silika gel GF 254 dan berbagai sistem pengembang. Penampak bercak yang digunakan adalah sinar UV pada λ 254 nm dan 366 nm, serta asam sulfat 10 % dalam metanol.

3.7 Fraksinasi dan Pemantauan Fraksi

Proses fraksinasi ekstrak dilakukan secara KCV dengan kepolaran fase gerak (kombinasi n-heksana-etil asetat-metanol) meningkat agar terfraksinasi sempurna. Pemantauan hasil

fraksinasi menggunakan KLT dengan penjerap silika gel GF 254 dan berbagai sistem pengembang. Penampak bercak yang digunakan adalah sinar UV pada λ 254 nm dan 366 nm, serta asam sulfat 10 % dalam metanol.

3.8 Pemurnian dan Uji Kemurnian

Pemurnian dilakukan secara KLT preparatif dengan penjerap silika gel GF 254 dan sistem

pengembang yang cocok. Uji kemurnian isolat dilakukan secara KLT pengembangan tunggal.

3.9 Karakterisasi Isolat

Isolat yang diperoleh dikarakterisasi menggunakan KLT dengan berbagai penampak bercak khusus, spektrofotometri ultraviolet-sinar tampak dan spektrofotometri inframerah.