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PRODUCCIN DE SANGRE ARTIFICIAL A PARTIR DE HEMERITRINA OBTENIDA

DEL GUSANO MARINO Sipunculus nudus



Resumen
El propsito de esta investigacin fue encontrar otro medio para la produccin de
sangre por medio de la protena hemeritrina encontrada en la especie de gusanos
marinos Sipunculus nudus, este proyecto va desde la obtencin de la protena hasta la
produccin de la sangre, debe recalcarse que esta mezcla es artificial y es universal.












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Introduccin.
Una de las necesidades en las que se enfrenta el sistema de salud a nivel mundial es la
demanda de las transfusiones de sangre que existe. Las transfusiones de sangre
permiten salvar vidas y mejorar la salud. Se puede decir, que nueve de cada diez
personas necesitarn una transfusin de sangre en algn momento de su vida; debido
a alguna ciruga o por motivo de algn accidente pero muchos de estos cuando
requieren de una transfusin no pueden acceder por las limitaciones que el sistema
presenta, esto debido a que no se cuenta con la cantidad suficiente o no se cuenta con
el tipo de sangre requerida.
Actualmente se cuenta con numerosas campaas de concientizacin y aun as las
tasas de donacin son inferiores al uno por ciento de la poblacin
Una transfusin de sangre es un procedimiento mdico relativamente sencillo durante el
cual un paciente recibe sangre o algn componente de la sangre a travs de una va
intravenosa. sta puede utilizarse para reponer una prdida de sangre o de una parte
de sta.
Es raro el caso en donde se lleve a cabo una transfusin de sangre completa. En vez
de eso, se hacen transfusiones de los componentes de la sangre que se necesitan. Los
glbulos rojos, la parte que se transfunde ms a menudo, se utilizan para incrementar la
capacidad de la sangre de transportar oxgeno y para evitar el agotamiento y otras
complicaciones
Teniendo en cuenta que en el mundo millones de pacientes no tienen acceso a este
recurso cuando lo necesitan (generalmente cuando sufren enfermedades crnicas,
complicaciones en el parto, cirugas o accidentes de trnsito) diversos cientficos han
dedicado aos de trabajo al desarrollo de sangre artificial.
En la actualidad, la sangre artificial se trabaja mediante perfluorocarbonos (PFC), un
lquido claro e inerte de consistencia similar al aceite, o soluciones de hemoglobina, que
utilizan elementos vivos como placenta humana, sangre vacuna o bacterias. Entre los
avances ms recientes, cientficos del Centro Escocs de Medicina Regenerativa

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obtuvieron a mediados de este ao el permiso para desarrollar sangre a partir de
clulas madre adulta. Esto permitira transportar de manera efectiva oxgeno y dixido
de carbono por todo el cuerpo.
La manera alternativa en que se busca producir sangre por medio de gusanos marinos
(protena), sal y agua; se conoce de un estudio que se llevado a cabo por el doctor
Silaghi-Dumitrescu, sus investigaciones estn enfocadas a lograr un fluido estril, que
no conlleve riesgos de infeccin durante la transfusin, ni requiera tanta refrigeracin, a
fin de que pueda ser aplicada en humanos de manera instantnea, en situaciones de
emergencia.
La sangre se compone principalmente de un tipo de protena que se encuentra en
gusanos marinos llamados Anlidos poliquetos (Polychaete annelid), llamada
hemeritrina. Se encontr que la protena de los gusanos resiste ms tipos de estrs que
la hemoglobina que es la protena principal de la sangre humana.
Estas investigaciones tienen el fin de aportar alternativas seguras y que puedan
almacenarse de una forma eficiente y sin cuidados especiales para cualquier tipo de
emergencia.
Cabe sealar que la sangre artificial no es un sustituto de sangre, sino que es un medio
de proteccin que ayuda al organismo a regenerar su sangre en tan solo 24 horas sin la
necesidad de exponerse a riegos mortales.
Nuestra investigacin est dirigida a sostener todas las cuestiones planteadas
anteriormente con el desarrollo terico de proponer otra especie marina para la
ampliacin de materia prima en la obtencin de hemeritrina.
El Sipunculus nudus es tambin una especie marina, que porta la protena estudiada
para la produccin de sangre artificial, pretendemos que sea una opcin para la
extensin de nuestro panorama en la bsqueda de otra especie que nos ayude en la
elaboracin de esta nueva fuente de sangre.


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Antecedentes.
Transfusiones de sangre.
El almacenamiento y transfusin de sangre estril compatible o de componentes de la
sangre es un procedimiento de rutina que salva vidas. Su desarrollo tiene una larga
historia y ha dependido de los experimentos con animales realizados por varios
mdicos y cientficos. Actualmente se hacen alrededor de 88 millones de donaciones de
sangre cada ao, suficientes para llenar 32 piscinas olmpicas, a pesar de que todava
no son suficientes para cubrir la demanda. La investigacin sigue encontrando formas
alternativas de abastecerse de sangre e incluso alternativas a la sangre. (George Crile,
2011)
Donacin de sangre a nivel mundial.
El 65% de las donaciones de sangre se hacen en los pases desarrollados, que solo
representan un 25% de la poblacin mundial. Las tasas de donacin siguen siendo
inferiores al 1% de la poblacin (el mnimo necesario para atender las necesidades
bsicas de un pas) en 73 pases, 71 de los cuales son pases en desarrollo o en
transicin. En 42 pases los donantes voluntarios no remunerados, que son la fuente
ms segura, aportaron menos del 25% de las donaciones. En 2007, 31 pases seguan
obteniendo donaciones remuneradas, que totalizaron ms de un milln de donaciones.
En 41 pases no se realizaron en toda la sangre donada pruebas de deteccin de una o
ms de las siguientes infecciones transmisibles por transfusin: VIH, hepatitis B y C, y
sfilis. (Bagozzi, 2009)
De los 85,4 millones de donaciones hechas en 2007, aproximadamente el 65%
correspondieron a los pases desarrollados, que solo representan aproximadamente un
25% de la poblacin representada. (Bagozzi, 2009)
Las donaciones por 1000 habitantes, que tambin reflejan la disponibilidad general de
sangre en un pas, son muy variables, y la menor disponibilidad corresponde a los
pases en transicin y en desarrollo. La tasa media de donaciones fue de 38,1/1000
habitantes (entre 4,92 y 68,01) en los pases desarrollados, de 7,5 (entre 1,07 y 35,18)

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en los pases en transicin, y de 2,3 (entre 0,40 y 7,46) en los pases en desarrollo. Se
registraron menos de 10 donaciones por 1000 habitantes en 73 pases, 71 de los cuales
son pases en desarrollo o en transicin. (Jose, 1997)
Segn las estadsticas, cada ao en el todo el mundo se donan cerca de 80 millones de
litros de sangre, que es el equivalente a 40 piscinas olmpicas. Estos datos tambin nos
arrojan unas cifras en las que se indica que el 54% de los donantes de sangre son
hombres, correspondiendo el 46% a las mujeres. Si diferenciamos por edades, el 41%
de los donantes tienen entre 31 y 45 aos, el 35% corresponde a los que abarcan la
franja de 18 a 30 aos y 24% restante a los de 46 a 65 aos. Una reciente encuesta
entre personas que haban donado sangre en alguna ocasin mostr que un 45,4% de
los preguntados dado sangre por solidaridad y altruismo y un 19,8% porque lo haba
necesitado un familiar y/o conocido. (20 minutos, 2014)
Donacin de sangre en Mxico.
En Mxico la recuperacin de sangre es de menos del 65% del 100% necesario (en
Latinoamrica es de apenas 37%). Del total de la sangre donada, slo el 2% es
voluntario. 90% de 6 mil 500 donadores (cifra anual de 2011) acude porque tiene a un
ser querido hospitalizado. De los 80 pases del mundo con un bajo ndice de
donaciones de sangre (menos de 10 donaciones por cada mil personas), 79 son
naciones en desarrollo (es el caso de Mxico). (Mexicana, 2012)
Investigaciones y avance en las transfusiones sanguneas.
Richard Lower fue el primero en realizar una transfusin sangunea de animal a animal
y de animal a humano, ambos en 1665. La primera transfusin sangunea
documentada, de humano a humano y con resultado exitoso no se produjo hasta 1830,
cuando James Blundell transfiri sangre de su asistente a una mujer que sufra
hemorragia posparto. (Dr. Decaro Jorge, 2010).En esos tiempos la transfusin
sangunea era un procedimiento tcnicamente difcil: los nicos aparatos disponibles
eran plumas de animales o tubos de plata, y no haba forma de prevenir la formacin de
cogulos de sangre. A pesar de esto, su prctica continu como un procedimiento

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extremo y pronto se usaron nuevas soluciones intravenosas como una solucin salina,
leche y albmina extrada de huevo. (Dimitrescu, 2013)
Los experimentos con animales, que se desarrollaron entre los aos 1900 y 1916,
permitieron que las transfusiones se convirtieran gradualmente en el tratamiento
rutinario que conocemos en la actualidad. En 1907, George Crile perfeccion la tcnica
de la transfusin de arteria a vena, usando perros, tal como describi en su aplicacin a
32 pacientes. El protagonista del siguiente mayor logro fue Adolph Hustin, quin en
1914 hall que aadir citrato de sodio a la sangre impeda que sta se coagulara y
poda entonces transferirse a perros con seguridad. En 1915, Richard Lewinsohn
foment este descubrimiento al establecer la mxima cantidad de citrato que podra
transferirse a perros sin que provocara toxicidad. Esto revel la concentracin mxima
de citrato de sodio que poda aadirse a la sangre para conseguir un efecto
anticoagulante ptimo. (Crile, 2011)
El siguiente avance se produjo en 1915 cuando Richard Weil mostr que esta sangre a
la que se haba aadido citrato, poda almacenarse durante dos das y mantener su
efectividad al ser transferida a cobayas y perros que haban perdido sangre. A estos
experimentos le siguieron el trabajo de Peyton Rous y Joseph Turner en conejos en
1916, que demostr que con determinados aditivos y el tratamiento adecuado, la
sangre poda almacenarse durante 14 das y posteriormente administrarse con xito
mediante transfusin. (George Crile, 2011)
Sangre artificial.
En 2011, un sustitutivo de la sangre derivado del plasma de vaca se us para salvar la
vida de una mujer a la que slo le quedaba un litro de sangre en el cuerpo pero que su
religin impeda una transfusin sangunea convencional. En este caso se us un
transportador de oxgeno basado en la hemoglobina (Hemopure) que no requiere la
compatibilidad de tipos sanguneos y puede durar hasta tres aos sin refrigeracin.
(Jonathan, 2012)

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Esta es una de las llamadas sangres artificiales, diseadas para aumentar el transporte
de oxgeno en el cuerpo despus de una fuerte prdida de sangre. Sin embargo, stas
han tenido una historia controvertida. (Jonathan, 2012)
Un metaanlisis de estudios sugiri que el uso de sangre artificial ha aumentado en un
30% el riesgo de muerte. La FDA atrajo las crticas de las fuerzas navales de los EEUU,
quin haban financiado la mayor parte de las investigaciones. Las crticas se
fundamentaban en que la FDA haba interrumpido los ensayos clnicos, y el autor del
metaanlisis fue denunciado por una de las empresas que desarroll el tratamiento.
(Saulo, 2012)
En la actualidad, la sangre artificial se trabaja mediante perfluorocarbonos (PFC), un
lquido claro e inerte de consistencia similar al aceite, o soluciones de hemoglobina, que
utilizan elementos vivos como placenta humana, sangre vacuna o bacterias.
(dimitrescu, 2014)
Cultivo de glbulos rojos.
Los investigadores tambin han estado trabajando en la creacin de una reserva
continua de glbulos rojos provenientes de clulas madre embrionarias. Despus de un
primer desarrollo de esta tcnica en ratones, investigadores japoneses desarrollaron
una lnea de clulas madre embrionarias humanas inmortalizadas que podan usarse
indefinidamente para producir glbulos rojos. El trabajo en este campo se ha retrasado
indefinidamente debido a inquietudes ticas y problemas para obtener licencias para el
uso de clulas derivadas de embriones humanos. (Diego, 2014) A pesar de estas
precauciones se espera que los ensayos clnicos empiecen pronto.
En el ao 2011 se cultivaron glbulos rojos de clulas madre hematopoyticas
extradas de mdula sea. Estos cultivos produjeron 10 billones de clulas (el
equivalente a 2 mililitros de sangre) y, despus de pruebas iniciales en ratones, estas
clulas se inyectaron de nuevo a la mdula sea del donante. Se observ que se
comportaban igual que glbulos rojos normales, de modo que esta tcnica parece

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prometedora, a pesar de que el reto se mantiene en magnificar el proceso para obtener
grandes cantidades. (Emma, 2014)
Sangre artificial obtenida a travs de la hemeritrina de gusanos marinos Anlidos
poliquetos.
Cientficos de la Universidad Babe-Bolyai, en Rumania, desarrollaron un compuesto
muy similar a la sangre. El doctor Radu Silaghi-Dumitrescu, lder de esta investigacin,
menciona que est fabricado a partir de albmina (principal protena de la sangre, que
se sintetiza en el hgado), agua, sal y una protena obtenida de gusanos marinos. Hasta
el momento, han sido muchos los intentos por crear sangre artificial; sin embargo, no se
haba logrado que las sustancias obtenidas resistieran el estrs mecnico y qumico. La
sangre est compuesta por hemoglobina, que se encarga de transportar oxgeno
obtenido de los rganos respiratorios a los tejidos, en este caso, el fluido artificial
creado por el equipo rumano, contiene hemeritrina, una protena que ha mostrado ser
sumamente resistente a varios tipos de estrs. En su laboratorio, el doctor Silaghi-
Dumitrescu transfiri la sangre desarrollada a ratones sin que stos presentaran alguna
enfermedad o efecto adverso; el siguiente paso es que dicho compuesto trabaje por
horas en el cuerpo de los roedores. El doctor Silaghi-Dumitrescu sigue trabajando para
lograr un fluido estril, que no conlleve riesgos de infeccin durante la transfusin, ni
requiera tanta refrigeracin, a fin de que pueda ser aplicada en humanos de manera
instantnea, en situaciones de emergencia. (Martnez, 2013)
Hemeritrina.
Es una protena que se encuentra en los glbulos sanguneos de algunos anlidos y de
unos pocos braquipodos. La protena hemeritrina es responsable del enlace y
transporte de O
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en algunos invertebrados. A pesar de su nombre, no contienen grupos
hemos. (J.C., 2014)
El trabajo hecho por los investigadores rusos se hizo con anlidos poliquetos, los
poliquetos constituyen el grupo ms numeroso de anlidos, estos son de vida marina,
habitando en las zonas litorales y nerticas, estos gusanos son difciles de hallar y no en
toda regin abundan, nosotros usaremos el gusano marino llamado Sipunclido nudus,

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el cual contiene igual la protena hemeritrina. (Dimitrescu, Ferric carboxymaltose
improves exercise capacity and quality of life in patients with pulmonary arterial
hypertension and iron deficiency: A pilot study., 2014)

Anlidos Poliquetos.
Son los gusanos anillados, pues su cuerpo est formado por una serie de anillos o met
meros de anatoma muy parecida. (Tirsoferrol)
Podemos definir a los anlidos como mazoos triblsticos con simetra bilateral, esquizo
celomados y protstomos.
El mayor avance del filo esta representado por la metamera.La cavidad celmica alcan
za un alto grado de desarrollo.
La regin ceflica se especializa con rganos diferenciados, tales como tentculos,
palpos y ojos rudimentarios de los poliquetos.
El sistema nervioso est formado por ganglios cerebroideos, dos cordones que no
recorren el cuerpo y ganglios con sus ramas laterales.
Las tres grandes clases del filo de los Anlidos son:
Clase Poliquetos (unas 5.300 especies), Son gusanos con cerdas, sobre todo
marinos y a menudo luminiscentes
Clase Oligoquetos (unas 3.100 especies), que son, sobre todo, terrestres o viven
en el suelo, como la lombriz de tierra;
Clase Hirudneos (unas 300 especies), Son las sanguijuelas, en su mayora, de
agua dulce pero tambin pueden ser marinas o terrestres. (Tirsoferrol)




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Poliquetos.
El cuerpo es alargado y seccin redondeada, con la boca en un extremo y el ano
en el otro, presenta simetra bilateral. Est compuesto por varias unidades
similares, o segmentos, separados externamente por surcos y en su interior por
tabiques.
Los segmentos suelen tener unos lbulos (parpodos) con cerdas que
pertenecen al sistema de locomocin. (Garza, 2013)
El sistema digestivo est formado por un tubo recto y el sistema nervioso tiene
rganos sensoriales poco desarrollados.
Los poliquetos crecen por adicin de segmentos al cuerpo en el extremo
posterior, algunos son depredadores activos. Tienen un modo de vida sedentario
y extraen partculas de agua o depsitos en el fondo.
Aparato circulatorio debido a que no hay continuidad entre las cavidades
celmicas el sistema no puede ser abierto, sino que ha de ser cerrado.
Est constituido por dos grandes vasos: ventral y dorsal. La hemolinfa circula de
la parte posterior hacia delante en el vaso dorsal, y al contrario en el vaso ventral
En la superficie de las branquias se realiza el intercambio de gases, ya que
estas estn muy irrigadas. En ocasiones tambin se puede realizar a travs del
cuerpo.
La fecundacin es externa presenta una larva trocfora similar a la de los
moluscos
(Garza, 2013)
Sipunclidos
Los Sipunculus o sipunclido son un filo de animales protstomos celomados, marinos
y con el cuerpo no segmentado. Se conocen entre 144 y 320 especies. Se les
denomina gusanos cacahuate.
Normalmente no sobrepasan los 10 cm de largo. Su caracterstica ms destacable es
su boca, rodeada por un anillo de tentculos retrctiles. El tracto digestivo, en forma de
U helicoidal, pasa de la cavidad oral a la parte posterior del cuerpo para luego remontar

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y acabar en un ano en el costado del animal; algunos grupos poseen una estructura
calcificada anal (y una porcin calcificada posterior. (Adina, 2013)
Presentan celoma, pero no aparato circulatorio, aprovechan los fluidos intersticiales
para el transporte de oxgeno y nutrientes. El celoma est separado en dos porciones
por un saco de compensacin; se distingue un celoma del introverto y otro del cuerpo.
El exterior del cuerpo est muy muscularizado y les permite encogerse hasta parecer
un cacahuate. (Dumitrescu, 2013)
















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Objetivos generales:
Purificacin de la protena hemeritrina a partir del gusano marino de la especie
Sipunculus nudus para su uso en la preparacin de sangre artificial.
Objetivos particulares:
Bsqueda de secuencias homologas de la protena hemeritrina.
Secuenciar la protena.
Obtener la secuencia nucleotidica y el marco de lectura completo.
Expresin de la protena con plsmidos de expresin
Produccin de la protena.
Preparacin de la sangre artificial.













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Metodologa
Nos daremos a la tarea de buscar en bases de datos secuencias tanto del genoma
completo como del mRNA, esto nos ayudar a conocer la secuencia de nucletidos del
cual est compuesta la protena y poder obtener el marco de lectura completo.
Reiteramos la utilizacin de base de datos para encontrar el marco de lectura en la
secuencia de ADN, este nos da la traduccin de la protena correspondiente y a la vez
nos dar instrucciones para hacer una protena completa.
(NCBI National Center for Biotechnology Information)
Ya teniendo la secuencia de nucletidos sta ser insertada en un vector o vehculo de
clonacin, el cual consiste en una molcula de ADN capaz de replicarse de forma
autnoma. Entre los vectores ms utilizados se encuentran los plsmidos ya que estos
pueden replicarse independientemente del cromosoma principal. Los ms comunes son
E.Colli y Saccharomyces Cerevisiae.
(LA GUA)
Queremos mencionar que para nuestro sistema se utilizar Saccharomyces Cerevisiae,
dado que es una levadura eucarionte y nuestra protena proviene de un organismo
eucarionte.
Dependiendo de su origen, las levaduras son ricas en protena y vitaminas (Martnez et
al., 2001), adems poseen la propiedad de no ser txicas, presentan alta digestibilidad,
elevado contenido en protenas, grasas, carbohidratos.
Las clulas de la levadura se multiplican rpidamente por gemacin, una forma
asimtrica de reproduccin asexual: a partir de una clula se origina una protuberancia
que va creciendo y acaba dando lugar a otra clula, ms pequea (al principio) que la
clula inicial y diferenciada genticamente de la clula original. En condiciones ptimas,

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este tipo de reproduccin dura unas dos horas y permite la colonizacin total de los
mostos en cuestin de horas o das. El rpido crecimiento ha sido clave a la hora de
elegir esta levadura como herramienta para la investigacin y las aplicaciones
biotecnolgicas.
(Consejo Superior de Investigaciones Cientifcas (CSIC))
Una vez que obtengamos la secuencia nucleotdica de la hemeritrina, procederemos a
aislar el ARNm (ARN mensajero) el cual codifica a la protena de inters, esto lo
haremos con el propsito de obtener una copia del ADN de la protena mediante la
transcriptasa reversa, sta copia llamada ADNc (ADN complementario), no presentar
intrones, lo cual permitir que la protena se exprese correctamente dentro de un
husped que ser nuestro vector de expresin el ADNc en la clula de levadura para su
replicacin, ste husped eucaritico no distinguir entre el ADN extrao y el propio, y
la maquinaria celular continuar el programa gentico de replicacin, transcripcin y
traduccin de los genes que se han introducido.
(LA GUA)
(Manipulacin de la expresin)
Separacin o recuperacin de las protenas
El siguiente paso se llevara a cabo por medio de la purificacin de las protenas, el cual
depende de la localizacin de la Protena, la cual tambin proporciona ciertas ventajas
segn cada caso.
Si la protena se acumula en el citoplasma, el primer paso es la ruptura celular, por
medios mecnicos o qumicos.
La acumulacin en el citoplasma lleva a la acumulacin de cuerpos de inclusin, lo que
depende de factores como la secuencia de la protena, la fuerza del promotor, la
temperatura, velocidad de crecimiento, etc. Los cuerpos de inclusin pueden tener
agregadas grandes cantidades de contaminantes como ADN, ARN y chaperonas, por

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mencionar haciendo que la proporcin de protenas en el cuerpo de inclusin llegue a
ser baja .Si las protenas son acumuladas en el espacio periplsmico, la aplicacin de
un choque osmtico permite la extraccin de la protena a la vez que causa muy poco
dao a las clulas.
La recuperacin de la protena puede llevarse a cabo empleando filtros de diversos
tamaos y con superficie cargada. Los cidos nucleicos pueden ser removidos
mediante extracciones o bien agregando agentes policatinicos como la polietinilamina.
La protena puede ser capturada o precipitada selectivamente empleando una variedad
de materiales que han sido desarrollados para este propsito, como algunas resinas de
interaccin hidrofbica (Kato y col, 2004).
(Lara, 2011)
Cuando ya se tenga la protena purificada, se dispone a preparar la sangre artificial,
esta mezcla estar compuesta por agua, sales, la protena hemeritrina y albmina
como agente contra los factores de estrs. (Tu discovery)









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Bibliografa

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