Anda di halaman 1dari 51

1

I. PENDAHULUAN
A. Latar Belakang
Bioteknologi di bidang pertanian telah berkembang pesat, salah satu
contohnya adalah kultur jaringan. Kultur jaringan tanaman merupakan
teknik menumbuh kembangkan bagian tanaman, baik berupa sel, jaringan atau organ
tanaman dalam kondisi aseptis secara in vitro. Ciri teknik ini adalah kondisi kultur
yang aseptis, penggunaan media kultur buatan dengan kandungan nutrisi lengkap, dan
kondisi lingkungan kultur yang sesuai. Lingkungan yang sesuai dapat dipenuhi
dengan menentukan media tumbuh yang sesuai dan penempatan pada kondisi yang
terkendali berkaitan dengan intensitas dan periodisitas, cahaya, temperatur, dan
kelembaban serta keharusan sterilisasi.
Kultur jaringan merupakan suatu metode untuk mengisolasi bagian dari
tanaman seperti protoplasma, sel, sekelompok sel, jaringan maupun organ , serta
menumbuhkannya dalam keadaan aseptik, sehingga bagian-bagian tersebut dapat
memperbanyak diri dan beregenerasi menjadi tanaman utuh kembali (Sany, 2007).
Konsep awal dari kultur jarngan adalah diketahuinya kemempuan totipotensi dari sel
tumbuhan. Totipotensi sel (Total Genetic Potential), artinya setiap sel memiliki
potensi genetik seperti zigot yaitu mampu memperbanyak diri dan berediferensiasi
menjadi tanaman lengkap.
Sterilisasi adalah bahwa segala kegiatan dalam kultur jaringan harus
dilakukan ditempat yang steril, yaitu di laminar flow dan menggunakan alat-alat yang
juga steril. Seperti disebutkan sebelumnya bahwa kondisi yang aseptic merupakan
syarat yang mutlak dalam tahapan perbanyakan tanaman secara kultur jaringan.
Lingkungan aseptic sebagai salah satu syarat utama suksesnya kegiatan kultur
jaringan perlu diterapkan dengan sungguh-sungguh. Untuk itu perlu adanya usaha
sterilisasi peralatan yang akan digunakan dalam proses kultur.
2

Tidak hanya terbatas pada peralatan, namun ruangan yang akan digunakan
pun harus dalam kondisi aseptic. Tujuan utama dari sterilisasi ruangan maupun
peralatan kultur pada dasarnya untuk menghindari kontaminasi oleh mikro organisme
yang ada di peralatan maupun di udara bebas sekitar ruangan. Perlakuan tersebut
mutlak dilakukan terutama pada ruang penabur atau tempat yang digunakan untuk
penanaman eksplan.
B. Tujuan
Tujuan dari acara ini adalah untuk meningkatkan ketrampilan mahasiswa
dalam melakukan sterilisasi peralatan dengan menggunakan autoklaf.











3

II. TINJAUAN PRAKTIKUM
Sterilisasi merupakan suatu proses untuk mematikan semua organisme yang
terdapat pada atau di dalam suatu benda. Sterilisasi basah dapat digunakan
untuk mensterilkan bahan apa saja yang dapat tembus uap air dan tidak rusak bila
dipanaskan dengan suhu yang berkisar antara 110-121. Sterilisasi yang umum
dilakukan dapat berupa:
a. Sterilisasi secara fisik (pemanasan, penggunaan sinar gelombang pendek yang
dapat dilakukan selama senyawa kimia yang akan disterilkan tidak akan berubah
atau terurai akibat temperatur atau tekanan tinggi). Dengan udara panas,
dipergunakan alat bejana/ruang panas (oven dengan temperatur 170 180 dan
waktu yang digunakan adalah 2 jam yang umumnya untuk peralatan gelas).
b. Sterilisasi secara kimia (misalnya dengan penggunaan disinfektan, larutan
alkohol,larutan formalin).
c. Sterilisasi secara mekanik, digunakan untuk beberapa bahan yang akibat
pemanasan tinggi atau tekanan tinggi akan mengalami perubahan, misalnya adalah
dengan saringan/filter. Sistem kerja filter, seperti pada saringan lain adalah
melakukan seleksi terhadap partikel-partikel yang lewat (dalam hal ini adalah
mikroba).
Sterilisasi dengan autoklaf adalah salah satu metode sterilisasi dengan uap
air di bawah tekanan. Kapas penyumbat, kasa, perlatan laboratorium, plastik
penutup, peralatan gelas, penyaring, air, dan media nutrisi dapat disterilisasi dengan
autoklaf. Hampir semua mikroba mati bila terkena uap yang sangat panas dari
autoklaf selama 10-15 menit/ semua obyek hendaknya disterilisasi pada suhu 121C
dan tekanan 15 Psiselama 15-20 menit. (Torres, 1989).
Sebagai syarat mutlak suksesnya kultur jaringan tanaman, biasanya sterilisasi
dilakukan dengan menggunakan autoklaf. Bahkan autoklaf juga dapat digunakan
4

untuk sterilisasi media tumbuh kultur jaringan. Tipe autoklaf yang dapat
digunakan untuk sterilisasi sangatlah beragam macamnya, mulai dari yang sederhana
sampai digital (terprogram) (Gunawan, 1988).
Autoklaf yang sederhana menggunakan sumber uap dari pemanasan air yang
ditambahkan ke dalam autoklaf. Pemanasan air dapat menggunakan kompor atau api
Bunsen. Dengan autoklaf sederhana ini, tekanan dan temperatur diatur dengan jumlah
panas dari api. Kelemahan dari autoklaf ini adalah bahwa perlu adanya penjagaan dan
pengaturan panas secara manual dan terkontrol, selama masa sterilisasi dilakukan.
Tetapi autoklaf ini mempunyai keuntungan, yaitu: lebih sederhana sederhana, harga
relatif murah, tidak tergantung dari aliran listrik yang sering merupakan problema
untuk negara-negara yang sedang berkembang, serta lebih cepat dari autoklaf listrik
yang seukuran dan setaraf.
Autoklaf yang lebih komplit menggunakan sumber energi dari listrik. Alatnya
dilengkapi dengan timer dan thermostat. Bila pengatur automatis ini berjalan dengan
baik. Maka autoklaf dapat dijalankan sambil mengerjakan pekerjaan lain.
Kelemahannya adalah bila salah satu pengatur tidak bekerja, maka pekerjaan
persiapan media menjadi sia-sia dan kemungkinan menyebabkan kerusakkan total
pada autoklaf. Sebagai sumber uap, juga berasal dari air yang ditambahkan ke dalam
autoklaf dan didihkan.
Biasanya untuk laboratorium komersial, menurut Gunawan (1988), diperlukan
autoklaf dengan kapasitas besar dan sumber uap biasanya dari boiler yang terpisah.
Autoklaf ini sangat cepat dan dapat diprogam waktu sterilisasi serta waktu
pendinginan. Setelah sterilisasi bahan atau alat selesai, temperatur dan tekanan
autoklaf diturunkan secara perlahan-lahan dalam waktu 15-20 menit. Pada autoklaf
yang programmable (memiliki program yang dapat diatur), panas ini diatur secara
atomatis. Tetapi pada autoklaf yang sederhana hal ini harus diatur secara manual.

5

III. MATERI PRAKTIKUM

A. Alat dan Bahan
Bahan dan peralatan yang digunakan pada acara praktikum ini antara
lain autoklaf, kompor serta gas, peralatan kaca/Glass ware (seperti botol
kultur, Erlenmeyer, petridish, gelas piala), peralatan penanaman /Dissecting
kit (seperti pinset, scalpel), aluminium foil, kertas paying, karet gelang, kertas
merang, kertas pembungkus, plastic seal.
B. Prosedur Kerja
1. Glass ware dan dissesting kit dicuci bersih dengan sabun, dibilas dengan air
lalu dikeringkan. Setel;ah kering mulut botol ditutup dengan aluminium foil
dan dieratkan dengan plastic seal (segel plastik). Pinset dan scalpel dibungkus
dengan kertas aluminium foil.
2. Glass ware dan dissesting kit disterilisasi dengan autoklaf pada suhu 120
o
C
pada tekanan 17,5 psi selama 30 menit.
3. Selama proses sterilisasi berlangsung, autoklaf ditutup rapat sehingga tekanan
didalam autoklaf naik. Tekanan tinggi tersebut dipertahankan selama 30 menit
dengan mengecilkan api, dilakukan selama tiga kali.
4. Kompor dimatikan setelah proses sterilisasi selesai katup dibuka untuk
membuang uap air hingga tekanan 0 psi.
5. Autoklaf dibuka dan peralatan yang disterilisasi diambil.
6. Peralatan disimpan di tempat yang bersih.


6

IV. HASIL DAN PEMBAHASAN

A. Hasil
No. Nama Alat Gambar Keterangan
1 Autoclave

Alat sterilisasi
peralatan dan media
kultur jaringan
2 Timbangan
Analitik

Untuk menimbang
bahan dalam
pembuatan media
kultur jaringan
3 pH Meter

Untuk mengukur
pH media kultur
jaringan
4 Magnetik Stirer

Untuk mengaduk
larutan dan
memanaskan
larutan
5 Botol Kultur

Untuk tempat
menanam eksplan
7

6 LAF

Untuk tempat
penanaman eksplan
7 Gelas ukur

Untuk mengukur
suatu larutan
8 Erlenmeyer

Untuk menampung
larutan
9 Seal

Untuk merekatkan
alumunium foil
pada botol kultur
10 Pipet

Untuk
memindahkan
larutan
11 Suntikan

Untuk
memindahkan
larutan dengan
skala yang kecil
dan terukur
8

12 Pembakar Bunsen

Untuk sterilisasi
eksplan dan alat
13 Petridish

Untuk meletakan
eksplan yang akar
di kultur
14 Pinset

Untuk mengambil
eksplan
15 Pengaduk Kaca

Untuk mengaduk
larutan dalam
pembuatan media
kultur
16 Sarung Tangan
(Gloves)

Untuk melindungi
tangan dari panas
17 Karet Gelang

Unttuk mengikat
alat-alat yang akan
disterilkan
9

18 Aluminium foil

Untuk menutup
botol kultur
19 Beker Glass

Untuk tempat
membuat
media/tempat
melarutkan larutan
20 Kertas Payung

Untuk
membungkus alat-
alat yang akan di
sterilisasi

B. Pembahasan
Sterilisasi adalah bahwa segala kegiatan dalam kultur jaringan harus
dilakukan ditempat yang steril, yaitu di laminar flow dan menggunakan alat-alat yang
juga steril. Seperti disebutkan sebelumnya bahwa kondisi yang aseptic merupakan
syarat yang mutlak dalam tahapan perbanyakan tanaman secara kultur jaringan.
Lingkungan aseptic sebagai salah satu syarat utama suksesnya kegiatan kultur
jaringan perlu diterapkan dengan sungguh-sungguh. Untuk itu perlu adanya usaha
sterilisasi peralatan yang akan digunakan dalam proses kultur.
Autoclave adalah alat yang digunakan untuk sterilisasi media mikrobiologi,
peralatan gelas laboratorium dan dekontaminasi atau membunuh bakteri. Pada
prinsipnya, sterilisasi autoclave menggunakan panas dan tekanan dari uap air.
Temperature sterilasi biasanya 1210C, tekanan yang biasa digunakan antara 15-17,5
psi (pound per square inci) atau 1 atm. Lamanya sterilisasi tergantung dari volume
10

dan jenis. Alat-alat dan air disterilkan selama 1 jam, tetapi media antara 20-40 menit
tergantung dari volume bahan yang disterilkan.
Prinsip kerja autocalve:
o Proses Sterilisasi pada Autoclave adalah memanfaatkan panas dan tekanan
uap dalam chamber.
o Panas dan tekanan tersebut dihasilkan oleh pemanasan elemen di dalam
chamber yang dikondisikan menjadi hampa udara.
o semakin besar setting waktu dan suhu yang digunakan maka semakin besar
tekanan yang dihasilkan dalam chamber sehingga proses sterilisasi akan lebih
cepat selesai.
o Tetapi dalam proses sterilisasi sudah ditentukan besarnya suhu dan lamanya
waktu sterilisasi, tergantung pada hasil kualifikasi nya dan dari setiap bahan /
alat yang akan disterilkan.
Adapun cara kerja yang baik dalam menggunakan autocalve antara lain,
sebagai berikut :
o Sebelum melakukan sterilisasi cek dahulu banyaknya air dalam autoklaf. Jika
air kurang dari batas yang ditentukan, maka dapat ditambah air sampai batas
tersebut. Gunakan air hasil destilasi, untuk menghindari terbentuknya
kerak dan karat.
o Masukkan peralatan dan bahan. Jika mensterilisasi botol bertutup ulir, maka
tutup harus dikendorkan.
o Tutup autoklaf dengan rapat lalu kencangkan baut pengaman agar tidak ada
uap yang keluar dari bibir autoklaf. Klep pengaman jangan dikencangkan
terlebih dahulu.
o Nyalakan autoklaf, diatur timer dengan waktu minimal 15 menit pada suhu
121oC.
11

o Tunggu sampai air mendidih sehingga uapnya memenuhi kompartemen
autoklaf dan terdesak keluar dari klep pengaman. Kemudian klep pengaman
ditutup (dikencangkan) dan tunggu sampai selesai. Penghitungan waktu
15dimulai sejak tekanan mencapai 2 atm.
o Jika alarm tanda selesai berbunyi, maka tunggu tekanan dalam kompartemen
turun hingga sama dengan tekanan udara di lingkungan (jarum pada preisure
gauge menunjuk ke angka nol). Kemudian klep-klep pengaman dibuka dan
keluarkan isi autoklaf dengan hati-hati.
Bagian-bagian autoklaf :
1. Panci luar.
2. Panci dalam tempat meletakkan botol dengan alur tempat saluran uap.
3. Tutup beserta penunjuk tekanan dan saluran uap.
4. Katup pengeluaran uap.
5. Pengunci atau klem.
Komponen-komponen utama autoclave :
1. Pressure Gauge (Pengukur Tekanan Gas/Uap) ; tekanan yang disarankan
1,05-1,2 kg/cm
2

2. Thermometer (Pengukur Suhu) ; suhu yang disarankan 121
o
-125
o
C
3. Exhaust Valve
a. Saat sterilisasi dimulai, valve dinuka sampai ada uap air yang keluar dan
menetes kemudian valve ditutup, tujuannya untuk kesempurnaan
sterilisasi (pada saat velve dibuka gas/udara yang tidak steril keluar)
b. Setelah sterilisasi selesai (tekanan menunjukan angka 0), valve dibuka
kembali untuk mengeluarkan gas/uap yang tersisa
4. Automatic Pressure Regulating Valve (Sefety Valve) ; menjaga tekanan
uap/gas tetap pada tekanan yang disarankan
12

Alat-alat logam dan gelas yang digunakan pada saat penanaman dapat
disterilkan dalam autoklaf. Alat tanam seperti: pinset dan gunting dapat juga
disterilkan dengan pembakaran atau dengan pemanasan dalam bacticinerator ataupun
pembakar bunsen.
Menurut Anonim (2009), khusus untuk skalpel, gagangnya dapat disterilkan
dengan pemanasan, namun mata pisaunya (blade) dapat menjadi tumpul bila
dipanaskan dalam temperature tinggi. Oleh karena itu untuk mata pisaunya
dianjurkan cara sterilisasi dengan pencelupan dalam alkohol atau larutan kaporit.
Sebelum dimasukkan petridish, pisau scalpel , pinset, dan alat-alat yang lain
(alat-alat logam dan gelas) terlebih dahulu dibungkus dengan kertas agar tidak kontak
langsung dengan uap air autocalve. Petridish akan mudah rusak (pecah) jika
mengalami kontak langsung dengan uap air yang panas. Sedangkan alat-alat seperti
pisau scalpel dan pinset akan mudah berkarat jika berkontak langsung dengan uap air.
Bagian yang ada tulisan dari kertas pembungkus harus diletakkan di bagian luar agar
tinta yang larut nanti tidak mengotori alat yang ada di dalamnya.
Peralatan Kultur Jaringan
o Cawan petri: Cawan petri berfungsi untuk membiakkan (kultivasi)
mikroorganisme. Medium dapat dituang ke cawan bagian bawah dan cawan
bagian atas sebagai penutup. Cawan petri tersedia dalam berbagai macam ukuran,
diameter cawanyang biasa berdiameter 15 cm dapat menampung media sebanyak
15-20 ml,sedangkan cawan berdiameter 9 cm kira-kira cukup diisi media
sebanyak 10 ml.
o Botol kultur: Umumnya botol-botol kultur terbuat dari bahan yang tahan panas. Syarat
botol kultur adalah dasarnya lebar dan mulutnya kecil, karena mulut botol yang lebar
memungkinkan kontaminasi yang lebih besar. Sama seperti glassware yang lain
sterilisasi botol kultur dengan autoclave tetapi sebelumnya dicuci bersih dengan deterjen
dan dikeringkan. Ketika dimasukkan ke dalam autoclave mulut botol kultur ditutup
dengan plastik dan diikat dengan karet gelang.
13

o Alumunium foil: adalah Alumunium foil lembaran aluminium tipis yang dapat
dipakai untuk berbagai macam aplikasi memasak ataupun lainnya. Salah satu
keuntungan dari menggunakan aluminium foil adalah karena sifatnya yang dapat
digunakan kembali hingga beberapa kali. Di dalam kultur jaringan aluminium foil
berfungsi untuk menutup botol kultur.
o Seal : Seal digunakan untuk menutup botol kultur atau botol ukur. Tujuannya
adalah untuk meminimalisir masuknya kontaminan ke dalam botol kultur atau
bisa juga untuk mencegah bahan-bahan atau larutan dalam botol tumpah.
o Kertas payung: Kertas ini digunakan untuk membungkus alat alat kultur dan
petridish sebelum disterillisasikan.
o Karet gelang: Karet gelang digunakan sebagai pengikat penutup botol yakni
plastik atau juga untuk mengikat kertas pembungkus petridish dan dissecting kit
selama proses sterilisasi dengan autoclave.
o Suntikan: Jarum injeksi digunakan untuk mengambil larutan stok dalam
pembuatan media atau untuk memasukkan larutan (enzim) dalam pekerjaan
isolasi protoplas ataupun untuk keperluan lain. Jarum injeksi ada dua macam
yaitu yang terbuat dari plastik dan yang terbuat dari kaca. Jarum injeksi ada yang
dapat disterilisasi dengan autoclave ada juga yang dengan mengganti jarum
suntiknya.
o Scalpel: scalpel atau pisau dalam kultur jaringan digunakan untuk mengiris atau
memotong eksplan. Scalpel ada dua macam yaitu scalpel biasa yang dapat dipakai
seterusnya (selalu disterilkan dengan autoclave) dan scalpel blits. Scalpel jenis
blits mata pisaunya dapat dipasang menurut ukuran yang dikehendaki.
Tangkainya dapat disterilkan dengan autoclave sedangkan mata pisaunya hanya
sekali dipakai. Scalpel blits digunakan untuk mengiris bahan isolasi protoplas
karena membutuhkan irisan yang sangat tipis (Daisy dan Ari, 2002).
o pH meter: pH meter yang dipakai pada praktikum kali ini menggunakan pH
meter otomatis. Pengukuran pH media, ujung sensor dimasukkan ke dalam
larutan media, pada monitor akan muncul nilai pH media. Tinggal kita tambahkan
NaOH jika terlalu asam dan HCl jika terlalu basa.
14

o Gelas ukur: Berguna untuk mengukur volume suatu cairan, seperti labu
erlenmeyer, gelas ukur memiliki beberapa pilihan berdasarkan skala volumenya.
Pada saat mengukur volume larutan, sebaiknya volume tersebut ditentukan
berdasarkan meniskus cekung larutan.
o Erlenmeyer : Alat ini digunakan dalam kultur jaringan tanaman sebagai sarana
menuangkan air suling maupun untuk tempat media dan penanaman eksplan.
o Laminar Air Flow Cabinet (LAFC): Alat ini letaknya di ruang penabur, yaitu
ruang yang selalu harus dalam keadaan steril. Alat ini digunakan sebagai tahap
perlakuan penanaman.
o Shaker (penggojok) : Merupakan alat penggojok yang putarannya dapat diatur
menurut kemauan kita.
o Sarung tangan: Sarung tangan adalah sejenis pakaian yang menutupi tangan,
baik secara sebagian ataupun secara keseluruhan. Fungsi sarung tangan ialah
untuk melindungi sang pemakai dari pengaruh lingkungan sekitarnya atau
melindungi lingkungan sekitar dari tangan sang pemakai.
o Timbangan Analitik : jenis alat ini bermacam-macam, tetapi yang penting adalah
timbangan yang dapat dipergunakan untuk menimbang sampai satuan yang sangat
keil. Alat ini berfungsi sebagai alat untuk menimbang bahan-bahan kimia yang
digunakan untuk kultur jaringan.
o Stirer : Alat ini berfungsi untuk menggojok dengan pemanas. Dengan
menggunakan listrik, alat ini berfungsi sebagai kompor di samping sebagai
penggojok.
o Pembakar spiritus: Salah satu alat yang berfungsi untuk menciptakan kondisi
yang steril adalah pembakar spiritus. Api yang menyala dapat membuat aliran
udara karena oksigen dikonsumsi dari bawah dan diharapkan kontaminan ikut
terbakar dalam pola aliran udara tersebut. Untuk sterilisasi jarum ose atau yang
lain, bagian api yang paling cocok untuk memijarkannya adalah bagian api yang
berwarna biru (paling panas). Perubahan bunsen dapat menggunakan bahan bakar
gas atau metanol.
15

o Tabung Reaksi: Di dalam mikrobiologi, tabung reaksi digunakan untuk uji-uji
biokimiawi dan menumbuhkan mikroba. Tabung reaksi dapat diisi media padat
maupun cair. Tutup tabung reaksi dapat berupa kapas, tutup metal, tutup plastik
atau aluminium foil. Media padat yang dimasukkan ke tabung reaksi dapat diatur
menjadi 2 bentuk menurut fungsinya, yaitu media agar tegak ( deep tube agar )
dan agar miring(slants agar ). Untuk membuat agar miring, perlu diperhatikan
tentang kemiringan media yaitu luas permukaan yang kontak dengan udara tidak
terlalu sempit atau tidak terlalu lebar dan hindari jarak media yang terlalu dekat
dengan mulut tabung karena memperbesar resiko kontaminasi. Untuk alas an
efisiensi, media yang ditambahkan berkisar 10-12 ml tiap tabung.
o Pipet Tetes: Fungsinya sama dengan pipet ukur yaitu digunakan untuk
memindahkan suatu cairan atau larutan, namun volume yang dipindahkan tidak
diketahui. Salah satu penerapannya adalah dalam menambahkan HCl / NaOH
saat mengatur pH media, penambahan reagen ada uji biokimia, dll.
o Autoclave: Autoclave adalah alat untuk mensterilkan berbagai macam alat dan
bahan yang digunakan dalam mikrobiologi menggunakan uap air
panas bertekanan. Tekanan yang digunakan pada umumnya 15 psi atau sekitar 2
atm dandengan suhu 121oC (250oF). Jadi tekanan yang bekerja ke seluruh
permukaan benda adalah 15 pon tiap inchi 2(15 psi = 15 pounds per square inch).
Lama sterilisasi yang dilakukan biasanya 15 menit untuk 121oC.
1. Botol bersih diberi beberapa tetes aquadest dan tutup dengan kertas atau
aluminium foil (jangan terlalu kencang bila menggunakan aluminium foil).
Untuk botol-botol yang mempunyai tutup yang autoclave, jangan tutup terlalu
kencang, karena selama pemanasan terjadi pemuaian.
2. Alat-alat yang perlu disterilkan sebelum penanaman adalah: pinset, gunting,
gagang skalpel, kertas saring, petri-dish, botol-botol kosong, jarum dan pipet.
3. Alat-alat dan kertas saring dibungkus rapi dengan kertas tebal atau ditaruh
dalam baki stainless steel dan bakinya dibungkus dengan kain tebal sebelum
16

dimasukkan dalam autoklaf. Alumunium foil tidak direkomendasikan sebagai
pembungkus, karena uap tidak dapat masuk ke dalam bungkusan. Alat-alat
sektio seperti pinset, gunting, gagang skalpel, dan jarum, dibungkus dengan
kertas kopi atau kertas merang. Hindarkan penggunaan Al-foil karena uap
sukar masuk kedalam bungkusan sehingga sterilisasi kurang efektif.
4. Petri-dish akan disterilkan, juga dibungkus dengan kertas kopi atau kertas
merang.
5. Temperatur yang digunakan untuk sterilisasi botol kultur kosong dan alat-alat
yang akan digunakan untuk menanam eksplan, adalah 121 pada tekanan 15
psi (pound per square inch) atau 1 atm selama 30-60 menit. Penghitungan
waktu sterilisasi dimulai setelah tekanan dan temperatur yang diinginkan
tercapai.
Pada prinsipnya, sterilisasi autoclave menggunakan panas dan tekanan dari
uap air. Temperature sterilasi biasanya 121, tekanan yang biasa digunakan antara
15-17,5 psi( pound per square inci) atau 1 atm. Lamanya sterilisasi tergantung dari
volume dan jenis. Alat-alat dan air disterilkan selama 1 jam, tetapi media antara 20-
40 menit tergantung dari volume bahan yang disterilkan. Sterilisasi media yang
terlalu lama menyebabkan :
1. Penguraian gula.
2. Degradasi vitamin dan asam-asam amino.
3. Inaktifasi sitokinin zeatin riboside.
4. Perubahan pH yang berakibatkan depolimerisasi agar.
( Lydiane Kyte & John Kleyn. 1996 : 169).

17

Suhu sterilisasi yang disarankan adalah 121C, hal ini dikarenakan suhu
tersebut merupakan suhu kritis, dimana seluruh bentuk kontaminan tidak dapat
bertahan hidup/mati. Sedangkan khusus untuk lama sterilisasi sifatnya disesuaikan
dengan volume media yang disterilisasi dan besarnya suhu yang diinginkan,
Semakin banyak volume media maka semakin lama masa sterilisasinya. Biasanya
untuk lama sterilisasi 20 menit, volume media yang digunakan berkisar 20-30
ml/botol atau 70-100ml/cup plastik atau 1 liter botol Schoolt atau 4 liter botol
Erlenmeyer.












V. SIMPULAN DAN SARAN
18


A. SIMPULAN
Berdasarkan data hasil pengamatan, maka dapat ditarik kesimpulan bahwa
sterilisasi peralatan kultur dilakukan sebagai salah satu syarat utama
suksesnya kegiatan kultur jaringan yang perlu diterapkan dengan sungguh-
sungguh, salah satunya dengan menggunakan autoclave pada suhu 121
0
C
pada tekanan 15-17,5 psi. selama 30 menit. Beberapa peralatan yang di
sterilisasi menggunakan autoklaf antara lain botol kultur, petridish,
Erlenmeyer, aluminium foil, scalpel, dan pinset.
Bagian-bagian autoklaf :
1. Panci luar.
2. Panci dalam tempat meletakkan botol dengan alur tempat saluran uap.
3. Tutup beserta penunjuk tekanan dan saluran uap.
4. Katup pengeluaran uap.
5. Pengunci atau klem.
Alat-alat logam dan gelas yang digunakan pada saat penanaman dapat
disterilkan dalam autoklaf. Alat tanam seperti: pinset dan gunting dapat juga
disterilkan dengan pembakaran atau dengan pemanasan dalam bacticinerator
ataupun pembakar bunsen. Khusus untuk skalpel, gagangnya dapat disterilkan
dengan pemanasan, namun mata pisaunya (blade) dapat menjadi tumpul bila
dipanaskan dalam temperature tinggi. Oleh karena itu untuk mata pisaunya
dianjurkan cara sterilisasi dengan pencelupan dalam alkohol atau larutan
kaporit.
B. SARAN
Sterilisasi alat harus dilakukan sesuai prosedur dan teliti agar tidak terjadi
kontaminasi

19

I. PENDAHULUAN

A. Latar Belakang
Kultur jaringan tanaman merupakan bagian suatu teknik perbanyakan
vegetatif nonkonvensional. Perbedaan teknik ini dibandingkan dengan teknik
perbanyakan vegetative konvensional biasanya terletak dalam situasi dan lokasi yang
berbeda. Penerapan teknikkultur jaringan tanaman mensyaratkan kondisi di dalam
ruangan (laboratorium) dan sifatnyaaseptik (steril dari patogen). Bermuara dalam
kondisi yang aseptic, maka perlu dijelaskan bahwa segala aktifitas yang berkaitan
dengan jaringan harus dalam kondisi aseptik. Kondisi ini dimulai dari cara:
1. Penyiapan peralatan (alat tanam berbahan logam ataupun gelas).
2. Pembuatan media penanaman.
3. Penanaman (inisiasi dan pemilihan: a. perbanyakan; b.perakaran).
Selain peralatan kultur jaringan, media merupakan salah satu factor utama
dalam keberhasilan kultur. Media kultur jaringan tanaman harus berisi semua zat
yang diperlukan untuk menjamin pertumbuhan eksplan yang ditanam. Media kultur
jaringan memiliki karakteristik masing-masing. Artinya tidak semua media dapat
digunakan pada semua kultur tanaman. Karena beberapa media yang ada memiliki
perbedaan kandungan dan konsentrasi zat-zat yang diperlukan atau digunakan pada
kultur.
Media merupakan faktor utama dalam perbanyakan dengan kultur jaringan.
Keberhasilan perbanyakan dan perkembangbiakan tanaman dengan metode kultur
jaringan secara umum sangat tergantung pada jenis media. Media tumbuh pada kultur
jaringan sangat besar pengaruhnya terhadap pertumbuhan dan perkembangan eksplan
serta bibit yang dihasilkannya. Oleh karena itu, berbagai komposisi media kultur
20

telah diformulasikan untuk mengoptimalkan pertumbuhan dan perkembangan
tanaman yang dikulturkan. Media kultur fisiknya dapat berbentuk padat atau cair.
Media berbentuk padat menggunakan pemadat media seperti agar. Media kultur
yang memenuhi syarat adalah yang mengandung nutrient makro dan mikro dalam
kadar dan perbandingan tertentu, sumber energi (sukrosa), serta mengandung
berbagai macam vitamin dan ZPT.
B. Tujuan
Praktikum ini bertujaun untuk:
1. Mengetahi dan mempraktikan cara membuat larutan stok
2. Mengetahui dan mempraktikan cara membuat medium MS (Murashige &
Skoog)
3. Melakukan sterilisasi medium










21

II. TINJAUAN PRAKTIKUM
Media kultur jaringan merupakan faktor penting penentu
keberhasilan perbanyakan tanaman secara kultur jaringan. Media tanam harus berisi
semua zat yang diperlukan untuk menjamin kebutuhan eksplan. Bahan-bahan yang
diramu berisi campuran garam mineral sumber unsur makro dan unsur mikro, gula,
protein, vitamin, dan hormon tumbuhan. Berhasilnya kultur jaringan banyak
ditentukan selain kondisi aseptic juga oleh media tanam. Campuran media yang satu,
dapat cocok untuk jenis tanaman tertentu, tetapi dapat kurang cocok untuk jenis
tanaman yang lain.
Dalam kultur jaringan, unsur-unsur diberikan tidak dalam bentuk unsure
murni, tetapi berupa senyawa berbentuk garam. Sebelum dicampurkan kedalam
media tumbuh, garam-garam mineral itu haruslah lebih dahulu dilarutkan dalam
konsentrasi tertentu, sehingga dalam media tumbuh nantinya jumlah tiap gram benar
sesuai dengan ketentuan sebagai pelarut dipakai akuades (Rahardja, 1995)
Faktor-faktor yang perlu diperhatikan untuk keberhasilan kultur jaringan yaitu
bahan sterilisasinya, kandungan unsur kimia dalam media, hormon yang digunakan,
substansi organik yang ditambahkan dan terang atau gelapnya saat inkubasi. Dari
sekian banyak permasalahan yang harus diteliti dan diperhatikan adalah komposisi
media tumbuh pada kultur jaringan karena sangat besar pengaruhnya terhadap
pertumbuhan dan perkembangan eksplan serta bibit yang dihasilkannya (Daisy 1994).
Teknik aseptik merupakan salah satu kunci keberhasilan dalam kutur jaringan.
Keaseptikan harus dijaga dalam proses pengkulturan, selain itu juga termasuk
sterilisasi bahan tanaman (eksplan). Pada tahap ini dilakukan berbagai perlakuan
untuk membersihkan kotoran yang ada di permukaan bahan tanaman (disinfestasi).
Selain itu, zat pengatur tumbuh adalah senyawa organik bukan hara yang dalam
jumlah sedikit dapat mendukung, menghambat dan dapat merubah proses fisiologi
tanaman. (Prawitasari 2005)
22

III. MATERI PRAKTIKUM

A. Alat dan Bahan
1. Bahan : Media MS
a. Unsur hara makro :
- KNO
3
= 1.900 mg/l
- NH
4
NO
3
= 1.650 mg/l
- CaCl
2
.2H
2
O = 440 mg/l
- MgSO
4
.7H
2
O = 370 mg/l
- KH
2
PO
4
= 170 mg/l
b. Unsur hara mikro :
- MnSO
4
.4H
2
O = 22,3 mg/l
- ZnSO
4
.7H
2
O = 8,6 mg/l
- MoBO
3
= 6,2 mg/l
- KI = 0,83 mg/l
- Na
2
MoO
4
.2 H
2
O = 0,25 mg/l
- CuSO
4
.5H
2
O = 0,025 mg/l
c. Besi :
- FeSO
4
.7H
2
O = 27,8 mg/l
- Na
2
-EDTA.2H
2
O = 37,3 mg/l
d. Vitamin :
- Mio-inositol = 100 mg/l
- Thiamin HCl = 0,1 mg/l
- Asam nikotinat = 0,5 mg/l
- Piridoksin HCl = 0,5 mg/l
- Glisin = 2 mg/l
e. ZPT :
- Sitokinin = 1 mg/l
23

- Auksin = 1 mg/l
f. Bahan pemadat : agar = 7 g/l
g. Sukrosa = 30 g/l
h. KOH atau NaOH = 1 M
i. HCl = 1 M
2. Alat :
a. Tabung erlenmeyer h. Timbangan analitik
b. Gelas ukur i. Botol kultur
c. Pipet j. Otoklaf (autoclave)
d. Pengaduk kaca k. Aluminium foil
e. Magnetic stirrer l. Karet gelang
f. Kompor m. Kertas payung
g. pH meter

B. Cara Kerja
1. Pembuatan larutan stok
a. Larutan stok A, merupakan larutan unsur hara makro, dibuat 10 kali dilarutkan
dalam 1000 ml aquades.
b. Larutan stok B, merupakan larutan hara mikro, dibuat 1000 kali dalam 100 ml
aquades.
c. Larutan stok C, merupakan campuaran FeSO
4
.7H
2
O dan Na-EDTA, dibuat 100
kali dan dilarutkan ke dalam 200 ml aquades.
d. Larutan stok D, merupakan larutan vitamin kecuali mio-inositol, dibuat 100 kali
ke dalam 200 ml aquades.
e. Larutan stok E, merupakan larutan mio-inositol, dibuat 100 kali dan dilarutkan
ke dalam 100 ml aquades.
f. Larutan Stok F, merupakan larutan ZPT, dibuat 100 kali dilarutkan ke dalam
500 ml aquades.


24


2. Pembuatan Medium Kultur
a. Aquades sebanyak 500 ml disiapkan di dalam erlenmeyer berukuran 1000 ml.
Untuk pembuatan 1 liter medium, ditambahkan stok A 100 ml, stok B 5 ml,
stok C 50 ml, stok D 50 ml, stok E 2 ml dan stok F : IAA (air kelapa) 15 ml.
b. Sukrosa ditimbang sebanyak 30 gram dan dimasukkan ke dalam erlenmeyer
sambil diaduk.
c. Aquades ditambahkan samapai volumenya 1000 ml.
d. pH larutan diukur menggunakan pH meter elektrik hingga mencapai pH yang
dibutuhkan yaitu 5,7 5,8. Jika terlalu asam tambahkan NaOH atau KOH 1 M,
dan jika terlalu basa tambahkan HCl 1 M.
e. Sebanyak 7 gram agar-agar ditambahkan ke dalam larutan, lalu dpanaskan
sampai mendidih sambil diaduk-aduk.
f. Medium dituangkan ke dalam botol sekitar 20 ml.
g. Botol ditutup menggunakan aluminium foil dan seal.

3. Sterilisasi Media
a. Botol kultur yang sudah berisi medium dimasukkan ke dalam autoclave dengan
tekanan 15 - 17,5 psi pada suhu 120
o
C selama 20 menit, sampai tiga kali.
b. Botol diangkat dan disimpan dalam ruang inkubasi sampai siap digunakan.
c. Medium siap digunakan.





25

IV. HASIL DAN PEMBAHASAN
A. Hasil
Media MS
B. Pembahasan
Pembuatan media harus berdasarkan perhitungan konsentrasi yang tepat.
Karena akan mempengaruhi keberhasilan tumbuh eksplan. Media yang digunakan
merupakan media Ms (Murashige dan Skoog). Pada proses pembuatannya, unsure
makro diencerkan sebanyak 5 kali, unsure mikro 100 kali, stok Fe 200 kali, vitamin
10 kali, ZPT 100 kali. Ditambakan pula sukrosa yang bertujuan untuk memberikan
bahan baku metabolisme eksplan karena eksplan beum mampu menghasilkan asimilat
seperti tumbuhan pada umumnya. Selanjutnya ditambahkan pemadat berupa agar
swallow untuk memadatkan media.
Pada umumnya komposisi utama media tanam kultur jaringan, terdiri dari
hormon (zat pengatur tumbuh) dan sejumlah unsur yang biasanya terdapat di dalam
tanah yang dikelompokkan ke dalam unsur makro dan unsur mikro. Hasil yang lebih
baik akan dapat kita peroleh bila, kedalam media tersebut, ditambahkan vitamin,
asam amino, dan hormon, bahan pemadat media (agar), glukosa dalam bentuk gula
maupun sukrosa, air destilata (akuades), dan bahan organik tambahan (Gunawan,
1988).
o Gula digunakan sebagai sumber energi dalam media kultur, karena umumnya
bagian tanaman atau eksplan yang dikulturkan tidak autotrof dan mempunyai
laju fotosintesis yang rendah. Oleh sebab itu tanaman kultur jaringan
membutuhkan karbohidart yang cukup sebagai sumber energi. Menurut
Gautheret dalam Gunawan (1992), sukrosa adalah sumber karbohidrat
penghasil energi yang terbaik melebihi glukosa, maltosa, rafinosa. Namun
jika tidak terdapat sukrosa, sumber karbohidrat tersebut dapat digantikan
26

dengan gula pasir. Gula pasir cukup memenuhi syarat untuk mendukung
pertumbuhan kultur. Selain sebagai sumber energi, gula juga berfungsi
sebagai tekanan osmotik media.
o Asam amino merupakan sumber N organik. Asam amino yang sering
digunakan adalah glutamine, asparagin, sistein, dan glisin.
o Vitamin berfungsi sebagai katalisator dalam system enzim dan diperlukan
dalam jumlah kecil. Vitamin yang dibutuhkan pada sebagian besar kultur
jaringan tumbuhanadalah thiamin, yang diberikan dalam bentuk Thiamin-
HCl. Vitamin lain yang biasa digunakan adalah asam nikotinat dan piridoksin
HCl (vitamin B6).
Pembuatan larutan stok pada dasarnya ditujukan untuk menyediakan bahan-
bahan yang diperlukan pada pembuatan media dengan konsentrasi yang tepat. Karena
media-media yang digunakan pada kultur jaringan diperlukan unsure-unsur dengan
konsentrasi yang sangat kecil. Karena tidak dimungkinkan menimbang unsure dengan
konsentrasi yang sangat kecil, maka dibuat lah larutan stok dengan menggunakan
konsep kalibrasi, sehingga pada pembuatan media, unsure-unsur tersebut dapat
digunakan seusia dengan konsentrasi yang diinginkan (Sriyanti, 2002).
Selain media MS yang digunakan, terdapat pula beberapa jenis media lain,
diantaranya (Raharja, 1995):
1. Heler
2. White
3. Nitsch & Nitsch
4. Hildebrandt, Riker dan Duggar
5. Gautheret
6. Knudson
7. VAcin dan Went
8. Miller
9. Linsmaier & Skoog
27

10. Gamborg
11. Murashige & Skoog
12. White, diperkaya dengan fosfat dan diperkuat dengan senyawa organic
seumber N serta asam amino.
Media nomor 1 sampai dengan nomor 5 adalah media dasar yang hanya berisi
unsure makro dan unsure mikro. Untuk keperluan kultur jarigan, media tersebut
masih perlu ditambahkan bahan pelengkap berupa asam amino, vitamin, gula dan
hormone tumbuhan. pH disesuaikan sehingga nilainya berkisar sekitar 5,6. Bahan-
bahan lain yang dapat ditambahkan sebagai pelengkap misalnya ekstrak tauge,
ekstrak ujunga kecambah jagung dan air kelapa muda (Raharja, 1995).
Beberapa media dasar yang banyak digunakan antara lain media dasar
Murashige dan Skoog (1962) yang dapat digunakan untuk hampir semua jenis kultur,
media dasar B5 untuk kultur sel kedelai dan legume lainnya, media dasar White
(1934) sangat cocok untuk kultur akar tanaman tomat, media dasar Vacin dan Went
(1949) digunakan untuk kultur jaringan anggrek, media dasar Nitsch dan Nitsch
(1969) digunakan dalam kultur tepung sari (pollen) dan kultur sel, media
dasar Schenk dan Hildebrandt (1972) untuk kultur jaringan tanaman monokotil,
media dasar WPM (Woody Plant Medium, 1981) khusus untuk tanaman berkayu,
media dasar N6(1975) untuk serealia terutama padi. Untuk eksplan dari tanaman
keras sering menggunakan medium WPM, sedangkan untuk tanaman semusim
(sayuran dan tanaman hias) sering menggunakan medium MS. Medium Kundson C
cocok untuk menanam eksplan kelapa kopyor dan anggrek. Dari sekian banyak media
dasar di atas, yang paling banyak digunakan adalah media Murashige dan Skoog
(MS).
Keasaman pH adalah nilai derajat keasaman atau kebasaan dari larutan dalam
air. Keasaman (pH) suatu larutan menyatakan kadar dari ion H dalam larutan. Nilai di
dalam pH berkisar antara 0 (sangat asam) sampai 14 (sangat basa), sedangkan titk
netral adalah pH pada 7. Sel-sel tanaman yang dikembangkan dengan teknik kultur
28

jaringan mempunyai toleransi pH yang relatif sempit dengan titik optimal antara pH
5,0-6,0. Bila eksplan mulai tumbuh, pH dalam lingkungan kultur jaringan tanaman
umumnya akan naik apabila nutrein habis terpakai. Pengukuran pH dapat dilakukan
dengan menggunakan pH meter, atau bila menginginkan yang lebih praktis dan
murah dapat digunakan kertas pH. Bila ternyata pH medium masih kurang normal,
maka dapat ditambah KOH 1-2 tetes. Sedangkan apabila pH melampaui batas normal
dinetralkan dengan penambahan HCL.
Menurut Gamborg dan Shyluk (1981) dalam Gunawan (1988), sel-sel
tanaman membutuhkan pH yang sedikit asam berkisar antara 5,55,8. Pengaturan pH,
biasa dilakukan dengan dengan menggunakan NaOH (atau kadang-kadang KOH)
atau HCL pada waktu semua komponen sudah dicampurkan .
Faktor pH dalam media juga perlu mendapat perhatian khusus. pH tesebut
harus diatur sedemikian rupa, hal ini ditujukan agar tidak mengganggu fungsi
membran sel dan pH dari sitoplasma, sehingga media yang dibuat sesuai dengan
kondisi yang menjadi syarat untuk tumbuhnya eksplan dalam kultur jaringan. Selain
itu, jika pH lebih tinggi dari 6.0, media mungkin menjadi terlalu keras dan jika pH
kurang dari 5.2, agar tidak dapat memadat. Pengaturan pH selain memperhatikan
kepentingan beberapa fisiologi sel, juga harus mempertimbangkan faktor-faktor:
o Kelarutan dari garam-garam penyusun media.
o Pengambilan (uptake) dari zat pengatur tumbuh dan garam garam lain.
o Efisiensi pembekuan agar-agar.
Bahan pemadat media yang paling banyak digunakan adalah agar-agar. Agar-
agar adalah campuran polisakarida yang diperoleh dari beberapa spesies algae. Dalam
analisa unsur, diperoleh data bahwa agar-agar mengandung sedikit unsur Ca, Mg, K,
dan Na (Debergh, 1982 dalam Gunawan, 1992). Keuntungan dari pemakaian agar-
agar adalah :
29

o Agar-agar membeku pada suhu 45 C dan mencair pada suhu 100C sehingga
dalam kisaran suhu kultur, agar-agar akan berada dalam keadaan beku yang
stabil.
o Tidak dicerna oleh enzim tanaman.
o Tidak bereaksi dengan persenyawaan - persenyawaan penyusun media.
Media kultur merupakan salah satu faktor penentu keberhasilan
perbanyakantanaman secara kultur jaringan. Berbagai komposisi media kultur telah
diformulasikan untuk mengoptimalkan pertumbuhan dan perkembangan tanaman
yang dikulturkan. Contohnya komposisi Knudson C (1946), Heller (1953), Nitsch
dan Nitsch (1972),Gamborg dkk B5 (1976), Linsmaier dan Skoog-LS (1965),
Murashige dan Skoog MS(1962) serta woody plant medium-WPM (Lloyd dan Mc
Known, 1980). Komponen media kultur yang lengkap dan yang harus diperhatikan
dalam pembuatan media kultur adalah sebagai berikut :
o Air distilata (akuades) atau air bebas ion sebagai pelarut atau solven.
o Hara-hara makro dan mikro.
o Gula (umumnya sukrosa) sebagai sumber energy.
o Vitamin, asam amino dan bahan organic lain.
o Zat pengatur tumbuh.
o Suplemen berupa bahan-bahan alami, jika diperlukan.
o Agar-agar atau gelrite sebagai pemadat media.( Endang Yuniastuti. 2008: 5)
Untuk memenuhi factor pertumbuhan tanaman, maka factor factor yang
harus diperhatikan dalam pembuatan media kultur jaringan yang baik adalah media
yang mengandung:
1. Hara anorganik. Ada 12 hara mineral yang penting untuk pertumbuhan
tanaman dan beberapa hara yang dilaporkan mempengaruhi pertumbuhan in
vitro. Untuk pertumbuhan normal dalam kultur jaringan, unsur unsur
penting ini harus dimasukkan dalam media kultur. Perbandingan 5 media pada
Tabel 12.1 memperlihatkan bahwa unsur esensial ini dimasukkan pada masing
30

masing media tapi konsentrasinya berbeda karena diberikan dalam bentuk
yang berbeda.
2. Hara organic. Tanaman yang tumbuh dalam kondisi normal bersifat autotrof
dan dapat mensintesa semua kebutuhan bahan organiknya. Meskipun tanaman
in vitro dapat mensintesa senyawa ini, diperkirakan mereka tidak
menghasilkan vitamin dalam jumlah yang cukup untuk pertumbuhan yang
sehat dan satu atau lebih vitamin mesti ditambahkan ke media. Thiamin
merupakan vitamin yang penting, selain itu asam nikotin, piridoksin dan
inositol biasanya ditambahkan. Selain bahan organik tersebut, bahan
kompleks seringkali ditambahkan, termasuk ekstrak ragi, casein hydrolysate,
air kelapa, jus jeruk, jaringan pisang, dan lain lain. Penambahan bahan
kompleks ini menghasilkan media yang tak terdefinisi. Dengan penelitian
yang cukup, semestinya bahan kompleks ini dapat diganti dengan zat tertentu,
mungkin tambahan suatu vitamin atau asam amino.
3. Sumber karbon. Tanaman dalam kultur jaringan tumbuh secara heterotrof dan
karena mereka tidak cukup mensintesa kebutuhan karbonnya, maka sukrosa
harus ditambahkan ke dalam media. Sumber karbon ini menyediakan energy
bagi pertumbuhan tanaman dan juga sebagai bahan pembangun untuk
memproduksi molekul yang lebih besar yang diperlukan untuk tumbuh.
Biasanya sukrosa pada konsentrasi 1 5% digunakan sebagai sumber karbon
tapi sumber karbon lain seperti glukosa, maltosa, galaktosa dan laktosa juga
digunakan. Ketika sukrosa diautoklaf, terjadi hidrolisis untuk menghasilkan
glukosa dan fruktosa yang dapat digunakan lebih efisien oleh tanaman dalam
kultur.
4. Agar. Umumnya jaringan dikulturkan pada media padat yang dibuat seperti gel
dengan menggunakan agar atau pengganti agar sperti Gelrite atau Phytagel.
Konsentrasi agar yang digunakan berkisar antara 0.7 1.0%. Pada konsentrasi
tinggi agar menjadi sangat keras, sedikit sekali air yang tersedia, sehingga
31

difusi hara ke tanaman sangat buruk. Agar dengan kualitas tinggi seperti
Difco BiTek mahal harganya tapi lebih murni, tidak mengandung bahan lain
yang mungkin mengganggu pertumbuhan. Pengganti lain seperti gelatin
kadang kadang digunakan pada lab komersial. Gel sintetis diketahui dapat
menyebabkan hyperhidration (vitrifikasi) yang merupakan problem fisiologis
yang terjadi pada kultur. Untuk mengatasi masalah ini, produk baru bernaman
Agargel telah diproduksi ole Sigma. Produk ini merupakan campuran agar
dan gel sintetis dan menawarkan kelebihan kedua produk sekaligus
mengurangi problem vitrifikasi. Produk ini dapat dibuat di lab dengan
mencampurkan 1 g Gelrite (Phytagel) dengan 4 g agar sebagai agen pengental
untuk 1 L media.
5. pH. media biasanya diatur pada kisaran 5.6 5.8 tapi tanaman yang berbeda
mungkin memerlukan pH yang berbeda untuk pertumbuhan optimum. Jika pH
lebih tinggi dari 6.0, media mungkin menjadi terlalu keras dan jika pH kurang
dari 5.2, agar tidak dapat memadat.
6. Zat Pengatur Tumbuh. Pada media umumnya ditambahkan zat pengatur
tumbuh. Zat pengatur tumbuh akan dibahas tersendiri pada minggu 13.
7. Air. distilata biasanya digunakan dalam kultur jaringan, dan banyak lab
menggunakan aquabides (air destilata ganda). Beberapa lab, dengan alasan
ekonomi, menggunakan air hujan, tapi ini menyebabkan sulit mengontrol
kandungan bahan organik dan non-organik pada media.
8. Pemilihan Media. Jika tidak ada informasi awal, biasanya mulai dengan media
MS (Murashige dan Skoog 1962). Media ini mengandung konsentrasi garam
dan nitrat yang lebih tinggi dibandingkan media lain, dan telah sukses
digunakan pada berbagai tanaman dikotil. Untuk inisiasi kalus, 2.4-D
ditambahkan ke media dengan konsentrasi 1 5 mgL-1. Untuk multiplikasi
tunas, sitokinin seperti BAP ditambahkan dan juga diberi auksin, seperti NAA
32

pada konsentrasi yang rendah. Untuk inisiasi akar, IBA pada konsentrasi 1 2
mgL-1 ditambahkan. Faktor yang paling sulit ditentukan dalam kultur
jaringan adalah zat pengatur tumbuh dan biasanya perlu melakukan penelitian
kecil untuk menentukan konsentrasi terbaik yang akan digunakan. Ada 2
pendekatan: Pendekatan pertaman adalah dengan menggunakan media dasar
MS dan meneliti kisaran dua zat pengatur tumbuh yang berbeda pada media
tersebut. (Anonimous, 2009).
Seperti halnya peralatan kultur, media yang digunakan juga perlu dilakukan
sterilisasi untuk menciptakan kondisi lingkungan yang aseptic bagi eksplan. Untuk
media kultur yang tidak mengandung bahan-bahan yang Heat-labile, sterilisasi
dilakukan dengan autoklaf pada temperature 121Oc, tekanan antara 15 psi atau 1 atm
dengan waktu antara 20-25 menit tergantung dari volume wadah dan volume media.
Untuk 15-50 ml media dalam tabung reaksi atau botol kecil berukuran 50-100 ml,
sterilisasi dilakukan pada tekanan 15 psi dengan waktu 20 menit. Untuk 20 botol
volume 1 liter membutuhkan waktu yang lebih lama yaitu 34 menit, 10 botol volume
2 liter memerlukan waktu 37 menit, 5 botol 4 liter waktu yang digunakan 52 menit.
Dengan waktu yang lebih lama.
Dalam sterilisasi aquadest dan media, setelah waktu sterilisasi yang
diinginkan sudah tercapai, autoklaf tidak boleh diturunkan tekanannya secara
mendadak. Bila tekanan diturunkan mendadak, cairan didalamnya mendidih dan
meluap (bubbled up). Untuk bahan-bahan yang heat-labile dalam bentuk larutan,
sterilisasi dilakukan dengan menyaring larutan melalui filter yang mempunyai ukuran
pori 0.20-0.22 um. Diameter filter yang bermacam-macam tergantung dari volume
larutan yang ingin disterilkan. Untuk volume larutan 10 ml, dipergunakan filter yang
dipasang di ujung jarum suntik. Bahan yang heat labile antara lain : GA3, Thiamin-
HCL, Ca-panthothenate, Antibiotik: carbenocilin (Anonimous, 2009).

33

V. SIMPULAN DAN SARAN

A. SIMPILAN
Berdasarkan hasil pengamatan, maka dapat ditarik kesimpulan bahwa:
1. Media kultur jaringan merupakan faktor penting penentu
keberhasilan perbanyakan tanaman secara kultur jaringan. Media tanam harus
berisi semua zat yang diperlukan untuk menjamin kebutuhan eksplan. Bahan-
bahan yang diramu berisi campuran garam mineral sumber unsur makro dan
unsur mikro, gula, protein, vitamin, dan hormon tumbuhan. Berhasilnya kultur
jaringan banyak ditentukan selain kondisi aseptic juga oleh media tanam.
2. Pembuatan larutan stok dilakukan dengan mengencerkan menggunakan
aquades. unsure makro diencerkan sebanyak 5 kali, unsure mikro 100 kali,
stok Fe 200 kali, vitamin 10 kali, ZPT berupa IAA dan Kinetin 100 kali.
3. Pembuatan medium MS dilakukan dengan mencampurkan stok yang telah
dibuat. Untuk pembuatan 1L medium, maka stok unsure makro diambil
sebanyak 100 ml, stok unsure mikro diambil 5 ml, stok Fe diambil 5 ml, stok
vitamin diambil 50 ml, stok ZPT untuk auksin dan sitokinin masing-masing 1
ml.
4. Sterilisasi medium dilakukan dengan menggunakan autoklaf pada suhu 121
0
C
pada tekanan 15-17,5 psi selama 20 menit.
B. SARAN
1. Pembuatan larutan stok mikro dan stok mikro dalam media MS harus
dilakukan dengan teliti agar eksplan dapat tumbuh dengan baik.
2. Sterilisasi media harus dilakukan dengan baik, agar tidak terjadi kontaminasi.


34

1. PENDAHULUAN

A. Latar Belakang
Kultur jaringan merupakan salah satu tekhnik memperbanyak suatu tanaman
dengan cara menanam sebagian kecil jaringan pada medium yang sudah dalam
keadaan steril. Teknik kultur jaringan bukan hanya digunakan untuk beberapa tujuan
seperti mendapatkan produksi metabolit sekunder, mendapatkan keragaman seleksi
dan pemuliaan tanaman.
Pada dasarnya langkah-langkah dalam melakukan proses kultur jaringan ada 3
tahap, yaitu :
1. Tahap I atau disebut juga tahap persiapan eksplan
2. Tahap II atau disebut juga tahap penggandaan.
3. Tahap III atau disebut juga tahap penndewasaan.( D.F. Wetherell,1976).
Langkah pertama yang harus dilakukan apabila akan melakukan kultur
jaringan adalah menentukan tujuan yang ingin dicapai, karena akan menyangkut
materi yang akan digunakan. Misalnya tujuannya ingin memperbanyak tanaman
dengan hasil yang sesuai dengan induknya, maka dilakukan kultur meristem atau
kultur kalur. Apabila tujuannya ingin mendapatkan tanaman yang homozigot,
dilakukan kultur anther. Langkah berikutnya adalah menentukan medium yang akan
digunakan dengan menambahkan ZPT vitamin dan suplemen lainnya. Selanjutnya
adalah tahap kerja di laboratorium.
Proses pelaksanaan kultur jaringan yang dapat dikatakan proses terakhir yaitu
penanaman eksplan. Syarat pertama kultur jaringan juga masih digunakan pada
pelaksanaan ini yaitu kondisi yang aseptic. Pada pross penanaman eksplan,
lingkungan yang digunakan haruslah benar-benar dalam kondisi yang aseptic. Oleh
karenanya penanaman biasanya dilakukan di Enkas, sebuah kotak dengan tepi yang
transparan dan terdapat lubang untuk tangan, atau dengan menggunakan LAF
(Laminar Air Flow).
35

Penanaman eksplan harus dilakukan pada ruangan yang harus steril, dan
eksplan juga dalam keadaan yang steril pula. Penanaman dapat dilakukan pada
ruangan tertutup atau ruangan penabur dalam Laminair Air Flow (LAF). Ruangan
digunakan, setelah dilakukan sterilisasi dengan menggunakan larutan alkohol 96 %
pada lantai dan dinding ruangan, dan membiarkan ruangan selama 30 menit dengan
sinar UV yang menyala.
Kontaminasi yang terjadi pada kultur jaringan merupakan momok yang cukup
mengganggu proses kultur jaringan. Namun kontaminasi juga dapat dicegah dengan
perlakuan-perlakuan yang aseptic. Stelah dua acara praktikum diatas dilakukan
sterilisasi terhadap peralatan kultur dan media kultur, tanaman atau eksplan yang
akan ditanam juga harus dalam keadaan steril dan sehat artinya eksplan tidak
terserang penyakit ataupun terkena serangan mikroba.
Keberadaan kontaminan yang berasal dari spora maupun mikroba lainnya
sangat sulit dihindari termasuk juga di dalam ruang kultur. Untuk itu sterilisasi
ruangan juga perlu dilakukan tentunya dengan tujuan untuk menciptakan lingkungan
yang aseptic dan menghilangkan mikroba maupun spora penyebab kontaminan.
B. Tujuan
1. Mengetahui dan mempraktikan cara menanam eksplan dan sub kultur.
2. Mengamati pertumbuhan eksplan.
3. Mencari factor-faktor penyebab kontaminasi dalam kultur jaringan.






36

II. TINJAUAN PRAKTIKUM

Dengan semakin berkembangnya usaha di bidang pertanian maka kebutuhan
bibit semakin meningkat. Melalui perbanyakan konvensional sangat sulit untuk
memenuhi kebutuhan bibit yang sangat banyak dengan waktu relatif cepat. Dengan
demikian, teknologi kultur jaringan telah terbukti dapat digunakan sebagai teknologi
pilihan.( Mariska, 2008 ).
Menurut Sriyanti (1994), kultur jaringan adalah suatu metode untuk
mengisolasi bagian dari tanaman seperti protoplasma, sel, sekelompok sel, jaringan
dan organ, serta menumbuhkannya dalam kondisi aseptik, sehingga bagian-bagian
tersebut dapat memperbanyak diri dan beregenerasi menjadi tanaman lengkap
kembali. Tujuan dari Kultur jaringan diantaranya menciptakan tanaman baru bebas
penyakit, memperbanyak tanaman yang sukar diperbanyak secara seksual, dan
menghasilkan tanaman baru sepanjang tahun (Hendaryono,1994).
Kultur jaringan atau biakan jaringan merupakan teknik pemeliharaan jaringan
atau bagian dari individu secara buatan (artifisial). Yang dimaksud secara buatan
adalah dilakukan di luar individu yang bersangkutan. Karena itu teknik ini sering kali
disebut kultur in vitro, sebagai lawan dari in vivo. Dikatakan in vitro (bahasa Latin,
berarti "di dalam kaca") karena jaringan dibiakkan di dalam tabung inkubasi atau
cawan petri dari kaca atau material tembus pandang lainnya. Kultur jaringan secara
teoretis dapat dilakukan untuk semua jaringan, baik dari tumbuhan maupun hewan
(termasuk manusia) namun masing-masing jaringan memerlukan komposisi media
tertentu (Hendra, 2007).
Pertumbuhan dan perkembangan dalam kultur in vitro dipengaruhi oleh
beberapa faktor, diantaranya: faktor genetik, media tumbuh, faktor lingkungan, dan
zat pengatur tumbuh. Menurut Wetherell (1982), zat pengatur tumbuh (ZPT) di dalam
37

dalam media berfungsi untuk mengatur pertumbuhan dan perkembangan tanaman
pada setiap tingkat pertumbuhan dan perkembangan.
Di dalam tanaman terdapat fitohormon yang mendorong pertumbuhan dan
perkembangan, serta fitohormon yang menghambat. ZPT akan bekerja secara aditif
(sinergis) dengan fitohormon (pendorong) atau antagonis dengan fitohormon yang
menghambat. Resultan dari interaksi ini akan tampil dalam pertumbuhan dan
perkembangan tanaman. Menurut Gardner (1991) tanaman pada kultur jaringan tidak
dapat menghasilkan karbohidrat sendiri dalam jumlah cukup sehingga perlu diberikan
sumber energi karbon dalam media berupa sukrosa.
Proses perbanyakan tanaman melalui kultur jaringan terdiri atas seleksi pohon
induk (sumber eksplan), sterilisasi eksplan, inisiasi tunas, multiplikasi, perakaran, dan
aklimatisasi. Eksplan berupa mata tunas, diambil dari pohon induk yang fisiknya
sehat. Tunas tersebut selanjutnya disterilkan dengan alkohol 70%, HgCl2 0,2%, dan
Clorox 30%. Inisiasi tunas. Eksplan yang telah disterilkan di-kulturkan dalam media
kultur (MS + BAP). Setelah terbentuk tunas, tunas tersebut disubkultur dalam media
multiplikasi (MS + BAP) dan beberapa komponen organik lainnya. Multiplikasi
dilakukan secara berulang sampai diperoleh jumlah tanaman yang dikehendaki,
sesuai dengan kapasitas laborato-rium. Setiap siklus multiplikasi berlangsung selama
23 bulan. Untuk biakan (tunas) yang telah responsif stater cultur, dalam periode
tersebut dari 1 tunas dapat dihasilkan 10-20 tunas baru. Setelah tunas mencapai
jumlah yang diinginkan, biakan dipindahkan (dikulturkan) pada media perakaran (
Biogen, 2008 ).
Untuk perakaran digunakan media MS + NAA. Proses perakaran pada
umumnya berlangsung selama 1 bulan. Planlet (tunas yang telah berakar)
diaklimatisasikan sampai bibit cukup kuat untuk ditanam di lapang. Aklimatisasi.
Dapat dilakukan di rumah kaca, rumah kasa atau pesemaian, yang kondisinya
(terutama kelembaban) dapat dikendalikan. Planlet dapat ditanam dalam dua cara.
Pertama, planlet ditanam dalam polibag diameter 10 cm yang berisi media (tanah +
38

pupuk kandang) yang telah disterilkan. Planlet (dalam polibag) dipelihara di rumah
kaca atau rumah kasa. Kedua, bibit ditaruh di atas bedengan yang dinaungi dengan
plastik. Lebar pesemaian 1-1,2 m, panjangnya tergantung keadaan tempat. Dua
sampai tiga minggu sebelum tanam, bedengan dipupuk dengan pupuk kandang (4
kg/m2) dan disterilkan dengan formalin 4%. Planlet ditanam dengan jarak 20 cm x 20
cm. Aklimatisasi berlangsung selama 2-3 bulan. Aklimatisasi cara pertama dapat
dilakukan bila lokasi pertanaman letaknya jauh dari pesemaian dan cara kedua
dilakukan bila pesemaian berada di sekitar areal pertanaman ( Biogen, 2008 ).

39

III. MATERI PRAKTIKUM

A. Bahan dan Alat :
Bahan
a. Bahan eksplan yang dapat berupa daun muda, tunas, pucuk tanaman
b. Media tumbuh
c. Sterilan : alcohol, sublimat, Clorox
d. Aquades steril

Alat
a. Laminar Air Flow
b. Erlenmeyer
c. Handsprayer
B. Prosedur Kerja
Persiapan ruang penabur
1. Sebelum digunakan ruang penabur disterilkan dengan sinar UV selama
30 menit atau dengan menyemprotkan alcohol 96% ke bagian tangan
dan botol yang berisi media
2. Alat-alat yang digunakan diatur dengan rapi pada LAF, posisi scalpel
dan pinset serta alcohol 96% yang digunakan untuk mensterilkan
dissecting kit (scalpel dan pinset) disebelah kiri Bunsen sedangkan botol
kultur disebelah kanan.
3. Petridish diletakan dibagian tengah, setiap selesai eksplant dipotong
petridish ditutup kembali untuk menghindari kontaminasi.
40

4. Selesai digunakan alat disterilkan dengan alkohok dan dibakar dengan
Bunsen.
5. Sebelum masuk kedalam LAF semua seperti botol dan tangan harus
disterilkan dengan alcohol 96%.
6. Setiap selesai menggunakan pinset maupun scalpel, lalu dicelupkan
kedalam alkohol, lalu dibakar pada nyala api bunsen.
Penyiapan Eksplan
Eksplan adalah bahan tanaman yang akan dikulturkan, dapat berupa daun,
tunas, pucuk, bunga, endosperm, buah muda, sel, protoplas dan yang
lainnya.
Penanaman Eksplan
a. Disiapkan alat-alat yang akan digunakan untuk penanaman eksplan.
b. Diambil potongan eksplan yang sudah siap untuk ditanam dengan
pinset.
c. Dibuka botol kultur yang telah berisi media dan dibakar bagian mulut
botol.
d. Diletakan eksplan kedalam media dengan hati-hati.
e. Botol ditutup dengan kertas aluminium foil dan diseal.
f. Diletakan pada ruang inkubasi.
g. Diamati perkembangan eksplan.

41

IV. HASIL DAN PEMBAHASAN

A. Hasil

B. Pembahasan
Kultur jaringan merupakan salah satu teknik memperbanyak suatu tanaman
dengan cara menanam sebagian kecil jaringan pada medium yang sudah dalam
keadaan steril. Dalam melakukan proses kultur jaringan ada beberapa langkah yang
harus dilakukan diantaranya adalah menentukan tujuan yang ingin dicapai hal ini
penting karena menyangkut materi yang akan digunakan. Setelah mengetahui tujuan
yang aingin dicapai langkah yang dilakukan berikutnya adalah menentukan medium
yang akan digunakan.( Nasir,2001)


Hari / Tanggal
Pengamatan
No Botol Eksplan Keterangan
1 2 3 1 2 3
Kamis, 15
Desember 2011
Belum
Tumbuh
Belum
Tumbuh
Belum
Tumbu
h
Eksplan,
media
(baik)
Eksplan,
media
(baik)
Eksplan,
media
(baik)
Senin, 19
Desember 2011
Belum
Tumbuh
Belum
Tumbuh
Belum
Tumbu
h
Kontam
(jamur)
Kontam
(jamur)
Kontam
(jamur)
Rabu, 21
Desember 2011
Belum
Tumbuh
Belum
Tumbuh
Belum
Tumbu
h
Kontam
(jamur)
Kontam
(jamur)
Kontam
(jamur)
42

Proses kultur jaringan tidak bisa dilakukan di temapt yang sembarangan, akan
tetapi dilaksanakan pada laboratorium tertentu. Proses penyimpanan eksplan
dilakukan di dalam ruang penabur. Dimana ruang penabur merupakan kunci
keberhasilan budidaya in-vitro. Didalam ruangan ini semua dilakukan dengan steril,
dan pengawasan kesterilan di ruang penabur tersebut sangat ketat.( Moeso S,1996 )
LAF cabinet merupakan suatu kotak tempat sterilisasi dan penanaman eksplan
( bahan tanam ). Di dalam laminar, terdapat blower dan lampu ultra violet. Blower
menghembuskan udara halus melalui suatu kotak filter yang fungsi untuk mencegah
kontaminan yang berasal dari udara. Sementara itu, lampu ultra violet berfungsi untuk
mematikan kontaminan yang berada di permukaan dalam laminar, permukaan dalam
laminar dilap dengan kapas atau tissu yang sebelumnya dicelupkan dalam alkohol
70% dan lampu ultra violetnya dinyalakan selama 0,5-1jam (Hendaryono,1994 ).
Prinsip kerja Laminar Air Flow Cabinet
Lamianar Air Flow Cabinet digunakan sebagai meja kerja steril untuk
kegiatan inokulasi/ penanaman.
Laminar Air Flow Cabinet mengutamakan adanya hembusan udara steril yang
digerakkan oleh blower yang disaring oleh HEPA Filter.
Sebelum dioperasikan Laminar Air Flow Cabinet harus dinyalakan minimal
30 menit dan harus dilakukan penyemprotan dengan alcohol agar alat dan
ruang kerja tersebut terjamin kesterilannya.
Pada saat melaksanakan pekerjaan, harus dinyalakan blowernya yang
berfungsi sebagai penghembus udara steril dan lampu TL sebagai penerang.
Agar Laminar Air Flow Cabinet dapat difungsikan setiap saat, pemeliharaan
dan perawatan alat harus selalu dilakukan.
Cara kerja Laminar Air Flow Cabinet
Bersihkan meja kerja dengan menggunakan tissue, Semprot meja kerja
dengan menggunakan alkohol tanpa mengenai bagian filter HEPA.
43

Tutup kaca Laminar Air Flow Cabinet, kemudian nyalakan lampu UV selama
30 menit.
Setelah minimum 30 menit, matikan lampu UV dan buka kaca laminar air
flow cabinet serta nyalakan lampu TL dan blower.
Siapkan pisau scalpel dan pinset pada meja kerja steril Semprotkan alat
tersebut dengan menggunakan alcohol.
Bakarlah alat tersebut dengan menggunakan nyala api lampu spirtus. Lakukan
kegiatan inokulasi dengan hati-hati dan cermat sesuai dengan petunjuk kerja.
Bersihkan kembali Laminar air flow cabinet sehingga dalam kondis siap
pakai. Matikan blower dan lampu TL, tutup kembali pintu kaca meja steril.
Pada laminar air flow cabinet, terdapat 2 macam filter :
o Pre-filter, yang menggunakan saringan pertama terhadap debu-debu dan
benda-benda yang kasar. Pori-porinya kira-kira 5mm sehingga efisiensinya
dapat mencapai 95mm untuk objek-objek yang >5mm.
o HEPA filter dengan pori-pori 0.3 m dan terdapat pada bidang keluar udara
kearah permukaan tempat kerja.
Pre-filter harus sering dibersihkan dengan vacum cleaner dan sebaiknya
diganti 1 tahun sekali. Namun HEPA filter diganti setelah melalui pemeriksaan
dengan particulate count atau dengan alat yang disebut magnehelic gauge. Laminar
air flow cabinet ada yang dilengkapi dengan lampu UV, ada juga yang tidak. Pada
laminar air flow cabinet yang tidak dilengkapi dengan lampu UV, blower harus
dijalankan terus menerus walaupun laminar air flow cabinet tersebut sedang tidak
dipergunakan. Hal ini dilakukan untuk menjaga kebersihan ruang kerja didalam
laminar air flow tersebut. Pada laminar air flow yang dilengkapi dengan lampu UV.
dianjurkan agar menyalakan lampu UV. minimum 30 menit sebelum laminar air flow
digunakan. Ketika laminar air flow sedang digunakan, lampu UV harus dimatikan,
sedangkan blower dijalankan. Blower pada laminar air flow cabinet yang dilengkapi
dengan lampu UV, hanya dijalankan pada saat laminar air flow sedang digunakan. (
D.F.Wetherell,1976 )
44

Ukuran :
Panjang total : 80 cm
Lebar total : 75 cm
Tinggi total : 95 cm
Ruang kerja LAFC :
Panjang : 77 cm
Lebar : 42 cm
Tinggi : 61 cm
Bobot Total sekitar 75 kg.

Komponen dan bahan.
Sentrifugal Blower 90 watt, dengan setting dua kekuatan.
Lampu Ultra violet 15 watt, panjang gelombang < 320 nanometer (khusus
untuk sterilisasi).
Lampu neon 20 watt.
Bahan pelapis luar dan ruang kerja bagian dalam adalah plat Almunium.
Komponen dasar Mulipel blok.
Lapisan bagian dalam diberi lapisan peredam suara, sehingga suara mesin
sangat halus. lantai kerja almunium dilapis kaca tebal 5 mm di cat bagian
bawahnya putih.
Rangka luar filter Kawat persegi aluminium versi baru.
Komponen penutup ruang kerja adalah akrilik kualitas prima/bening.
Bagian dalam dilengkapi lapisan kaca setengah bagian untuk mengurangi
kontaminasi dari luar.
Dilengkapi dengan rangka meja besi yang kokoh khusus untuk meletakkan
LAFC.

45

Sterilisasi eksplan dapat dilakukan atau dilaksanakan dengan dua cara yaitu
secara mekanik dan secara kimia.
a. Sterilisasi eksplan secara mekanis. Cara ini digunakan untuk eksaplan yang
keras atau berdaging, yaitu dengan membakar eksplan tersebut diatas lampu
spirtus sebanyak tiga kali. Eksplan keras yang disterilkan dengan cara ini
adalah tebu, biki salak, bung, buah anggrek, akapulaga dan sebagainya.
Sterilisasi eksplan dengan cara kimiawi.
b. Sterilisasi secara kimiawi digunakan untuk eksplan yang lunak seperti daun,
tangkai daun, dan sebagainya. Bahan kimia yang sering dipakai untuk
disinfestasi adalah alkohol seperti etil, metil, atau isopropyl-alkohol dengan
konsentrasi 70-80%, Ca-hipoklorit atau Na- hipoklorit.
Macam-macam bahan untuk sterilisasi dan fungsinya:
1. Deterjen (Membershkan kotora/debu dari eksplan)
2. Fungisida (Memberihkan jamur/cendawan)
3. Bakterisida (Membersihkan bakteri)
4. Alkohol 70% dan 95%
5. Sodium hipoklorik dengan nama dagang clorox atau bayclin
6. Mercury chlorit dengan nama dagang sublima 0,05 %
7. Tween -20 (Agen pembasah)
8. Antibiotik
9. Iodine/betadine Antiseptik
Satu hal yang penting dalam sterilisasi permukaan eksplan adalah
mengkompromikan antara usaha untuk mendapatkan eksplan yang steril dan menjaga
agar jaringan eksplan tidak rusak akibat tingginya konsentrasi disinfektan. Untuk
meminimalkan tingkat kontaminasi dan mendapatkan pertumbuhan eksplan yang
cepat, beberapa perlakuan (threatment) terhadap tanaman induk sumber eksplan dapat
diterapkan sebagai berikut:
46

o Pemeliharaan tanaman induk di rumah kaca dengan pengendalian hama dan
penyakit tanaman secra intensif.
o Pemangkasan tanaman induk diikuti pemupukan yang seimbang. Flush atau
trubusan baru yang tumbuh setelah pemangkasan digunakan sebagai eksplan.
Flush yang tumbuh tersebut sebaiknya disemrot dengan fungisida sistemik (
Benlate) dan bakterisida ( Agrept) agar tumbuhnya lebih sehat.
o Perlakuan tanaman induk dengan temperatur yang tertentu seperti suhu rendah
(4oC) atau suhu tinggi (35oC).
o Perlakuan tanaman induk dengan ZPT seperti sitokonin atau giberelin.
Sitokonin untuk merangsang tumbuhnya tunas-tunas aksilar, sedangkan
giberelin untuk merangsang pemanjangan tunas.
Pemeliharaan tanaman induk dalam keadaan yang lebih higienis yaitu dengan
menumbuhkannya di dalam rumah kaca dengan pengendalian hama dan penyakit
tanaman yang intensif membuktikan dapat mengurangi tingkat kontaminasi eksplan
yang diambil dari tanaman tersebut, terutama yang disebabkan oleh cendawan.
Namun, cara ini sulit diterapkan untuk kontaminasi yang disebabkan oleh
mikroorganisme endofilik, terutama bakteri.
Eksplan atau kultur dapat terkontaminasi oleh berbagai mikrooganisme seperti
jamur, bakteri, serangga atau virus. Namun, sumber utama kontaminan adalah spora
jamur dan bakteri yang membentuk bagian alami dari atmosfer. Banyak yang bersifat
non-patogenik, artinya mereka tidak menyebabkan bahaya bagi tanaman inang pada
kondisi normal. Kontaminasi permukaan dapat diatasi dengan cara pencucian
menggunakan berbagai perlakuan bahan kimia. Keterbatasan utama adalah untuk
memberikan perlakuan yang cukup kuat untuk mengeliminasi kontaminasi tanpa
merusak jaringan tanaman. Ini biasanya dicapai dengan menambahkan detergen,
agitasi (digoyang goyang), atau membenamkan eksplan dengan sedikit tekanan
untuk mengilangkan gelembung udara yang mungkin mengandung mikroorganisme
(Hendaryono, 1994).
47

Kontaminasi yang disebabkan oleh mikroorganisme endofilik (organisme
yang hidup di dalam sel atau ruang antar sel tanaman) yang sering merupakan biote
dari tanaman sumber eksplan, sulit diatasi dengan sterilisasi permukaan. Keadaan ini
disebabkan oleh koloni baktri sering tidak muncul pada saat eksplan baru dikulturkan
pertama kali, tetapi beberapa minggu kemudian muncul koloni bakteri. Bakteri
tersebut tetap ada setelah disubkulturkan berkali-kali, karena hidupnya memang
secara epifit di dalam jaringan tanaman.
Eksudasi dari eksplan merupakan tipe kontaminasi yang lain, bukan dari
organisme lain. Ketika jaringan tanaman terluka, dengan cara pemotongan atau
perlakuan bahan kimia seperti larutan klorin, reaksi fisiologis terjadi pada sel sekitar
luka. Salah satu prosesnya adalah produksi bahan biokimia apakah sebagai produk
pecahan atau sintesa sebagai mekanisme perlindungan. Keluarnya substansi dari
jaringan akan terjadi. Bahan kimia ini mungkin atau mungkin tidak memberi
pengaruh mematikan pada pertumbuhan kultur (Imron, 2007).
Eksplan sendiri adalah bagian tanaman yang dipakai untuk bahan budidaya
atau kultur jaringan. Eksplan yang baik adalah :
a) Bagian tanaman yang masih muda
b) Diambil dari tanaman yang tumbuh subur dan sehat
c) Dinding sel amsih tipis dan belum berpembuluh kayu
d) Bersifat merismatik atau meristemoid.
Sterilisasi sangat penting karena :
a) Jasad renik yang terbawa eksplan akan tumbuh menutupi eksplan dan
media sehingga dapat menghancurkan jaringan yang akan ditanam.
b) Adanya jasad renik akan mengubah lingkungan karena hilangnya zat
makanan di media dan dilepaskan produk metabolit tambahan ke
dalam media dan dilepaskannya produk metabolit tambahan ke dalam
media, sehingga dapat menghancurkan eksplan yang akan ditanam.

48

Hal-hal yang perlu diperhatikan dalam kegiatan inisiasi/penanaman yakni
sebagai berikut : ( Hawaauriz, 2009 ).
1. Alat dan bahan yang dimasukkan dalam laminar harus dipastikan dalam
keadaan steril sehingga perlu dilakukan penyemprotan dengan alkohol 70
%.
2. Untuk mengurangi masuknya mikroorganisme yang tidak diinginkan,
sebelum membuka tabung kultur sebaiknya mulut tabung digarang pada api
terlebih dahulu
3. Kegiatan penanaman diusahakan dilakukan dengan cepat, karena semakin
cepat dilakukan penanaman maka eksplan tidak akan terlalu lama berikatan
dengan oksigen sehingga kemungkinan untuk browning semakin kecil.
Sebagai sumber utama kontaminan, eksplan memiliki perlakuan khusus pada
proses sterilisasinya. Diantranya adalah pencucian dengan menggunakan deterjen
ditujukan untuk menghilangkan sisia-sisa tanah pada umbi eksplan. Selanjutnya di
rendam dalah alcohol untuk menghilangkan atau membunuh kuman. Selanjutnya
dicelupkan pada larutan klorok untuk membunuh mikroba terutama yang ada di
bagian dalam eksplan. Digunakan pula fungisida untuk membunuh spora ataupun
cendawan yang diperkirakan ada pada eksplan.
Praktikum kultur jaringan kali ini, eksplan yang digunakan adalah daun bunga
begonia dan ditanam pada media yang telah dibuat sebelumnya yaitu Media MS.
Setelah dilkukan penanaman, eksplan tersebut diamati selama kurang lebih 2 minggu,
untuk mengetahui apakah terjadi kontaminasi pada eksplan ataupun media.
Adapun kontaminasi yang sering terjadi pada kultur jaringan tanaman terdiri
atas dua jenis yaitu kontamiasi oleh bakteri dan kontaminasi oleh jamur. Untuk
membedakan kedua jenis kontaminasi ini, dapat dilihat dari ciri-ciri fisik yang
muncul pada eksplan maupun media kultur. Bila terkena kontaminasi bakteri maka
tanaman akan basah atau menyebabkan adanya lendir, hal ini dikarenakan bakteri
langsung menyerang terhadap jaringan dari tubuh tumbuhan itu sendiri. Sedangkan
49

bila terkontaminasi oleh jamur, tanaman akan lebih kering dan akan muncul hifa
jamur pada tanaman yang terserang dan biasanya dapat dicirikan dengan adanya garis
garis (seperti benang) yang berwarna putih sampai abu abu. Penyebab terjadinya
kontaminasi bisa diakibatkan karena kesalahan pada saat penanaman, saat sterilisasi
media dan eksplan atau bahkan pada saat pembuatan media.
Berdasarkan pengamatan dilakukan selama 2 minggu (3 kali pengamatan)
ternyata ketiga eksplan terkontaminasi. Adapun pada pengamatan pertama (2 hari
setelah penanaman) kondisi eksplan dan media tumbuh kultur masih dalam keadaan
baik. Sedangkan pada pengamatan kedua, eksplan dan media kultur telah
terkontaminasi oleh jamur. Hal ini ditunjukkan dengan adanya kontaminan yang
berwarna putih dan membentuk seperti benang (hifa). Begitupun pada pengamatan
selanjutnya, kontaminasi yang terjadi oleh jamur makin jelas dan terlihat begitu nyata
karena hampir seluruh bagian permukaan eksplan dan media kultur ditumbuhi oleh
jamur. Kontaminasi bisa terjadi dikarenakan adanya kesalahan atupun kurang
optimalnya dalam penanaman maupun melakukan hal lain yang dapat mendukung
keberhasilan kultur jaringan tersebut, terutama dalam hal sterilisasi.









50

V. SIMPULAN DAN SARAN

A. SIMPULAN
Berdasarkan hasil pengamatan dan pelaksanaan praktikum kultur jaringan
tanaman acara Penanaman Eksplan dapat diperoleh beberapa simpulan sebagai
berikut :
1. Penanaman eksplan dilakukan di LAF (Laminar Air Flow). Penggunaan alat
sebelumnya sudah dalam keadaan steril. Penanaman dilakukan dengan cara
mencelupkan scalpel dan pinset ke dalam alcohol 96% lalu dibakar pada nyala
api Bunsen. Setelah itu alat baru bisa digunakan untuk menanam. Pada setiap
botol kultur, diisi 1 potong eksplan.
2. Pada eksplan daun begonia terjadi kontaminasi oleh jamur, hal ini ditunjukkan
dengan adanya kontaminan yang berwarna putih dan membentuk seperti
benang (hifa).
3. Kontaminasi bisa terjadi dikarenakan adanya kesalahan atupun kurang
optimalnya dalam penanaman maupun melakukan hal lain yang dapat
mendukung keberhasilan kultur jaringan tersebut, terutama dalam hal sterilisasi.
B. SARAN
Dalam pemilihan eksplan terutama eksplan yang berasal dari daun, sebaiknya
memilih daun yang bertekstur lebih keras / kaku. Begitu juga dalam hal pemotongan
eksplan, sebaiknya dibentuk lebih lancip untuk bagian yang akan ditanam guna
memudahkan dalam proses penanaman eksplan.


51