Anda di halaman 1dari 33

Praktikum Halal, 27 Juni 2014

BAB I
LANDASAN TEORI
Ringkasnya metode elektroforesis ini mulai berkembang akhir abad ke 19 setelah
ditemukan penelitian yang menunjukkan adanya efek dari listrik terhadap partikel-partikel
atau molekul-molekul yang bermuatan listrik, dalam ha1 ini termasuk juga protein
(PORNE, !"#N$%E, &'R()* (alm R#$&'R(+ON dkk, 19,-.* /enurut P'++E"R
dkk* (19,,. elektroforesis berasal dari bahasa )unani yang mempunyai arti transport atau
perpindahan melalui partikel-partikel listrik*
1. 1. Struktur dan fungsi protein.
+ebelum melakukan metode elektroforesis guna mengetahui suatu populasi
ataupun sistematik dari suatu jenis he0an ataupun tumbuhan, sebaiknya didasari
terlebih dahulu dengan pengetahuan mengenai biokimia protein serta pengetahuan
tentang metode elektroforesis*
1ila dilihat dari struktur protein, hampir sebagian besar sel terbentuk dari
protein, karena di dalam sel bahan ini men2apai lebih dari separuh berat kering sel*
Protein akan menentukan bentuk dan struktur sebuah sel serta bertindak sebagai alat
utama pengenalan antar molekul dan proses katalis* 3alaupun (N' menyimpan
informasi yang dibutuhkan untuk sebuah sel, peran langsungnya sangat ke2il dalam
proses-proses di dalam sel (1R"$E dkk 1994.*
%onformasi tiga demensi sebuah molekul protein ditentukan oleh urutan asam
aminonya* (alam hal ini struktur pelipatannya dimantapkan oleh interaksi-interaksi
non ko5alen antara bagian-bagian yang berbeda dalam rantai polipeptida* 'sam-asam
amino dengan rantai-rantai samping yang hidrofobik 2enderung menggerombol di
bagian sebelah dalam molekul, dan interaksi-interaksi ikatan hidrogen lokal antara
ikatan-ikatan peptids yang berdekatan menyebabkan terbentuknya alpha heli6 dan beta
sheet*
1R"$E dkk* (1994. mengatakan bah0a di dalam istilah komputer, (N' dan
mRN' dapat disamakan sebagai 7perangkat lunak atau soft0are7 yaitu rangkaian
perintah yang diterima oleh sebuah sel dari induknya* +edangkan protein dan molekul-
Praktikum Halal, 27 Juni 2014
molekul RN' yang katalitik dapat dianggap sebagai 7perangkat keras atau hard0are7,
yakni mesin pengeksekusi program-program yang tersimpan dalam memori*
(N' dan RN' adalah rantai-rantai nukleotida yang se2ara kimia hampir tidak
saling berbeda, sedangkan sebaliknya protein terbuat dari 2ampuran 89 ma2am asam
amino yang sangat berlainan, masing-masing dengan sifat kimianya yang khas*
%eragaman inilah yang memungkinkan sifat kimia yang serba 2anggih dimiliki oleh
setiap protein, dan ini diduga dapat menjelaskan mengapa e5olusi telah memilih
protein dari pada molekul RN' sebagai katalisator yang terbesar reaksinya di dalam
sel (1R"$E dkk 1994 dan R#$'R(+ON dkk* 19,-.*
/enurut +$&":; < +$&#R/ER(19=9. ada 1- asam amino yang berbeda
yang digunakan oleh he0an, dan masing-masing asam amino tersebut mempunyai
rantai samping yang berbeda pula* Rantai-rantai tersebut sangat berbeda dalam ukuran,
bentuk, dan perintah* Perintah tersebut dapat positif, negatif atau netral, ber5ariasi
untuk asam amino yang berbeda dan juga akan ber5ariasi dengan p& untuk setiap asam
amino*
+edangkan fungsi biologi sebuah protein menurut 1R"$E dkk* (1994. dan
R#$&'R(+ON dkk* (19,-. bergantung pada sifat-sifat kimia rin2i di permukaannya*
empat-tempat pengikatan yang berupa rongga-rongga di permukaan protein dibentuk
oleh penempatan rantai-rantai samping asam amino se2ara tepat melalui pelipatan
protein* (engan mengikat sangat ken2ang molekul-molekul antara pada reaksi-reaksi
yang tidak mantap, en>im-en>im mengkatalis perubahan-perubahan kimia pada
molekul-molekul substrat yang terikat, sering kali dengan bantuan molekul-molekul
ko-en>im yang ke2il dan terikat ken2ang untuk menambah ke2anggihan kimia0inya*
:aju-laju rekasi en>im sering dibatasi oleh difusi namun dapat ditingkatkan bila en>im
dan substratnya dikurung dalam kompartement ke2il yang sama*
Praktikum Halal, 27 Juni 2014
Protein alosterik dapat berubah-ubah bentuk bila ada ligan (sebuah molekul
protein mengikat sebuah molekul lain, maka molekul kedua disebut dengan ligan.
yang terikat pada permukaannya* Perubahan yang ditimbulkan oleh sebuah ligan sering
berpengaruh terhadap pengikatan ligan yang lain, karena itu membentuk suatu
mekanisme untuk pengaturan berbagai proses dalam sel* Perubahan-perubahan protein
seperti itu dapat dibuat terarah apabila diberi energi kimia tambahan* sebagai 2ontoh,
apabila 'P, protein-protein dapat melakukan kerja yang bermanfaat misalnya
membangkitkan gaya mekanik atau memompa ion-ion agar dapat memintas sebuah
membran* 7/esin-mesin protein7 yang sangat efisien dapat dibentuk dengan 2ara
menyertakan protein-protein yang selalu bergerak ke dalam kompleks-kompleks
multien>im? kompleks protein sema2am ini tampaknya berfungsi menyelenggarakan
berbagai reaksi biologi yang utama 1R"$E dkk* (1994. dan R#$'R(+ON dkk*
(19,-.*
(N' dapat diisolasi dari setiap bagian mahkluk hidup yang mengandung
nukleus@ inti sel, dengan langkah-langkah berikut A
o Pengumpulan@panen sel-sel (2ell har5est.
o Peme2ahan sel-sel (2ell lysis.
o Pen2ernaan protein agar asam nukleat dilepaskan (protein digestion.
o Pengendapanan (N' ((N' pre2ipation
1. 2. Prinsip
'da tiga prinsip utama dalam isolasi (N' yakni penghan2uran (lisis., ektraksi
atau pemisahan (N' dari bahan padat seperti selulosa dan protein, serta pemurnian
(N'* Prinsip elektroforesis agarose adalah teknik pemisahan asam nukleat@ protein
berdasarkan perbedaan medan listrik, molekul dan partikel bermuatan akan bergerak
ke arah elektrode yang memiliki muatan berla0anan di ba0ah pengaruh medan listrik*
Prinsip elektroforesis +(+-P'BE (+odium (ode2yl +ulfate-Polya2rilamide Bel
Rea2tion. teknik pemisahan protein darah dengan migrasi komponen a2rilamida
berdasarkan perbedaan berat molekul*
1. 3. Difinisi Eektroforesis.
Praktikum Halal, 27 Juni 2014
Elektroforesis adalah suatu 2ara analisis kimia0i yang didasarkan pada
pergerakan molekul-molekul protein bermuatan di dalam medan listrik (titik
isoelektrik.* Pergerakan molekul dalam medan listrik dipengaruhi oleh bentuk, ukuran,
besar muatan dan sifat kimia dari molekul (#R'3'N# 199-.* Pemisahan dilakukan
berdasarkan perbedaan ukuran berat molekul dan muatan listrik yang dikandung oleh
makro-molekul tersebut* 1ila arus listrik dialirkan pada suatu medium penyangga yang
telah berisi protein plasma maka komponen-komponen protein tersebut akan mulai
bermigrasi (R#$'R(+ON dkk* 19,-.*
/enurut +ENE+& dalam #R'3'N# (199-. teknik elektroforesis dapat
dibedakan menjadi dua 2ara, yaitu A elektroforesis larutan (mo5ing boundary
ele2trophoresis. dan elektroforesis daerah (>one ele2trophoresis.* Pada teknik
elektroforesis larutan, larutan penyangga yang mengandung makro-molekul
ditempatkan dalam suatu kamar tertutup dan dialiri arus listrik* %e2epatan migrasi dari
makromolekul diukur dengan jalan melihat terjadinya pemisahan dari molekul (terlihat
seperti pita. di dalam pelarut* +edangkan teknik elektroforesis daerah adalah
menggunakan suatu bahan padat yang berfungsi sebagai media penunjang yang berisi
(diberi. larutan penyangga*
Elektroforesis (N' merupakan teknik untuk memisahkan sampel (N'
berdasarkan atas ukuran (berat molekul. dan struktur fisik molekulnya* Bel yang biasa
digunakan antara lain agarosa* (engan gel agarosa dapat dilakukan pemisahan sampel
(N' dengan ukuran dari beberapa ratus hingga 89*999 pasang basa (pb.*
/olekul (N' bermuatan negatif sehingga di dalam medan listrik akan
bermigrasi melalui matriks gel menuju kutub positif (anode.* /akin besar ukuran
molekulnya, makin rendah laju migrasinya* 1erat molekul suatu fragmen (N' dapat
diperkirakan dengan membandingkan laju migrasinya dengan laju migrasi fragmen-
fragmen molekul (N' strandar (marker. yang telah diketahui ukurannya* Cisualisasi
(N' selanjutnya dilakukan di ba0ah paparan sinar ultra5iolet setelah terlebih dulu gel
direndam di dalam larutan etidium bromid*
/obilitas fragmen (N' pada gel elektroforesis sangat dipengaruhi oleh
komposisi dan kelarutan ion buffer elektroforesis* Dika konsentrasi ion-ion sangat
sedikit maka konduktifitas listrik sangat ke2il dan migrasi (N' menjadi lambat*
Praktikum Halal, 27 Juni 2014
%onsentrasi ion yang berlebih akan mengakibatkan gel men2air dan (N'
terdenaturasi* +elain buffer elektroforesis, teknik elektroforesis (N' juga memerlukan
loading buffer* 1uffer ini berfungsi meningkatkan densitas sampel sehingga fragmen
tersebut berada di dasar 0ell dan tidak menyebar* Eungsi lainnya adalah memberi
0arna pada fragmen (N' sehingga mempermudah pengamatan proses elektroforesis*
1uffer ini dapat juga membantu pergerakan sampel ke anoda* "kuran fragmen (N'
hasil pemotongan dengan endonuklease restriksi dapat ditentukan dengan memakai
penanda (N' (marker.* Penanda (N' adalah fragmen (N' yang telah diketahui
ukurannya (+ambrook et al*19,9.*
/edia penunjang yang biasa dipakai adalah gel agarose, gel pati, gel
poliakrilamida dan kertas sellulose poliasetat* 'dapaun menurut +'RBEN <
BEORBE (19=F. elektroforesis daerah disebut sebagai elektroforesis gel dengan dua
buah model yaitu hori>ontal dan 5ertikal* /etode yang biasa digunakan adalah model
hori>ontal, karena mempunyai beberapa keuntungan yaitu peralatan yang digunakan
sangat sederhana, relatif murah dan pemisahan untuk en>im tertentu dapat
menghasilkan pemisahan yang lebih baik*
a. Elektroforesis Bel (Bel Ele2trophoresis.
Elektroforesis Bel A teknik pemisahan dari (N', RN', dan protein
menggunakan dan protein menggunakan arus listrik pada matrik gel*
/etode elektroforesis gel
Elektroforesis gel agarosa ('garose Bel Ele2trophoresis.A digunakan untuk
separasi (N' dan RN' (899-F9,999 pg . asangan basa.
Elektroforesis gel poliakrilamid (Polia2rylamide gel ele2trophoresis.A digunakan
untuk separasi protein, dan (N'@RN' molekul Gke2ilH
Elektroforesis kapiler ($apillary ele2trophoresis.
Praktikum Halal, 27 Juni 2014
1. !. "egunaan #etode Eektroforesis.
elah disebutkan di atas bah0a pola protein tertentu dari satu spesies he0an
berbeda, se2ara elektroforesis akan memperlihatkan pola protein yang berbeda pula
pada he0an lainnya* Eaktor tersebutlah yang menyebabkan pola protein dapat
digunakan untuk membedakan spesies he0an* Perbedaan pola protein inilah yang
seringkali digunakan sebab untuk membedakan populasi se2ara tepat kadangkala tidak
dapat dilakukan apabila hanya menggunakan pengamatan melalui morfologis saja*
Eenomena ini pula yang menyebabkan metode elektroforesis banyak dilakukan untuk
pengamatan taksonomi, sistematik dan genetik serta untuk mengindentifikasi spesies
he0an maupun tumbuhan (bio-sistematik.* (apat pula digunakan untuk melihat
phylogeneti2 re2onstru2tion (rekonstruksi se2ara Eilogenetik. dari suatu jenis he0an
atau tumbuhan*

Praktikum Halal, 27 Juni 2014
1. $. Eektroforesis.
+ebelum dilakukan per2obaan sebaiknya disiapkan dahulu alat dan bahan kimia
yang akan digunakan* 'lat yang biasa digunakan adalah tabung Eppendorf,
mikropipet, tip, mortat, tabung Erlenmeyer, gelas ukur, penangas air (dengan suhu
,9I$., magneti2 stir rer, magne2ti2 bar, sentrifuga, pinset, timbangan, pompa 5a2um,
2etakan gel 89 6 1- 6 1 2mJ, timer, meja pendingin, pembungkus plastik, free>er,
ka0at halus untuk memotong gel, inkubator, po0er supply, pisau, penggaris, spidol,
kantong plastik tebal untuk menyimpan gel setelah pe0arnaan, nampan plastik, spons
dan alat-alat tulis*
+edangkan untuk bahan kimia yang digunakan, tergantung dari he0an atau
tumbuhan en>im apa yang akan diuji* +eperti misalnya larutan pengekstra yang
digunakan untuk jenis udang-udangan berdasarkan (#$%+ON dkk, (19,J. adalah
menggunakan sistem en>im Esterase (E+., dan /alat dehidrogenase (/(&.*
3#%NE+3'R# (199F. menggunakan /alik En>im (/E., serta $&E:#'% < P#E:
(19,4. menggunakan Phosphat glukosa isomerase (PB#. dan lain sebagainya* "ntuk
menentukan sistem en>im tersebut sebelumnya dilakukan uji optimalisasi terlebih
dahulu terhadap he0an yang akan diujikan*
$ara kerja terdiri dari beberapa tahap yaituA 1* ekstraksi en>im, 8* pembuatan
gel pati, J* penempatan sampel, 4* proses elektroforesis, F* 5isualisasi sistem en>im, -*
obser5asi gel dan =* /etode analisis*
1* Ekstraksi en>im
+etelah sample dibersihkan ditempatkan di dalam mortar dan diberi larutan
pengekstrak sebanyak K 899 L (tergantung dari banyak, sedikitnya sampel atau
besar ke2ilnya sampel.* %emudian sampel digerus hingga halus* Penggerusan
dilakukan pada kondisi dingin (K4I$. dan dilakukan di dalam meja pendingin,
agar suhu tetap konstan* &asil gerusan tersebut dimasukkan ke dalam tabung
Eppendorf dan kemudian dilakukan sentrifuse dengan ke2epatan 8999 rpm selama
89 menit* +upernatan yang didapat dipisahkan dari endapan, yang selanjutnya
dimasukkan ke dalam tabung Eppendorf dan disimpan dalam lemari pendingin
(Eree>er. dengan suhu sekitar -=9I$*
Praktikum Halal, 27 Juni 2014
8* Pembuatan gel pati*
Pembuatan gel pati biasanya berma2am ma2am* 'da yang berasal dari pati
kentang, dan lain sebagainya* +etelah ditentukan banyaknya pati, maka diberikan
larutan buffer morfolin sitrat dengan p& -*1 sebanyak JF9 ml di dalam labu
erlenmeyer 1999 ml* $ampuran tersebut kemudian dipanaskan dalam penangas air
dengan suhu K ,9 I$, selama 8F menit* Panaskan lagi dengan magneti2 bar dan
diaduk dengan menggunakan magneti2 strirer selama F menit hingga mengental
membentuk gel yang bening*
+etelah gel mendidih, dilakukan pengisapan gelembung udara dengan 2ara diisap
dengan 70ater jet pump7 dan setelah dingin, gel dituangkan ke dalam 2etakan gel
yang berukuran 89 6 1- 6 1 2mJ hingga rata dan biarkan mengeras pada suhu
kamar lebih kurang -9menit*
J* Penempatan sampel
Bel dilepaskan dari 2etakan gel dengan 2ara mengiris keliling tepi gel dengan
menggunakan pisau* 1agian ujung gel diiris kira 8 2m dari salah satu tepinya yaitu
dari arah kotada yang dipakai sebagai penyimpan ekstra en>im*
Ekstrak en>im yang akan diuji dikeluarkan dari free>er dan biarkan sebentar
hingga men2air* Pengambilan ekstrak en>im dilakukan dengan 2ara men2elupkan
kertas saring berukuran -61F mm ke ekstrak en>im* Potongan kertas saring yang
telah berisi ekstrak en>im diletakkan dengan posisi tegak lurus ke 2elah irisan gel*
Darak antara 2elah 1-1*F mm* +ebagai indikator adanya pergerakkan maka pada
2elah irisan gel tersebut diberikan sedikit biru brom fenol*
4* Proses elektroforesis
Bel yang telah siap kemudian diletakkan se2ara hori>ontal di atas kotak
elektroforesis yang telah berisi larutan penyangga elektroda* Proses ini dilakukan
di dalam lemari pendingin dengan suhu 4 I$*
Praktikum Halal, 27 Juni 2014
%edua sisi gel diberi spons yang telah dibasahi dengan larutan penyangga
elektroda sebagai jembatan antar larutan penyangga elektroda dengan gel* +etelah
itu gel ditutup dengan plastik dan di atas gel tersebut diberi gel yang dingin*
Proses elektroforesis dijalankan dengan memberi daya listrik pada gel* Pemberian
daya listrik disesuaikan dengan sampel yang akan digunakan, misalnya sebesar F9
- =9 L', F9--9 L' atau 4F-FF L' selama kurang lebih J jam*
+etelah terlihat bah0a biru brom fenol men2apai titik yang berjarak K J 2m
dari ujung gel, maka proses elektroforesis dihentikan* 1agian gel yang tidak
terpakai dipotong, sedangkan potongan gel yang menjadi tempat migrasi en>im
diiris tipis se2ara hori>ontal dengan menggunakan gergaji yang berka0at tipis*
Bel diiris menjadi beberapa lembar gel yang kemudian setiap lembar diletakkan
dalam 0adah plastik, untuk selanjutnya di0arnai sesuai en>im yang akan
dianalisis*
F* Cisualisasi sistem en>im
Cisualisasi sistem dilakukan dengan pe0arna biokimia* (engan komposisi yang
telah ditentukan sebelumnya*
-* /etode analisis
(alam hal ini 2ara menganalisa hasil pita dari elektroforesis tersebut sangat
tergantung dari topik apa yang akan diteliti* &asil 5isualisasi en>in berupa bintik
atau noda yang disebut pola pita (bandmorp.* /a2am pola pita dibedakan atas tipe
pola pita yang terbentuk* +emua tipe pola pita yang berbentuk diinterpretasikan
sebagai lokus iso>im dan alel yang kemudian dijadikan dasar dalam pengukuran
parameter-parameter yang ada dalam suatu populasi (NE# 19==? 1RO3N <
3E#R 19,J? RO&E 199F.* :okus iso>im adalah struktur gen yang memiliki
kemampuan menghasilkan en>im pengkatalisis reaksi biokimia tertentu,
sedangkan alel adalah salah satu dari dua atau lebih bentuk gen yang dapat
Praktikum Halal, 27 Juni 2014
mun2ul pada satu lokus (+";"%# dkk* 199J.* /etode analisis dapat dilakukan
dengan beberapa 2ara misalnya metode analisis ekspresi alel, atau metode analisis
fenetik dan lain sebagainya*
+edangkan untuk menangani sampel dari mulai pengambilan di lapangan hingga
penyimpangan dapat diterangkan sebagai berikutA
%oleksi +ampel
'gar proses elektroforesis dapat berhasil dengan baik, tidak lepas dari proses
pengambilan sampel di lapangan* "ntuk pengambilan sampel sangat
diperlukan pengertian dan pengetahuan yang benar terhadap metode serta
sampling yang digunakan* (isamping juga pengetahuan mengenai dasar bio-
kimia dari protein* %arena proses elektroforesis sangat berpengaruh dengan
jaringan-jaringan dan protein yang terdapat pada he0an koleksi*
+ampel yang akan diambil sedapat mungkin harus segar atau untuk he0an
diusahakan agar tetap hidup dan tidak boleh dia0etkan dengan menggunakan
bahan penga0et alkohol ataupun formalin* 'tau apabila he0an tersebut mati,
maka sebaiknya disimpan dalam bentuk dingin atau membeku (masukkan
dalam i2e bo6 yang diberi dry es atau masukkan ke dalam larutan nitrogen
2air.*
Penanganan dan Penyimpanan +ampel
'pabila telah diperoleh sampel yang diinginkan, maka sampel segera diba0a
ke laboratorium untuk disimpan ke dalam free>er dengan suhu -F9I$* +ampel-
sampel tersebut dapat disimpan dalam jangka 0aktu panjang, hingga proses
elektroforesis siap dilakukan* +ebelum dimasukkan ke dalam free>er, sampel
disimpan dalam kotak plastik atau bila dalam bentuk jaringan atau supernatan
dapat dimasuukan ke dalam tabung Eppendorf*
Ba%an
Praktikum Halal, 27 Juni 2014
1* +ampelA (aging sapi dan daging bagi
8* %it isolasi (&igh Pure P$R emplate Preparation %it.
a* issue :ysis 1uffer
b* Proteinase %
2* 1inding 1uffer
d* #nhibitor Remo5al 1uffer
e* 3ash buffer
f* Elution buffer
g* $olle2tion ube
h* Eilter tube
Aat
1. /i2rosentrifuge tube Col* 1,F ml (steril.
8* /i2ropipette 89-899 Ll
J* /i2ropipette 199-1999 Ll
4. ips kuning (89-899 Ll. steril
5. ips biru (199-1999 Ll. steril
6. angkai pisau bedah dan pisau bedah (steril.
=* 'luminium Eoil
,* Corte6
9* +entrifugator
Prosedur
Praktikum Halal, 27 Juni 2014
1* (aging sapi dan daging babi masing-masing dipotong halus dan ditimbang 199 mg*
kemudian masing-masing dimasukkan ke dalam /i2rosentrifuge ube untuk 1,F ml
yang telah diberi label
8* /asing-masing tube tersebut ditambahkan 899 Ll issue :ysis 1uffer, kemudian
dihomogenkan dengan 2ara up and do0n*
J* /asing-masing ditambahkan 49 Ll Proteinase %, dihomogenkan dengan 5orte6
selama 8 menit*
4* %edua tube tersebut diinkubasi dalam 0ater bath bersuhu FF-F= $ selama 84 jam*
F* /asing-masing tube ditambahkan 899 Ll 1inding 1uffer (berfungsi untuk mengikat
(N' agar terikat dalam filter., di5orte6 8 menit, dan diinkubasi dalam 0ater bath =9
$ selama 19 menit hingga membentuk larutan yang homogeny* ( jika belom
homogeny, 0aktu inkubasi ditambahkan.*
-* /asing-masing ditambahkan 199 Ll #sopropanol 'bsolut untuk presipetasi (N',
di5orte6 1 menit
=* /asing-masing 2ampuran dipipet seluruhnya dan dimasukkan ke dalam Eilter ube
yang telah dipasangkan $olle2tion ube* (i5orte6 8 menit, kemudian disentrifugasi 1
menit dengan ke2epatan ,=99 rpm* $airan yang mele0ati filter dibuang bersamaan
2olle2tion tube* Eilter tube dipasangkan dengan 2olle2tion tube baru*
,* /asing-masing ditambahkan F99 Ll #nhibitor Remo5al 1uffer* (i5orte6 8 menit,
kemudian disentrifugasi 1 menit dengan ke2epatan ,=99 rpm* $airan yang mele0ati
filter dibuang bersamaan 2olle2tion tube* Eilter tube dipasangkan dengan 2olle2tion
tube baru*
9* /asing-masing ditambahkan F99 Ll 0ash buffer* (i5orte6 8 menit, kemudian
disentrifugasi 1 menit engan ke2epatan ,=99 rpm* $airan yang mele0ati filter
dibuang bresaaan 2olle2tion tube* Eilter tube dipasangkan dengan 2olle2tion tube baru*
19* /asing-masing ditambahkan kembali F99 Ll 0ah buffer* (i5orte6 8 menit, kemudian
disentrifugasi 1 menit dengan ke2epatan ,=99 rpm*
Praktikum Halal, 27 Juni 2014
11* $airan yang mele0ati filter dibuang, 2olle2tion tube dipasangkan kembali*
(isentrifugasi 8 menit dengan ke2epatan ,=99 rpm untuk menghilangkan sisa 3ash
1uffer* $airan yang mele0ati filter dibuang bersamaan 2olle2tion tube* Eilter tube
dipasangkan dengan /i2rosentrifuge ube steril*
18* /asing-masing ditambahkan 199 Ll Elution 1uffer (telah dihangatkan pada suhu =9
$ minimal F menit.* (i5orte6 8 menit, kemudian disentrifugasi 1 menit dengan
ke2epatan ,=99 rpm* Perlakuan ini dilakukan8 kali*
1J* Eilter tube dilepaskan dari /i2rosentrigue tube* Pada mi2rosentrifuge tube telah
mengandung (N' terpurifikasi dan disimpan pda suhu 8 $ untuk dianalisa
selanjutnya*
BAB II
Praktikum Halal, 27 Juni 2014
#ETODOLO&I
'udu Praktiku(
'nalisis (N' 1abi dan +api dengan metode Elektroforesis
Te(pat) Tangga Praktiku(
:aboratorium PN'* DumMat, 89 juni 8914
Ba%an
1* 'Nuabidest F99 ml
8* :arutan buffer 'E 19 6 ( mengandung 84*8 gr ris 1ase? 19 ml E(' 9,F / p&
,?F*= ml 's* 'setat Bla2ial? aNuabidest 'dd F99 ml.
J* 'garose
4* :oading (ye
F* Ethidium 1romide 19 mg@ml
Aat
1* /i2ropipette 1-19 Ll
8* ips putih 1-19 Ll
J* +atu set alat elektroforesis
4* 'luminium foil
F* Bel do2umentation
-* +patula
=* Belas ukur
,* Pipet tetis
9* %a2a arloji
Praktikum Halal, 27 Juni 2014
19* Erlenmeyer
11* &ot plate
Prosedur Pe(*uatan
a* Pembuatan buffer elektroforesis 'E 16, 1 liter
- F9 ml 'E 19 6 dimasukkan ke dalam labu ukur F99 ml
- 'dd aNuabidest sampai tanda batas dan dihomogenkan
b* Pembuatan gel agarosa 1O
- 9*F gr agarosa dilarutkan dengan F9 ml 'E 16
- (ipanaskan diatas hot plate sampai larutan menjadi bening dan mendidih*
(ihomogenkan*
- :arutan agarosa didiamkan hingga suhu -9 $ dan ditambahkan 8F Ll etidium
bromide 19 mg@l, diaduk hinga homogeny
- :arutan dituangkan pada gel 2aster dan 2omb disisipkan untuk membuat 0ell
(sumur.* :arutan agarose dibiarkan hingga mengeras*
- Bel diletakkan pada 2hamber ele2trophorsesis dengan posisi 0ell pada muatan
negati5e (0arna hitam.* %emudian buffer 'E 16 dituang hingga gel terendam
dalam 2hamber ele2trophoeresis namun tidak melebihi garis batas ma6 buffer*
2* :oading sample
- /asing-masing sebanyak F Ll (N' hasil isolasi ditaruh diatas aluminium foil*
%emudian masing-masingnya ditambahkan 1 Ll loading dye dan dihomogenkan
dengan menaik turunkan mikropipet*
- /asing-masing 2ampuran tersebut dipipet dan dimasukkan ke dalam 0ell agar
telah terpasang pada 2hamber
Praktikum Halal, 27 Juni 2014
d* Running sampel
- $hamber ditutu rapat dan kabel 2hamber dihubungkan dengan po0er supply
- Running sampel dilakukan selama 4F menit dengan 5oltase 99 Colt 499 m'*
e* (okumentasi gel agarose dengan gel (o2umentation
BAB III
+ASIL DAN PE#BA+ASAN
+ASIL
Praktikum Halal, 27 Juni 2014
Terlihat terbentuknya pita saat gel diamati diatas sinar UV.
Pe(*a%asan
+aat praktikum, kami melakukan elektroforesis dengan menggunakan sampel (N'
sapi dan (N' babi* Elektroforesis merupakan suatu teknik pemisahan molekul selular
berdasarkan ukurannya, dengan menggunakan medan listrik yang dialirkan pada suatu
medium yang mengandung sampel yang dipisahkan* eknik ini dapat digunakan dengan
memanfaatkan muatan listrik yang ada pada makromolekul, misalnya (N' yang bermuatan
negatif ()u0ono, 899F.* 'dapun perbedaan dari elektoforesis agarose dan +(+ P'BE
adalah pada +(+ P'BE yang dianalis adalah proteinnya* Prinsip kerjanya adalah jika
molekul yang bermuatan negatif ((N'. dile0atkan melalui suatu medium, misalnya gel
agarose, kemudian dialiri arus listrik dari satu kutub ke kutub yang berla0anan muatannya
(positif., maka molekul tersebut akan bergerak dari kutub negatif ke kutub positif
(Elektroforesis. melalui membran matriks gel agarose tersebut ()u0ono, 899F.*
(alam praktikum ini jenis elektroforesis yang digunakan adalah elektroforesis >ona
dan menggunakan teknik elektroforesis hori>ontal karena menggunakan gel agarose yang
diletakkan pada alat elektroforesis se2ara hori>ontal dan teknik ini difungsikan untuk
analisais (N'* Proses isolasi (N' terdiri dari tiga tahapan diantaranya, lisis jaringan dan
membran sel, pemisahan (N' dari protein sel, dan presipitasi (N'*
Praktikum Halal, 27 Juni 2014
+iapkan daging sapi dan daging babi lalu dipotong halus agar luas permukaan kontak
dengan reagen kimia lebih luas dan kemudian ditimbang* %emudian masing masing
dimasukkan ke dalam mi2rosentrifuge tube yang telah diberi label* +elanjutnya ditambahkan
Tissue lysis Buffer yang berfungsi untuk melisiskan sel* :isis sel berfungsi untuk
mengeluarkan (N' yang terdapat di dalam sel dapat dipisahkan untuk dianalisa* +elanjutnya
ditambahkan proteinase %* penambahan proteinase % digunakan untuk merusak protein yang
menyelubungi di sekeliling (N'* &al ini dilakukan agar (N' yang didapatkan merupakan
(N' murni yang tidak lagi terikat atau terselubungi oleh protein* +elanjutnya dilakukan
homogenasi dengan 5orte6 selama 8 menit* +elanjutnya dilakukan inkubasi selama 84 jam
pada water bath dengan suhu FF-F=
o
$* +etelah 84 jam, dilakukan penambahan binding buffer
bertujuan untuk mengikat (N' agar dapat terikat pada filter tube* +elanjutnya dilakukan
5orte6 untuk homogenisasi, dan diinkubasi dalam 0aterbath =9
o
$ selama 19 menit hingga
membentuk larutan yang homogen*
+elanjutnya ditambahkan isopropanol absolut yang berfungsi untuk mengumpulkan
(N' yang telah terpisah dan berada di lapisan air* :alu dilakukan 5orte6 selama 1 menit*
/asing masing 2ampuran lalu dipipet seluruhnya dan dimasukkan ke dalam filter tube yang
telah dipasangkan collection tube* +elanjutnya di5orte6 8 menit dan disentrifugasi 1 menit
dengan ke2epatan ,=99 rpm untuk memisahkan antara endapan (pellet. dan supernatant*
$airan yang mele0ati filter dibuang bersamaan collection tube* Filter tube dipasangkan
dengan collection tube baru* +elanjutnya masing - masing ditambahkan wash buffer yang
berfungsi untuk men2u2i (N' yang sudah diikat dari pengotor pengotor en>im en>im@protein
protein* Proses pen2u2ian ini dilakukan sebanyak 8 kali untuk memastikan (N' yang
didapatkan benar benar murni dan bebas dari segala ma2am pengotor* +etelah itu, dilakukan
5orte6 8 menit untuk homogenisasi dan lalu sentrifugasi dengan ke2epatan ,=99 rpm selama
1 menit*
%emudian, tanpa penambahan reagen dilakukan sentrifugasi kembali dengan
kekuatan rpm yang sama selama 8 menit untuk menghilangkan sisa wash buffer yang
mungkin masih terdapat pada sampel* $airan sisa wash buffer dibuang bersama dengan
2olle2tion tubenya* :alu dipasangkan mi2rosentrifuge steril pada filter tube* +elanjutnya
masing masing ditambahkan elusion buffer untuk mengelusi (N' yang telah murni* Elusion
buffer dapat berupa Tris &$l atau Tris E(' ldengan p& ,-,,F* +elanjutnya dilakukan
5orte6 selam 8 menit untuk homogenisasi lalu disentrifuge 1 menit* Perlakuan ini dilakukan
sebanyak 8 kali* +elanjutnya, filter tube dilepaskan* Microsentrifuge steril selanjutnya akan
Praktikum Halal, 27 Juni 2014
menampung (N' murni yang telah dilarutkan homogeny dalam buffer elusi yang telah siap
untuk dianalisa* 'pabila sampel tidak diguakan langsung, sampel disimpan pada suhu 8
o
$
untuk menjaga stabilitas*
(alam proses pengerjaan isolasi (N' harus steril, hati P hati, dan sediaan atau bahan
sesudah digunakan harus ditutup kembali agar tidak terkontaminasi dari mikroba* (engan
dilakukan proses tersebut maka analisa yang didapat akan baik dan bagus*
+elanjutnya proses pembuatan gel agarose, se2ara umum proses pembuatan gel
agarose dilakukan dengan 2ara men2ampurkan bubuk agarosa dengan larutan dengan F9 ml
'E, dipanaskan diatas Hot plate sampai mendidih* :arutan 'E merupakan suatu buffer
yang mengandung ris base, E(' 9*F/ dengan p& ,, asam asetat gla2ial, dan aNuabides*
%emudian didiamkan pada suhu -9Q$ ditambah etidium bromida diaduk sampai homogen*
1ubuk agarosa yang digunakan sebanyak 9,F gr dan larutan buffer F99 m: yang berperan
untuk memudahkan migrasi dari fragmen (N' berdasarkan perbedaan kekuatan ionik*
Penambahan etidium bromida dilakukan dengan tujuan me0arnai asam nukleat* Etidium
bromida adalah mutagen dan harus ditangani dengan hati-hati* Penanganannya harus
dilakukan dengan sarung tangan karet (1o0en 8999A 4.* $airan etidium bromida
ditambahkan dengan tujuan sebagai pe0arna fluoresen untuk mendeteksi asam nukleat,
sehingga hasil elektroforesis nanti dapat diamati diba0ah sinar "C* Etidium bromide akan
mengikat pasangan basa (N' dan dapat mengurangi mobilitas (N'* :arutannya ditiangkan
pada coaster dan Comb sampai agarosa tersebut mengeras* Penambahan buffer dilakukan
dengan tujuan mempermudah pengerasan gel saat dilakukan pemanasan* ahap selanjutnya
adalah gel dimasukan dalam 2hamber yang bermuatan negatif, kemudian buffer dituang
sampai gel terendam tapi tidak melebihi garis batas maksimum buffer* eknik elektroforesis
pada dasarnya berdasarkan pada fakta bah0a (N' 2enderung bermuatan negatif pada p&
netral dengan buffer sebagai penyangga p& agar saat dilakukan elektroforesis dengan
memberikan daya listrik di kedua kutub maka (N' akan bergerak kekutub positif, inilah
prinsip kerja elektroforesis gel agarosa*
ahap selanjutnya adalah men2ampurkan (N' hasil isolasi dengan loading dye yang
memiliki fungsi membantu sampel turun ke dalam well dan membantu memonitor berapa
lama proses elektroforesis telah berlangsung karena memiliki pe0arna bromofenol biru
(1o0en 8999A J.* Pemindahan sampel (N' dilakukan oleh dua orang praktikan se2ara
bergantian* Proses pemindahan dilakukan dengan memakai mikropipet dan harus dilakukan
se2ara hati-hati agar 2ampuran (N' dengan loading buffer tidak GmeluberH ke bagian 0ell
Praktikum Halal, 27 Juni 2014
yang lain* (N' memiliki muatan negatif ((N' mengandung gugus PO4. sehingga
diharapkan akan bergerak menuju kutub positif (/artin 199-A 9.*
Praktikum dilanjutkan dengan memasang penutup ruang elektroforesis dan diberikan
arus listrik* Bel dikeluarkan dari ruang elektroforesis setelah mengalami perubahan 0arna
dan dilihat dengan sinar "C* /edan listrik dialirkan pada suatu medium yang mengandung
sampel yang akan dipisahkan* eknik ini digunakan dengan memanfaatkan muatan listrik
yang adapada makromolekul, misalnya (N' yang bermuatan negatif* Dika molekul
yangbermuatan negatif dile0atkan melalui suatu medium, kemudian dialiri arus listrik dari
suatu kutub ke kutub yang berla0anan muatannya maka molekul tersebut akan bergerak dari
kutub negatif ke kutub positif* %e2epatan gerak molekul tersebut tergantung pada nisbah
muatan terhadap massanya serta tergantung pulapada bentuk molekulnya* +e2ara umum,
elektroforesis digunakan untuk memisahkan, mengidentifikasi, dan memurnikan fragmen
(N'* Pergerakan molekul terutama tergantung di muatan yang ada pada permukaan partikel,
tanda dan besarnya muatan pemba0a oleh 5ariasi group ionogenik* ergantung kepada
kekuatan molekul listrik dan p& dari medium, sehingga pemisahan molekul dapat terjadi
karena efek seleksi dan medium yang sesuai*
:arutan (N' yang bermuatan negatif dimasukkan ke dalam sumur-sumur yang
terdapat pada gel agarosa dan diletakkan di kutup negatif, apabila dialiri arus listrik dengan
menggunakan larutan buffer yang sesuai maka (N' akan bergerak ke kutup positif* :aju
migrasi (N' dalam medan listrik berbanding terbalik dengan massa (N'* /igrasi (N'
terutama ditentukan oleh ukuran panjang danbentuk (N'* Eragmen (N' yang berukuran
ke2il akan bermigrasi lebih 2epat dibanding yang berukuran besar, sehingga elektroforesis
mampu memisahkan fragmen (N' berdasarkan ukuran panjangnya*
(engan adanya Etilen 1romida yang berfungsi untuk 5isualisasi pada sinar "C
dimana urutan etidium bromida yang akan masuk diantara ikatan hidrogen pada (N',
sehingga pita fragmen (N' akan kelihatan diba0ah lampu "C 8F4 nm* &al ini sesuai
dengan praktikum yang kami lakukan dimana terlihat pita-pita ber0arna ketika dilihat pada
sinar "C 8F4 nm sehingga dapat kami simpulkan bah0a preparasi sampel yang kami lakukan
berhasil* Panjang amplikon bisa diperkirakan dengan membandingkannya dengan pita (N'
standar*
Pada penggunaan agar-agar untuk eletroforesis agarose, agar-agar yang digunakan
tidak boleh terlalu panas saat dituang ke dalam 2etakan karena jika terlalu panas 2etakan akan
retak retak dan agar-agar juga tidak boleh terlalu dingin karena agar-agar akan mengental dan
Praktikum Halal, 27 Juni 2014
tidak dapat menjadi sumur* +aat menuang agar-agar ke dalam 2etakan yang harus
diperhatikan adalah gelembung udara karena tidak boleh ada gelembung udara pada saat
men2etak agar-agar*
BAB I,
Praktikum Halal, 27 Juni 2014
PEN-T-P
%esimpulan
1* (ari hasil elektroforesis yang diperoleh bah0a telah terbentuk pita yang
mengidentifikasi (N' sapi dan (N' babi*
8* Panjang amplikon bisa diperkirakan dengan membandingkannya dengan pita (N'
standar*
+aran
1* Peralatan yang digunakan untuk praktikum sebaiknya ditambah sehingga memudahkan
untuk pengerjaan praktikum dan praktikan juga lebih memahami proses praktikum*
8* (alam proses pengerjaan isolasi (N' harus steril, hati P hati, dan sediaan atau bahan
sesudah digunakan harus ditutup kembali agar tidak terkontaminasi dari mikroba*
(engan dilakukan proses tersebut maka analisa yang didapat akan baik dan bagus*
Praktikum Halal, 27 Juni 2014
DA.TAR P-STA"A
1RO3N, '*&*( dan 1*+* 3E#R 19,J* /easuring Cariability in Plant Population* #n A +*(*
'N%+:E) and * D* ORON (eds*., #so>ymes in plant Beneti2s and 1reed ing* Part
'* Else5ier +2ien2e Publisers, 'msterdamA 819 pp*
1R"$E, '*, (* 1R')*, D* :E3#+, /* R'EE*, RO1ER+ dan D*(* 3'+ON 1994* 1iologi
/olekuler +el /engenai +el* Edisi kedua P* Bramedia Pustaka "tama, DakartaA J4-
hal*
$&E:#'%, 3* / dan D* '* P#E: 19,4* e2hniNues for +tar2h Bel Ele2trophoresis of
En>ymes from Eorest ree +pe2ies* #nformation Report P# - R - )8* Peta0a0a
National Eorestry #nstitute* $anadian Eorestry +er5i2e 'gri2ulture $anada A 18= pp*
(#$%+ON, R, +#EB/"N(*, +* +$&NE#(ER, &* D* :#N;EN, 1* B#E:EN+, $* PRE'"R*,
B* :ON#E*, R* %E::ER /'NN dan D* E* :O+PE#$& 19,J* $omplete 'mino
'2id seNuen2e of a Eun2tional "nit from a /ollus2an &emo2yanin (&eli6 pomatia.*
1iol* $hem* &oppe-+eyler J-, A -1= pp*
NE#, /* 19==* E-+tatisti2 and 'nalysis of Ben (i5ersity in +ubdi5ided Populations* 'nn*
&um* Benet, 41A8FF*
P'+E"R, N, B* P'+E"R*, E* 1ON&O//E*, D* $'':'N*, D* 1R#ON* dan
('C#(#'N*, 19,,* Pra2ti2al #so>yme Beneti2s* :aboratory of E2ologi2al Beneti2s,
"ni5ersity of /ontpellier 8* Eran2eA F4 pp*
R#$&'R(+ON, 1* D, P* R* 1'CER+O$% and /* '('/+ 19,-* 'llo>yme
Ele2trophoresis* ' &andbook for 'nimal +ystemati2s and Population +tudies*
'2ademi2 Press, #n2* +an (iego A 419 pp*
Praktikum Halal, 27 Juni 2014
RO&E, B* /* 199F* Ele2trophoresis of En>ymes* +pringer - Cerlag* 1erlin &eidelbergA 8=,
pp*
+'RBEN, D* R* dan +* B* BEORBE 19=F* /ethods in ;one Ele2trophoresis 1(&
$hemi2al :(* Poole EnglandA 819 pp*
DO"-#ENTASI
'* PREP'R'+# +'/PE:
Siapkan daging sapi dan daging sapi segar Bersihkan masing-masing daging secara
terpisah
Ambil bagian daging yang tidak berlemak
lakukan secara terpisah!
"#t#ng halus lakukan secara terpisah!
Timbang 1$$mg masing-masing %asukan ke tube terpisah
Praktikum Halal, 27 Juni 2014
Tambahkan &$$'l tissue lysis bu((er)
h#m#genkan
Tambahkan 4$'l pr#tein *) h#m#genkan
Corte6 8 menit &asil yang telah di5orte6, di#nkubasi di
0aterbath selama 84jam suhu -9-=9
PENBEN$ER'N :'R"'N 'E
'E %ON+ENR'+# 196 (#EN$ER%'N F9 ml dalam F99ml
Praktikum Halal, 27 Juni 2014
1* ':' 1'&'N
%# P$R RE'BEN )'NB (#B"N'%'N
$* #+O:'+# PROE#N
Praktikum Halal, 27 Juni 2014
S
Praktikum Halal, 27 Juni 2014
Praktikum Halal, 27 Juni 2014
(* PEN)'#'P'N BE: 'B'RO+E
Praktikum Halal, 27 Juni 2014
1ahan yang digunakan Pelarutan agarose
menggunakan 'E
Pemanasan
Praktikum Halal, 27 Juni 2014
Penambahan etidium
bromida
Penuangan pada pen2etak gel Penyisipan comb
:etakan gel pada 2hamber
elektroforesis
Penuangan buffer 'E #solat (N' disimpan diatas
aluminum foil
ambahkan loading dye Pemasukan sampel kedalam
sumur
Running sampel
Praktikum Halal, 27 Juni 2014
ISOLASI DNA DA&IN& SAPI DAN DA&IN& BABI DEN&AN
#EN&&-NA"AN "IT ISOLASI
HIGH PURE PCR TEMPLATE PREPARATION KIT
DIS-S-N OLE+ /
Ra%(i Sertiana 111110200001$
Ageng +asna . 1111102000011
Nind2a nurfitriani a3%ar 111110200004$
&ai% Nur%adi 1111102000103
#.A.5. "%airrurri6a 1111102000102
Ber2 7a%2in A 1111102000108
Praktikum Halal, 27 Juni 2014
Ana 9uiana 1111102000104
.A"-LTAS "EDO"TERAN DAN IL#- "ESE+ATAN
-NI,ERSITAS ISLA# NE&ERI S9ARI. +IDA9AT-LLA+ 'A"ARTA
201!