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Desarrollo de un mtodo analtico por cromatografa de lquidos

de alta resolucin para la cuantificacin de sulfxido de
albendazol en orina

Resumen
Se desarroll un mtodo analtico por CLAR y deteccin UV para la cuantificacin de
sulfxido de albendazol en orina. La extraccin en fase slida permiti concentrar la
muestra y cuantificar el metabolito en las concentraciones esperadas en orina despus de
administrar una dosis de albendazol.El mtodo fue selectivo, con un recobro absoluto >
80%; lineal (R2 > 0.99), preciso (CV < 7%) y exacto (diferencia 15% del valor nominal) en
el intervalo de concentraciones utilizadas (0.125 a 4 g/mL). La aplicabilidad del mtodo
se demostr mediante la determinacin del metabolito en dos voluntarios sanos a los que
se les administr una dosis oral de 400 mg (tabletas) de albendazol. No se detect sulfona
de albendazol en el perodo de recoleccin de las muestras.

Introduccin
El albendazol (5-propiltio-1H-bencimidazol-2-il carbamato de metilo) (ABZ) es un frmaco
antihelmntico de amplio espectro con demostrada actividad sistmica que presenta
efecto de primer paso y se transforma en un compuesto conocido como sulfxido de
albendazol (ABSO). Este cambio esta mediado por los sistemas flavin monooxigenasa y
citocromo P450. El ABSO se oxida al compuesto inactivo sulfona de albendazol (ABSO2) va
citocromo P450. Debido al extenso metabolismo del ABZ despus de su administracin
oral, las concentraciones plasmticas del frmaco inalterado son muy bajas y su efecto
sistmico se ha asociado principalmente al ABSO. Este metabolito es detectable tanto en
plasma como en lquido cefalorraqudeo y en el interior de los parsitos despus de un
perodo de incubacin.
La mayora de los mtodos publicados para cuantificar metabolitos de albendazol utilizan
plasma humano y plasma de diferentes especies animales; sin embargo, slo algunos
consideran la determinacin de los compuestos en orina. La determinacin de los
metabolitos en orina representa ventajas sobre aquellos mtodos que utilizan plasma ya
que se dispone de grandes volmenes de fluido biolgico que pueden ser sometidos a un
proceso de concentracin mediante el tratamiento adecuado de la muestra. Estos
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mtodos se simplifican por la ausencia de protenas adems de que el procedimiento de
muestreo no resulta invasivo.
De esta forma se logran detectar niveles urinarios de los metabolitos de albendazol
mayores a los que se encontraran despus de administrar una sola dosis y durante
perodos cortos de recoleccin de orina. Domnguez y col. no detectaron metabolitos de
albendazol en orina al utilizar un mtodo por cromatografa de lquidos de alta resolucin
(CLAR) con detector ultravioleta (UV), despus de la administracin de una dosis nica de
7 mg/kg de ABZ en voluntarios sanos. Dada la mayor sensibilidad de un detector de
fluorescencia, este detector ha sido utilizado con xito en la determinacin de ABSO y
ABSO2 en orina con un volumen de muestra pequeo en periodos de recoleccin de 8 h.
Es posible lograr niveles comparables de cuantificacin utilizando un detector de UV de
uso ms comn, con el adecuado manejo de un volumen grande de muestra
Este procedimiento tiene ventajas significativas cuando se trata de recuperar metabolitos
a partir de orina ya que por una parte, es conocida la importancia de la va renal en la
eliminacin de frmacos y/o sus metabolitos y por otra, es posible contar con los
volmenes grandes de muestra. El mtodo se aplic exitosamente al anlisis de muestras
de orina de dos voluntarios que ingirieron una dosis de 400 mg de ABZ en tabletas.

Material y mtodos
Reactivos
Los metabolitos ABSO y ABSO2 se sintetizaron mediante el mtodo reportado por Soria y
col. La pureza de los metabolitos se evalu por cromatografa en capa fina, cromatografa
de lquidos de alta resolucin y espectrofotometra de absorcin ultravioleta. Los
compuestos fosfato dibsico de potasio, cido clorhdrico y cido actico fueron grado
reactivo (Merck, Mxico). Los disolventes metanol y acetonitrilo fueron grado
cromatogrfico (J.T. Baker, Mxico). El agua utilizada en todos los experimentos fue grado
cromatogrfico obtenida mediante un equipo Simplicity System (Millipore Corporation,
USA)
Preparacin de las curvas de calibracin
Se prepararon soluciones madre de ABSO y ABSO2 de 1 mg/mL en acetonitrilo y se
almacenaron a 4C. La soluciones de trabajo se prepararon diariamente mediante la
dilucin de soluciones madre en orina blanco para obtener concentraciones de 0.125 a 4
g/mL.
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Equipo
El sistema cromatogrfico (Perkin Elmer S.A.) consisti de una bomba binaria serie 200, un
inyector manual Rheodyne modelo 7225 y un detector UV/visible de longitud de onda
variable (Applied Biosystem).La separacin cromatogrfica se efectu en una columna
Zorbax C8, 250 4.6 mm, 5 m de tamao de partcula (Agilent Technologies)
Condiciones cromatografcas
Como fase mvil se empleo una mezcla de agua-metanol-acetonitrilo-acido actico
50:41:8:1. La separacin cromatografica se realizo a una velocidad de flujo de 1 ml/min y
la deteccin de los metabolitos a una longitud de onda de 286 nm
Preparacin de muestras
Las muestras de orina de 25 ml se sometieron a un proceso de extraccin en fase solida,
utilizando cartuchos C18 de 10 gr
Extra Clean Column (Alltech). Los cartuchos se acondicionaron previamente mediante el
paso consecutivo de 20 mL of acetonitrilo, 30 mL de mezcla de solucin amortiguadora de
fosfatos 0.01 M pH 8-acetonitrilo (50:50, v/v) y 30 mL de solucin amortiguadora de
fosfatos 0.01 M pH 8. Posteriormente, el volumen de orina se transfiri al cartucho y se
realizaron los siguientes lavados: 30 mL de solucin amortiguadora de fosfatos 0.01 M pH
8; 20 mL de una mezcla de solucin amortiguadora de fosfatos 0.01 M pH 8-acetonitrilo
(80:20, v/v) y 6 mL de metanol. Los analitos se eluyeron con 8 mL de mezcla de
acetonitrilo-metanol-cido actico (49.5:49.5:1, v/v/v). El eluato se evapor a sequedad
en bao de agua a 45C bajo suave corriente de nitrgeno. El residuo se reconstituy en
400 L de mezcla de fase mvil-acetonitrilo (50:50, v/v) y se filtr a travs de acrodiscos
de poro de 0.45 m (Millipore Corporation, USA). Finalmente, se inyectaron muestras de
20 L al sistema cromatogrfico bajo las condiciones descritas previamente.
Validacin del mtodo
Selectividad
Se sometieron muestras de orina blanco de diferentes voluntarios al tratamiento de
extraccin descrito y se inyectaron en el sistema cromatogrfico. Los cromatogramas
obtenidos se compararon con muestras de orina aadidas con cantidades conocidas de
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ABSO y ABSO2 a fin de evaluar la presencia de interferencias de origen endgeno en el
ensayo.

Linealidad y precisin
La linealidad y la precisin del sistema se determinaron mediante el anlisis estadstico de
regresin lineal y el clculo del coeficiente de variacin (CV) del factor respuesta de tres
curvas de calibracin de estndares disueltos en la mezcla fase mvil-acetonitrilo (50:50,
v/v).
Para determinar la linealidad del mtodo analtico se analizaron tres curvas de calibracin
en orina en un intervalo de concentraciones de 0.125 a 4 g/mL. Los parmetros de
regresin y el anlisis de varianza de la regresin se obtuvieron del ajuste de los datos del
rea bajo la curva en funcin de la concentracin de ABSO y de ABSO
2
.


Recobro y precisin
El nivel de recuperacin absoluta se determin en trminos del porcentaje de recobro al
analizar siete rplicas de muestras de orina aadidas con ABSO y ABSO
2
y soluciones
estndar no sometidas a extraccin a tres concentraciones diferentes comprendidas en el
intervalo de trabajo: 0.27 g/mL (nivel bajo), 0.54 g/mL (nivel medio) y 1.08 g/mL (nivel
alto) para ABSO y 0.30 g/mL (nivel bajo), 0.60 g/mL (nivel medio) y 1.19 g/mL (nivel
alto) para ABSO
2
. La precisin del mtodo se evalu con los resultados del anlisis de
muestras procesadas en un da de trabajo. En cada nivel de concentracin se determin el
CV.
Exactitud
Para evaluar la exactitud del mtodo se compararon los resultados de concentracin
obtenidos contra la concentracin nominal de muestras control (n = 6), analizadas
paralelamente con una curva de calibracin en orina. Se consider como exacto los
valores con desviacin relativa de 15% del valor de la concentracin nominal y con
precisin de no ms de 15% para el valor del CV.
Para el lmite de cuantificacin se consider la concentracin ms baja del metabolito con
la cual se obtuvo una precisin satisfactoria (CV < 20%) y exactitud (expresada como el
porcentaje de desviacin relativa del valor nominal) con un valor lmite de 20%.
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Reproducibilidad del mtodo
Se analizaron por duplicado muestras control de tres concentraciones conocidas (baja,
media y alta) en muestras de orina, en tres das. Se determin para cada concentracin el
valor promedio, la desviacin estndar y el CV en porciento para los seis resultados
obtenidos de cada concentracin.
Estabilidad
La estabilidad de los metabolitos de albendazol en muestras de orina, en congelacin a
20C, durante tres meses, fue confirmada previamente por otros autores . Por este
motivo, en el presente trabajo no se llev a cabo el estudio de estabilidad de las mismas.
En este estudio, las muestras urinarias obtenidas fueron congeladas inmediatamente a
20C y analizadas en un perodo no mayor a 24 a 48 h posterior a su recoleccin, por lo
que se consider adecuada su estabilidad.
Muestras biolgicas
Dos voluntarios sanos, voluntario 1 (sexo masculino de 27 aos de edad y peso corporal
de 68 kg) y voluntario 2 (sexo femenino de 25 aos de edad y peso corporal de 50 kg)
libres de tratamiento farmacolgico alguno recibieron, previo consentimiento firmado,
una dosis oral de 400 mg de ABZ (tabletas) despus de un perodo de 12 h de ayuno y de
colectar una muestra de orina blanco etiquetada como tiempo cero.
Dos horas despus de la administracin de la dosis de ABZ, los voluntarios recibieron un
desayuno ligero. Las muestras de orina se recolectaron en los siguientes intervalos de
tiempo: 02, 24, 46, 68, 812 y 1224 h para el voluntario 1 y 02, 24, 46, 68,
812, 1224 y 2436 h para el voluntario 2.
Las muestras de orina de los voluntarios se analizaron paralelamente a duplicados de
muestras control a tres niveles de concentracin (0.336, 0.788 y 3.36 g/mL) para ABSO,
(0.318, 0.746 y 3.180 g/mL) para ABSO2 y una curva de calibracin en orina. El
tratamiento de las muestras se llevo a cabo dentro de las siguientes 24 h de la obtencin
de stas. El ensayo se acept siempre y cuando los resultados del anlisis de las muestras
control estuvieran comprendidos dentro de 15% del valor nominal.


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Resultados y discusin
Validacin del mtodo analtico
Selectividad
Los cromatogramas obtenidos a partir de muestras de orina blanco no mostraron
interferencia en los tiempos de retencin del ABSO y ABSO2 (6.7 y 7.8 min,
respectivamente) atribuibles a compuestos endgenos (Figura 1).

Linealidad
El detector mostr una respuesta lineal, en el intervalo de concentraciones esperadas, con
coeficientes correlacin R > 0.999 para ambos metabolitos y un CV< 2 % en el factor
respuesta en todos los niveles de concentracin.
Bajo las condiciones establecidas y aplicando el mtodo de extraccin propuesto, el
mtodo present un comportamiento lineal en el intervalo de 0.125 a 4 g/mL al
correlacionar el rea bajo la curva obtenida contra la concentracin de ABSO y ABSO
2
en
orina (Figura 2).
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El intervalo de trabajo utilizado para este mtodo es comparable al reportado por Lanchote y col.
en el cual se utiliza un detector de fluorescencia. Los lmites de deteccin para el detector de
fluorescencia frecuentemente son menores de uno a tres rdenes de magnitud a los intervalos de
concentracin en mtodos donde se utiliza el detector UV. Por tal motivo, si el tratamiento de
extraccin de la muestra aqu propuesto se aplicara con un detector de fluorescencia sera posible
alcanzar un lmite de cuantificacin significativamente menor.
Recobro y precisin
Los resultados obtenidos para el recobro absoluto de cada metabolito a los tres niveles de
concentracin y sus respectivos valores de CV se presentan en la Tabla 1. Se encontr un recobro
absoluto de 82 a 97% con CV < 7% lo que permite considerarlo como repetible y recobros
aceptables.





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Exactitud
En la Tabla 2 se presentan los resultados obtenidos para evaluar la exactitud del mtodo para
ambos metabolitos a tres niveles de concentracin (n = 6). Como se observa ningn dato supera el
15% del valor nominal de concentracin. El lmite de cuantificacin del mtodo fue 0.125 g/mL
para ambos metabolitos ya que concentraciones menores presentaron valores de CV > 20 %.


El lmite de deteccin determinado como cinco veces la relacin seal/ruido fue 0.02 g/mL para
el ABSO y 0.04 g/mL para el ABSO
2
.




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Reproducibilidad del mtodo
El mximo valor de CV obtenido para muestras aadidas de ABSO analizadas por duplicado en
diferentes das fue 7.2% y en el caso de ABSO2 de 8.6%. Para ambos compuestos la variabilidad
obtenida en diferentes das fue inferior al 15% (Tabla 3), por lo que la reproducibilidad del mtodo
es aceptable.
Anlisis de muestras urinarias
Se encontraron concentraciones cuantificables de ABSO a lo largo del perodo de muestreo de
ambos voluntarios. La cantidad total excretada de ABSO en 24 h para el voluntario 1 fue de 2.95
mg y para el voluntario 2 en 36 h fue de 2.76 mg. Estos resultados se encuentran dentro del
intervalo reportado previamente por Lanchote y col en cuyo estudio se encontraron valores entre
1.94 a 5.89 mg/24 h para la cantidad total excretada en orina de ABSO, despus de la
administracin oral de albendazol bajo un rgimen de dosificacin mltiple (7 mg/kg/12 h).
La utilidad de la determinacin de frmaco y/o metabolitos en muestras urinarias, radica en que
stas son un reflejo del comportamiento en plasma, dada la relacin que hay entre lo que se
absorbe y lo que se elimina, de tal forma que es posible determinar algunos parmetros
farmacocinticos sin requerir la toma de muestras sanguneas. La constante de velocidad de
eliminacin de ABSO para cada voluntario se calcul a partir de la fase terminal de la
representacin semilogaritmica de los datos de velocidad de excrecin urinaria en funcin del
tiempo medio del perodo de recoleccin de orina (Figura 3). La vida media de eliminacin en el
voluntario 1 fue de 11 h, mientras que para el voluntario 2 fue de 7 h. Ambos valores concuerdan
con lo reportado en otros estudios farmacocinticos realizados tanto con muestras plasmticas
como con muestras urinarias.
En este estudio, los resultados obtenidos para el voluntario 1, no muestran una fase ascendente
en la velocidad de excrecin



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urinaria del ABSO sin embargo, en la fase descendente se observa un pequeo pico en la grfica
correspondiente. Por otro lado, los datos del voluntario 2 mostraron dos picos antes de la fase
descendente (Figura 3). Si bien es cierto que el mtodo de velocidad de excrecin urinaria puede
presentar este tipo de variaciones, es posible que el comportamiento urinario observado en estos
voluntarios, refleje un perfil de concentracin plasmtica con dos picos. La presencia de un
doble pico para el perfil de concentracin plasmtica de ABSO, ha sido descrito previamente y
podra ser explicado por el metabolismo presistmico de albendazol a nivel de la pared intestinal
demostrado por Redondo y col. Con dichos antecedentes es posible que lo observado en los datos
urinarios represente una segunda fase de crecimiento en los niveles plasmticos de ABSO, sin
embargo para confirmar esta hiptesis se requiere realizar el estudio en un mayor nmero de
voluntarios.



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El compuesto ABSO
2
no se detect en ninguna de las muestras analizadas. Esta reportado que la
cantidad total excretada de este metabolito en orina, despus de la dosificacin mltiple de 7
mg/kg/12 h de ABZ, fue de 0.03 a 0.13 mg en 24 h. En el presente estudio donde se administr una
dosis de ABZ a los voluntarios y el lmite de cuantificacin para ABSO
2
fue de 0.125 g/mL, era
poco probable su determinacin; sin embargo, el hecho de que el mtodo desarrollado sea
selectivo para ABSO es de gran importancia por tratarse del metabolito activo. Algunos mtodos
previamente reportados no presentan resolucin entre ambos metabolitos por lo que su
aplicacin al anlisis de muestras puede resultar en la determinacin conjunta de los mismos. En
el desarrollo de este mtodo se logr una cuantificacin selectiva del metabolito activo ABSO en
presencia del metabolito secundario ABSO
2
Conclusiones
El mtodo desarrollado muestra recobros altos, una adecuada precisin, es lineal y exacto en el
intervalo de concentraciones esperadas para ABSO y presenta el planteamiento de un tratamiento
sencillo con extraccin en fase slida para la determinacin de los metabolitos de ABZ presentes
en orina.
La aplicacin del mtodo desarrollado se demostr con el anlisis de muestras de voluntarios
sanos que recibieron una dosis de ABZ de 400 mg. Las concentraciones de ABSO determinadas en
las muestras de orina de los voluntarios se encontraron dentro del intervalo de concentraciones
contempladas en la validacin del mtodo. Los niveles de ABSO
2
en orina despus de una dosis
nica de ABZ probablemente estn por debajo de los lmites de cuantificacin considerados para
el mtodo desarrollado, por lo que dicho metabolito no se determin en las muestras.
Referencias bibliogrficas
http://www.redalyc.org/pdf/579/57912960004.pdf
Danaher M., De Ruyck H., Crooks S.R.H., Dowling G., O Keeffe M. 2007. Review of methodology
for the determination of benzimidazole residues in biological matrices. Journal of Chromatography
B, 845:137