Cuantificacion Aloina Por HPLC

de
Las
tesinas
Belgrano
Facultad de Ciencias Exactas y Naturales
Carrera de Farmacia
Desarrollo de un mtodo de valoracin de
polvo de Cscara Sagrada y jugo de Aloe en
cpsulas

N 532 Guillermo Costa
Tutora: Dra. Erica Georgina Wilson
Universidad de Belgrano
Universidad de Belgrano
Zabala 1837 (C1426DQ6)
Ciudad Autnoma de Buenos Aires - Argentina
Tel.: 011-4788-5400 int. 2533
e-mail: invest@ub.edu.ar
url: http://www.ub.edu.ar/investigaciones
Departamento de Investigaciones
Setiembre 2012
Tesinas Desarrollo de un mtodo de valoracin de polvo de Cscara Sagrada y jugo de Aloe...
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Agradecimientos
A Erica Wilson por guiarme durante el desarrollo de este trabajo y brindarme siempre su confanza y
paciencia.
A Juan Blanes por los favores concedidos a lo largo del desarrollo de este trabajo.
A Silvia De Benedetti y a Hernn Aldana Marcos por toda su ayuda a lo largo de mi carrera.
A todo el claustro docente de la carrera de farmacia.
A mis compaeros de cursada.
A mi familia.
A mis amigos.
Y a Karinisha.
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ndice
1 - Resumen ..................................................................................................................................... 7
2 - Introduccin..................................................................................................................................... 7
3 - Drogas vegetales ............................................................................................................................ 8
3.1 - Aloe ..................................................................................................................................... 8
3.1.1 - Descripcin botnica................................................................................................... 8
3.1.2 - Composicin qumica.................................................................................................. 9
3.2 - Cscara Sagrada ................................................................................................................. 10
3.2.1 - Descripcin botnica................................................................................................. 10
3.2.2 - Composicin qumica................................................................................................ 11
3.3 - Propiedades fsico-qumicas de los derivados hidroxiantracnicos ..................................... 12
3.4 - Actividades farmacolgicas.................................................................................................. 12
4 - Valoracin espectrofotomtrica de Aloe y Cscara Sagrada como materia prima ....................... 13
4.1 - Materiales............................................................................................................................. 13
4.2 - Esquema de valoracin Farmacopea Britnica 2007: Cscara Sagrada (modifcado) ........ 13
4.3 - Esquema de valoracin Farmacopea Britnica 2007: Aloe (modifcado) ............................ 15
4.4 - Resultados ........................................................................................................................... 16
4.5 - Discusin.............................................................................................................................. 16
5 - HPLC: Desarrollo del mtodo........................................................................................................ 16
5.1 - Fundamento del mtodo ...................................................................................................... 16
5.2 - Materiales y mtodos ........................................................................................................... 16
5.2.1 - Materiales ................................................................................................................. 16
5.2.2 - Soluciones ................................................................................................................ 17
5.2.3 - Mtodo ...................................................................................................................... 17
5.3 - Identifcacin del marcador de Aloe: .................................................................................... 17
5.4 - Identifcacin del marcador de Cscara Sagrada ................................................................ 18
5.4.1 - Materiales y mtodos ................................................................................................ 18
5.4.2 - Preparacin del extracto Cscara Sagrada: ............................................................. 18
5.5 - Resultados y Discusin .......................................................................................................... 18
6 - Validacin del mtodo analtico ..................................................................................................... 21
6.1 - Linealidad.............................................................................................................................. 21
6.1.1 - Cscara Sagrada: Preparacin de los extractos ...................................................... 21
6.1.2 - Aloe: Extractos .......................................................................................................... 24
6.2 - Exactitud ............................................................................................................................... 27
6.2.1 - Recuperacin ............................................................................................................ 27
6.2.2 - Linealidad de recuperacin ....................................................................................... 27
6.3 - Especifcidad ......................................................................................................................... 29
7 - Cuantifcacin de Cscara Sagrada y Aloe en cpsulas............................................................... 30
7.1 - Preparacin de soluciones:................................................................................................... 30
7.1.1 - Fase mvil................................................................................................................. 30
7.1.2 - Solvente de dilucin .................................................................................................. 30
7.1.3 - Solucin testigo......................................................................................................... 30
7.1.4 - Solucin muestra ...................................................................................................... 30
7.2 - Procedimiento ....................................................................................................................... 30
7.3 - Clculos ................................................................................................................................ 30
8 - Conclusin ................................................................................................................................... 31
9 - Referencias bibliogrfcas y material de consulta ......................................................................... 31
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7
1 - Resumen
El siguiente trabajo presenta el desarrollo de un mtodo de valoracin de polvo de Cscara Sagrada
y jugo de Aloe en cpsulas.
En primera instancia se valoraron las materias primas (jugo de Aloe spp. y Cscara Sagrada) utili-
zando los mtodos espectrofotomtricos de la Farmacopea Britnica 2007 (BP 2007). Luego se analiz
la factibilidad de aplicar el mtodo de Cscara Sagrada para la valoracin de la misma en el producto
terminado considerando que la cantidad de aloinsidos (C- y O-glicsidos provenientes de Aloe) era
despreciable con respecto a los cascarsidos (O- y C- hetersidos provenientes de Cscara Sagrada),
calculando luego la cantidad de Aloe por diferencia.
Al no ser posible, se desarroll un mtodo por HPLC en fase reversa que utiliza un gradiente de elucin
de 35 minutos con cido actico 1% como solvente A y metanol con cido actico 1% como solvente B
en columna C18 de 150 x 46 mm.
El Aloe se cuantifc utilizando alona (A/B) que se comercializa como sustancia de referencia. En el
caso de Cscara, al no haber disponible en el mercado cascarsidos puros, se los aisl por TLC.
Se validaron los parmetros de linealidad, exactitud y especifcidad.
2 - Introduccin
Para garantizar la efcacia y seguridad de un medicamento ftoterpico es necesario poder contar
con mtodos de control de calidad que permitan verifcar la identidad y cantidad de las drogas vegetales
presentes en dichos frmacos.
Los mtodos utilizados para la valoracin de drogas vegetales varan de acuerdo al tipo de compuestos
y la actividad biolgica de los mismos. En el caso que se describe en esta tesina, el ftoterpico a valorar
son cpsulas que contienen 100mg de jugo de Aloe desecado y 150 mg de Cscara Sagrada como activos.
Tanto el Aloe como la Cscara Sagrada son drogas con actividad catrtica debido a la presencia de
antraquinonas (Bruneton 2001). Las antraquinonas son derivados hidroxiantracnicos que se encuentran,
en general, mono o diglicosidados, aunque tambin puede haber cantidades mnimas de aglucones,
producto de la hidrlisis de estos glicsidos (an cuando la droga haya sido bien conservada). Como la
actividad catrtica o purgante se debe al aglucn antraquinnico, todas las antraquinonas tienen activi-
dad independientemente de su grado de glicosidacin. Debido a esto, las monografas farmacopicas de
estas drogas defnen el contenido de derivados hidroxiantracnicos, incluyendo todo tipo de glicsidos,
no as los aglucones que son productos de degradacin de los mismos. Estas drogas vegetales tienen
varios glicsidos diferentes, de los cuales solo algunos se han identifcado. Esto implica una difcultad
obvia ya que es imposible cuantifcar cada compuesto por separado, ya sea porque algunos estn en
cantidades muy bajas o inclusive puede ser que no se hayan identifcado an o porque no existen sustan-
cias de referencia de cada uno de ellos. Una solucin posible es utilizar un mtodo de valoracin capaz
de detectar indiscriminadamente todos los compuestos con ncleo antraquinnico, como podra ser un
mtodo espectrofotomtrico.
Sin embargo, para esto se debe disear un procedimiento que asegure la extraccin de todos los
compuestos evitando asimismo la extraccin de otros componentes que puedan interferir en la valoracin
de los derivados hidroxiantracnicos. El grado de glicosidacin de las antraquinonas incide en primer
lugar en su solubilidad pero adems plantea una gran difcultad para calcular la correspondencia entre
aglucones/hetersidos a la hora de estandardizar drogas vegetales. Por este motivo, se calcula por sepa-
rado el contenido en diglicsidos y monoglicsidos, previa hidrlisis de todos los hetersidos y posterior
valoracin de los aglucones resultantes. Una frmula que contempla el tipo de hetersido valorado permite
convertir el dato de contenido de aglucones en hetersidos.
Tanto Cscara Sagrada como Aloe estn codifcados en la Farmacopea Europea (Ph.E 7th. ed.) y en
la USP, aunque en esta ltima slo se describe un mtodo de valoracin para Cscara Sagrada. En la
Farmacopea Argentina 8va Ed. est codifcada slo la Cscara Sagrada. En todos los casos en la Cscara
Sagrada se valoran por separado cascarsidos (diglicsidos) y derivados hidroxiantracnicos distintos
de cascarsidos. La Farmacopea Europea indica slo la valoracin de derivados hidroxiantracnicos
calculados como alona en Aloe.
Al encarar la valoracin de una droga vegetal en un ftoterpico, es razonable intentar aplicar el mismo
mtodo empleado para la valoracin de la potencia en la materia prima. Por lo tanto, para determinar
la aplicabilidad de estos mtodos de valoracin de materia prima al producto terminado, se aplicaron
8
ambos mtodos a las drogas vegetales por separado con el fn de evaluar el grado de interferencia que
podan tener.
En primera instancia se analiz la factibilidad de aplicar el mtodo de Cscara Sagrada para la valoracin
de la misma en el producto terminado considerando que en la Cscara Sagrada la cantidad de aloin-
sidos (C- y O-glicsidos provenientes de Aloe) podra ser despreciable con respecto a los cascarsidos
(O- y C- hetersidos provenientes de Cscara Sagrada). Si as fuera, seria posible calcular la cantidad
de Aloe presente por diferencia en la cantidad de derivados hidroxiantracnicos detectados al valorarlos
utilizando el mtodo de Aloe. Como resultado se determin que la cantidad de aloinsidos presentes en
Cscara no era despreciable con respecto a sus cascarsidos.
Fue necesario, por lo tanto buscar otro mtodo que permitiera valorar los activos del producto termi-
nado. Se decidi utilizar cromatografa lquida de alta performance (HPLC) debido a su alta resolucin y
especifcidad.
Se desarroll un mtodo con elucin por gradiente que permite determinar los activos en una misma
corrida. Dado el amplio rango de aceptabilidad de activos en drogas vegetales, se utiliza la misma ma-
teria prima presente en el producto terminado como referencia para su valoracin. Al analizar una droga
vegetal por HPLC, es habitual identifcar uno o ms marcadores para valorar cada materia prima en el
medicamento. Estos marcadores deben ser especfcos para cada componente del producto terminado
y si fuera posible deberan estar vinculados con la actividad de la droga. Por otra parte, es deseable que
sean compuestos que se puedan adquirir fcilmente y con bajo costo, como sustancias de referencia. En
el caso del Aloe, se eligi la denominada alona o barbalona (una mezcla de los ismeros alona A/ B),
ya que est disponible comercialmente y adems se determin que si bien estas alonas tambin estn
presentes en Cscara Sagrada, estn en una concentracin despreciable. Para Cscara Sagrada, los
compuestos ms relacionados con su actividad biolgica son los cascarsidos A, B, C y D. Sin embargo,
ninguno de ellos est disponible comercialmente. Por lo tanto se aislaron por TLC.
El siguiente trabajo presenta el desarrollo del mtodo de valoracin para cpsulas mezcla de jugo de
Aloe spp. desecado 100 mg y Cscara Sagrada 150 mg utilizando cromatografa liquida de alta perfor-
mance.
3 - Drogas vegetales
3.1 - Aloe
El laboratorio declara en su monografa que emplea Aloe spp.
La Farmacopea Britnica 2007 (BP2007) tiene codifcada 2 especies de Aloe.
Aloe de Barbados:
Aloe barbadensis consiste en el jugo concentrado desecado de las hojas de Aloe barbadensis Miller.
Contiene no menos de 28.0 por ciento de derivados hidroxiantracnicos expresados como barbalona
(C
21
H
22
O
9
; M
r
418.4) y calculados como droga seca.
Aloe del Cabo:
Aloe del Cabo consiste en el jugo concentrado desecado de las hojas de varias especies de Aloe,
principalmente A. ferox y sus hibridos. Contiene no menos de 18.0 por ciento de derivados hidroxiantra-
cnicos expresados como barbalona (C
21
H
22
O
9
; M
r

3.1.1 - Descripcin botnica
Los loes (existen ms de 150 especies) son plantas de porte ms o menos arborescente, de hojas
gruesas y carnosas, generalmente con los bordes espinosos, reunidas en una roseta densa en la cima de
un tronco robusto de longitud variable. En el caso de las especies ofcinales, las fores, rojo escarlata cuando
estn en forma de botones (Aloes del Cabo) o amarillas (Aloe de los Barbados) se encuentran reunidas en
densos racimos dispuestos sobre un escapo foral erguido, nico (A. barbadensis) y ramifcado (A. ferox).
Aloe ferox es originario del sur de frica; se hibrida con facilidad y se cultiva. El Aloe barbadensis, es
originario de frica del norte e introducido desde el siglo XVII en las Antillas, se cultiva en la actualidad
en los Estados Unidos (Florida).
Zumo de aloes y gel de aloes: La seccin transversal de la hoja muestra, bajo la epidermis con cutcula
muy espesa, un parnquima cloroflico y amilfero, una regin central con clulas de muclago y, entre
ambos, los haces conductores aislados con periciclo y endodermo marcados. El zumo de aloes (el ac-
bar) se encuentra en las clulas pericclicas y fuye espontneamente de la hoja cortada mientras que
el gel de aloes est constituido nicamente por el muclago de las clulas polidricas de la zona central.
9
Tradicionalmente se recoge el zumo que fuye espontneamente de las hojas cortadas y se concentra
por ebullicin. El zumo concentrado se presenta en forma de masa marrn oscuro (acbar de Barbados)
con refejos verdosos (acbar del Cabo). El gel se obtiene despus de eliminar los tejidos ms externos
de la hoja (Bruneton 2001).
Fig. 1: Aloe vera.
Missouri Botanical Garden.
3.1.2 - Composicin qumica
Composicin de los acbares: la droga contiene entre un 15 y un 40% de derivados hidroxiantrac-
nicos, que son C-glucsidos en C-10 del aloe-emodol antrona: alona (=barbalona), hidroxi-alonas y,
en A. ferox, aloinsido. La alona ampliamente mayoritaria, es de hecho una mezcla de alona A (10-R) y
de alona B (10-S) interconvertibles va forma antranlica. Lo mismo ocurre para el aloinsido, derivado
ramnosilado sobre el hidroximetilo en C-3 de la alona A es caracterstica de A. ferox, las 7-hidroxi-alonas
A y B y sus homlogos 8-O-metilados slo se encuentran en A. barbadensis (que contiene asimismo
10-C-glicsidos 10-hidroxilados).
El zumo contiene tambin una fraccin resinosa a partir de la cual se han aislado los
C-glucsidos en C-8 de 2-acetonil-7-hidroxi-5-metilcromonas: aloesina y aloerresina A. Estas cromo-
nas mayoritarias (A. ferox) pueden ir acompaadas de pequeas cantidades de derivados no C-glico-
sdicos, de nafto[2,3c]furanos y de 1-metiltetralinas. En Aloe barbadensis, se han caracterizado algunas
2-(2-hidroxipropil)-cromonas C-glucosiladas en C-8 (isoaloerresina D, derivadas del aloesol, aloediol,
noreugenina, isorabaicromona, etc.). Tambin se ha caracterizado, en A. ferox una tetralina libre y glico-
silada, la feroxidina.
Composicin del gel de aloe: muy rico en agua, no parece que contenga compuestos muy especf-
cos: aminocidos, lpidos, esteroles, enzimas y principalmente polisacridos (pectinas, hemicelulosas)
(Bruneton 2001).
10
Fig. 2: [1] Alona A ; [2] Alona B ; [3] Aloinsido C ; [4] Aloinsido D.
WHO (1999).
3.2 - Cscara Sagrada
La Farmacopea Argentina (8va Ed.) defne a la Cscara Sagrada como la corteza desecada de
Rhamnus purshiana D.C. (Rhamnaceae) recogida por lo menos un ao antes de ser empleada con fnes
medicinales. Debe contener no menos de 7,0 por ciento de derivados de hidroxiantraceno totales, calcula-
dos como cascarsidos A, de los cuales no menos de 60 por ciento est constituido por cascarsidos A.
Para la Farmacopea Britnica (BP2007), la Cscara consiste en la corteza, entera o pulverizada de
Rhamnus purshiana D.C. (Frangula purshiana (D.C.) A. Gray ex J. C. Cooper). Contiene no menos de 8.0
por ciento de glicsidos hidroxiantracnicos de los cuales no menos del 60% son cascarsidos, ambos
expresados como cascarsido A (C
27
H
32
O
14
; M
r
3.2.1 - Descripcin botnica
La Cscara Sagrada es un rbol originario de la costa oeste de Amrica del norte. La droga proviene de
plantas espontneas explotadas de las regiones montaosas del oeste de Estados Unidos y de Canad.
La recoleccin se inicia en mayo y prosigue hasta fnales del verano. Las cortezas, cortadas en pequeos
fragmentos, se conservan mucho tiempo antes de su utilizacin.
Lo droga se presenta en fragmentos bastante gruesos (hasta de 5 mm) con la superfcie externa sal-
picada con lenticelas poco frecuentes y habitualmente ms o menos recubierta de lquenes, musgos y
hepticas. Al microscopio, la ausencia de clulas con muclago y la presencia en el parnquima cortical
y en el periciclo de las clulas esclerosas en grupos, as como la presencia de radios medulares anchos
diferencian esta corteza de la de frngula (Bruneton 2001).
11
Fig. 3: Cscara Sagrada (Rhamnus purshiana).
3.2.2 - Composicin qumica
La corteza de Cscara Sagrada (droga seca) contiene 6-9% de hetersidos hidroxiantracnicos. Los
constituyentes mayoritarios (70% y ms) son O-hetersidos de C-hetersidos, los cascarsidos A, B,
C y D. Estos compuestos son, respectivamente, los ismeros en C-10 de los 8-O--D-glucsidos de la
alona (=barbalona) y de crisalona. Estn acompaados por los C-hetersidos correspondientes (que
son sin duda productos de degradacin de los cascarsidos): alona (=barbalona = C-glucsido en 10 del
aloe-emodol antrona) y crisalona (C-glucsido en C-10 del crisofanol antrona). Tambin se encuentran
O-hetersidos de antraquinonas y de diantronas (Bruneton 2001).
Cascarsido A Cascarsido B
12
Cascarsido C Cascarsido D
Fig. 4: (WHO, 2004).
Crisalona A Crisalona B
Fig. 5: (WHO, 2004).
3.3 - Propiedades fsico-qumicas de los derivados hidroxiantracnicos
Las antraquinonas son compuestos de color rojo anaranjado, muy poco solubles en agua fra, excepto
en medio alcalino donde pierden los hidrgenos hidroxlicos y aumentan su solubilidad, solubles en agua
caliente, solubles en disolventes orgnicos como acetato de etilo y alcoholes. Los diglicsidos (O- y C-
hetersidos) son ms solubles en agua que los monoglicsidos (O- o C-hetersidos).
Los O-hetersidos se hidrolizan en medio cido fuerte, pero la ruptura del enlace carbono-carbono de
los C-hetersidos no se puede efectuar ms que en presencia de cloruro frrico.

3.4 - Actividades farmacolgicas
Las drogas con derivados hidroxiantracnicos (antraquinonas) poseen accin laxante. Se denominan
purgantes irritantes o de contacto debido a la irritacin directa de la mucosa o la estimulacin directa de
los plexos nerviosos. Actan fundamentalmente por inhibicin de la absorcin de electrolitos y agua desde
la luz intestinal; de esta manera, aumentan el contenido de lquido intestinal y estimulan intensamente
la peristalsis.
Como efecto colateral pueden generar molestias gastrointestinales, en forma de colitis espsticas, y
alteraciones hidroelectrolticas, como prdida de potasio, deplecin sdica, deshidratacin, aldosteronismo
secundario y cuadros de mala absorcin (Flrez et al., 2008).
13
4 - Valoracin espectrofotomtrica de Aloe y Cscara Sagrada como
materia prima
4.1 - Materiales
Espectrofotmetro UV-Vis Shimadzu UV1700 Pharmaspec
Acetato de etilo, pa
cido clorhdrico 37%, pa
Diclorometano, pa
Hierro (III), cloruro, hexahidratado, pa
Magnesio, acetato, monohidrato pa
Metanol calidad HPLC
Sodio hidrxido, solucin 1N
Sodio, sulfato anhidro, pa
4.2 - Esquema de valoracin Farmacopea Britnica 2007: Cscara Sagrada (modifcado)
1.0 g de Cscara Sagrada
Agregar 100ml de H
2
O purifcada
Hervir durante 5 minutos agitando
Filtrar
Llevar a volumen con H
2
O purifcada
Tomar 10ml y trasvasar a una ampolla
Agregar 1ml de HCl 0.1 M
Extraer con 2 porciones de 20ml de Cl
2
CH
2
FASE ORGNICA FASE ACUOSA
Extraer con 4 porciones de
30ml de Acetato de Etilo
saturado con H
2
O
FASE ACUOSA FASE ORGNICA
Cascarsidos Derivados
hidroxiantracnicos
distintos
de cascarsidos
Cascarsidos
Llevar a 50ml con H
2
O purifcada
Colocar 20ml de la solucin en un baln
Agregar 2g de FeCl
3
y 12ml de HCl concentrado
Calentar a refujo durante 4 horas
Dejar enfriar y trasvasar a una ampolla de decantacin
Lavar el baln con 4ml de NaOH 1M y luego con 4ml de H
2
O
Agregar las aguas de lavado a la ampolla
14
AMPOLLA
30ml de Cl
2
CH
2
Lavar la fase orgnica con
2 porciones de 20ml de H
2
O
descartando las aguas de lavado
Tomar 20ml
Llevar a sequedad
Disolver en 10ml de solucin de Acetato
de Magnesio 5g/L
Medir absorbancia a 515nm
Derivados hidroxiantracnicos distintos de cascarsidos
Llevar a sequedad y disolver en 0.5ml de metanol
Llevar a 50ml con H
2
O purifcada
Colocar 20ml de la solucin en un baln
Agregar 2g de FeCl
3
Lavar el baln con 4ml de NaOH 1M y luego con 4ml de H
2
O
AMPOLLA
30ml de Cl
2
CH
2
2
O
Tomar 20ml
Llevar a sequedad
Disolver en 10ml de solucin de
Acetato de Magnesio 5g/L
Calcular el contenido de cascarsidos como cascarsido A tomando 169 como valor de A (1%, 1cm).
El ensayo no ser vlido si no se cumple la relacin Abs
515
/ Abs
440
2.7.
15
4.3 - Esquema de valoracin Farmacopea Britnica 2007: Aloe (modifcado)
300mg de jugo de Aloe
Humectar con 2ml de Metanol HPLC
Agregar 80ml de H
2
O purifcada a 60C
Agitar mecnicamente durante 30 minutos
Filtrar
Llevar 1000ml con H
2
O purifcada
Colocar 10ml del extracto en un baln
Agregar 2g de FeCl
3
Lavar el baln con 4ml de H
2
O, luego 4ml de NaOH 1M y luego con 4ml de H
2
O
AMPOLLA
30ml de Cl
2
CH
2
2
O
Tomar 20ml
Llevar a sequedad
Disolver en 10ml de solucin de Acetato
de Magnesio 5g/L
Medir absorbancia a 515nm y a 440nm
Calcular el porcentaje de derivados hidroxiantracnicos como barbalona utilizando la siguiente ex-
presin:
(A x 19.6) / m
Donde m es la masa de droga vegetal en gramos y A es la absorbancia medida a 215nm. El ensayo
no ser vlido si no se cumple la relacin Abs
515
/ Abs
440
2.7.
16
4.4 - Resultados

MATERIA PRIMA
Mtodo de la BP 2007 para Aloe
Aloe (derivados hidroxiantracnicos) = 12,05%
Cscara Sagrada (derivados hidroxiantracnicos) = 8,97%
Mtodo de la BP 2007 para Cscara Sagrada
Cscara Sagrada
Fase acuosa (cascarsidos) = 6,13%
Fase orgnica (derivados hidroxiantracnicos diferentes a cascarsidos) = 1,66%
Aloe
Fase acuosa = 4,44%
Fase orgnica = 8,34%
CPSULAS
Mtodo de Cscara Sagrada de la BP 2007
Fase orgnica = 2,50% (equivalente a 6,25 mg/cpsula)
Fase acuosa = 6,64% (equivalente a 16,60 mg/cpsula)
4.5 - Discusin
Al aplicar el ensayo de Cscara Sagrada al Aloe, se observ que la cantidad de aloinsidos (4%) no
era despreciable con respecto a cascarsidos, ya que de los 16.6 mg de derivados 0-y C- hetersidos
detectados por cpsula un 25% provenan del Aloe.
A partir de esto, se descart la opcin de valorar las cpsulas por espectrofotometra y se procedi al
desarrollo de un mtodo de HPLC que permitiera valorar compuestos caractersticos de cada materia prima.
5 - HPLC: Desarrollo del mtodo
5.1 - Fundamento del mtodo
El mtodo de valoracin consiste en la deteccin de picos correspondientes a marcadores de cada
materia prima en los cromatogramas de solucin muestra, y cuyas reas se comparan con los detectados
en las materias primas con las cuales fue producido el lote a analizar.
Para el caso de Aloe, se utiliz un standard de referencia de alonas (mezcla de los ismeros A y B).
Al no existir en el mercado cascarsidos como sustancia de referencia, se aislaron por TLC y luego
se eligi uno de ellos en el cromatograma del extracto de polvo de Cscara.
Se determin la concentracin de Cscara Sagrada y Aloe en las cpsulas por cuantifcacin del
cascarsido de mayor tiempo de retencin y de alonas A/B respectivamente.
Se desarroll y valid un mtodo cromatogrfco en fase reversa con gradiente de elucin y detec-
cin a dos longitudes de onda (295nm para Aloe y 324nm para Cscara) que permite la cuantifcacin
simultnea de Cscara sagrada y Aloe en las cpsulas utilizando como testigo la propia materia prima.
5.2 - Materiales y mtodos
5.2.1 - Materiales
Cromatgrafo: Shimadzu Prominence
Bomba cuaternaria LC-AT
Horno de columna CTO-10ASVP
Detector UV-VISIBLE con Arreglo de Diodos SPD-M 20 A
Inyector Rheodyne 7125, con rulo de 20 l
Columna Phenomenex Gemini C18 150 x 4.6 mm y 5m
17
cido actico pa (Baker)
Metanol pa (Baker)
Agua calidad HPLC
Acetonitrilo, calidad HPLC
Alona A/B (Sigma-Aldrich, MIssouri, EEUU - N Cat. 1415-73-2)
5.2.2 - Soluciones
Solvente A: cido actico 1%
Solvente B: Metanol con 1% de cido actico
Solvente de dilucin: agua : acetonitrilo (50:50)
5.2.3 - Mtodo
La muestra se eluy con un gradiente de elucin de 35 minutos de duracin:
Minutos 0 10 15 16 20 30 30,2 35
% B 30 65 70 95 95 95 30 30
% A 70 35 30 5 5 5 70 70
Tabla 1: Gradiente de Elucin.
El volumen de inyeccin fue de 20l, la temperatura de 30C y la cuantifcacin se realiz a dos lon-
gitudes de onda (324nm para Cscara y 295nm para Aloe).
Fig. 6: Grfco de gradiente.
Lnea Roja: Concentracin de A.
Lnea azul: Concentracin de B.
5.3 - Identifcacin del marcador de Aloe:
Se prepar una solucin de 0,15mg/ml pesando 1,5mg de alonas A/B sustancia de referencia y diluy-
endo a 10ml, en matraz aforado con solvente de dilucin.
18
5.4 - Identifcacin del marcador de Cscara Sagrada
Para identifcar un pico correspondiente a un cascarsido para utilizar como marcador de Cscara
Sagrada se aislaron los cascarsidos C y D por TLC (Wagner et al., 1996).
5.4.1 - Materiales y mtodos
TLC slica gel 60 F
254
de 20 x 20 cm Merck
Agua destilada calidad HPLC
Metanol pa, Sintorgan
Acetato de etilo pa, Sintorgan
cido actico glacial pa Merck (Darmstadt, Alemania)
2-aminoetil ster del cido difenil brico (Fluka, cat. 42810) (NPR)
Lmpara UV @ 365nm
Sonicador TestLab
5.4.2 - Preparacin del extracto Cscara Sagrada:
Se pesaron 0,500g de Cscara Sagrada corteza seca pulverizada y se extrajeron con metanol a bao
mara durante cinco minutos.
Se fltr y luego se sembr 1ml del extracto en banda en placa de TLC. Se eluy con una fase mvil
compuesta por acetato de etilo : metanol : agua : cido actico glacial (100 : 13,5 : 10 : 1).
Se revel con una solucin 2% en metanol de NPR, tapando la parte central de la placa y luego se
observ a 365nm. Se marcaron las bandas de inters ubicadas a Rf: 0.05-0.15 para cascarsidos A y B,
y Rf: 0.2-0.25 para cascarsidos C y D.
Se recortaron las bandas correspondientes a Rf = 0.05; Rf = 0.15; Rf = 0.2 y Rf = 0.25, se colocaron
en un tubo de ensayo con metanol : agua (50 : 50) y se sonicaron durante quince minutos. La suspensin
obtenida se centrifug y se llev a 10mL con metanol : agua (50 : 50).
El sobrenadante se analiz por HPLC utilizando el mtodo detallado en 5.1.2.
5.5 - Resultados y Discusin
Cascarsidos

Fig. 7: TLC Cscara Sagrada
(Wagner et al., 1996).
19
Fig. 8: Cromatograma de la fraccin de cascarsidos obtenidos por TLC.
Como marcador de Cscara Sagrada, se eligi el pico 2 de tiempo de retencin 6.332 minutos debido
a que no hay superposiciones con otros picos del extracto de aloe.
Fig. 9: Espectro Cascarsido (Tr = 3.693min).
20
Fig. 10: Espectro Cascarsido (Tr = 6.332min).
Como marcador de Aloe, se utilizaron ambas alonas (T
r
alona A = 12.971 y T
r
alona B = 13.381)
debido a que no hay superposiciones con otros picos del extracto de Cscara.
Fig. 11: Cromatograma Alonas A/B.
21
Fig. 12: Espectro de alona A/B.
6 - Validacin del mtodo analtico
Se validaron los siguientes parmetros del mtodo:
Exactitud: linealidad, recuperacin de analito, linealidad de recuperacin.
Especifcidad.
6.1 - Linealidad
Se prepararon diez muestras: Cinco extractos de Aloe con valores de 60%, 80%, 100%, 120% de la
concentracin declarada en las cpsulas y cinco extractos de Cscara Sagrada con valores de 60%, 80%,
100%, 120% y 140% de la concentracin declarada en las cpsulas.
Cada extracto se inyect por duplicado en orden creciente de concentracin y ledo a 295nm para Aloe
y a 324nm para Cscara. Los resultados se grafcaron, y se calcul el coefciente R
2
.
Se tom como criterio de aceptacin un valor de coefciente R
2
mayor o igual a 0,99.
6.1.1 - Cscara Sagrada: Preparacin de los extractos
Se prepararon extractos Agua Metanol (50%-50%) pesando las cantidades indicadas de Cscara
Sagrada.
CSCARA SAGRADA
Nivel Peso (mg) Porcentaje de la concentracin declarada (%)
1 29,73 60
2 39,89 80
3 50,39 100
4 60,06 120
5 69,75 140
Tabla 2: Puntos de linealidad Cscara Sagrada.
Todas las muestras se disolvieron en 50 ml de metanol:agua (50:50).
22
Fig. 13: Cromatograma Cscara Sagrada a 295 y 394nm.
Se cuantifc a 324nm ya que no presentaba interferencia con aloe a esa longitud de onda.
A) Muestra @ 295nm (para valorar alonas).
B) Muestra @ 394nm (para valorar el cascarsido).
Fig. 14: Espectro del pico correspondiente al cascarsido de Tr = 6.534min
en el cromatograma del extracto de Cscara Sagrada.
23
Nivel
T
R
rea Promedio SD
Peso
(mg)
1
Iny. 1 6,490 156927
156953 0,02 29,73
Iny. 2 6,478 156979
2
Iny. 1 6,501 203524
203983,5 0,32 39,89
Iny. 2 6,535 204443
3
Iny. 1 6,534 263304
263436,5 0,07 50,39
Iny. 2 6,488 263569
4
Iny. 1 6,505 315612
313821 0,81 60,06
Iny. 2 6,496 312030
5
Iny. 1 6,502 362408
362375,5 0,01 69,75
Iny. 2 6,535 362343
Tabla 3: Linealidad del mtodo para Cscara Sagrada.
Fig. 15: Linealidad del mtodo para Cscara Sagrada.
R
2
= 0,9992.
24
6.1.2 - Aloe: Extractos
Se prepararon soluciones Agua Metanol (50%-50%)
ALOE
Punto Peso (mg)
Porcentaje de la
concentracin declarada (%)
1 29,97 60
2 40,42 80
3 50,49 100
4 60,05 120
5 70,63 140
Tabla 4: Linealidad del mtodo para Aloe.
Fig. 16: Cromatograma extracto 5 de aloe a 295 y 394nm.
Se cuantifc a 295nm ya qure las alonas tienen su mximo a esa longitud de onda.
25
Fig. 17: Espectro del pico correspondiente a alona de T
R
= 12.813
en la muestra en el extracto de aloe.
Fig. 18: Espectro el pico correspondiente a alona testigo de T
R
= 13.249.
26
Nivel
rea rea Suma de reas
Promedio SD Peso (mg)
Alona B Alona A Alona A + B
1
Iny. 1 470159 413918 884077
882405 0,27 29,97
Iny. 2 470378 410355 880733
2
Iny. 1 635157 554252 1189409
1187551 0,22 40,42
Iny. 2 632465 553228 1185693
3
Iny. 1 791150 687357 1478507
1474416,5 0,39 50,49
Iny. 2 784323 686003 1470326
4
Iny. 1 941373 810780 1752153
1749701,5 0,20 60,05
Iny. 2 933248 814002 1747250
5
Iny. 1 1098295 954048 2052343
2048181 0,29 70,63
Iny. 2 1094677 949342 2044019
Tabla 5: Linealidad del mtodo para Aloe.
Fig. 19: Linealidad de Aloe R
2
= 0,998.
La linealidad evaluada en este rango de concentraciones presenta valores de coefciente R
2
iguales
o mayores a 0,99 para alonas y cascarsidos ledos 295nm y a 324nm.
27
6.2 - Exactitud
Para exactitud se evalu recuperacin, linealidad de recuperacin.
6.2.1 - Recuperacin
Se analiz la recuperacin del mtodo para cada droga. Se prepararon tres muestras concentracin
terica Aloe 60% - Cscara Sagrada 140%, Aloe 100% - Cscara Sagrada 100 y Aloe 140% - Cscara
Sagrada 60%.
6.2.2 - Linealidad de recuperacin
Nivel rea Promedio Peso (mg) Recuperacin %
Referencia
Iny. 1 266629
266737 51,02 -
Iny. 2 266845
1
Iny. 1 370892
369947,5 69,76 101,44
Iny. 2 369003
2
Iny. 1 278917
278318 50,66 105,08
Iny. 2 277719
3
Iny. 1 180180
180190,5 29,93 115,15
Iny. 2 180201
Tabla 6: Linealidad de recuperacin de Cscara Sagrada.
Fig. 20: Linealidad de recuperacin de Cscara Sagrada.
28
Aloe
rea
Alona A
rea
Alona B
rea Alo-
na A+B
Promedio
Peso
(mg)
Recuperacin %
Referencia
Iny. 1 797846 693981 1491827
1487325,5 50,90 -
Iny. 2 789701 693123 1482824
Punto 1
Iny. 1 453967 405234 859201
855438 31,02 94,38
Iny. 2 453009 398666 851675
Punto 2
Iny. 1 807711 674136 1481847
1481745,5 52,00 97,52
Iny. 2 808789 672855 1481644
Punto 3
Iny. 1 1077899 958948 2036847
2035977 69,99 99,55
Iny. 2 1078071 957036 2035107
Tabla 7: Linealidad de recuperacin de Aloe.
Fig. 21: Linealidad de recuperacin de Aloe.
29
Fig. 22: Cromatograma solucin Cscara Sagrada y Aloe (extracto 3).
Aloe se valora a 294nm y Cscara Sagrada a 394nm.
La recuperacin para Aloe es 97.20% y para Cscara Sagrada es de 105.08% para el punto 2 (100%
del valor declarado de Aloe).
6.3 - Especifcidad
En los cromatogramas del extracto de Aloe, no hay ningn pico signifcativo que se superponga con
los picos correspondientes a las alonas y el espectro UV/Vis de los picos correspondientes a alona
A/B en el producto terminado coincide con los de la sustancia de referencia. Por otro lado, se comprob
que ninguna sustancia correspondiente a Aloe se superpone con el pico correspondiente al cascarsido
utilizado como marcador de Cscara.
El espectro UV/Vis del pico correspondiente al cascarsido en el cromatograma de producto terminado
coincide con el del cascarsido en la solucin de referencia.
30
7 Cuantifcacin de Cscara Sagrada y Aloe en cpsulas
7.1 - Preparacin de soluciones:
7.1.1 - Fase mvil
Solucin A: Medir exactamente 1 ml de cido actico glacial, colocar en matraz de 100ml y llevar a
volumen con agua purifcada calidad HPLC.
Solucin B: Medir exactamente 1 ml de cido actico glacial, colocar en matraz de 100ml y llevar a
volumen con metanol calidad HPLC.

7.1.2 - Solvente de dilucin
Mezclar 3 partes de metanol calidad hplc y 1 parte de agua purifcada calidad HPLC.

7.1.3 - Solucin testigo
Pesar exactamente alrededor de 50 mg de aloe, zumo desecado y 75 mg de cscara sagrada (polvo),
colocar en un matraz de 50 ml, agregar 20 ml de solvente de dilucin y sonicar durante 10 minutos. Llevar
a volumen con solvente de dilucin y fltrar por membrana de nylon 0.45 de dimetro de poro.

7.1.4 - Solucin muestra
Pesar 10 cpsulas por separado, registrando el peso individual. Vaciar las cpsulas completamente
y registrar el peso de las mismas. Calcular el contenido promedio de las cpsulas. Pesar una cantidad
de polvo equivalente a 50% del contenido de una cpsula ( 180 mg) y transferir a un matraz de 50 ml.
Agregar 20 ml de solvente de dilucin y sonicar durante 15 minutos. Llevar a volumen con solvente de
dilucin y fltrar por membrana de nylon de 0.45 de dimetro de poro.

7.2 - Procedimiento
Inyectar la solucin testigo por duplicado, registrando el cromatograma a 295 y 324nm. Identifcar el
rea correspondiente al cascarsido (324 nm) y los dos picos correspondientes a alona A y B (295 nm).
Inyectar la solucin muestra por duplicado, registrando el cromatograma a 295 y 324 nm. Identifcar los
picos correspondientes a cscarsido (324 nm) y alonas A y B (295 nm).
7.3 - Clculos
Calcular la cantidad de activo en cada cpsula aplicando la siguiente frmula:
Aloe (mg) = rea
MT
x Conc
T
x Peso
PROM
/ rea
T
x Peso
MT
Dnde:
rea
MT
= Sumatoria de las reas de Alonas A y B detectadas en la inyeccin de la solucin muestra.
rea
T
= Sumatoria de las reas de Alonas A y B detectadas en la inyeccin de la solucin testigo.
Conc
T
= Concentracin de Aloe (materia prima utilizada para la fabricacin del lote analizado) expre-
sado en mg/ml.
Peso
MT
= Peso de la muestra (expresado en mg).
Peso
PROM
= Peso promedio del contenido de las cpsulas (expresado en mg).
Cscara Sagrada (mg) = rea
MT
x Conc
T
x Peso
PROM
/ rea
T
x Peso
MT
Dnde:
rea
MT
= rea del pico de Cascarsido en la inyeccin de la solucin muestra.
rea
T
= rea del pico de Cascarsido en la inyeccin de la solucin testigo.
Conc
T
= Concentracin de Cscara sagrada (materia prima utilizada para la fabricacin del lote anali-
zado) expresado en mg/ml.
Peso
MT
= Peso de la muestra (expresado en mg).
Peso
PROM
= Peso promedio del contenido de las cpsulas (expresado en mg).
31
8 Conclusin
Al cuantifcar una droga en particular presente en una forma farmacutica compuesta por varias drogas
vegetales, el empleo de un mtodo cromatogrfco instrumental en general supera ampliamente a las
tcnicas espectrofotomtricas tales como las propuestas por la BP 2007 para materias primas ya que las
mismas carecen de la especifcidad necesaria.
No existen mtodos codifcados para combinaciones de de Cscara y Aloe por lo que fue necesario
desarrollar un mtodo de valoracin por HPLC para producto terminado que permitiera valorar cada droga
por separado y si fuera posible, en una misma corrida por cuestin de tiempo y recursos.
Cuando la frmula cuali-cuantitativa de un ftoterpico est expresada en cantidad de droga vegetal,
una vez identifcados los marcadores de las mismas es conveniente utilizar la materia prima utilizada para
la fabricacin del lote del producto terminado como sustancia de referencia.
Tanto las alonas como el cascarsido utilizado como marcador de Cscara se pueden detectar en el
producto terminado de manera lineal en un amplio rango de concentraciones (40-140% del contenido de
Aloe y Cscara declaradas), tanto en extracto obtenido con la materia prima individual como en extracto
obtenido con las proporciones analizadas para el ensayo de recuperacin.
La validacin del mtodo permiti concluir que el mismo es lineal, ya que el coefciente de regresin
lineal calculado result ser igual o mayor a 0,99 en el rango (75-150%) analizado.
En cuanto a la especifcidad, se confrm que no hay superposiciones signifcativas con otros picos
tanto para los marcadores de Aloe, como para el marcador de Cscara.
Se desarroll por lo tanto un mtodo sencillo, exacto y lineal que permite valorar por HPLC el producto
terminado.
9 Referencias bibliogrfcas y material de consulta
British Pharmacopoeia 2007 (Barbados Aloes, pg. 3374).
British Pharmacopoeia 2007 (Cape Aloes, pg. 3374 ).
British Pharmacopoeia 2007 (Cascara Sagrada pg. 3435).
Bruneton, Jean (2001). Farmacognosia: ftoqumica y plantas medicinales 2 edicin Editorial Acribia.
Farmacopea Nacional Argentina 8va. Edicin (2003). Cscara Sagrada.
Flrez, Jess. Armijo, Juan & Mediavilla, frica (2008). Farmacologa Humana,
5 edicin. Editorial Elsevier Masson.
United States Pharmacopoeia 30 (2007). Cascara Bark.
Wagner, Hildebert & Bladt, Sabine. Plant Drug Analysis: A Thin Layer Chromatography Atlas, 2 edicin (1996).
World Health Organization (1999). Monographs on Selected Medicinal Plants Vol. 1.
World Health Organization (2004). Monographs on Selected Medicinal Plants Vol. 2.
32

Cuantificacion Aloina Por HPLC

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