1

Mtodos cromatogrficos e espectromtricos usados

em quimiotaxonomia, prospeco de metablitos
bioativos e identificao rpida de fungos
Lucas M. de Abreu, DFP, UFLA
Setembro, 2011
V Simpsio Brasileiro de Microbiologia Aplicada
?
O
O H
O
OH
OH
OH
2
Metab Metab litos prim litos prim rios e metab rios e metab litos secund litos secund rios... rios...
substncias com distribuio
generalizada
substncias com distribuio restrita
O H O
O
O
O O
O
O
O
OH
O
Dewick, 2001
3
Metab Metab litos secund litos secund rios produzidos por fungos rios produzidos por fungos
100 mil espcies de fungos descritas
25 mil metablitos secundrios descritos (2005)
10 mil spp. investigadas quanto ao metabolismo secundrio
funes
competio, proteo
toxinas, antibiticos
controle metabolismo (sob certas condies)
comunicao
nenhuma ?
diversidade - aproximadamente...
Brdy, 2005; Dewick, 2001
4
usos - frmacos e seus precursores
O
N
O
O
O H
S
N
H
H
O
OH
O
O
S
N
tiamulina - antibitico de uso veterinrio caspofungina - antifngico
griseofulvina - antifngico
penicilina G - antibitico
Metab Metab litos secund litos secund rios produzidos por fungos rios produzidos por fungos
Misiek & Hoffmeister, 2007
5
N
O
N
O
N
O
N
O
N
H
O
N
H
O
N
O
N
H
O
N
O
N
O
N
H
O
O H
H
ciclosporina A - imunossupressor
cido micofenlico - imunossupressor
lovastatina - inibidor da sntese do colesterol
ergotamina - vasoconstritor (enxaqueca)
usos - frmacos e seus precursores
Metab Metab litos secund litos secund rios produzidos por fungos rios produzidos por fungos
Misiek & Hoffmeister, 2007
6
perigos - micotoxinas
aflatoxina B1
toxina T2
ocratoxina A
patulina
citrinina
fumonisina B1
Metab Metab litos secund litos secund rios produzidos por fungos rios produzidos por fungos
Bennett & Klich, 2003
7
Prospec Prospec o qu o qu mica de fungos mica de fungos
em geral desvinculada de um trabalho taxonmico
fontes de diversidade
solo (tradicional), plantas (endfitos e patgenos)
e ambiente marinho
escolha dos isolados
aleatria ou baseada em resultados de bioensaios
frequente ocorrncia de redundncias
taxonmica e qumica
Larsen et al., 2005; Monaghan et al., 1995
8
Fungos toxignicos Fungos toxignicos
mtodos analticos para deteco de toxinas em alimentos e fungos
contaminantes
taxonomia importante: conhecendo-se as espcies e seus metablitos
tem-se idia do risco associado
Penicillium roqueforti
Frisvad & Samson, 2004
Maturao de queijos - sem riscos
Contaminao de forragens e
gros - toxina PR
Toxina PR Toxina PR
Nielsen et al., 2005
9
Estrat Estrat gia gia
obteno de perfis de metablitos produzidos
comparaes entre perfis; uso de bancos de dados
caracterizao parcial das substncias presentes nos extratos
Prospeco qumica, anlise toxicolgica e quimiotaxonomia
Larsen et al., 2005; Smedsgaaard & Nielsen, 2005
avaliao dos metablitos secundrios produzidos
por fungos cultivados em pequena escala
mtodos analticos - CLAE, CLAE-EM
RT, espectro UV, espectro de massas
10
Primeira etapa Primeira etapa - - obten obten o de extratos o de extratos
cultivo dos isolados em meio(s) apropriado(s)
Penicillium brasilianum
11
Obten Obten o de extratos o de extratos
extrao em micro-escala
Smedsgaard, 1997; Nielsen, 2009
12
Cromatografia l Cromatografia l quida de alta eficincia com detector de arranjo de diodos quida de alta eficincia com detector de arranjo de diodos
(CLAE (CLAE- -DAD, HPLC) DAD, HPLC)
Nielsen, 2009
RT =9,5 min
RT =10,8 min
RT =5,5 min
RT =6,9 min
13
Fel 355
CLAE CLAE- -DAD DAD
Alternariol
RT =8,7 min
RT =11,5 min
14
CLAE CLAE- -DAD acoplada DAD acoplada espectrometria de massas (EM) espectrometria de massas (EM)
metablitos separados por CLAE so analisados por EM
EM - ons so separados de acordo com sua razo massa / carga (m/z)
espectrmetro de massas
Nielsen & Smedsgaard, 2003
15
CLAE CLAE- -DAD DAD- -EM EM
espectrmetros de alta resoluo - determinao de frmulas moleculares
bancos de dados - identificao de metablitos, desreplicao
Perfil de metablitos secundrios de Aspergillus fumigatus obtido por CLAE-EM. Adaptado de Frisvad
et al., 2009
16
Uso de perfis de metab Uso de perfis de metab litos na desreplica litos na desreplica o e descoberta de substncias o e descoberta de substncias
Triagem inteligente
obteno de perfis de metablitos em pequena escala e definio de
quimiotipos
CLAE-DAD, CLAE-DAD-EM
seleo de representantes de cada quimiotipo e desreplicao
espectros de massa, bancos de dados
conduo de bioensaios
extratos brutos ou (micro) fracionados
cultivo em grande escala, purificao e elucidao estrutural
metablitos alvo
Larsen et al., 2005; Smedsgaard & Nielsen, 2005
17
novos anlogos da mevastatina produzidos por Penicillium solitum
Mevastatina Mevastatina
Solistatina Solistatina Solistatinol
Espectros de absoro no UV dos metablitos mevastatina, solistatina e solistatinol. Adaptado de
Srensen et al., 1999; Larsen et al., 2007
Triagem inteligente
18
Alantripinona
N
N
O
N H
O
N
H
O
Alantripinona
N
N
O
N H
O
N
H
O
descoberta de anlogos de metablitos conhecidos - programa X-hitting
avalia arquivos gerados por CLAE-DAD em busca de espectros de
absoro no UV semelhantes ao de uma substncia alvo
Lapatina A
N H
N
N
O
NH
N
O
H
O
Lapatina A
N H
N
N
O
NH
N
O
H
O
Lapatina B Lapatina B
Comparao entre os espectros de absoro no UV da alantripinona (azul) com aqueles da lapatina
A (esquerda) e lapatina B (direita). Adaptado de Hansen et al., 2005
Triagem inteligente
19
Fracionamento de extratos por CLAE seguido de bioensaios Fracionamento de extratos por CLAE seguido de bioensaios
metablitos eludos so distribudos em uma placa de microtitulao
o contedo dos poos submetido a bioensaios (micro-escala)
os resultados de bioatividade so comparados com os cromatogrficos
20
[M+H]
+
[M+NH
4
]
+
Frmula molecular:
C
29
H
35
NO
8
Escoparasina A Fenocalasina B
Microfracionamento Microfracionamento
metablitos citotxicos produzidos por Libertella sp.
21
Perfil por CLAE, atividade antibacteriana e citotxica do extrato do fungo Gliocladium sp. Adaptado
de Lang et al., 2006
4-ceto-clonostaquidiol
O O
O
O
O O H
4-ceto-clonostaquidiol
O O
O
O
O O H
Microfracionamento Microfracionamento
metablitos bioativos produzidos por Gliocladium sp.
22
objetivo
uso de metablitos secundrios como caracteres (marcadores) para
caracterizao e identificao de fungos
hiptese
quimioconsistncia - espcies diferentes produzem perfis de
metablitos secundrios distintos
Quimiotaxonomia Quimiotaxonomia
Frisvad et al. 2008
gneros mais estudados
Penicillium, Aspergillus, Fusarium, Alternaria,Trichoderma,
Stachybotrys, Xylaria, Hypoxylon
23
Samson et al. 2004
abordagem descritiva - marcadores qumicos para caracterizao de
espcies definidas; indicao de possveis novos txons
P. roqueforti produo de queijos;
contaminao de pes, silagem e
gros
Produz toxina PR, cido micofenlico,
isofumigaclavina A e B, roquefortina C
P.carneum contaminao de
carne, pes, cerveja, queijos e
silagem
P. paneum contaminao de
pes, gros e silagem
Produz patulina, penitrem A, cido
micofenlico, isofumigaclavina A e B,
roquefortina C
Produz patulina, botriodiplodina,
roquefortina C
Quimiotaxonomia Quimiotaxonomia
24
taxonomia numrica - classificao multivariada de isolados com base em
perfis de metablitos
matrizes binrias isolados X metablitos (RI) - ndices de similaridades
667 681 688 689 696 697 699 702 703 707 712 718 721 733 740 744 745
CML871_Coffee_MG 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 1 0 0 0
CML1316_Coffee_MG 1 1 1 0 1 0 0 0 0 1 0 0 0 1 0 0 0
CML1501_Mango_MG 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 1 0 0
CML1506_Mango_MG 1 1 1 0 1 0 0 0 0 1 0 0 0 1 1 0 0
CML1527_Cacao_BA 1 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0
CML1928_Phoradendron_MG0 1 1 0 1 0 0 0 0 1 0 0 0 1 1 0 0
CML1930_Tapirira_MG 1 1 1 0 1 0 0 0 0 1 0 0 0 1 1 0 0
CML1932_Tapirira_MG 1 1 1 0 1 0 0 0 0 1 0 0 0 1 1 0 0
CML1933_Tapirira_MG 1 1 1 0 1 0 0 0 0 1 0 0 1 1 0 0 0
CML1500_Mango_MG 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0
CML1502_Mango_MG 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 1
CML1503_Mango_MG 0 1 0 0 1 0 0 0 0 1 0 1 0 0 0 0 0
CML1507_Mango_MG 0 0 0 0 1 0 0 1 0 0 0 1 0 0 0 0 1
CML1931_Tapirira_MG 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 1 0 0 0
CML1934_Phoradendron_MG0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0
CML1936_Phoradendron_MG0 0 0 0 1 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 1
CML1481_Mango_MG 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0
CML1520_Cacao_AM 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0
CML1529_Cacao_BA 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0
CML1530_Cacao_BA 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0
CML1939_Phoradendron_MG0 0 0 0 1 1 0 0 0 0 0 0 1 0 0 1 0
CML1929_Tapirira_MG 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0
Quimiotaxonomia Quimiotaxonomia
25
taxonomia numrica
Overy et al. 2005
Quimiotaxonomia Quimiotaxonomia
26
quimiotipos e filogenia
Quimiotaxonomia Quimiotaxonomia
27
Penicillium polonicum
Identifica Identifica o r o r pida (e taxonomia) de fungos pida (e taxonomia) de fungos
ESI - ionizao de um grande nmero de metablitos; de perfis de massa
Larsen et al., 2005
infuso direta do extrato bruto no espectrmetro de massas ( id-EM)
28
id id- -EM EM
Id-EM Filogenia
Larsen et al., 2005
29
An An lise de perfis de prote lise de perfis de prote nas por EM nas por EM
extratos brutos, miclio ou esporos analisados diretamente por EM
ionizao de protenas - MALDI
Glish & Vachet, 2009; Santos et al., 2009
30
An An lise de perfis de prote lise de perfis de prote nas por EM nas por EM
analisador de massas por tempo de vo - TOF
Glish & Vachet, 2009; Santos et al., 2009
31
An An lise de perfis de prote lise de perfis de prote nas por EM nas por EM MALDI MALDI- -TOF TOF
A. candidus
A. chevalieri
A. flavus
A. fumigatus
A. sydowii
A. terreus
A. ustus
A. versicolor
Hettick et al. 2008a
32
An An lise de perfis de prote lise de perfis de prote nas por EM nas por EM MALDI MALDI- -TOF TOF
A - A. candidus
B - A. chevalieri
C - A. flavus
D - A. fumigatus
E - A. nidulans
F - A. niger
G - A. parasiticus
H - A. repens
I - A. sydowii
J - A. terreus
K - A. ustus
L - A. versicolor
Hettick et al. 2008a
33
An An lise de perfis de prote lise de perfis de prote nas por EM nas por EM MALDI MALDI- -TOF TOF
P. aurantiogriseum
P. brevicompactum
P. citrinum
P. chrysogenum
P. purpurogenum
P. roqueforti
P. simplicissimum
P. variabile
Hettick et al. 2008b
34
An An lise de perfis de prote lise de perfis de prote nas por EM nas por EM MALDI MALDI- -TOF TOF
A - P. aurantiogriseum
B - P. brevicompactum
C - P. citrinum
D - P. chrysogenum
E - P. expansum
F - P. fellutanum
G - P. jensenii
H - P. melinii
I - P. purpurogenum
J - P. roqueforti
K - P. simplicissimum
L - P. variabile
Hettick et al. 2008b
35
contato:
lmabreu@gmail.com
FIM!