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Criofratura

Ao final desta aula, você deverá ser capaz de:


OBJETIVOS
• Conhecer os princípios da criofratura.
• Entender as informações contidas numa réplica
de criofratura.
• Correlacionar a criofatura à construção do modelo
do mosaico fluido de membrana.

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Biologia Celular I | Criofratura

INTRODUÇÃO Uma das limitações do microscópio eletrônico de transmissão sempre foi o


fato de que as imagens observadas eram cortes ultrafinos das amostras, isto é,
imagens bidimensionais de estruturas (células) tridimensionais (Figura 3.1).
Isto pôde ser contornado com a observação de cortes seriados, uma técnica
bastante trabalhosa (Figura 3.2), e também com a microscopia de varredura.
Entretanto, a resolução do microscópio eletrônico de varredura é menor que a
do microscópio de transmissão, não permitindo a visualização de vários detalhes,
principalmente do interior da célula (vide Aula 2) .

plano de corte
perfil bidimensional,
membrana de aspecto trilaminar

Figura 3.1: No microscópio de transmissão o corte ultrafino de uma célula resulta numa imagem
bidimensional onde se vê o contorno (perfil) trilaminar da membrana plasmática e as organelas internas
(não representadas).

planos de corte

O “empilhamento" de vários
perfis bidimensionais em série
permite reconstruir o aspecto
tridimensional da estrutura.

Figura 3.2: Cortes em série de uma estrutura podem dar uma noção de sua forma
tridimensional.

Em cortes ultrafinos, a membrana plasmática aparece sempre como


uma estrutura trilaminar, com uma faixa clara limitada por duas linhas mais
escuras. O aspecto trilaminar da membrana plasmática é chamado unidade
de membrana.

Esse aspecto dificulta a determinação da real estrutura da membrana,


levando a conclusões erradas acerca da distribuição de proteínas e lipídeos
(vide boxe), porém o desenvolvimento da técnica da criofratura abriu um
novo horizonte de informações sobre as membranas celulares.

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MÓDULO 1
Há muito tempo já era sabido que a membrana plasmática

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era composta principalmente de proteínas e lipídeos; entretanto, a

AULA
observação da estrutura trilaminar da membrana em cortes ultrafinos
levou à conclusão errada de que a estrutura da membrana seria um
"sanduíche" de proteínas recheado por uma bicamada lipídica.
Uma membrana com essa organização seria não apenas
muito rígida, dificultando os movimentos celulares, como seria
quase impossível que substâncias passassem através dela: aquelas
hidrofílicas ficariam impedidas de passar pela bicamada lipídica, assim
como seria impossível que as substâncias hidrofóbicas atravessassem a
cobertura de proteínas (veja o esquema na Figura 3.3).

Lipídeos e outras
substâncias hidrofóbicas
não cruzariam a “couraça”
Proteínas e outras moléculas de proteínas da membrana.
hidrofílicas não atravessariam
o “miolo” lipídico da membrana.

proteína

proteína
lipídeo

Figura 3.3: O "modelo do sanduíche" da membrana era rígido e não explicava os movimentos
celulares e o transporte através da membrana, embora correspondesse à imagem de microscopia
eletrônica de transmissão de cortes ultrafinos.

Fundamentos da técnica

A técnica da criofratura começou a ser desenvolvida na década de 60


e a idéia inicial foi reduzir ao máximo os artefatos decorrentes da fixação
química por aldeídos. O objetivo era parar instantaneamente a atividade
celular, provocando a fixação das células sem que nenhum processo de
decomposição celular tivesse tempo de acontecer.
O procedimento básico para criofratura consiste em 4 etapas :
a. congelamento das células em nitrogênio líquido;
b. fratura das células;
c, d. evaporação da superfície fraturada com carbono e platina
formando um "molde" da superfície fraturada (chamado réplica);
e, f. digestão dos restos celulares, de modo que apenas a réplica
metálica é observada ao microscópio eletrônico de transmissão.

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Biologia Celular I | Criofratura

Figura 3.4: Principais etapas na produção de uma réplica.

CONGELAMENTO
Algumas adaptações tiveram de ser feitas para que os cristais de
gelo que se formavam no processo de congelamento não perfurassem
as células, lesando-as gravemente e impedindo a observação de sua
organização. Assim, antes de congelar as amostras, elas são brevemente
fixadas em aldeídos e infiltradas com glicerol, uma substância que
dificulta a formação de cristais de gelo (Figura 3.5). Um outro fator
que impede a formação de cristais é fazer um congelamento ultra-
rápido, o que requer equipamentos ainda mais sofisticados.

Figura 3.5: Para criofratura, as células são inicialmente fixadas com aldeídos, a seguir infiltradas com glicerol, que
impedirá a formação de cristais de gelo quando congeladas.

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MÓDULO 1
FRATURA

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Depois de congeladas, as amostras são colocadas numa câmara

AULA
a vácuo e aí fraturadas, também a baixa temperatura. Para observar a
superfície exposta após a fratura, não seria possível retirar a amostra do
aparelho, pois à temperatura ambiente ela simplesmente derreteria.
Por esse motivo, é necessário fazer um molde que reproduza a
superfície fraturada com todos os detalhes.

Figura 3.6: O material congelado é fraturado, expondo o interior celular.

REPLICAÇÃO

Ainda sob vácuo e baixa temperatura, a superfície exposta é


recoberta com uma fina camada de platina. Lembre que o carbono é
um átomo leve, pouco eficiente para barrar os elétrons do microscópio
eletrônico. A platina é evaporada em ângulo lateral, assim não se deposita
em toda a superfície da amostra. Lembre também que a platina é um
metal pesado, barrando os elétrons
que colidirem com seus átomos.
Imediatamente após, é feito um
sombreamento com carbono, que
forma a base da réplica.
Essa réplica de carbono e
platina é que será observada ao
microscópio eletrônico. Para que
a réplica não sofra interferência de
restos celulares da amostra inicial,
ela é limpa com a ajuda de ácido e
bases fortes.

Figura 3.7: A platina evaporada em


ângulo se deposita apenas em algumas
partes da superfície fraturada. O
carbono forma um filme contínuo sobre
a superfície fraturada.

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Biologia Celular I | Criofratura

INTERPRETAÇÃO DAS RÉPLICAS

O aspecto de algumas réplicas era muito diferente das imagens


dos cortes ultrafinos. Embora algumas estruturas fossem identificadas
(Figura 3.8), muitas vezes observava-se apenas grandes áreas que
pareciam corresponder à superfície celular (Figura 3.9). Nessas
superfícies de membrana havia sempre um grande número de
partículas distribuídas: as partículas intramembranosas (Figura 3.9).

Foto: Raul D. Machado

Figura 3.8: Quando a célula é fraturada em seu plano médio é possível reconhecer o
núcleo pelo seu envoltório duplo e complexos de poro. Vacúolos e organelas
intracelulares são de identificação mais difícil.

Figura 3.9: Quando a fratura expõe a superfície da célula, observamos várias


partículas intramembranosas, setas que correspondem às proteínas da membrana.

Em 1966 foi possível demonstrar que a fratura ocorre


preferencialmente no plano médio da membrana, isto é, separando as
duas camadas de fosfolipídeos que a formam (Figura 3.10 ), e que as
partículas inseridas nas membranas correspondiam a proteínas delas.
Essa foi uma das evidências mais importantes para a sustentação do
modelo do mosaico fluido, proposto por Singer e Nicolson em 1972.

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MÓDULO 1
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AULA
Figura 3.10: O plano de fratura preferencial divide os folhetos da bicamada lipídica. Podem ser observados
o folheto voltado para o citoplasma (face P) ou o lado voltado para o meio extracelular (face E) da membrana.

(A) (B) (C) (D1) (D2)

Figura 3.11: Esquema de uma hemácia (A) sendo fraturada (B) e (C) e expondo, ora a face E da membrana,
voltada para o exterior (D1), ou a face P, voltada para o citoplasma (D2).

CONCLUSÃO

A criofratura continua sendo uma técnica importante no estudo das células, entretanto,
muitas variações foram introduzidas, permitindo a obser vação não apenas do "miolo" da
membrana, mas também das faces voltadas para o citoplasma, para o meio extracelular e
também de estruturas citoplamáticas, como os microtúbulos.

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Biologia Celular I | Criofratura

RESUMO

A técnica de criofratura consiste em fraturar células ou tecidos depois de congelados.


A fratura tem grande probabilidade de ocorrer entre as duas camadas de fosfoli-
pídeos que formam as membranas, expondo uma matriz homogênea (os lipídeos)
com partículas de diversos tamanhos nela inseridas. Essas partículas "intramembranosas"
correspondem a proteínas que atravessam a bicamada lipídica. Para que a face
fraturada possa ser observada é feita uma réplica em carbono e platina da mesma.
Finalmente, os restos da amostra são separados da réplica que é colocada sobre uma
grade e levada ao microscópio eletrônico de transmissão.
O plano de fratura ocorre preferencialmente entre os dois folhetos de bicamada lipídica,
expondo o plano hidrofóbico do lado voltado para o citoplasma (face P) ou do lado
voltado para o meio extracelular (face E).

EXERCÍCIOS

1. Liste as etapas do procedimento para criofratura, explicando os objetivos de cada uma.


2. Qual a parte da membrana que é exposta na fratura?
3. A que correspondem as partículas intramembranosas observadas nas réplicas?
4. Qual a contribuição da criofratura na elaboração do modelo do mosaico fluido?

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