A Micropropagao de Eucalipto

Leonardo Ferreira Dutra

(1)
, Ivar Wendling
(2)
, Gilvano Ebling Brondani
(3)
(1)
Embrapa Clima Temperado, Rodovia BR 392, Km 78, Caixa Postal 403, CEP 96.001-970, Pelotas-RS. E-mail: leo@cpact.embrapa.br;
(2)
Embrapa Florestas, Estrada da Ribeira, Km 111, Caixa Postal 319, CEP 83.411-000, Colombo-PR. E-mail: ivar@cnpf.embrapa.br;
(3)
Escola Superior de Agricultura "Luiz de Queiroz" - ESALQ/USP, Av. Pdua Dias, 11, Caixa Postal 9, CEP 13.418-900, Piracicaba-SP. E-mail:
gebrondani@yahoo.com.br
Resumo - O eucalipto o gnero forestal mais pesquisado em micropropagao, entretanto, so poucos os
resultados efetivos obtidos com sua multiplicao contnua. A micropropagao inclui a desinfestao e cultivo
dos explantes em meio nutritivo e condies asspticas, a multiplicao dos propgulos em sucessivos subcultivos
e o enraizamento in vitro ou ex vitro. Como vantagens, possibilita: alto rendimento por planta matriz; obteno
de plantas isentas de viroses; produo de mudas em qualquer poca do ano; produo intensiva de mudas
sadias, em curto perodo de tempo e espao reduzido; clonagem de plantas de difcil propagao vegetativa
por mtodos convencionais como estaquia e miniestaquia; e preservao de plantas matrizes sem riscos de
infeco. Suas desvantagens incluem a dependncia de um laboratrio de cultura de tecidos, cuja manuteno
implica em altos custos, alm da exigncia de mo-de-obra altamente especializada; elevada possibilidade de
contaminao; variao de condies entre e dentro de clones; difculdade de encontrar o meio adequado para a
espcie desejada; e possibilidade de ocorrncia de mutaes, como resultado do uso de ftorreguladores. Embora
tenha alto custo em comparao a outros mtodos de clonagem, a micropropagao de eucalipto estratgica
para manter material vegetal superior in vitro ou para abastecer o microjardim clonal.
Termos para indexao: Eucalyptus spp., cultura de tecidos, cultivo in vitro, produo de mudas.
The Eucalipt Micropropagation
Abstract - The Eucalyptus is the genus that has the highest number of researchs in micropropagation. However,
there are few effective results obtained with their continuous proliferation. Micropropagation includes disinfection
and culture of explants in nutrient medium and aseptic conditions, multiplication in successive subcultures
and in vitro or ex vitro rooting. As advantages, the micropropagation allows: high yield per donor plant, free-
virus plants, production of saplings at any time of the year, intensive production of healthy saplings in a short
period of time and in a limited space, cloning of plants diffcult-to-propagate by conventional methods, such
as cutting and minicutting, and donor plant preservation without risk of infection. Its disadvantages include the
dependence on a tissue culture laboratory, which results in high maintenance costs, as well as the requirement
of highly trained workers, high possibility of contamination, variation of conditions within and among clones,
the diffculty of fnding appropriate culture medium for the species desired and possibility of mutation as a
result of the use of growth regulators. Despite having high cost when compared to other cloning methods, the
species and hybrids of eucalypt micropropagation is strategic to maintain superior plant material in vitro or to
supply the micro-clonal hedge.
Index terms: Eucalyptus spp., tissue culture, in vitro culture, production of plants.
Introduo
O eucalipto o gnero forestal que mais possui
estudos de micropropagao. Os primeiros trabalhos
relatados com o cultivo in vitro de eucalipto datam
da dcada de 60 e somente no fnal dessa ocorreu o
primeiro relato de sucesso na regenerao de plntulas
de Corymbia citriodora (=E. citriodora), feito por Aneja
e Atal (1969). A partir desse momento, diversos trabalhos
tm sido desenvolvidos com os mais variados objetivos
e resultados obtidos.
Segundo Chaperon (1987), existem trs situaes
em que a micropropagao de eucalipto tem sido
recomendada: 1) quando outras tcnicas de propagao
vegetativa no apresentam resultados satisfatrios para
determinadas espcies; 2) quando a rvore selecionada
Pesquisa Florestal Brasileira, Colombo, n.58, p.49-59, jan./jun. 2009
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no pode ser rejuvenescida por meio da promoo de
brotaes basais; e 3) quando se deseja aumentar a
taxa de propagao e abreviar o tempo para seu uso
comercial.
Di versas espci es de eucal i pt o e h bri dos
interespecfcos j foram estudados in vitro, tais como:
E. alba, E. badjensis, E. bancroftii, E. benthamii,
E. botryoides, E. bridgesiana, E. calophylla, E.
camaldulensis, E. cladocalyx, E. cloeziana, E. coccifera,
Corymbia citriodora (=E. citriodora), E. curtisii,
E. dalrympleana, E. deglupta, E. delegatensis, E.
diversicolor, E. dunnii, E. erythronema, E. fcifolia,
E. gamphocephala, E. globulus, E. grandis, E. gunnii,
E. henryi, E. impensa, E. laevopinea, E. leichow,
E. macarthurii, E. macrorhyncha, E. maculata, E.
marginata, E. megacarpa, E. melliodora, E. microcorys,
E. microtheca, E. namely, E. nicholii, E. nitens, E. nova
anglica, E. obtusifora, E. occidentalis, E. oreades, E.
pauclifora(= E. niphophila), E. pellitta, E. phylacis, E.
polybractea, E. radiata, E. regnans, E. resinifera, E.
robusta, E. rubida, E. rudis, E. saligna, E. sargentii,
E. sideroxylon, E. smithii, E. stricklandii, E. stuartiana
(= E. ovata), E. tereticornis, E. torelliana, E. urnigera,
E. urophylla, E. viminalis, E. viridis, E. wandoo, E.
youmanii, Eucalyptus x Trabutti, E. camaldulensis x
E. tereticornis, E. dunnii x E. sp., E. erythronema x E.
stricklandii, E. grandis x E. camaldulensis, E. grandis
x E. nitens, E. grandis x E. robusta, E. grandis x E.
tereticornis, E. grandis x E. urophylla, E. gunnii x E.
dalrympleana, E. gunnii x E. globulus, E. macarthurii
x E. grandis, E. tereticornis x E. camaldulensis, E.
tereticornis x E. grandis, E. torelliana x E. citriodora,
E. urophylla x E. grandis.
Entretanto, so poucos os resultados efetivos obtidos
com a multiplicao contnua de espcies desse gnero.
Assim, o uso da micropropagao na produo comercial
de mudas de eucalipto ainda no se justifca tcnica e
economicamente, sendo indicada, principalmente, para o
rejuvenescimento de clones selecionados em laboratrio,
para espcies e hbridos de alto valor comercial e de
difcil enraizamento. Embora a micropropagao tenha
se mostrado tecnicamente vivel na clonagem de espcies
recalcitrantes, no foi vivel sob ponto de vista econmico
para uso em larga escala (ASSIS; MAFIA, 2007).
Atualmente, as aplicaes da propagao in vitro de
eucalipto so: produo massal de gentipos selecionados,
conservao de germoplasma e como veculo para pesquisas
com gentica molecular (WATT et al., 2003b).
Objetivos da Micropropagao de Eucalipto
Um dos objetivos da micropropagao a necessidade
de clonar espcies ou hbridos que tenham altas taxas
de crescimento, tolerncia a baixas temperaturas e
salinidade, resistncia a pragas e doenas. Tambm pode
haver interesse em micropropagar espcies com interesse
horticultural, como E. fcifolia; para produo de leo, no
caso de Corymbia citriodora (=E. citriodora); e espcies
raras ou com risco de extino, como E. carnabyi
(McCOMB; BENNETT, 1986).
Outra importante vantagem o rejuvenescimento
de rvores adultas selecionadas, visto que se tem
comprovado que o potencial de enraizamento de
propgulos de rvores adultas aumenta com os
sucessivos subcultivos in vitro.
O rejuvenescimento ou revigoramento de tecidos
adultos pode ser obtido via micropropagao por
sucessivos subcultivos in vitro (GONALVES, 1982;
BONGA; VON ADERKAS, 1992; GRATTAPAGLIA;
MACHADO, 1998). Assis e Mafia (2007) relatam
que o subcultivo sucessivo de tecidos adultos melhora
o enraizamento. Complementam, ainda, que a
micropropagao promove a homogeneizao fsiolgica
dos tecidos, seja em potencial de enraizamento ou
qualidade do sistema radicular.
O aumento do nmero de subcultivos no cultivo in
vitro de eucalipto restaura as caractersticas juvenis,
como o maior potencial de enraizamento (CHAPERON,
1987; XAVIER; COMRIO, 1996, 1997; ASSIS,
1996). De acordo com Alfenas et al. (2004), o
rejuvenescimento ou pelo menos o restabelecimento
da competncia ao enraizamento obtido, geralmente,
aps 10-12 subcultivos. Semelhante recomendao
foi feita por Xavier et al. (2007), para os quais um
mnimo de 12 subcultivos devem ser feitos, quando o
objetivo o rejuvenescimento de clones de eucalipto
selecionados na idade adulta e a melhoria do potencial
de enraizamento.
Mesmo com suas limitaes, a micropropagao de
espcies e hbridos de eucalipto faz parte do processo
de produo de mudas em algumas empresas forestais.
Normalmente, as mudas obtidas por micropropagao
so mantidas em condies in vitro por questes
estratgicas, no caso de material vegetal superior, ou
servem para abastecer o mini/microjardim clonal.
L. F. Dutra et al.
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O Processo de Micropropagao de Eucalipto
em Etapas
As fontes de explantes para inoculao in vitro
provm de matrizes cultivadas em ambiente protegido,
mini ou microjardim clonal, brotaes epicrmicas de
rvores adultas, brotaes de rvores decepadas ou ainda
de galhos podados.
As etapas da micropropagao seguem um
procedimento padro, no qual os explantes oriundos
de material vegetal coletado no campo necessitam de
limpeza e desinfestao prvia inoculao no meio de
cultura. Aps o estabelecimento in vitro, os explantes so
multiplicados, alongados, enraizados in vitro ou ex vitro
e fnalmente aclimatizados em ambiente ex vitro.
Os estgios da micropropagao incluem a seleo,
desinfestao e cultivo dos explantes em meio nutritivo
e condies asspticas; a multiplicao dos propgulos
em sucessivos subcultivos; e o enraizamento das partes
areas em meio de enraizamento com subsequente
aclimatizao em ambiente ex vitro (MURASHIGE,
1974).
Desinfestao
O estabelecimento in vitro uma etapa determinante
no processo de micropropagao, principalmente se os
explantes so oriundos de plantas no campo, em funo
de altas taxas de contaminao dos tecidos (ALFENAS
et al., 2004). Para esses autores, uma alternativa a
associao com a enxertia, pois os enxertos podem ser
mantidos em ambientes protegidos, otimizando os pr-
tratamentos, como a desinfestao.
A desinfestao superfcial de explantes de eucalipto
para cultura in vitro relativamente fcil quando
utilizado material juvenil e retirado de plantas cultivadas
em ambientes protegidos. Todavia, mais difcil de
obter material limpo e vivel de brotaes oriundas de
rvores mantidas em condies de campo (McCOMB;
BENNETT, 1986).
Os procedimentos de desinfestao podem variar em
funo do tipo e origem do explante, da poca do ano
e do ambiente onde so coletados os explantes. Para
explantes oriundos de brotaes originrias da decepa de
rvores matrizes de E. benthamii, com 17 anos de idade,
Hansel et al. (2005) recomendam a imerso em lcool 70
% (1 min) e NaClO 2 % (10 min) de segmentos nodais
e em NaClO 2 % (5 min) para pices caulinares.
Inmeros procedimentos e produtos so utilizados
para a desinfestao de explantes. Entre os mais
utilizados esto o etanol, normalmente utilizado a 70 %,
e o hipoclorito de sdio, em diversas concentraes.
Brondani (2008) e Brondani et al. (2009), testando
concentraes de hipoclorito de sdio na desinfestao
de segmentos nodais de E. benthamii x E. dunnii,
coletados de minicepas cultivadas em sistema semi-
hidropnico, constataram que a concentrao de 0,5 %
de cloro ativo foi mais efetiva.
Alfenas et al. (2004) recomendam a desinfestao de
segmentos nodais mais lignifcados imersos em 0,5 %
de cloro ativo durante 20 minutos e 0,3 % de cloro ativo
durante dois minutos para segmentos nodais mais tenros.
Normalmente, so adicionadas gotas de detergente
comercial ou 0,01-0,05 % de Tween 20 s solues a
base de cloro a fm de aumentar o contato dessas com
os tecidos.
Na desinfestao de sementes de eucalipto, McComb
e Bennett (1986) relatam que a desinfestao depende
do tamanho e espessura do revestimento da casca.
Termignoni et al. (1996) utilizaram hipoclorito de sdio
a 0,12 % por 15 minutos na desinfestao de sementes
de E. dunnii. J para E. marginata, que possui sementes
grandes e com revestimento mais espesso, pode-se tratar
as sementes com 5 % de hipoclorito de sdio por 1 hora
(CAHILL et al., 1992).
Holden e Paton (1981) em E. grandis, desinfestaram
os explantes com hipoclorito de clcio saturado por
75 minutos, seguido de 4 h sob irradiao ultravioleta.
Gupta et al. (1981) utilizaram cloreto de mercrio
(HgCl
2
) a 0,05 % por 15 minutos em E. citriodora (=C.
citriodora); HgCl
2
a 0,2 g.L
-1
por 2 minutos, seguida
de 2 minutos em 10 g.L
-1
de hipoclorito de clcio em
E. grandis foi utilizado por Watt et al. (2003a) e em E.
grandis x E. urophylla por Hajari et al. (2006), enquanto
Sharma e Ramamurthy (2000) empregaram 1 g.L
-1
de
HgCl
2
por 10 minutos em E. tereticornis.
O cloreto de mercrio altamente txico e utilizado
em concentraes inferiores aos hipocloritos, enquanto
o cloreto de benzalcnio pouco txico aos tecidos
vegetais e pode ser usado em concentraes semelhantes
aos hipocloritos (GRATTAPAGLIA; MACHADO,
1998). Outros agentes desinfestantes como o PPM
TM

(Preservative Plant Mixture) e o Saniagri

tambm
podem ser utilizados.
Aps a desinfestao, os explantes so inoculados em
meio de cultura, onde podem permanecer por 20-30 dias,
entretanto a ocorrncia de oxidaes e/ou contaminaes
pode ser perceptvel j na primeira semana de cultivo. A
A Micropropagao de Eucalipto
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fm de evitar contaminaes generalizadas, indicada a
inoculao dos explantes em tubos de ensaio, onde fcam
individualizados, ao invs de frascos de cultura.
Nessa fase, a composio do meio de cultura pode
variar de acordo com as necessidades nutricionais de
cada espcie. Os meios de cultura mais utilizados no
cultivo in vitro de eucalipto so MS (MURASHIGE;
SKOOG, 1962), JADS (CORREIA, 1993) e WPM
(Woody Plant Medium) (LLOYD; McCOWN, 1980).
Para o estabelecimento in vitro de plantas lenhosas,
recomenda-se a utilizao de meios de cultura com
baixas concentraes de nutrientes. Em funo disso,
muito empregado o meio MS com metade das
concentraes normais de seus sais, ou MS, no qual
todos os componentes so reduzidos metade. A adio
de ftorreguladores facultativa.
Visando evitar ou diminuir o processo oxidativo,
podem ser adicionados antioxidantes, como o
polivinilpirrolidona (PVP) e o cido ascrbico. Alm
disso, a iniciao do cultivo na ausncia de luz ou baixa
intensidade luminosa por 7 a 14 dias, a troca frequente
de meio de cultura, o uso de Gelrite

ou Fitagel
TM
como
solidifcante ou a adio de carvo ativado podem evitar
a oxidao fenlica. Fungicidas e bactericidas tambm
podem ser adicionados ao meio de cultura para controlar
contaminaes.
Multiplicao
O objetivo dessa fase a proliferao dos explantes,
mantendo-se a estabilidade gentica. Os explantes oriundos
da fase de estabelecimento so inoculados em meio de
cultura contendo combinaes de auxinas e citocininas,
dependendo da espcie e do tipo de explante.
O benzilaminopurina (BAP) tem sido o ftorregulador
mais utilizado para induzir a proliferao de gemas em
eucalipto (DEL PONTE et al., 2001). As concentraes
tm variado de 0,006 M a 8,8 M. No entanto, outras
citocininas, como a cinetina (0,23 M a 2,5 M), o
tidiazuron (TDZ) (0,045 M a 0,05 M) e o 2iP (2,5
M) tambm tm sido utilizadas.
As combinaes das citocininas tm sido feitas com
as auxinas cido naftalenoactico (ANA) (0,01 M a
5,3 M), cido indolbutrico (AIB) (0,05 M) e 2,4-D
(0,2 M).
O nmero de subcul t i vos i ndefi ni do, no
entanto, quando o objetivo o rejuvenescimento e o
restabelecimento da capacidade de enraizamento, 10-12
subcultivos, no mnimo, so necessrios (ALFENAS
et al., 2004; XAVIER et al., 2007). O perodo de cada
subcultivo geralmente de 20 a 30 dias.
Alfenas et al. (2004) alertam para a utilizao de
concentraes elevadas de BAP no meio de cultura,
pois o acmulo deste ftorregulador nos tecidos pode
prejudicar o enraizamento posterior das brotaes.
Os mesmos autores relatam que a multiplicao e o
alongamento das brotaes pode ser obtido com 0,3 M
de BAP e 0,5 M de ANA.
Alongamento
Fase no qual o objetivo a preparao das brotaes
para o enraizamento. O desejvel que a multiplicao
e o alongamento das brotaes ocorram ao mesmo
tempo. Contudo, em funo do gentipo e de materiais
genticos de difcil propagao in vitro, eventualmente
necessria uma fase de alongamento em meio de cultura
prprio. Quando esta etapa necessria, normalmente
adicionada giberelina (GA
3
) ao meio de cultura, embora
alongamento de brotaes tambm seja obtido com
diversas combinaes entre BAP, ANA, AIB e GA
3
.
Outra opo a simples reduo na concentrao de
citocininas utilizadas na fase de multiplicao.
Multiplicao seguida de alongamento de brotaes
foram obtidas com combinaes de 1,0 mg.L
-1
de
BAP com 0,04 mg.L
-1
de GA
3
, em E. tereticornis x E.
grandis (JOSHI et al., 2003); 1,0 e 2,0 mg.L
-1
de BAP
com 0,01 e 1,0 mg.L
-1
de ANA, em E. tereticornis x E.
camaldulensis (BISHT et al., 1999); 0,1 mg.L
-1
de AIB
com 0,1 mg.L
-1
de BAP, em E. urophylla (SANTOS et
al., 2004); 0,1 mg.L
-1
de GA
3
, em E. saligna (FANTINI
JNIOR; GRAA, 1990). Brondani (2008) obteve
maior alongamento de brotaes de clones de E.
benthamii x E. dunnii adicionando 0,10 ou 0,20 mg.L
-1

de GA
3
combinadas com 0,10 mg.L
-1
de BAP e 0,5
mg.L
-1
de ANA.
Enraizamento
Aps a multiplicao e o alongamento, as brotaes
so induzidas ao enraizamento, o qual pode ser realizado
tanto em condies in vitro quanto ex vitro.
No enraizamento in vitro, as brotaes alongadas so
subcultivadas em meio para enraizamento contendo
auxina, geralmente o AIB. Alfenas et al. (2004) indicam
a permanncia dos explantes por 7 a 15 dias em meio de
cultura contendo 1,0 mg.L
-1
de AIB.
A sequncia e o nmero de fases do processo de
micropropagao podem ser alterados em funo da
espcie e dos objetivos. Para Xavier e Comrio (1997),
o enraizamento in vitro pode ser dispensado, fazendo-se
com que as gemas alongadas in vitro em meio de cultura
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sejam enraizadas em condies de casa de vegetao.
Citam como vantagens: evitar a manipulao de plantas
de raiz nua, reduzir o perodo de formao da muda,
aumentar a capacidade de produo do laboratrio e
reduzir uma fase de desenvolvimento (enraizamento
in vitro).
O enraizamento ex vitro proporciona reduo de
custos de mo-de-obra e economia de espao de sala de
crescimento, energia eltrica e meio de cultura. Quanto
qualidade, o enraizamento ex vitro tende a produzir
um sistema radicular mais completo e funcional, com
maior nmero de razes secundrias (GRATTAPAGLIA;
MACHADO, 1998).
Xavier e Comrio (1997) relatam que no enraizamento
ex vitro, que ocorre entre 10-15 dias, no h necessidade
de aplicao de ftorreguladores na base das gemas
alongadas. Titon (2001) e Wendling (2002), em trabalhos
com E. grandis, tambm observaram a no necessidade
do tratamento das microestacas com ftorreguladores
para o enraizamento ex vitro.
Aclimatizao
a ltima etapa do processo de micropropagao,
objetivando reduzir o estresse causado pela diferena
entre os ambientes in vitro e ex vitro e constitui-se numa
etapa na qual ocorrem grandes perdas de explantes.
A aclimatizao realizada em ambiente sombreado,
onde as plantas fcam por um perodo varivel de 15-30
dias e, posteriormente, so levadas para rea de pleno
sol, onde ocorre a rustifcao e o crescimento.
Desenvolvimento da Microestaquia como
Resultado dos Avanos da Micropropagao
de Eucalipto
Tendo como base a micropropagao, desenvolveu-se
a microestaquia. Essa tcnica foi um avano desenvolvido
por Assis et al. (1992), sendo uma aplicao direta do
rejuvenescimento via micropropagao. A microestaquia
possui vantagens em relao ao enraizamento tradicional
de estacas, como: menor envolvimento de mo-de-obra
na preparao de estacas e aplicao de ftorreguladores e
maior grau de juvenilidade das microestacas, com aumento
da velocidade de iniciao e crescimento radicular.
A microestaquia de eucalipto envolve a seguinte
sequncia: 1) partes areas alongadas in vitro, em
laboratrio de cultura de tecidos, so enraizadas em
casa de vegetao durante 15 dias; 2) aclimatizao
em casa de sombra por 10 dias; 3) transferncia para
pleno sol, em que aps 20 dias j feita a primeira
coleta de microestacas (pices das mudas de trs a cinco
centmetros de tamanho).
O emprego da microestaquia proporciona algumas
vantagens, entre as quais se podem destacar: maiores
ndices de enraizamento obtidos; supresso de gastos
com jardins clonais; melhor qualidade do sistema
radicular em termos de vigor, uniformidade, volume,
aspecto e formato; no-necessidade da aplicao de
reguladores de crescimento para enraizamento.
Como desvantagem, destaca-se a maior sensibilidade
das microestacas s condies ambientais. Em funo
das limitaes da microestaquia relativas a custos, por
depender da disponibilidade de um laboratrio de cultura
de tecidos para rejuvenescer o material, desenvolveu-
se a miniestaquia, hoje utilizada nos programas de
propagao clonal massal das empresas florestais
brasileiras. Ainda deve-se considerar que h difculdade
de rejuvenescimento de algumas espcies/clones.
Comparao entre as Tcnicas de Produo de
Mudas de Eucalipto
Os trabalhos desenvolvidos para comparar diferentes
tcnicas de propagao de eucalipto tm reportado
vantagens da microestaquia e miniestaquia em relao
propagao convencional.
Titon (2001), em trabalho com clones de E.
grandis, concluiu que clones com maior difculdade
de enraizamento apresentaram maior resposta ao
rejuvenescimento via microestaquia, resultando em
maior efcincia de enraizamento. Resposta semelhante
foi obtida por Santos et al. (2005), comparando
quatro clones de E. grandis propagados por estaquia,
miniestaquia, microestaquia e micropropagao.
Estes observaram que em avaliaes iniciais em teste
clonal (4 e 8 meses), maior crescimento em altura,
dimetro e biomassa da parte area foram obtidos em
mudas de alguns clones oriundas de micropropagao
e microestaquia. J, aos 24 meses, houve tendncia
de uniformidade entre as variveis para as diferentes
tcnicas de propagao clonal. Watt et al. (1995), em
seis clones hbridos de E. grandis com E. urophyla, E.
camaldulensis e E. tereticornis, e Xavier et al. (1997),
em dez clones hbridos de E. grandis x E. urophyla,
observaram aos 36 e 72 meses de idade, respectivamente,
que as plantas micropropagadas obtiveram maior altura
e dimetro (DAP).
A Micropropagao de Eucalipto
Pesquisa Florestal Brasileira, Colombo, n.58, p.49-59, jan./jun. 2009
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Xavier et al. (2001), em trabalho comparando o
desempenho da miniestaquia e da microestaquia de
clones hbridos de E. grandis, constataram que a
microestaquia proporcionou melhor desempenho e
velocidade de enraizamento e qualidade do sistema
radicular em relao miniestaquia.
Em contrapartida, para Wendling (2002), o subcultivo
in vitro no foi eficiente no rejuvenescimento de
clones de E. grandis, o que, de acordo com o autor,
ocorreu porque os clones estudados apresentavam alto
potencial de propagao vegetativa. Em funo disso,
o rejuvenescimento de matrizes adultas selecionadas ou
de clones somente indicado quando estes apresentam
difculdade de enraizamento
Outro ponto a considerar, de acordo com Watt et
al. (1995), que plantas in vitro parecem ter sistemas
radiculares que se assemelham mais aos de mudas
produzidas por sementes do que aquelas de plantas oriundas
de macroestacas. Assim, recomendam a associao
da propagao in vitro com mtodos de produo por
estaquia para contribuir com o melhoramento forestal e
programas de silvicultura clonal.
Avanos e Tendncias na Micropropagao
Micropropagao Fotoautotrfca
O cultivo in vitro convencional preconiza a adio
de altas concentraes de sacarose ao meio, baixa
irradincia e vedao dos frascos de cultura que no
permitem trocas gasosas. Esses fatores infuenciam
negativamente nos cultivos in vitro por proporcionarem
baixo teor de CO
2
disponvel, induzirem alteraes
morfo-fsiolgicas das plantas produzidas, difcultando a
transio do metabolismo heterotrfco para o autotrfco
e afetarem a sobrevivncia ex vitro.
Uma srie de defcincias anatmicas, induzidas pela
condio in vitro, difculta o controle da transpirao e
ocasiona rpida perda de gua, dentre as quais, pode-
se destacar: formao de cera epicuticular defciente,
funcionalidade do mecanismo de fechamento estomtico,
maior densidade estomtica, estmatos mais superfciais
na epiderme da folha, presena de hidatdios, reduzida
diferenciao do mesflo das folhas, alta proporo
de espaos intercelulares e conexo defciente entre
o sistema vascular do caule e razes. De acordo com
Preece e Sutter (1991), a alta umidade relativa do ar
no interior dos recipientes e a baixa irradincia so os
principais fatores que provocam alteraes na estrutura
e funcionamento dos tecidos, levando incapacidade
das mudas em controlar as perdas de gua.
Em funo dos problemas apresentados pela
micropropagao heterotrfca (convencional), inmeras
pesquisas foram realizadas visando rustifcao das
plantas produzidas in vitro e, consequente reduo das
taxas de mortalidade na fase de aclimatizao. Alteraes
na composio do meio de cultura e no intercmbio de
gases entre os ambientes in vitro e ex vitro fazem parte
do conceito de micropropagao fotoautotrfca (sugar-
free), na qual no so adicionadas fontes de carbono
(acares) ao meio de cultura.
Kozai e Kubot a (2005) coment am que na
micropropagao fotoautotrfca se utiliza meio de
cultura isento de acar, no qual o crescimento das
culturas ou acumulao de carboidratos nas culturas
depende em grande parte da fotossntese e absoro
de nutrientes inorgnicos. Alm da concentrao ou
excluso da sacarose e concentrao de CO
2
e O
2
,
outros fatores, como suportes (substratos) mais porosos,
fuxo de ftons fotossintticos, nvel e direo de luz,
ventilao natural ou forada, e fotoperodo tambm
tm sido pesquisados. As lmpadas fluorescentes,
normalmente utilizadas, podem ser substitudas por
fontes de iluminao base de diodos-LED e lmpadas
fluorescentes catdicas frias-CCFLs (PENCHEL et
al., 2007) ou de halognio (KOZAI et al., 1997). As
trocas gasosas tm sido permitidas com a utilizao de
tampas com fltros que impedem a passagem de agentes
contaminantes.
Nesta mesma linha, tambm tem sido pesquisada a
utilizao de luz natural para promover o crescimento in
vitro, em funo do aumento da taxa fotossinttica pela
maior densidade de fuxo de ftons fotossinteticamente
ativos (KOZAI et al., 1997). A micropropagao
fotoautotrfca com o uso da luz natural pode reduzir
custos de produo de mudas micropropagadas, com
menores gastos com energia eltrica ou melhorando
a qualidade das mudas, reduzindo as perdas durante a
aclimatizao e a contaminao microbiana. Entretanto,
as pesquisas com o uso da luz natural na micropropagao
fotoautotrfca so recentes e muito escassas.
A micropropagao fotoautotrfca possui vantagens,
entre as quais, podem-se destacar: promoo do
crescimento e fotossntese, altas porcentagens de
sobrevivncia/transio gradual para ambiente ex vitro,
eliminao de desordens morfolgicas e fsiolgicas,
menor perda de plantas devido contaminaes, uso
L. F. Dutra et al.
Pesquisa Florestal Brasileira, Colombo, n.58, p.49-59, jan./jun. 2009
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de recipientes maiores, automao do processo e a
simplifcao do sistema de micropropagao. Como
desvantagens, tem-se a relativa complexidade das
tcnicas e o conhecimento requerido para controlar o
ambiente in vitro, o custo de iluminao, enriquecimento
com CO
2
e refrigerao (PENCHEL et al., 2007).
Resultados com micropropagao fotoautotrfca
de eucalipto j foram obtidos, nos quais se constatou
superioridade em relao micropropagao
convencional (KIRDMANEE et al., 1995; ZOBAYED
et al., 2000, 2001; SHA VALLI KHAN et al., 2002;
TANAKA et al., 2005). As pesquisas realizadas
constataram que a micropropagao de eucalipto
sob condies fotoautotrficas proporciona maior
crescimento e desenvolvimento, tanto de parte
area quanto razes; maior taxa fotossinttica; e
porcentagem de sobrevivncia das plantas, em relao
micropropagao convencional.
Biorreatores
O cultivo in vitro baseia-se na utilizao de pequenos
recipientes contendo nmero reduzido de explantes em
meio de cultura geleifcado com gar. Nesse sistema,
h intensa manipulao das culturas e envolvimento de
grande quantidade de mo-de-obra, utilizao de vrias
cmaras de fuxo laminar, grandes autoclaves e espao
para cultivo em prateleiras com iluminao artifcial.
Em funo da necessidade de automao, adoo de
tcnicas de propagao em larga escala e alto volume,
com vistas reduo dos custos de produo de plantas
in vitro, os biorreatores comearam a ser empregados
no cultivo in vitro.
Existem inmeros modelos de biorreatores, os quais
podem ser de imerso temporria ou permanente, sendo
os primeiros mais utilizados.
Os biorreatores possibilitam aumentar a produo
de biomassa de tecido vegetal com reduo no tempo
requerido para propagao. Estes incrementos so
devidos ao maior contato das clulas ou brotaes com o
meio de cultura, maior aerao do meio e maior absoro
de nutrientes (LEMOS et al., 2000).
Embora tenha vantagens em relao micropropagao
convencional, esta tcnica ainda no largamente
utilizada no eucalipto. Entretanto, algumas pesquisas
tm relatado potencial de uso desta tcnica para o gnero
(CASTRO; GONZLES, 2002; REIS et al., 2003;
McALISTER et al., 2005).
Transformao gentica
A transferncia de um fragmento de DNA exgeno
para o interior da clula vegetal, sua integrao ao
genoma nuclear e posterior expresso de maneira estvel
fazem parte do processo de transformao gentica
(BRASILEIRO; DUSI, 1999).
Em um processo de obteno de plantas transgnicas,
o principal requisito, e maior dificuldade, o
estabelecimento prvio de uma metodologia efciente
de cultura de tecidos e regenerao da espcie-alvo. De
acordo com McCown e Sellmer (1987), a regenerao
in vitro infuenciada pelos fatores gentipo, fonte e
histrico; composio do meio de cultura; ambiente;
tempo entre subcultivos e suas interaes.
A transformao gentica possibilita a gerao de
cultivares/clones com caractersticas superiores. Em
eucalipto, os objetivos buscados so: aumento no
potencial de crescimento, modifcao das propriedades
das fibras, aumento na polimerizao da celulose,
modifcao na biossntese de lignina, reduo dos teores
de lignina e resistncia a estresses biticos e abiticos
(QUOIRIN; QUISEN, 2006).
De acordo com Pasquali e Zanettini (2007), a
transformao gentica pode proporcionar a reduo
do tempo necessrio para a introduo de novas
caractersticas de interesse. Entretanto, a recalcitrncia
transformao gentica o fator mais limitante da
aplicao desta tcnica no eucalipto. Embora a maioria
dos trabalhos com transformao de eucalipto seja
via indireta, mediada por Agrobacterium tumefaciens
(GONZLEZ, 2002), pesquisas tambm tem sido
realizadas com transformao direta, via biobalstica
(SARTORETTO et al., 2002).
Estudos recentes foram realizados com a transformao
gentica de E. camaldulensis visando utilizao na
ftorremediao (QUISEN, 2007) e de E. saligna para
aumentar a tolerncia ao frio (DIBAX, 2007). Entretanto,
a baixa taxa de obteno de explantes transformados e
a recalcitrncia observada indicam que mais pesquisas
so necessrias.
Embriognese somtica
Embriognese somtica ou assexual a produo de
estruturas como embries a partir de clulas haplides
ou somticas, sem que ocorra a fuso de gametas
(GUERRA et al., 1999). Quando os embries so
originados diretamente a partir de clulas esporofticas
A Micropropagao de Eucalipto
Pesquisa Florestal Brasileira, Colombo, n.58, p.49-59, jan./jun. 2009
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ou gametofticas do explante, sem a formao de calos,
denominada direta. No entanto, na maioria dos casos, os
embries somticos resultam de clulas embriognicas
determinadas indiretamente (WATT et al., 1999).
Os embries somticos possuem sistema vascular
fechado, no havendo conexo vascular com os tecidos
do explante inicial, o que, juntamente com a bipolaridade,
diferencia os embries somticos dos embries dos
propgulos resultantes da micropropagao e da
organognese (GUERRA et al., 1999). No entanto, seu
padro de desenvolvimento similar ao dos embries
zigticos.
De acordo com Xavier et al. (2007), a embriognese
somtica, em relao a outras tcnicas, apresenta
vantagens como: obteno de grande quantidade de
propgulos (embries somticos); possibilita elevado
grau de automao, reduzindo os custos por unidade
produzida; e produo sincronizada dos embries
somticos. A principal limitao em espcies lenhosas
a baixa taxa de converso de embries somticos em
plantas completas.
Os embries somticos podem ser utilizados tanto na
continuao da propagao in vitro quanto na produo
de sementes sintticas, que so um conjunto de tcnicas
utilizadas para usar os embries somticos como
sementes funcionais (GUERRA et al., 1999).
Em eucalipto, trabalhos com embriognese somtica
tm sido realizados por Muralidharan e Mascarenhas
(1987, 1995); Muralidharan et al. (1989); Watt et al.
(1991); Ruaud et al. (1997); Termignoni et al. (1996);
Bandyopadhyay et al. (1999); Arruda et al. (2000);
Nugent et al. (2001); Pinto et al. (2002); Prakash e
Gurumurthi (2005); Titon (2005); Carvalho (2007).
Concluses
O trabalho constou de ampla abordagem referente
micropropagao de eucalipto, considerando-se
as espcies trabalhadas at o momento, os objetivos
do emprego desta tcnica, suas etapas e distintas
utilizaes.
Embora considerando seu alto custo em comparao
a outros mtodos de clonagem, a micropropagao
de eucalipto estratgica para produo massal de
gentipos-elite e conservao de germoplasma.
A micropropagao de eucalipto, desde sua
concepo, evoluiu de forma substancial. Atualmente,
tcnicas avanadas como embriognese somtica,
micropropagao fotoautotrfica, emprego de
biorreatores e transformao gentica tm proporcionado
ganhos produo de mudas e pesquisas com eucalipto.
Considera-se, ainda, que h necessidade de continuidade
dos estudos com micropropagao desta espcie,
principalmente no sentido de reduo de custos,
maximizao das etapas que compem o processo e
estabelecimento de protocolo que possa ser empregado
para diversas espcies.
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A Micropropagao de Eucalipto
Recebido em 11 de maio de 2008 e aprovado em 03 de setembro de 2009