Apuntes EQAyC Fernando Hernndez Ramrez 23

Anlisis cualitativo y cuantitativo en cromatografa

Anlisis cualitativo
Es importante apreciar que la cromatografa no identifica en forma automtica los
diversos picos que se obtienen en una curva de elucin. El mtodo ms simple para
identificar un pico cromatogrfico consiste en comparar su tiempo de retencin con el de
una muestra conocida del compuesto cuya presencia se sospecha. Para un conjunto de
condiciones experimentales fijas, si un compuesto tiene el mismo tiempo de retencin que el
estndar, entonces ambos son el mismo compuesto.
Existe un mtodo cualitativo aplicable para identificar compuestos que pertenecen a
una serie homloga (por ejemplo, alcoholes, alcanos, etc.). El mtodo se basa en el ndice
de Kovats, y se ejemplifica a continuacin.
EJ EMPLO
Una serie de alcoholes de cadena recta se aliment a una columna de carbowax. Se
encontraron los siguientes tiempos de retencin:
Substancia tr, segundos
butanol 42
hexanol 73
octanol 135
decanol 250
Una substancia desconocida que se sabe es un alcohol de cadena recta se inyecta en la
misma columna en condiciones idnticas a los estndares. Su tiempo de retencin es de
100 s. Qu es la muestra desconocida?
SOLUCION
Se construye una grfica de log(tr) vs. Nmero de tomos de carbono en el alcohol. En la
grfica se observa que la muestra desconocida es heptanol.
Apuntes EQAyC Fernando Hernndez Ramrez 24
1.6
1.7
1.8
1.9
2.0
2.1
2.2
2.3
2.4
3 4 5 6 7 8 9 10 11
Alcoholes de cadena recta
l
o
g
(
t
r
)
No. tomos C
La muestra desconocida
es heptanol
Anlisis cuantitativo
Los mtodos cuantitativos en cromatografa se basan en el hecho de que,
manteniendo constantes las condiciones del experimento, el rea bajo un pico
cromatogrfico es proporcional a la concentracin del componente que representa.
Nosotros discutiremos 4 mtodos, en orden creciente de complejidad y exactitud:
1. Mtodo de normalizacin de reas
2. Mtodo del estndar externo
3. Mtodo del estndar interno
4. Mtodo de normalizacin con factores de respuesta
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1. Mtodo de NORMALIZACION DE AREAS
Este es un mtodo aproximado que debe usarse solo cuando no se requiera de
mucha exactitud o cuando no sea posible utilizar otro mtodo. El mtodo supone que el
rea de un pico es proporcional a la concentracin del componente, y que el detector
responde por igual a todos los compuestos. Adems, para que el resultado obtenido sea
correcto todos los componentes deben elir. Si aceptamos que el rea de un pico es
directamente proporcional a la concentracin del componente que produjo ese pico,
entonces estamos aceptando que el porcentaje de rea es tambin igual al porcentaje de
concentracin:

%componente
i
=
Area
i
Areas

100
EJ EMPLO: NORMALIZACION DE AREAS
Una muestra que contena nicamente hexano, heptano, undecano y tetradecano fue
inyectada a un cromatgrafo obtenindose los resultados que se muestran en la tabla.
Calcule el % en peso para cada componente.
Sustancia hexano heptano undecano tetradecano
Area del pico, cm
2
32.6 46.8 73.8 84.9
SOLUCION
reas = 32.6 + 46.8 + 73.8 + 84.9 = 238.1
% hexano = (rea hexano/ reas)x100 = (32.6/ 238.1)x100 = 13.7
% heptano = 19.6
% undecano = 31.0
% tetradecano = 35.7
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2. Mtodo del ESTANDAR EXTERNO
En este mtodo se inyecta primero un estndar conocido al cromatgrafo, para
poder obtener el tiempo de retencin de la sustancia que se desea identificar y el rea del
estndar. Luego, en una segunda inyeccin se introduce la muestra al cromatgrafo.
Comparando el rea del estndar con el rea del problema se puede obtener la
concentracin.
Primera inyeccin: Estndar puro. Sirve para obtener tr y el rea del estndar
Segunda inyeccin: Problema
Es importante notar que el estndar y el problema deben ser la misma sustancia.
Para calcular la concentracin del problema utilizamos una simple proporcin:

C
problema
C
estndar
=
A
problema
A
estndar
EJ EMPLO: METODO DEL ESTANDAR EXTERNO
Se inyectan 2 g de benceno puro en un cromatgrafo de gases, y se produce un pico de 25
cm
2
de rea. Cuando se inyectan 1.36 g de muestra desconocida al mismo cromatgrafo
en las mismas condiciones, el rea del pico de benceno es 5 cm
2
. Cuntos g de benceno
hay en la muestra? Qu porcentaje de benceno tiene?
SOLUCION

gbencenoenlamuest ra
gbencenoenelest ndar
=
A
problema
A
estndar

gbencenoenlamuest ra
2
=
5
25
gbencenoenlamuest ra = 0.4
El porcentaje de benceno en la muestra se calcula simplemente como:
Apuntes EQAyC Fernando Hernndez Ramrez 27

%benceno=
gbenceno
gmuest ra
100 =
0.4
1.36
100 = 29.41%
Intente usted ahora resolver el siguiente:
EJ EMPLO
Para determinar la cantidad de cocana presente en una grapa decomisada a un sujeto, se
prepar primero un estndar pesando 0.050 g de cocana pura y diluyendo hasta 100 ml en
un solvente apropiado (cido clorhdrico diluido). Se tomaron 5 mililitros de esta solucin, se
diluyeron nuevamente hasta 50 ml y se inyectaron 20 l de esta ltima dilucin al
cromatgrafo, obtenindose un rea de 9705 ua.
Posteriormente se prepar la muestra pesando 605 mg de la cocana decomisada y
diluyendo a 100 ml. Se tomaron 10 ml de esta solucin y se llevaron a 100 ml, luego se
tomaron 10 ml de esta solucin y se llevaron nuevamente hasta 100 ml. Al inyectar 20 l
de la ltima dilucin al cromatgrafo se obtuvo un rea de 6130 ua para el pico de cocana.
Cul es el porcentaje de pureza en la grapa decomisada?
Respuesta: 52.2 %.
3. Mtodo del ESTANDAR INTERNO
Este mtodo es ms exacto que los anteriores, porque la muestra y el estndar se
corren juntos en una sola inyeccin. El rea de los picos desconocidos se compara con el
rea del pico estndar y esto nos permite calcular la composicin de la muestra
desconocida.
El estndar debe ser una sustancia distinta a la que se desea determinar. Si los
detectores empleados en cromatografa fueran igualmente sensibles a todos los solutos, las
reas relativas de los picos seran iguales a las concentraciones relativas de cada
componente. Sin embargo, la sensibilidad del detector difiere de un compuesto a otro. Una
forma de expresar esto es utilizando un factor de respuesta F
Apuntes EQAyC Fernando Hernndez Ramrez 28

C
problema
C
estndar
= F
A
problema
A
estndar








Notar que la ecuacin es idntica a la empleada en el mtodo del estndar externo,
solamente que ahora aparece el factor F para compensar el hecho de que el detector no
responde por igual a todos los componentes.
Para entender cmo funciona el factor de respuesta, supongamos que por el
detector pasan dos solutos, A y B, que estn presentes en la misma concentracin. Al
soluto A le llamaremos estndar y el soluto B ser el problema. Si el detector respondiera
por igual tanto a A como a B, las dos reas deberan ser iguales. Sin embargo, vamos a
suponer que, por alguna razn, el detector es menos sensible para B que para A. Entonces,
aunque pase la misma cantidad de B por el detector, el rea del pico de B ser menor. Esto
se ejemplifica en la figura 15. Si nosotros no consideramos esta diferente sensibilidad del
detector, vamos a incurrir en un error de clculo muy grave.
Figura 15. Cromatogramas de un estndar A y de un soluto problema B, presentes en la misma
concentracin. El cromatograma de la derecha muestra lo que ocurre cuando el detector es menos
sensible a B que a A.
Continuando con nuestro ejemplo, quiere decir que el cromatgrafo siempre
reportar para B reas ms pequeas de lo que realmente debera obtenerse. Para convertir
esta rea pequea en un valor ms grande (el real) necesitamos multiplicarla por un nmero
mayor que la unidad. Este nmero es precisamente el factor de respuesta F. Por el
Apuntes EQAyC Fernando Hernndez Ramrez 29
contrario, si el detector respondiera exageradamente a B, producira un rea que no
corresponde al valor real de B, sino que es demasiado grande. Entonces, tendramos que
corregir esa desviacin multiplicando el rea exagerada por un nmero ms pequeo que la
unidad. Este nmero, otra vez, es F. En resumen:
Si F > 1 el detector responde ms al estndar que al problema
Si F < 1 el detector responde ms al problema que al estndar
Entonces, en el mtodo del ESTANDAR INTERNO se requieren dos inyecciones:
Primera inyeccin: Estndares puros. Sirve para calcular el factor de respuesta F.
Segunda inyeccin: Problema + estndar (juntos!).
El mtodo se llama as porque en la segunda inyeccin se inyectan juntos tanto el
estndar como el problema. Por cierto, el estndar debe ser una sustancia diferente a la que
se desea cuantificar en el problema. El mtodo quedar ms claro resolviendo un ejemplo.
EJ EMPLO: METODO DEL ESTANDAR INTERNO
Un estndar que contiene yoduro 8x10
-8
M y p-diclorobenceno 6.4x10
-8
M se introduce a un
cromatgrafo. Se encuentra que la respuesta del detector es la siguiente:
Componente Concentracin, mol/ lt Area
I
-
8x10
-8
1065
p-DB 6.4x10
-8
1500
Luego, se inyecta una muestra problema que se sabe contiene yoduro. J unto con la
muestra se inyecta una cantidad conocida de p-DB (9.3X10
-7
M) y se corre el
cromatograma. Se obtienen los siguientes datos:
Apuntes EQAyC Fernando Hernndez Ramrez 30
Componente Concentracin, mol/ lt Area
I
-
? 3181.09
p-DB 9.3x10
-7
2629
Calcular la concentracin de yoduro en el problema.
SOLUCION
Observamos que hay dos inyecciones, y que en la segunda de ellas se introdujo el problema
junto con un estndar. Esto nos da la pista de que se trata de un problema de estndar
interno.
El primer paso es calcular el factor de respuesta F con los datos de la primera inyeccin:

Conc.
I

Conc.
pDB
= F
Area
I

Area
pDB









8x10
8
6.4x10
8
= F
1065
1500








resolviendo, F = 1.76
Obsrvese que el detector responde 1.76 veces ms al p-DB que al yoduro.
El segundo paso es simplemente calcular la concentracin del problema, con los datos de la
segunda inyeccin, por supuesto:

El p diclorobenceno es el " est ndarinterno"
Conc.
I

Conc.
pDB
= F
Area
I

Area
pDB









Conc.
I

9.3x10
7
M
= 1.76
3181.09
2629








resolviendo, Conc.
I
= 1.98x10
6
M
Apuntes EQAyC Fernando Hernndez Ramrez 31
Como ejercicio, intente resolver el siguiente problema:
EJ EMPLO
Para determinar el metanol que contiene un licor se procede segn la tcnica del estndar
interno usando n-hexanol como compuesto estndar. Al realizar la experimentacin y
optimizar las condiciones, los siguientes datos para el estndar fueron obtenidos:
Pico # Compuesto Concentracin
(mg/ 100ml de etanol)
Area
2 metanol 588 391042
7 n-hexanol 288 370583
Al adicionar la misma cantidad de estndar a una muestra de licor desconocida (la
preparacin se efectu de tal forma que el volumen permaneci prcticamente sin
variacin), resultaron los datos siguientes para la muestra problema:
Pico # Compuesto Concentracin
(mg/ 100ml de etanol)
Area
2 metanol desconocida 211237
7 n-hexanol 288 364324
Considerando la misma riqueza de etanol tanto en la muestra estndar como en el licor,
Qu cantidad de metanol contiene la muestra desconocida en mg/ 100 ml de etanol?
Respuesta: 323 mg/ 100 ml
Apuntes EQAyC Fernando Hernndez Ramrez 32
4. Mtodo de NORMALIZACION CON FACTORES DE RESPUESTA RELATIVA
Por ms complicado que parezca el nombre, este mtodo es simplemente el anterior,
pero aplicado a mezclas que contienen ms de un componente desconocido. En el ejemplo
resuelto arriba, solo haba un componente desconocido: yoduro. En el ejemplo no resuelto,
solo hay un componente desconocido: metanol. Pero qu sucede cuando queremos
determinar simultneamente muchos compuestos desconocidos? Entonces recurrimos al
mtodo de NORMALIZACION CON FACTORES DE RESPUESTA RELATIVA. Obviamente,
tambin necesitamos dos inyecciones:
Primera inyeccin: Estndares puros. Sirve para calcular los factores de respuesta.
Segunda inyeccin: Problema
Para hacer ms fcil el mtodo, existe una serie de pasos fciles de seguir y recordar,
los cuales se exponen en seguida:
PASO # 1. Para el estndar, obtenga los factores de respuesta absoluta
dividiendo rea entre concentracin:

Fact orAC=
area
concentracin
PASO # 2. Todava con el estndar, obtenga los factores de respuesta relativa
F
RR
escogiendo un componente como base. La palabra se subray para recordar que
usted puede elegir al componente que prefiera. No importa cul escoja, el resultado final
ser el mismo, aunque los valores de los factores F
RR
sean distintos.

F
RR
=
Fact or AC
Factor A C de l abase
Apuntes EQAyC Fernando Hernndez Ramrez 33
PASO # 3. Para la muestra, obtenga las reas corregidas:

Areacorregida=
Areadelamuest ra
F
RR
PASO # 4. Aplique normalizacin de reas y encuentre la composicin de la muestra.

%componente
i
=
Acorregida
i
Areascorregidas

100
Qu le pareci? El procedimiento se aclarar resolviendo un ejemplo.
EJ EMPLO: NORMALIZACION CON FACTORES DE RESPUESTA RELATIVA
Un estndar que contena nicamente hexano, heptano, undecano y tetradecano (25 % peso
de c/ u) se inyect a un cromatgrafo obtenindose los siguientes resultados:
Sustancia Area del pico
C6 32.6
C7 46.8
C11 73.8
C14 84.9
Despus se inyecta una muestra problema y se obtienen los siguientes resultados:
Sustancia Area del pico
C6 35
C7 22
C11 44
C14 53
Apuntes EQAyC Fernando Hernndez Ramrez 34
Calcule el % peso de cada componente en la muestra problema.
SOLUCION
PASO # 1. Obtener factores de respuesta absolutos (Factor AC) para el estndar. Como
la concentracin de cada componente en el estndar es 25 %, simplemente divido el rea de
cada pico entre su concentracin.
Sustancia Area
Factor AC

area
%
C6 32.6 1.304
C7 46.8 1.872
C11 73.8 2.952
C14 84.9 3.396
PASO # 2. Escojo un componente como base y calculo los factores de respuesta relativa
usando los datos del estndar. A m se me ocurre elegir al tetradecano, por lo que tengo
que dividir todos los factores AC entre 3.396. Obtengo la siguiente tabla:
Sustancia Area
Factor AC

area
%
F
RR
C6 32.6 1.304 0.3840
C7 46.8 1.872 0.5512
C11 73.8 2.952 0.8693
C14 (BASE) 84.9 3.396 1
Notar que el factor de respuesta relativa del componente base siempre es la unidad.
Apuntes EQAyC Fernando Hernndez Ramrez 35
PASO # 3. Para el problema, calculo las reas corregidas dividiendo el rea de cada pico
entre su factor de respuesta relativa, que ya conozco.
Sustancia Area Area corregida, A/ F
RR
C6 35 91.15
C7 22 39.91
C11 44 50.62
C14 53 53
PASO # 4. Aplico normalizacin de reas a los datos corregidos. El problema est resuelto!
Sustancia Area Area corregida, A/ F
RR
% componente
C6 35 91.15 38.84
C7 22 39.91 17.01
C11 44 50.62 21.57
C14 53 53 22.58

= 234.68

Como sugerencia, resuelva usted mismo el problema escogiendo otro componente como
base. As se convencer de la validez del mtodo. Intente tambin resolver el siguiente:
EJ EMPLO
Un preparado farmacutico con vitaminas B1, B2 y B6 empleado como materia prima en la
produccin de multivitamnicos se analiz por HPLC. Al estudiar una serie de estndares los
siguientes datos promedio fueron obtenidos:
Vitamina B1 B2 B6
Factor (rea/ g) 24050 26210 22980
Apuntes EQAyC Fernando Hernndez Ramrez 36
El preparado se muestre tomando 0.1000 g y disolvindolo en 100.0 ml, una dilucin
posterior de 10 veces fue necesaria. Al inyectar 10 l de esta ltima dilucin al instrumento
se reportan los siguientes datos:
Pico # 1 2 3
Vitamina B1 B2 B6
Area 10800 9020 4370
Calcular la composicin vitamnica del preparado farmacutico en porcentaje.
Respuesta: 45.66 % vitamina B1, 35.00 % vitamina B2, 19.34 % vitamina B6.
PROBLEMAS VARIADOS
1. Una muestra de aceite de rosas se analiza por cromatografa de gases con el fin de
identificar los componentes que le imparten olor. Despus de inyectar una serie de
estndares para determinar los tiempos de retencin, se encontraron los siguientes
componentes en el aceite natural:
Pico # Componente Area
1 Geraniol 668
2 Citronelol 83.5
3 Alcohol feniletlico 8.35
4 Linalool 16.7
5 Citral 2.0875
6 Octilaldehido 4.1750
Suponiendo que el detector responde por igual a todos los componentes reportados, calcule
la composicin porcentual del aceite de rosas.
Apuntes EQAyC Fernando Hernndez Ramrez 37
2. Los desodorantes para WC contienen p-diclorobenceno y otras cargas. Una mezcla
estndar que contiene p-diclorobenceno y naftaleno se inyecta a un cromatgrafo HPLC.
Los resultados del cromatograma son:
Pico # Componente Concentracin,
g
Area
1 p-diclorobenceno 33 25668
2 naftaleno 90 32000
Se prepara una muestra problema pesando 0.530 g de desodorante para WC y mezclndolos
con 0.250 g de naftaleno puro. Se disuelve todo en acetona hasta obtener 250 mL de
solucin y despus se inyectan 50 L al cromatgrafo. Los resultados son:
Pico # Componente Area
1 p-diclorobenceno 13443
2 naftaleno 11594
Calcular el % de p-diclorobenceno en el desodorante. Respuesta: 25 %.
3. El compuesto qumico warfarina se emplea para exterminar roedores, ya que es un
anticoagulante muy potente. Se desea determinar si una marca comercial de raticida cumple
con la norma oficial, que es de 5.00 0.2 gramos de warfarina / 100 g de raticida.
En un experimento de HPLC, se inyecta un estndar que contiene 45 g de warfarina pura a
una columna de microesferas de slice como fase estacionaria y acetonitrilo/ agua como fase
mvil, obtenindose los siguientes resultados:
Pico # Concentracin de warfarina, g Area
1 45 19200
Apuntes EQAyC Fernando Hernndez Ramrez 38
Enseguida se prepara una muestra de raticida pesando 1 g del producto comercial y
aforando hasta obtener 100 mL de solucin. Se inyectaron 20 L al cromatgrafo con los
siguientes resultados:
Pico # Area
1 3636
Cul es la concentracin de warfarina en el raticida expresada como gr warfarina / 100 g
raticida? Cumple con la norma? Respuesta: no cumple la norma.
4. Para determinar cafena en un caf instantneo, se procede de la siguiente forma: Se
toman 0.8265 g del producto, se disuelven, completando el volumen a 50 ml. Una alcuota
de 5 ml se mezcla con 5 ml de una solucin de acetato de plomo, se deja reposar 5 minutos
y luego se filtra e inyecta al instrumento. Un estndar de 55 ppm de cafena se inyecta en
la misma cantidad y los resultados se muestran a continuacin
(1 ppm = 1 parte por milln = 1 mg/ lt)
Muestra Concentracin Area pico cafena
Estndar 55 ppm 32525
Caf instantneo desconocida 8626
Qu cantidad de cafena, en mg/ g de caf instantneo, contiene el producto?
Respuesta: 1.76 mg cafena/ g de caf.