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5.3 Ensaios biolgicos



5.3.1 Atividade antioxidante

A procura por substncias externas com propriedades antioxidantes como complemento
alimentar ou como frmacos, na preveno ou tratamento de lceras tem sido cada vez maior,
tendo em vista que os agentes antioxidantes so capazes de remover ou prevenir a formao de
EROs, in vitro (CARDOSO, 2003, p. 32; MOTA et al., 2009).
Nesse sentido, as plantas produzem uma gama de metablitos com atividade antioxidante
como fenlicos, carotenoides e substncias contendo enxofre e nitrognio, sendo algumas,
inclusive j utilizadas como recursos teraputicos preventivos ou no tratamento de leses
ulcerativas (BORRELLI, IZZO, 2000). Alm disso, espcies contendo flavonoides tm sido
amplamente testadas em modelos antioxidantes e antilcera, devido ao antioxidante
relatada para compostos dessa classe, principalmente para flavonis, flavanonas e chalconas
(MOTA et al., 2009).
Espcies de Sapindaceae so amplamente conhecidas por acumular flavonoides,
principalmente flavonis, flavonas e flavanonas (UMADEVI; DANIEL, 1991). Visando a
caracterizao da atividade antioxidante in vitro dos extratos hidroetanlicos e as respectivas
fraes (n-hexano, diclorometano e n-butanol) das espcies estudadas, C. corindum e S.
caracasana, procedeu-se com os experimentos utilizando o modelo com DPPH (2,2-difenil-1-
picril-hidrazila). Esse mtodo, amplamente empregado para medir a capacidade antioxidante
de extratos, fraes e compostos isolados de origem natural, apresenta como vantagens a
rapidez dos resultados, a facilidade da anlise e a utilizao de pequena quantidade de amostra.
Ademais, apresenta resultados confiveis, uma vez que sofre reduo significativa quando
exposto a molculas potencialmente antioxidantes (MORENO et al., 2012).
No tocante aos resultados observados (Tabela 25), o extrato bruto e a frao n-butanol de
S.caracasana reduziu em 93% e 90%, respectivamente, o DPPH em soluo, entretanto o
extrato bruto e as fraes de C. corindum no mostraram atividade antioxidante considervel.
Alm disso, observaram-se a falta de atividade antioxidante das fraes n-hexano de ambas as
espcies.
Com relao aos valores de CI50, tambm a frao n-butanol de S. caracasana (20,2 g /
mL), seguida pelo extrato bruto da mesma espcie (40,0 g/mL) foram os mais ativos.




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TABELA 26 Atividade antioxidante de extratos brutos e respectivas fraes de
C. corindum e S. caracasana

*
Porcentagem de valores de reduo de DPPH, referentes concentrao de 100
g/mL de amostra testada.
(-) No testada

5.3.2 Avaliao da toxicidade aguda de extratos

Os ensaios de toxicidade aguda permitem avaliar substncias de acordo com seu potencial
de letalidade ou sinais txicos, alm de determinar as espcies animais mais susceptveis ao
da substncia avaliada, identificar rgos ativos e selecionar doses para estudos posteriores
(LIMA, 2011, p. 69).
Nesse sentido, a famlia Sapindaceae conhecida por suas espcies abundantes em
saponinas e cianolipdeos txicos. Em especial no gnero Serjania, a grande maioria de seus
integrantes conhecida como timb pelo fato de serem txicos para animais ectotrmicos e
Amostras
Atividade antioxidante
(DPPH)
100 g/mL*
(%)
CI50
(g/mL)
Serjania caracasana
Extrato hidroetanlico 92,58 39,98
Frao n-hexano 1,43 > 300,00
Frao diclorometano 25,00 200,06
Frao n-butanol 90,03 20,19
Cardiospermum corindum
Extrato hidroetanlico 69,78 80,25
Frao n-hexano 5,19 > 300,00
Frao diclorometano 61,07 99,87
Frao n-butanol 50,8 80,41
Quercetina (4 g/mL) 98 -


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mamferos e, com isso, utilizados frequentemente na prtica da pesca por envenenamento. Essa
toxicidade tem sido comprovada para algumas espcies, como S. lethalis, onde as saponinas
isoladas da frao n-butanol dos caules da espcie mostraram-se ictiotxicas frente a peixes
conhecidos como lebistes, como tambm levaram ratos e camundongos testados a profunda
depresso, dispneia, cianose e falncia cardiovascular, culminando na morte dos mesmos
(TEIXEIRA et al., 1984).
Apesar disso, estudos com os extratos de clorofrmio e metanol de partes areas de
Serjania erecta, uma espcie utilizada no tratamento de lceras, no demonstraram efeitos
txicos, de mortalidade, nem de alteraes comportamentais ou no peso de rgos vitais em
ratos utilizados em modelo de toxicidade aguda (ARRUDA, 2008, p. 30-34). Portanto, a
atividade txica das espcies sob suspeita de serem txicas deve ser evidenciada por meio de
ensaios in vivo de toxicidade aguda e de doses repetidas.
Quanto ao gnero Cardiospermum, muitas espcies apresentam uso popular, inclusive C.
corindum, porm, apesar do uso difundido, apenas C. halicacabum foi testada quanto a sua
segurana toxicolgica, em ensaio agudo com ratos machos. Para esse, os autores no
encontraram nenhuma evidncia clnica ou macroscpica significativa de sinais de toxicidade
nas doses testadas, alm disso, os animais tratados tambm no mostraram alteraes
significativas no peso corporal, peso do fgado e parmetros hematolgicos e bioqumicos
(SHEEBA; ASHA, 2006).
Dessa forma, seguindo-se as diretrizes do guia OECD 420 (OECD,2011), que preconiza o
uso de roedores para os testes toxicolgicos, podendo-se extrapolar, para os testes
farmacolgicos, os resultados obtidos com animais de pesos diferentes, os camundongos (n=5
para cada grupo, inclusive controles) foram tratados com os extratos hidroetanlicos de C.
corindum e S. caracasana (v.o., por gavagem) na dose de 2000 mg/kg para avaliao dos testes
de toxicidade.
Na dose testada, os extratos hidroetanlicos de C. corindum e S. caracasana no mostraram
morbidade nem mortalidade durante todo o perodo do estudo, impossibilitando a determinao
da DL50.
Nesse ensaio, a via oral foi priorizada, uma vez que foi a mesma utilizada no teste de
atividade gastroprotetora. Dessa forma, pode-se ressaltar que a resposta dos animais frente
administrao por gavagem pode no ser a mesma que a observada por outra via, como a
intraperitoneal, devido s diferenas existentes entre os perfis de absoro estomacal e intestinal
com pH, superfcie de absoro, motilidade intestinal, irrigao sangunea, entre outros
(DANTAS, 2012).


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Alm da mortalidade e morbidade, a toxicidade sistmica pode se manifestar atravs da
reduo na massa corporal dos animais experimentais (pela reduo do consumo de gua e
rao), apatia, m condio da pelagem ou presena de pelos arrepiados. Ainda, podendo
ocorrer alterao da massa relativa dos rgos, alteraes hematolgicas e bioqumicas
sanguneas (DANTAS, 2012).
Quanto ao parmetro de peso corporal, os animais no apresentaram alteraes maiores do
que 10% do peso inicial aps 24, 48 e 72 h da administrao dos extratos hidroetanlicos das
duas espcies estudadas, quando comparados aos respectivos grupos controle (Figuras 161 e
162).



FIGURA 161 Mdia de peso corporal (gramas desvio padro) de
camundongos machos controles e tratados v.o. com extrato
hidroetanlico de C. corindum (2000 mg/kg), avaliados aps 24, 48 e 72
h da administrao do mesmo, n= 5.

24 h 48 h 72 h

Tempo


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c
o
n
t
r
o
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2
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h
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h
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A
Tempo
P
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s
o

(
g
)


FIGURA 162 Mdia de peso corporal (gramas desvio padro) de
camundongos machos controles e tratados v.o. com extrato
hidroetanlico de S. caracasana (2000 mg/kg), avaliados aps 24, 48 e
72 h da administrao do mesmo, n= 3-5.

A variao de peso corporal um dado de fcil obteno, sendo de extrema importncia
no que se refere toxicidade. Alteraes dessa ordem podem ser sinal do desenvolvimento de
doenas e alteraes tanto centrais como perifricas (MADALOSSO, 2011). Das espcies dos
gneros Cardiospermum e Serjania avaliadas quanto variao de peso corporal, tambm no
foram verificados, como apontados anteriormente, perda significativas nos pesos dos animais
tratados com extratos hidroetanlicos das espcies C. halicacabum e S. erecta (SHEEBA;
ASHA, 2006; ARRUDA, 2008, p. 30-34).
Outro parmetro avaliado foi o peso dos rgos vitais dos camundongos tratados com
extratos hidroetanlicos (2000 mg/kg) de C. corindum e S. caracasana em comparao com os
pesos dos mesmos rgos para os animais controle (Figuras 163 e 164). Pode-se observar que
os animais tratados com o extrato hidroetanlico de C. corindum apresentaram menor massa
relativa no tamanho do corao, do pulmo e dos rins, comparados aos animais controle. Para
o grupo de animais tratados com extrato hidroetanlico de S. caracasana somente houve
reduo relativa na massa dos pulmes, em comparao com o grupo controle. Essas variaes,
embora estatisticamente diferentes dos respectivos controles, no sugerem uma alterao
clinicamente importante no que se refere toxicidade aguda uma vez que, para esse tipo de
estudo, o aumento da massa relativa dos rgos vitais que aparece como sinal de alteraes
estruturais decorrentes da toxicidade da preparao avaliada.
24 h
48 h
72 h

Tempo


279



FIGURA 163 - Peso de rgos vitais dos camundongos machos
controles e tratados v.o. com extrato hidroetanlico de C. corindum
(2000 mg/kg), n = 5. **p < 0,01; Teste tde Student (tratado x controle).


FIGURA 164 - Peso de rgos vitais dos camundongos machos
controles e tratados v.o. com extrato hidroetanlico de S. caracasana
(2000 mg/kg), n = 3-5. **p < 0,01; Teste tde Student (tratado x
controle).


A
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pulmo
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corao
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g
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0
2
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8
10
pulmo
rins
fgado
corao
**
A
M
a
s
s
a

(
m
g
/
g
)




280

Nesse sentido, esse aumento pode caracterizar uma resposta inespecfica do organismo
frente droga e pode ocorrer devido formao de edema, ndulos ou expanso fibrosa.
Ademais, alteraes pulmonares podem estar associadas a aspirao de partculas durante a
administrao intragstrica e, por isso, devem ser analisadas com cautela (MADALOSSO,
2011).
Na avaliao da ambulao dos camundongos observou-se que o extrato hidroetanlico de
C. corindum (Figura 165) foi capaz de reduzir significativamente a atividade geral dos animais
na primeira hora, sendo, em seguida, reversvel na segunda hora, o que sugestivo de efeito
ansiognico/sedativo transitrio. Diferentemente, foi verificado que para o extrato
hidroetanlico de S. caracasana (Figura 166), somente aps 90 min da administrao, houve
reduo na ambulao dos animais, indicando tambm um efeito ansiognico/sedativo
temporrio, j que os animais retornaram ao estado inicial logo depois (HARSHA;
ANILAKUMAR, 2012; FOYET et al., 2012). O efeito ansiognico/sedativo observado nos
camundongos no pode ser considerado um sinal de toxicidade aguda relevante, sendo
possivelmente explicvel pela presena de diferentes compostos com atividade sedativa
(MADALOSSO, 2011).


FIGURA 165 - Ambulao dos animais tratados com o veculo ()
ou com o extrato hidroetanlico de C. corindum (), *p < 0,05;
**p < 0,01, ANOVA de uma via seguida do ps-teste de Dunnett
(veculo x tratado). (n= 5)



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**
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A
Tempo (min.)
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FIGURA 166 - Ambulao dos animais tratados com o veculo ()
ou com o extrato hidroetanlico de S. caracasana (), *p < 0,05,
ANOVA de uma via seguida do ps-teste de Dunnett (veculo x
tratado). (n= 5)


5.3.3 Avaliao da atividade gastroprotetora em leso induzida por etanol absoluto

O consumo de etanol considerado um dos fatores externos indutores da lcera, uma vez
que tem sido demonstrado que ele aumenta a liberao da isoforma vasoconstritora de
endotelina, a endotelina 1 (ET-1), pelos vasos sanguneos localizados no estmago. A ET-1,
por sua vez interage com receptores especficos ETA, na musculatura dos vasos, promovendo
vasocontrio, que leva a reduo do fluxo sanguneo na mucosa gstrica, seguida de estase
sangunea e, consequentemente desenvolvimento de hemorragias e necrose de tecidos. Alm
disso, atribui-se ao lcool o aumento de EROs na mucosa gstrica, uma vez ele capaz de
causar dano ao sistema antioxidante do organismo, induzindo a estresse oxidativo intracelular
(DIAS et al., 2009; HERNANDES, 2010, p. 39).
O etanol tambm confere um efeito tpico direto na mucosa gstrica, uma vez que produz
leses necrticas decorrentes da diminuio da secreo de bicarbonato e da produo de muco,
alm de modificar a composio de glicoprotinas (DIAS et al., 2009).
Adicionado a esses fatores, o acetaldedo, derivado da oxidao do etanol, pode levar a
injria na mucosa gstrica, alm de complexar com a glutationa, diminuindo os nveis de
antioxidante, o que favorece a peroxidao lipdica (LIMA, 2011, p. 72).
3
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0
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Tempo (min.)
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No modelo de atividade gastroprotetora por induo de lceras pela administrao de
etanol absoluto, observa-se, nos animais controle negativo, leses hemorrgicas lineares, edema
na submucosa, friabilidade da mucosa, recrutamento de clulas inflamatrias e perda de clulas
epiteliais do estmago (LIMA, 2011, p. 71). Sendo assim, esse modelo in vivo bastante
utilizado, j que contribui para a indicao citoprotetora frente a um agente extremamente lesivo
e tambm serve de triagem para a verificao da dose mais eficiente do composto ou extrato
avaliado (ARRUDA, 2008, p. 16).
Os resultados obtidos para C. corindum por esse modelo de induo de lcera
demonstraram que o extrato hidroetanlico da espcie, administrado via oral nas doses de 50,
150 e 500 mg/mL, atuou de forma dose-dependente, uma vez que a porcentagem de leses
observadas foram de 57,215,2; 32,510,7 e 13,03,6% (A.L.U.), respectivamente, quando
comparados aos grupos controles negativo (100% de A.L.U.) e positivo (omeprazol 20 mg/kg)
(Figura 167).






c
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Cc-EtOH (mg/mL)
**
**
*
A
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.
U
.

(
%
)

FIGURA 167 - Efeito do extrato hidroetanlico de C. corindum (Cc-
EtOH) (500 mg/kg, n = 5) e omeprazol (20 mg/kg, n = 6) por via oral
em lceras estomacais induzidas por etanol absoluto (controle, n = 4)
em ratos. **p < 0,01 (controle x tratamento), ANOVA de uma via
seguido de ps-teste de Dunnett.


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**
**
Sc-EtOH (mg/mL)
A
.
L
.
U
.

(
%
)

FIGURA 168 - Efeito do extrato hidroetanlico de S. caracasana (Sc-
EtOH) (50, 150 e 500 mg/kg, n = 3) e ranitidina (50 mg/kg, n = 3) por
via oral em lceras estomacais induzidas por etanol absoluto
(controle, n = 4) em ratos. **p < 0,01 (controle x tratamento),
ANOVA de uma via seguido de ps-teste de Dunnett.


Quanto ao extrato hidroetanlico de S. caracasana tambm foi verificada significativa
proteo dose-dependente da mucosa gstrica frente ao lesiva do etanol nas doses de 50,
150 e 500 mg/kg, administradas v.o., observando-se 19,119,1; 10,99,1 e 0,30,3% de A.L.U.,
respectivamente, nas doses avaliadas. Nesse ensaio, comparou-se o efeito do extrato com aquele
observado para os controles negativo (100% de A.L.U) positivo com ranitidina (50 mg/kg)
(Figura 162).
Dessa forma, os resultados relacionados atividade gastroprotetora inerente espcie S.
caracasana apontaram para uma atividade significativa do extrato hidroetanlico nas trs doses
testadas, em comparao com a atividade do antagonista H2 utilizado, ranitidina (50 mg/kg).
Alm disso, na dose de 150 mg/kg de extrato pode-se observar proteo gstrica comparvel
observada para ranitidina (p<0,01), enquanto que a maior dose avaliada (500 mg/kg, p<0,01)
foi mais ativa como citoprotetora, comparativamente ao controle positivo.
No ensaio com a espcie C. corindum, tambm houve reduo da A.L.U., comparando-se
com o controle positivo omeprazol (20 mg/kg), entretanto somente a maior dose (500 mg/kg)
apresentou significncia menor que 0,01 (ANOVA).



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5.3.4 Compostos naturais bioativos isolados de C. corindum e S. caracasana

A atividade biolgica atribuda a extratos vegetais resultante da presena de compostos,
metablitos primrios ou secundrios, que individualmente, ou em associao, respondem
frente a estudos de avaliao. Nesse sentido, os compostos majoritrios identificados em C.
corindum e S. caracasana podem fornecer uma explicao parcial para resultados observados
nos modelo de atividade antioxidante, de toxicidade aguda e de induo de lcera gstrica por
etanol absoluto.
Assim, das partes areas de C. corindum (fraes diclorometano e n-butanol) foram
identificados trs flavonas metoxiladas (crisoeriol monometoxilada; 3.4-dimetilter-
luteolina dimetoxilada; umuhengerina - pentametoxilada), enquanto para S caracasana
(frao n-butanol) somente se identificou um flavonol glicosilado (quercitrina), derivado da
quercetina.
Entretanto, estudos tm mostrado que a atividade antioxidante de flavonoides pode
depender do modelo utilizado para tal verificao. Dessa forma, muitas flavonas tem se
mostrado inativas em determinados modelos de efeito gastroprotetor, enquanto para outros
modelos sua atividade verificada (MOTA et al., 2009).
Diferentemente, a quercetina e seus derivados tm sido amplamente testados em diversos
modelos, sempre apresentando efeitos de proteo da mucosa gastrintestinal por leso aguda.
Alm disso, estudos tm apontado como principal mecanismo de ao dos flavonis a ao
antioxidante (MOTA et al., 2009), o que corrobora com os resultados obtidos para a frao n-
butanol de S. caracasana no ensaio antioxidante e principalmente com a presena de
quercitrina, um derivado raminosidco da quercetina.
Alm dos flavonoides, outras classes de compostos tm sido reportadas apresentarem
atividade gastroprotetora. Dessas, -amirina, um triterpeno isolado em abundncia, nesse
estudo, das partes areas de S. caracasana, foi apontado como responsvel por aes anti-
inflamatria e gastroprotetora, juntamente com -amirina, em modelo usando ratos e
camundongos (OLIVEIRA et al., 2004). Diversos estudos ainda apontam para a atividade anti-
inflamatria de triterpenos isolados de diferentes espcies vegetais, nesse sentido, fridelina,
isolado das duas espcies vegetais, tem se mostrado ativo em modelos de atividade anti-
inflamatria aguda por edema de pata induzido por carragenina e histamina (ANTONISAMY
et al., 2011).
Tambm, estudos apontam para a ao gastroprotetora de -sitosterol e estigmasterol,
isolados tanto de S. caracasana como de C. corindum, atravs da participao de


285

prostaglandinas, xido ntrico (NO) neurnios sensoriais capsaicina-sensitivos (SANCHEZ-
MENDOZA et al., 2008).
Quanto s cumarinas isoladas da frao diclorometano de C. corindum, estudos com
umbeliferona tm revelado atividades biolgicas, incluindo efeitos antidiabtico, antioxidante
e antiproliferativo. Entre essas aes, a atividade antioxidante se destaca, uma vez que pode
oferecer efeito protetor promissor contra o estresse oxidativo ocorrido em decorrncia de
diferentes fatores e que pode atingir rgos importantes, como o corao, crebro e estmago
(LACATUSU et al., 2013). Essa ao antioxidante tambm observada para escopoletina,
composto ativo em diferentes modelos de atividade antioxidante, podendo atuar no transporte
mitocondrial de cadeias longas de cido graxo (MALIK et al., 2011).
Com relao aos ensaios de segurana toxicolgica, C. corindum apresentou ao
ansiognica/sedativa temporria, uma vez que os animais se mostravam parados, em posio
de alerta, comparados com os animais controle. Contrastando com esse resultado, estudos
baseados no uso popular das razes de C. halicacabum para tratamento de depresses, levaram
confirmao da atividade ansioltica e, aps estudo biomonitorado, identificao de
cardiospermina, um glicosdeo cianognico usualmente encontrado em espcies do gnero
Cardiospermum, como responsvel por tal atividade (KUMAR et al., 2011). Porm, as razes
de C. corindum no forma trabalhadas nesse estudo, em contrapartida, das partes areas da
espcie foi isolado o glicosdeo no-cianognico epidermina, entretanto no se conhecem
estudos com relao s suas possveis atividades.
Os processos de isolamento de compostos acumulados nas partes areas de C. corindum
tambm resultaram no isolamento das flavonas metoxiladas umuhengerina, crisoeriol e 3,4-
dimetilter-luteolina. Nesse sentido, flavonas metoxiladas e polimetoxiladas possuem como
substituintes metoxilas que as conferem propriedades lipoflicas e possibilitam sua passagem
pela barreira hematoenceflica, assim em modelos animais de ansiedade tem-se verificado a
atividade ansioltica de tais compostos (COLETA et al., 2008), o que mais uma vez contrasta
com os resultados observados no modelo toxicolgico com extrato de C. corindum.
Quanto a S. caracasana, a atividade sedativa temporria no tem sido reportada para as
demais espcies do gnero. Em estudo recente, ARRUDA (2008) reportou a inalterao dos
parmetros comportamentais e de pesos corporal e de rgos vitais em estudo conduzido com
extrato hidroetanlico das partes areas de S. erecta. Entretanto, a atividade sedativa de
glicosdeos de flavonis tem sido reportada. Nesse sentido, Kang e colaboradores (2000)
demonstraram que quercitrina, tambm isolada de S. caracasana, aumentou o efeito sedativo
induzido por pentobarbital de forma dose-dependente, em camundongos.


286

Assim, a confirmao da atividade ansiognica/sedativa induzida temporariamente pelos
extratos hidroetanlicos de C. corindum e de S. caracasana dever ser verificada
posteriormente atravs do experimento de ansiedade utilizando o labirinto em cruz elevada.