PRCTICA11 Aislamiento de adn de una muestra de saliva humana Introduccin Las molculas ms grandes y probablemente las de mayor inters que se encuentran en los seres vivos actuales son los cidos Nucleicos. Todas las evidencias experimentales recientes indican que los cidos Nucleicos son las molculas que ejercen el control primario sobre los procesos bsicos de todos los organismos vivos. Estas sustancias forman el enlace qumico entre las generaciones, para entender como este tipo de molcula puede controlar todas las reacciones de los seres vivos, los cientficos han estudiado cuidadosamente la estructura de los cidos nucleicos. Los cidos nucleicos se descubrieron en la poca en que se llevaron a cabo intensa investigaciones qumicas sobre la materia viva, a fines del siglo XIX. El bioqumico suizo Friedrich Miescher fue el primero en descubrir estas sustancias, cidos asociados con las protenas del ncleo celular. Al estudiarlas mejor, Miescher comprendi que estas sustancias son bastante diferentes de las protenas y de otros compuestos conocidos. La unidad bsica de un cido nucleico es el nucletido, cada molcula de cido nucleico se forma como una larga cadena de 4 clases de nucletidos, a su vez lo nucletidos pueden ser fragmentados en 3 partes; una de esas partes es siempre un azcar de 5 carbonos y que son la ribosa y la desoxirribosa, los cidos nucleicos que contienen ribosa se denomina cido ribonucleico o ARN y los cidos nucleicos que contienen desoxirribosa se denominan acido desoxirribonucleicos o ADN. El ADN existe como un duplo de dos cadenas de polidesoxirribonucleicos, excepto en algunos virus bacterianos formando de una solo cadena de ADN o ARN. Las cadenas complementarias de la doble hlice muestra polaridad opuesta y por lo tanto son antiparalelas: una cadena progresa en la direccin 5 3 y la cadena opuesta progresa en la direccin 3 5. Por cristalografa de rayos x se han identificado tres formas de ADN: A, B y Z la forma B de ADN, que es la forma predominante en las clulas, es una doble hlice derecha con 10 pares de base en cada vuelta de la hlice. La forma A, que se forma en el laboratorio con baja humedad, existe como doble hlice derecha con casi 11 pares de base por vuelta. La forma Z, que puede presentarse fisiolgicamente en dobleces del ADN que contiene purina y pirimidinas alternadas, es una doble hlice izquierda en 12 pares de base por vueltas. El ADN se organiza en cromosomas que son estructuras intranucleares con la propiedad de autoduplicarse y de trasmitir la informacin gentica de los seres vivos.
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OBJETIVOS - Por medio de la siguiente prctica el alumno ser capaz de realizar un procedimiento de extraccin de DNA, partiendo de una muestra de saliva humana. - Utilizar tcnicas sencillas pre establecidas para poder extraer de ADN de una muestra de saliva y por el aspecto que presenta, confirmar su estructura fibrilar.
Procedimiento 1. Colectar la muestra de saliva indicado hasta la marca del recipiente de ORANGENE DNA, siguiendo los pasos indicados al respecto, luego invierta y mezcle el contenido durante por lo menos 20 segundos. Asegurando que las muestras viscosas se mezclen correctamente. 2. Incubar la muestra a 50C en una incubadora de agua durante un mnimo de 1 hora, este paso de tratamiento trmico es esencial para asegurar que el ADN se disuelva correctamente y que las nucleares se reactivos como Tris HCL, NaCl y EDTA. 3. Transferir 500 ul de la muestra mezclada a un tubo de microcentrifuga de 1,5 ml. 4. Para 500 ul de muestra, aadir 20 u (1/25 del volumen) de solucin ORAGENE purifier OG- L2P-5, al tubo de microventrifuga, y mezclar durante unos segundos usando un agitador (vortex). La muestra se volver turbia al precipitarse las impurezas e inhibidores. La solucin ORAGENE purifier OG- L2P-5, como su nombre lo indica, contiene reactivos purificadores de ADN como el SDS, la proteinasa K, encargados de formar complejos con las protenas asociadas al DNA (histonas), y liberar de formar pura el DNA. 5. Incubar en hielo durante 10 min. 6. Centrifugar a temperatura ambiente durante 5 minutos a 13000 rpm, un periodo ms prolongado por ej. 15 minutos puede ser til para reducir la turbidez de la solucin de ADN final. 7. Transferir con cuidado el sobrenadante claro con la punta de la pipeta a un tubo de microcentrifugadora limpio. Desechar el sedimento que contiene impurezas. Universidad Andina Nstor Cseres Velsquez CAP MEDICINA HUMANA
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8. Aadir a 500ul de sobrenadante 600ul de etanol al 95% a temperatura ambiente. Mezclar suavemente invirtiendo 10 veces. El ADN se preciptara como un conjunto de fibras o precipitado fino en funcin de la cantdad de ADN en la muestra. RESULTADOS
Conclusiones: - Se pudo concluir que es posible realizar la extraccin de ADN partiendo de una muestra de saliva humana. - En nuestra prctica se pudo observar el ADN y de ese modo confirmamos su estructura fibrilar. - Tambin se pudo comprender la importancia de la purificacin del DNA en el campo de medicina forense para la identificacin de personas.
Cuestionario 1.- Qu funcin cumplen en el aislamiento de ADN, los siguientes reactivos? 2. Describa un protocolo de aislamiento de DNA en plantas, virus y bacterias. EN PLANTAS O VEGETALES: MTODO DE EXTRACCIN Y PURIFICACIN CON CTAB El protocolo del mtodo del bromuro de cetil-trimetil amonio (CTAB) fue elaborado por Murray y Thompson en 1980 y publicado posteriormente, en 1987, por Wagner y sus colaboradores. El mtodo es adecuado para extraer y purificar ADN de vegetales y alimentos derivados de vegetales y est especialmente indicado para eliminar los polisacridos y los compuestos polifenlicos, que, de otro modo, alteraran la pureza del ADN y, por tanto, su calidad. Universidad Andina Nstor Cseres Velsquez CAP MEDICINA HUMANA
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Lisis de la membrana celular: La primera etapa de la extraccin del ADN es la rotura de la membrana celular y nuclear, para lo cual la muestra homogeneizada se trata primero con el tampn de extraccin, que contiene EDTA, Tris-HCl y CTAB. Todas las membranas biolgicas presentan la misma estructura general, integrada por molculas de lpidos y de protenas, unidas por interacciones no covalentes. En este mtodo, el detergente (CTAB) contenido en el tampn de extraccin provoca la lisis de la membrana. Dado que la composicin de los lpidos y del detergente es similar, el componente de CTAB del tampn de extraccin captura los lpidos que integran la membrana celular y nuclear. Una vez que se han roto las membranas de la clula y de los orgnulos (como los que se encuentran alrededor de las mitocondrias y los cloroplastos), se purifica el ADN.
Extraccin: En esta etapa, se separan los complejos formados por los cidos nucleicos y el CTAB de los polisacridos, los compuestos fenlicos, las protenas y los dems lisados celulares disueltos en la solucin acuosa. Es especialmente importante eliminar los polisacridos y los compuestos fenlicos, pues pueden inhibir numerosas reacciones enzimticas. En concentraciones hiposalinas (NaCl < 0,5 M), los contaminantes de los complejos de cidos nucleicos no precipitan y pueden eliminarse extrayendo la solucin acuosa con cloroformo. El cloroformo desnaturaliza las protenas y facilita la separacin de las fases acuosa y orgnica. La fase acuosa suele constituir la fase superior. No obstante, si dicha fase es densa debido a la concentracin salina (> 0,5 M), formar la fase inferior. Adems, si el pH de la solucin acuosa no se ha equilibrado debidamente (pH 7,8 8,0), los cidos nucleicos tendern a repartirse en la fase orgnica. Si es preciso, la extraccin con cloroformo se realizar dos o tres veces, con objeto de eliminar por completo las impurezas de la capa acuosa. Para perfeccionar la extraccin de los cidos nucleicos, puede retro-extraerse la fase orgnica con una solucin acuosa, que se aade a continuacin al extracto anterior. Universidad Andina Nstor Cseres Velsquez CAP MEDICINA HUMANA
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Precipitacin: En esta ltima etapa se separan los cidos nucleicos del detergente, para lo cual la solucin acuosa se trata primero con una solucin de precipitacin compuesta por una mezcla de CTAB y NaCl en concentracin elevada (NaCl > 0,8 M). Una alta concentracin salina es necesaria para que se forme un precipitado de cidos nucleicos. Puede ser preferible emplear acetato de sodio en lugar de NaCl por su capacidad tampn. En estas condiciones, el detergente, que es ms soluble en alcohol que en agua, puede eliminarse por lavado, mientras que los cidos nucleicos precipitan. El posterior tratamiento con etanol al 70 % permite una mayor purificacin o elucin de los cidos nucleicos de la sal residual. En este mtodo, los tampones acuosos con escasa concentracin inica (por ejemplo, tampn TE) resultan idneos. Cuantificacin del ADN mediante espectrofotometra:La concentracin de cidos nucleicos suele determinarse midiendo a 260nm y comparando con un blanco. La interferencia de contaminantes puede determinarse calculando un cociente. Dado que las protenas absorben a 280nm, se emplea el cociente A260/A280 para calcular la pureza de los cidos nucleicos. Los cocientes respectivos del ADN y el ARN puros son aproximadamente de 1,8 y 2,0. Una absorcin a 230nm significa que la muestra est contaminada con hidratos de carbono, pptidos, fenoles, compuestos aromticos u otras sustancias. El cociente A260/A230 de las muestras puras es de 2,2 aproximadamente. Cuando la cantidad disponible de cidos nucleicos es escasa, puede emplearse el mtodo de la placa de agarosa con bromuro de etidio. Permite calcular la cantidad de cidos nucleicos a partir de la intensidad de la fluorescencia emitida por el Extraccin y Purificacin de ADN 10 bromuro de etidio irradiado con luz UV, comparndola con unos patrones de concentracin. Visualizacin de ADN Para observar los fragmentos de ADN se utiliz la tcnica de electroforesis horizontal. El ADN obtenido en las extracciones y los productos de PCR fueron observados en geles de agarosa a una concentracin de 1.2%, en solucin tampn TBE 0.5 X (Tris-HCl, pH 7.5; cido brico, EDTA) en tanques de electroforesis. Las muestras fueron separadas a 100 V durante 60 min en geles pequeos y 90 min en geles grandes, teidos en una solucin 1:10 de bromuro de etidio: agua destilada durante 15-20 min; luego se visualizaron las bandas de ADN en el transiluminador y se fotografiaron bajo luz ultravioleta. Se utiliz una Universidad Andina Nstor Cseres Velsquez CAP MEDICINA HUMANA
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escalera molecular de ADN con un rango de 100-1500 pb, para verificar la presencia o ausencia de bandas.
EN VIRUS: DANAGENE Spin Viral DNA/RNA Kit Est designado para una rpida purificacin simultnea de ADN y ARN viral a partir de muestras libres de clulas, como suero, plasma y fluido cerebroespinal. Los virus cuando son lisados con un detergente y proteinasa K, liberan los cidos nucleicos virales. Luego, en presencia de sales caotrpicas, los cidos nucleicos virales se unen selectivamente a una membrana de slica en una spin columna. Los cidos nucleicos permanecen unidos mientras que una serie de lavados y pasos de centrifugacin eliminarn los componentes celulares contaminantes. Finalmente, con un tampn de elucin los cidos nucleicos virales sern eluidos de la membrana. Este proceso no requiere precipitaciones alcohlicas, extracciones con disolventes orgnicos, o extensivos manejos de cidos nucleicos. PROTOCOLO : Preparaciones Preeliminares Disolver la proteinasa K en 2 ml de agua libre de nucleasas y conservar a 20C. Se recomienda realizar varias alicuotas para evitar demasiados ciclos de descongelado- congelado. A esta temperatura es estable durante 1 ao. Aadir 20 ml Etanol 100 % al Tampn Lavado Virus. Mantener el envase bien cerrado para evitar la evaporacin del etanol. Aadir 80 ml Etanol 100 % Tampn Lavado Virus. Mantener el envase bien cerrado para evitar la evaporacin del etanol. Protocolo para la extraccin de ADN y ARN viral a partir de suero, plasma y fluidos biolgicos Universidad Andina Nstor Cseres Velsquez CAP MEDICINA HUMANA
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A. B. < C. D. Cerrar el microtubo y vortex vigorosamente durante 20 segundos. E. Incubar a 56C durante 20 minutos. F. Brevemente centrifugar el microtubo para recoger las gotas de la tapa. G. H. Incubar el lisado por 5 minutos a temperatura ambiente. I. Aadir el lisado a la Spin Columna con un tubo de recoleccin. J. Centrifugar la columna a 10.000 rpm por 1 min. Eliminar el tubo de recoleccin. Colocar la spin columna en un nuevo tubo de recoleccin. K. L. Centrifugar la columna a 12.000 rpm por 1 min. M. N. Centrifugar la columna a 12.000 rpm por 1 min. O. P. Centrifugar la columna a 12.000 rpm por 1 min. Q. Centrifugar la spin columna a mxima velocidad durante 2 minutos para eliminar el etanol residual. R. Eluir con 30- centro de la membrana de la columna. S. Incubar a temperatura ambiente por 1 minuto. Universidad Andina Nstor Cseres Velsquez CAP MEDICINA HUMANA
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T. Centrifugar la spin columna a mxima velocidad durante 1 minuto. El microtubo ahora contiene los cidos nucleicos virales. Eliminar la spin columna. U. Conservar el ADN/ARN viral a - 80C o utilizarlo en las aplicaciones posteriores inmediatamente. EN BACTERIAS: MTODO DE HERVIDO Existen diferentes mtodos para la obtencin de ADN bacteriano que varan en duracin y complejidad del procedimiento en funcin de la calidad del ADN que queramos obtener. En este apartado definimos dos mtodos para extraccin de ADN cromosmico como el mtodo de hervido, que es un mtodo rpido, pero con el que se obtiene un ADN de pureza mnima, pero suficiente para llevar a cabo procedimientos como la tcnica de PCR; y el mtodo de CTAB, ms largo pero con el que se obtiene un ADN de mayor pureza til para anlisis posteriores con enzimas de restriccin. Materiales Cultivo bacteriano en placa de agar Asa de siembra Estufa a 37 C Eppendorf de 1,5 ml estriles Pipetas y puntas desechables estriles Placa calefactora con capacidad de alcanzar 100C Centrfuga Agua molecular autoclavada Protocolo 1. Preparar un eppendorf estril por cada muestra al que se aaden 100 litos de agua molecular autoclavada. Universidad Andina Nstor Cseres Velsquez CAP MEDICINA HUMANA
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2. Tomar con un asa de siembra unas colonias de la placa de agar e introducirlas en el eppendorf, utilizando posteriormente la pipeta para obtener una suspensin homognea. 3. Calentar a 100C durante 15 minutos. 4. Aadir 900 litros de agua molecular estril a cada eppendorf y homogeneizar. 5. Centrifugar durante 5 minutos a 12.000 rpm 6. Recoger el sobrenadante en un eppendorf estril. 7. Para cada reaccin de PCR se aaden de 1-5 l de este sobrenadante.