Formato interno para la formulacin de proyectos de investigacin

Ttulo del proyecto: Capacidad de biodegradacin y bioconversin por hongos

de podredumbre blanca a partir de desechos de la industria maderera en
Colombia
1. Descriptores del Proyecto:
1.1. Planteamiento del problema de investigacin y Justificacin:
La gran complejidad estructural en los componentes de los residuos vegetales
como los son los residuos obtenidos por la industria maderera generan un gran
problema de contaminacin ambiental debido a que estos residuos poseen un
largo tiempo de biodegradacin y esto causa la generacin de zonas para el
desecho de estos residuos de compleja degradacin.
En Colombia se produce millones de toneladas de residuos de madera cada ao
(Apro !.!" m
#
$% y para el tratamiento de estos residuos% se utilizan vertederos%
incineracin y el reciclaje. En el caso de los residuos de madera que han sido
incinerado reducir&an en gran medida el volumen de residuos y de llenado%
ayudando de esta manera a el problema de la escasez de tierras' mas sin
embargo la incineracin de los residuos de madera generan emisiones
atmos()ricas nocivas tales como los idos de azu(re y nitrgeno (*uisheng et al%
"!+,$.
Este proyecto de investigacin se llevara a cabo con el (in de disminuir los
residuos madereros generados en Colombia a trav)s de la biodegradacin y
bioconversin por hongos de podredumbre blanca% ya que estos poseen una
actividad enzim-tica que componen una nueva opcin para la degradacin de
estos residuos en menor tiempo y de una manera amigable con la naturaleza%
desarrollando de este modo aplicaciones que contribuyan al saneamiento
ambiental por la eliminacin de estos residuos% y a su vez% evitar otros procesos
que suelen generar graves problemas ambientales.
1
Formato interno para la formulacin de proyectos de investigacin
1.2 Marco Terico y stado del !rte:

La madera es una opcin valiosa para la industria debido a que es un compuesto
org-nico biodegradable con caracter&sticas como la (leibilidad% baja densidad%
(acilidad de trabajo% dureza y la mala conductividad para el calor y la electricidad%
la dureza de la madera se determina por la composicin de la lignina la cual es un
componente estructural de la pared celular de las plantas compuesto por
monmeros derivados de tres alcoholes arom-ticos (cumar&lico% coni(eril y
sinap&lico$.
La madera se clasi(ica en tres grupos los cuales son. maderas blandas las cuales
poseen una mayor concentracin de alcohol cumar&lico% maderas duras las cuales
contienen alcohol cumar&lico y sinap&lico en cantidades similares y (inalmente las
maderas de c)sped las cuales poseen las tres subunidades en cantidades
variables.
En Colombia la super(icie total re(orestada se estim cerca de las /!!.!!!
hect-reas% dentro de las cuales "!!.!!! son re(orestadas con (ines industriales%
los departamentos que encabezan la actividad industrial maderera son Antioquia%
0alle% Cundinamarca% Cauca y 1oyac-. Colombia se considera un eportador
neto de madera y de muebles de este mismo material para uso de hogar u
industrial. (2ontealegre "!!3$.
La gran complejidad estructural en los componentes de los residuos vegetales
como los son los residuos obtenidos por la industria maderera generan un gran
problema de contaminacin ambiental debido a que estos residuos se poseen un
largo tiempo de biodegradacin y esto causa la generacin de zonas para el
desecho de estos residuos de compleja degradacin% por otro lado la actividad
enzim-tica presentada por algunos hongos denominados de podredumbre blanca
componen una nueva opcin para la degradacin de estos residuos en una (orma
amigable con la naturaleza y de menor tiempo en la cual se generan productos de
2
Formato interno para la formulacin de proyectos de investigacin
inter)s industrial como lo son alcoholes% -cidos y di(erentes tipos de metabolitos
de inter)s. (Aguilar et al "!+#$.
1iodegradacin y bioconversin es un deterioro natural o proceso de degradacin
en el que las comunidades microbianas romper o alterar la estructura de los
constituyentes de desechos de la industria maderera como sustancias org-nicas e
inorg-nicas (2annan et al% "!!/$. En el caso de los hongos degradadores de
madera% juegan un papel importante en los ciclos del carbono y del nitrgeno%
desarrollando la bioconversin de la materia org-nica. En base a sus patrones de
desintegracin% es posible establecer tres tipos principales de hongos. hongos de
pudricin blanda% marrn y blanca% los cuales han sido utilizados para aplicaciones
industriales (4ses% "!!5$. La degradacin (6ngica se produce etracelularmente
debido a la insolubilidad de lignina% celulosa y hemicelulosa. 7oseen dos tipos de
sistemas enzim-ticos etracelulares% el sistema hidrol&tico% que genera hidrolasas%
responsables de la degradacin de polisac-rido% y un sistema ligninol&tico
oidativo etracelular% el cual degrada la lignina y abre anillos de (enilo (8anchez%
"!!/$.
Actualmente la mayor&a de los procesos para la degradacin de residuos
vegetales dentro de los que se incluyen los desechos madereros son evaluados
haciendo uso de la actividad enzim-tica de diversos microorganismos.

En cuanto al sustrato% la madera consiste principalmente de tres componentes
mayoritarios. lignina% celulosa y hemicelulosa. La celulosa es un pol&mero de
anh&drido glucosa con uniones +9,. Las hemicelulosas consisten de pol&meros
similares de glucosa con otras uniones o pol&meros de monosac-ridos di(erentes a
la glucosa. La lignina es un pol&mero complejo de unidades (enlicas. :e igual
manera eisten otros compuestos que no (orman parte de la estructura de la
pared vegetal% y la mayor&a son solubles en solventes neutros. (8anchez "!!;'
8midt et al "!!3$
3
Formato interno para la formulacin de proyectos de investigacin
Los hongos de podredumbre blanca o lignoceluloliticos pertenecen a los grupos
de 1asidiomicetos y Ascomicetos% quienes tienen la propiedad de crecer en la
madera y juegan un papel esencial en el ciclo del carbono en la <ierra. Estos
hongos en particular poseen un sistema enzim-tico etracelular que se origin en
el periodo :evnico superior paralelamente a la evolucin de las plantas
vasculares% por lo que se pone en mani(iesto la relacin entre los procesos de
degradacin y s&ntesis de la lignina. (=an > Li "!+"$
*especto a estos hongos son los 6nicos con la habilidad de degradar lignina y
otros compuestos org-nicos con estructura qu&mica similar% por lo que desde el
punto de vista biotecnolgico poseen un gran potencial% pues estas estructuras tan
complejas son causantes de contaminacin en ambientes naturales. Estos
microorganismos se caracterizan por degradan en primer lugar la lignina y
producen ac6mulos de celulosa que dan la apariencia blanquecina a la madera.
Esta degradacin produce una despolimerizacin y mineralizacin para producir
C4
"
y ?
"
4. (8anchez "!!;$
El sistema enzim-tico por el cual se lleva a cabo la degradacin de la madera se
encuentra constituido por dos sistemas etracelulares% uno sistema hidrol&tico el
cual produce hidrolasas para realizar la degradacin de polisac-ridos y otro
oidativo que degrada la lignina y rompe los anillos de (enilo. 7or otro lado para
que se lleve a cabo esta degradacin se requiere de la presencia de enzimas
como la (enol oidasa conocida como lacasa y la accin de peroidasas como la
2anganeso peroidasa (2n7$ y la Lignino peroidasa (Ln7$. (8-nchez "!!;$.
La Lignino peroidasa (EC +.++.+.+,$%es una glicoprote&nas de tipo oligomanosa
constituida por un peso molecular entre #3 a ,# @:a% este se encuentra
constituido por una estructura compleja la cual cuenta con un centro catal&tico que
contiene un grupo hemo tipo b constituida por un in Ae BBB el cual se encuentra
unido a , anillos pirrlicos. Esta enzima contiene un alto potencial redo% ya que
puede oidar compuestos arom-ticos (enlicos y no (enlicos hasta en un ;! C
4
Formato interno para la formulacin de proyectos de investigacin
del pol&mero% no obstante este realiza la ruptura de enlaces C9C enlaces )ter (C9
49C$ de las cadenas de aril propano% hidroila grupos metileno benc&lico% oida el
de alcohol benc&lico para obtener aldeh&dos o cetonas y (inalmente oida (enoles y
rompe anillos arom-ticos de los compuestos no (enlicos de la lignina (8-nchez
"!!;$.
La 2anganeso peroidasa (E.C. +.++.+.+#$% es una hemo peroidasa% la cual
requiere de perido de hidrogeno para realizar su actividad y se encuentra
constituida por hierro% por otro lado esta tiene un poder redo in(erior a la Ln7 ya
que no oida compuestos no (enlicos y genera 2nD# al oidar el 2ED"
(8-nchez "!!;$.
La lacasa (E.C. +.+!.#."$% es una glicoprote&nas etracelular con un peso
molecular aproimado entre /! y +,! F:a% esta enzima monom)rica cuenta en su
centro activo con un cl6ster de cobre el cual le permite catalizar la oidacin de
un electrn de los (enoles y otros sustratos ricos en electrones para la (ormacin
de radicales libres y reducir el o&geno molecular a agua (8-nchez "!!;$.
7or otro lado las celulasas son enzimas responsables de realizar la degradacin
de la celulosa% la cual se encuentra constituida por una mezcla compleja de
prote&nas las cuales se dividen en endoglucanasas o 9 G +9, glucanasa ( EC
#.".+., $ % celobiohidrolasa (CE #.".+.;+ $ y G 9 glucosidasa (EC #.".+."+ $. Las
endoglucanasas tambi)n se conocen como carboimetilcelulasas y la
Celobiohidrolasa% conocida como eoglucanasa% es el principal componente
enzim-tico del sistema de celulasas (6ngicas ya que representa el ,!9H! C de las
prote&nas totales de la celulasa% esta adem-s puede hidrolizar celulosa altamente
cristalina ya que elimina los monmeros y d&meros de la cadena de glucano. La G9
glucosidasa hidroliza d&meros de glucosa (8-nchez "!!;$.
Ainalmente el ultimo sistema enzim-tico empleado para la degradacin de
desechos madereros son las hemicelulosas% estas se clasi(ican en endo 9 G +9,
5
Formato interno para la formulacin de proyectos de investigacin
ilanasa (EC #.".+.3$% la cual genera oligosac-ridos al realizar una escisin de
ilano y la G +9, ilosidasa (CE #.".+.#H $ produce ilosa a partir de
oligosac-ridos. 7or otro lado para que se lleve a cabo la degradacin de la
hemicelulosa se necesita de la presencia de otras enzimas como la ilano
esterasa% (er6lico y p I cum-rico esterasas% J 9 + 9 arabino(uranosidasas% y J 9 ,
glucuronosidases para que se lleve a cabo una degradacin sin)rgica de los
ilanos% mananos y dem-s componentes de la madera como el alcohol
coni(er&lico% sinap&lico y cumar&lico los cuales son componentes que determinan la
dureza de la madera (8-nchez "!!;$.
A partir de los antecedes previamente realizados en este trabajos se busca
evaluar la capacidad de biodegradacin y bioconversin de los hongos de
podredumbre blanca a partir de desechos de la industria maderera en Colombia.
1.3 Objetivos:
Keneral.
Evaluar la capacidad de biodegradacin y bioconversin de los hongos de
podredumbre blanca a partir de desechos de la industria maderera en Colombia.
Especi(icos.
:eterminar si la biodegradacin y bioconversin a partir de hongos de
podredumbre blanca es una buena alternativa que permita el correcto uso de los
desechos madereros obtenidos en di(erentes regiones de Colombia y de este
modo evitar problemas ambientales.
Bdenti(icar las cepas con mayor actividad enzim-tica y que de este modo
garantice una e(icaz biodegradacin y bioconversin de los desechos madereros
en Colombia.
6
Formato interno para la formulacin de proyectos de investigacin
Materiales y mtodos
AELLB8B8 E8<A:M8<BC4
<B74 :E E8<N:B4. diseo de eperimento totalmente aleatorizado.
8e realizar- un diseo (actorial completo donde se tomaran # variables con #
niveles d-ndonos un diseo de 3+ ensayos en los las variables ser-n. los hongos
utilizados para el desarrollo del proyecto% los niveles a evaluar ser-n la generacin
de las enzimas nombradas previamente en el proceso de la degradacin de los
residuos madereros. Cada ensayo ser- realizado por triplicado para generar
robustez estad&stica en los resultados obtenidos% generando un total de ",#
ensayos.
741LACBOE P 2NE8<*A
741LACBOE. :esechos de la industria maderera
2uestra. 0iruta obtenida del proceso de aserrinaje de la madera.
0A*BA1LE8
Actividad enzim-tica lignol&tica
Crecimiento de micelio sobre la madera
Caracter&sticas mor(olgicas de los ?ongos de pudricin blanca
Concentracin del sustrato a degradar en (uncin del tiempo de (ermentacin.
7eso del sustrato al (inal del tratamiento.
p? y temperatura
2E<4:4L4KBA
2icroorganismos y condiciones del cultivo para replicarlos.
7
Formato interno para la formulacin de proyectos de investigacin
8e utilizaran las cepas de los hongos 7hanerochaete chrysosporium (A<CC
",H"/$% <rametes versicolor (A<CC 5!;3/$ y 7leurotus ostreatus (A<CC #"H3#$.
Los anteriores hongos de podredumbre blanca han sido re(erenciados por la
literatura como buenos inductores de enzimas lignocelulol&ticas.

8e replicaran en medio P27K% el cual contiene. etracto de levadura al +C%
etracto de malta al +C% peptona bacteriolgica al !."C% glucosa al +C%
asparagina al !.+C% @?"74, al !."C% 2g84,Q H ?"4 al !.+C% tiamina clorhidrato
+ mg y agar al "C. 8e llevara a esterilizacin y se servir- en cajas de 7etri% las
cajas sembradas se llevar-n a incubacin a #HRC por / d&as% luego se mantendr-n
a ,RC.
La preparacin de los inculos se llevara a cabo trans(iriendo / trozos circulares
de agar colonizado desde las cajas de 7etri a Aernsbach de +L con +!!! mL de
medio de cultivo e incub-ndose por / d&as.
Caracter&sticas macro y microscpicas.
Bnicialmente se realizara una evaluacin de las caracter&sticas macro y
microscpicas de los hongos empleados en estudio% con el objetivo de analizar si
hubo un cambio en su mor(olog&a durante el proceso de degradacin% para esto se
deber- hacer uso de colorantes de Kram% Azul de lacto(enol y @4?.
Cultivos en (ase slida
7ara la evaluacin de la produccin de enzimas lignol&ticas se realizara un
sistema de (ermentacin en estado slido% en (rascos de +!! mL. 8e tomara los
residuos madereros con las siguientes dimensiones. +%"/ g del material seco
est)ril en trozos de !%/ cm de di-metro promedio% con 5%! mL del medio del cultivo
P27K y , mL de inoculo homogenizado.
8
Formato interno para la formulacin de proyectos de investigacin
Esto se incubara a #HRC la cual es una temperatura adecuada para los tres
hongos' peridicamente se retirara (rascos para analizar la actividad enzim-tica y
la degradacin del sustrato slido' el resto de (rascos se les controlara la
humedad de acuerdo con su p)rdida de peso.
Etraccin y medicin de la actividad enzim-tica
La etraccin de las enzimas se realizara adicionando a cada (rasco de cultivo +!
mL de solucin de malonato de sodio (+! m2% p? ,%/$ y agitando vigorosamente
en un agitador reciproco a #!! oscSmin durante / minutos. El l&quido sobrenadante
se centri(ugara a 5!!! rpm y se (iltrara a trav)s de una membrana de !%,/ micras
antes de determinar su actividad enzim-tica.
La actividad manganeso peroidasa (2n7$ se determinara a partir de la oidacin
del compuesto "%5 dimetoi(enol ("%59:27$ a ,53 nm. La mezcla de reaccin
consta de /! m2 de malonato de sodio (p?T,%/$% +m2 de dimetoi(eno% 2n84,%
!%, m2 de ?"4"% +!! UL de muestra y agua destilada. Nna unidad de actividad
representa + Umol de producto oidado de :27 por minuto.
La actividad Ligninoperoidasa (Li7$ se determinara mediante la oidacin de
alcohol veratrilico a aldehido veratrilico a #+! nm. La mezcla de reaccin consta
de de /! m2 de tartrato de sodio (p? #%!$% " m2 de alcohol veratrilico% !%, m2 de
?"4"% +!! UL de muestra y agua destilada.
:egradacin de los materiales lignocelulsicos
La degradacin del material en los cultivos de los hongos se determinara
retirando el l&quido liiviado de cada matraz por (iltracin al vac&o y determinando
el peso seco del solido remanente. La di(erencia de peso respecto al valor inicial
representa la cantidad de material degradado.
9
Formato interno para la formulacin de proyectos de investigacin
Actividad lignol&tica.
7ara poder evaluar la actividad lignol&ticas de los hongos utilizados% se debe
hacer uso de un medio de guaiacol% el cual va a ir suplementado con
concentraciones di(erentes de la (uente de carbono para poder evaluar y
determinar en qu) concentracin la enzima realiza una actividad ptima de
degradacin.
<A1NLACB4E P AELLB8B8 :E :A<48.
7osteriormente para el an-lisis de los resultados obtenidos en se realizara un
an-lisis de varianza AE40A el cual nos determinara las di(erencias
estad&sticamente signi(icativas obtenidas en los ensayos.
Ainalmente se calculara con la ayuda del programa estad&stico de 8igma7lot en el
cual se procesaran los datos y a estos se les determinara la desviacin est-ndar y
el coe(iciente de variacin% para establecer que tratamiento presentara una mayor
estabilidad de reaccin y este ser- el que podremos emplear para la
biodegradacin y bioconversin de los desechos provenientes de industrias
madereras.
*E8NL<A:48 E87E*A:48
Al (inalizar este proyecto se esperara.
7roduccin de biomasa y actividad de 2anganeso 7eroidasa% Ligninoperoidasa
y Lacasa para los hongos evaluados en (uncin del tiempo de (ermentacin.
7roduccin de enzimas ligninol&ticas de los hongos evaluados en los cultivos de
(ase slida sobre el material ligninocelulsico.
10
Formato interno para la formulacin de proyectos de investigacin
La actividad enzim-tica llevada a cabo por los hongos convierta la madera en
otras sustancias de m-s (-cil degradacin% es decir la lignina se convierta en
sustancias precursoras de humus como. 0ainillina% Lcido 0ainillinico y -cido
(er6lico.
Las sustancias precursoras de ?umus son (undamentales en el ciclo del carbono
en la tierra% pues constituyen la reserva de carbono en los suelos.
1.8. Bibliografa
!guilar !" #avioli $" %erra& !. '()13* +,tracellular activities and -ood component
losses during 7inus taeda biodegradation by the bro.n/rot fungus Kloeophyllum
trabeum. Bnternational 1iodeterioration > 1iodegradation. 8(: 180/111.
2annan 8% AaFhruVl9*azi A% Alam W% ("!!/$. Nse o( (ungi to improve bioconversion
o( activated sludge. =ater *esearch% 0olume #;% Bssue +#% August "!!/% 7ages
";#/9";,#
4ses *% 0alenzuela 8% Areer X% 1aeza X% *odr&guez X% ("!+#$. 7alm leave and
plastic Yaste Yood composite (or out9door structures. Construction and 1uilding
2aterials% 0olume ,H% 7ages +,#+9+,#/.
2uisheng 3g" 4atric5 C" 6ian 7" 8ong B" '()19*. !voided impact :uantification
from recycling of .ood .aste in 8ingapore: an assessment of pallet made from
technical .ood versus virgin soft.ood. ;ournal of Cleaner 4roduction" <olume =>"
4ages 990/9>0
8-nchez C% ("!!;$. Lignocellulosic residues. 1iodegradation and bioconversion by
(ungi. *esearch Centre (or 1iological 8ciences% Nniversidad Autnoma de
<lacala% <lacala% 2)ico. 1iotechnology Advances "H +3/I+;,1.1)
8midt +" ?eissl @" 8chumut&er ? A Binterstoisse B. '())8* Co/composting of
lignin to build up humic substances. 8trategies in .aste management to improve
compost :uality. Bndustrial Crops and 7roducts. (0: 11=/()1.
Cijani $" ;amal 4" !lam D A ?irghani +. '()13* Biodegratdaion potential and
ligninolytic en&yme activity of t.o locally isolated 4anus trigrinus strains on
selected agro/industrial .astes. Xournal o( Enviroment 2anagement 118: 11>/1(1.
-an Cai,i A Ei Febo. '()1(* %ungal pretreatment of lignocellulosic biomass.
1iotechnology Advances 3): 1990G19>0
11
Formato interno para la formulacin de proyectos de investigacin
12