Tcnicas para la determinacin de compuestos antioxidante en alimentos.

Laura Agudo Medina

ISSN: 1989-9041, Autodidacta




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TCNICAS PARA LA DETERMINACIN DE
COMPUESTOS ANTIOXIDANTE EN ALIMENTOS.

Laura Agudo Medina
biomedina@hotmail.com

1.- RADICALES LIBRES Y COMPUESTOS ANTIOXIDANTES
Radical libre (RL) es cualquier especie qumica capaz de existir de forma
independiente y que presenta uno o ms electrones desapareados en su estructura.
Como consecuencia, son altamente reactivos lo que hace que tengan una vida media
del orden de milisegundos, aunque vara segn el tipo de radical libre (Halliwell y col.,
1992). Los radicales libres tambin son conocidos como especies reactivas
oxignicas o del oxgeno, ROS, y especies reactivas del nitrgeno, RNS.
A bajas concentraciones los radicales libres son necesarios para el buen
funcionamiento celular pudiendo actuar como segundos mensajeros estimulando la
proliferacin celular y/o actuando como mediadores para la activacin de las clulas.
Sin embargo, un exceso de los mismos puede acumularse hasta niveles txicos dando
como resultado que se produzcan diversas acciones sobre el metabolismo de los
principios inmediatos, que pueden ser origen del dao celular (Davies, 1995).
La capacidad que tenga cada radical libre para actuar como agente oxidante est
determinada por factores como su reactividad, especificidad, selectividad y
difusibilidad. Son responsables del dao oxidativo de macromolculas biolgicas como
el DNA, lpidos, carbohidratos y protenas. Participan en los mecanismos
fisiopatolgicos de muchas enfermedades, como algunos tipo de cncer, diabetes,
patologas cardiovasculares, procesos reumticos, patologas gastroentricas,
afecciones broncopulmonares o procesos neurodegenerativos. Tambin estn
implicados en procesos fisiolgicos como el envejecimiento, el dao causado por el
ejercicio fsico agotador y otros.
Aunque se produce un gran dao oxidativo, el organismo ha desarrollado un
sistema de defensa antioxidante que intenta evitar o neutralizar la agresin. Un
antioxidante es cualquier sustancia que en presencia de un sustrato oxidable retrasa
o inhibe la oxidacin del mismo (Mataix y Battino, 2002). Se caracterizan por ser muy
heterogneos, pueden ser hidrosolubles y liposolubles, localizarse intra y
extracelularmente, y proceder de diferentes fuentes ya que algunos son nutrientes o
proceden de stos y otros son productos del metabolismo.
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Los antioxidantes pueden actuar:
A. Previniendo la formacin de ROS.
B. Interceptando el ataque de ROS.
C. Secuestrando los metabolitos reactivos y convirtindolos en molculas menos
reactivas.
D. Facilitando la reparacin del dao causado por ROS.
E. Manteniendo un ambiente favorable para la actuacin de otros antioxidantes.
F. Amplificando la resistencia de las dianas biolgicas sensibles al ataque de ROS.

Segn el modo de accin, los antioxidantes se clasifican en primarios, secundarios
terciarios:
Primarios: Impiden la formacin de radicales libres, frenan la reaccin en
cadena de los radicales libres, especialmente de las especies reactivas del oxgeno
(ROS) son quelantes de metales de transicin. Se comportan como captadores de
estos ROS.
Secundarios: Interrumpen la reaccin de propagacin de los radicales libres
desplazan las especies reactivas del oxgeno (cido ascrbico, carotenoides, glutation
y la mayora de las enzimas antioxidantes).
Terciarios: Reparan el dao causado a las molculas por los radicales libres
eliminan aqullas que se han estropeado.

En el organismo humano los radicales libres estn controlados mediante un amplio
espectro de antioxidantes de origen endgeno (enzimas antioxidantes, glutatin,
albmina, transferrina, cido rico, bilirrubina) y exgenos a travs de la dieta
(vitamina E y C, carotenoides, selenio, compuestos fenlicos) (Gutteridge, 1995). Entre
los componentes del sistema antioxidante endgeno destacan las enzimas
antioxidantes: catalasa, superxido dismutasa (SOD) y glucosa fosfato
deshidrogenasa. La SOD es una enzima distribuida en todo el organismo. Hay dos
tipos intracelulares de SOD: la que est presente en la mitocondria, que contiene
manganeso en su centro activo (Mn-SOD) y la del citosol, que tiene iones de cobre y
zinc (Cu-Zn-SOD). La Catalasa es una enzima intracelular que se localiza en el interior
de los glbulos rojos. El equilibrio entre la actividad de la Catalasa respecto de SOD es
fundamental para mantener el balance REDOX. La GPx es un complejo enzimtico,
existen cuatro formas diferentes de esta enzima y todas ellas tienen selenio en su
centro activo (Holben DH y col., 1999).

Cuando la agresin supera las defensas se habla de estrs oxidativo, es decir, el
balance oxidativo entre la produccin de radicales libres y las defensas antioxidantes
se rompe. Si esto ocurre las especies reactivas generadas pueden iniciar procesos
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patolgicos graves como diabetes, cncer, enfermedades cardiovasculares,
envejecimiento.
2.- BENEFICIOS QUE SE OBTIENEN DE UNA DIETA RICA EN POLIFENOLES.
Son numerosos los estudios que han mostrado que los polifenoles poseen
propiedades antioxidantes, inhibiendo la peroxidacin lipdica y captando radicales
libres hidroxilo, suproxido y alcoxi (Sichel et al., 1991). Protegen de la oxidacin a las
lipoprotenas de baja densidad (LDL) desempeando un papel clave en la prevencin
de la aterosclerosis. Tambin pueden prevenir la trombosis, inhibiendo la agregacin
plaquetaria, la permeabilidad y fragilidad capilar (Mazza, 2000). Son considerados
reguladores del sistema inmune y como antiinflamatorios, probablemente debido a la
modulacin del metabolismo del cido araquidnico, reduciendo los niveles de
tromboxano. Modulan la actividad enzimtica de la ciclooxigenasa, lipoxigenasa,
fosfolipasa A2, hialuronidasa, e inhiben la accin de la angiotensina convertasa,
mieloperoxidasa (que produce el hipoclorito y otros prooxidantes) y xantinooxidasa
(que produce los radicales superxido). Hay que destacar el potencial
anticarcingeno, ya que pueden estimular el bombeo de ciertos agentes cancergenos
hacia el exterior de las clulas o bien activar a las enzimas de detoxificacin (Mazza,
2000).
3.- EXTRACCIN DE COMPUESTOS ANTIOXIDANTES DE LOS ALIMENTOS
Los compuestos antioxidantes de los alimentos se extraen con disolventes de
diferentes polaridades de acuerdo con el carcter hidroflico o lipoflico de los
compuestos que se desean evaluar. El disolvente ms comnmente utilizado en la
obtencin de extractos lipoflicos es el hexano. Tambin se han utilizado el eter
dietlico y cloruro de metileno entre otros. Para la extraccin de compuestos con
carcter hidroflico se han utilizado metanol, etanol, mezclas de etanol/agua,
acetona/agua y metanol/agua as como extraccin en medio cido (pH=2) con
metanol/agua, seguida de acetona/agua y agua/acetonitrilo en medio cido, todos ellos
ensayados en diferentes proporciones. Recientemente se ha observado que el tipo de
disolvente y la polaridad puede afectar a la transferencia del electrn singlete y a la del
tomo de hidrogeno, los cuales son esenciales en la medida de la capacidad
antioxidante. Asimismo, la presencia de compuestos no antioxidantes (ciertos
aminocidos y cidos urnicos) en los extractos ensayados, tambin pueden afectar a
estos resultados. Esto sugiere que la comparacin de resultados sea solo llevada a
cabo en muestras en las que se utiliza el mismo mtodo y el mismo disolvente de
extraccin y que las sustancias interferentes deben ser comprobadas. (Prez Jimenez
y col, 2006).
3.1. Tcnicas para la determinacin de la actividad antioxidante
La determinacin de la actividad antioxidante de los alimentos es importante para
predecir el potencial antioxidante in vitro de los mismos antes de ser ingeridos; as
mismo, nos permite determinar la proteccin frente a la oxidacin y el deterioro del
alimento que disminuye su calidad y valor nutricional.
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Los mtodos de determinacin de la actividad antioxidante se basan en distintos
sistemas generadores de radicales libres. Dichos radicales reaccionaran con la
muestra y en virtud de la capacidad antioxidante de esta se inhibira la generacin de
los primeros. As, lo que se determina realmente es el efecto antioxidante ya que la
actividad antioxidante no se puede medir de forma directa. Lo ideal seria medir la
actividad antioxidante de cada componente de la muestra por separado, sin embargo,
y sobre todo en el caso de muestras naturales, es muy difcil determinar el nmero y
concentracin de los compuestos antioxidantes presentes en la muestra.
En la actualidad, debido a la complejidad de los procesos de oxidacin, no existe un
mtodo que refleje de forma completa el perfil antioxidante de una muestra, por tanto,
es bueno trabajar con varios mtodos para facilitar la comparacin e interpretacin de
los resultados. Las caractersticas ideales que debe reunir un mtodo de
determinacin de capacidad antioxidante son: sencillez, mecanismo qumico definido y
punto final fijo, reproducibilidad, adaptabilidad a sustancias antioxidantes hidroflicas y
lipoflicas y elevado rendimiento de anlisis.
Las medidas de la actividad antirradicalaria se pueden realizar mediante dos
estrategias distintas, en funcin de la informacin que se desea obtener (Snchez-
Moreno, 2002):
Determinacin directa: El radical se emplea como un factor de cuantificacin
(produce una seal analtica). La adicin del antioxidante, antes o despus de la
generacin del radical, provoca una disminucin de la seal. En el ensayo de post-
adicin se forma el radical en ausencia de la muestra y as, cuando se aade la
sustancia antioxidante se produce un descenso en la seal debido a la disminucin de
la concentracin del radical. En ensayos de inhibicin, la muestra se aade a los
sustratos de oxidacin antes que sea generado el radical, La reaccin comienza con la
adicin del oxidante (ABTS
+
, DPPH, etc).
Determinacin indirecta: La presencia de radicales libres produce la prdida o
aparicin de un reactivo, y por tanto, en presencia de un antioxidante se provoca el
aumento o disminucin de la seal (mtodos, ORAC, FRAP, etc).

3. 1. 1.- Mtodo del ABTS
+
(cido 2,2-azinobis (3- etilbenzotiazoln)-6-
sulfnico).
El radical ABTS
+
se genera a partir de su precursor el cido 2,2-azinobis (3-
etilbenzotiazoln)-6-sulfnico (ABTS), ver figura 11 (Ronald L. Prior, 2005). El radical
catinico obtenido es un compuesto de color verde-azulado, estable y con un espectro
de absorcin en el UV-visible.

Es un radical artificial que no mimetiza bien la situacin in vivo,
termodinmicamente puede ser reducido por compuestos que tengan un potencial
redox menor que el del ABTS (0.68V), pudiendo reaccionar con el radical, muchos
compuestos fenlicos con un potencial ms bajo. El punto final de la reaccin lo marca
la sustancia antioxidante empleada, fijando tiempos cortos o muy elevados que
pueden interferir en los resultados finales, lo cual, es un inconveniente.
La ventaja de este ensayo es que puede realizarse tanto en muestras hidrosolubles
como liposolubles, eligiendo el disolvente apropiado en cada caso.
Existen varios mtodos de generacin del radical ABTS
+
:
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- Enzimticamente (mioglobina, peroxidasa de rbano).
- Qumicamente (Dixido de manganeso, persulfato potsico, radicales peroxilo).
- Electroqumicamente.
En el presente estudio, se ha realizado el mtodo ABTS
+
generando el radical
qumicamente utilizando persulfato potsico.
La oxidacin con persulfato potsico se lleva a cabo a temperatura ambiente, en
ausencia de luz, en un tiempo de 12 a 16 h. El persulfato potsico y el ABTS
reaccionan estequiomtricamente (1:0.5). Una vez generado el radical la medida se
realiza mediante un ensayo de post-adicin. Este mtodo se aplica en la
determinacin de la actividad antioxidante de frutas, verduras, bebidas estimulantes.
Preparacin de reactivos:
- ABTS 7mM. Para 10 ml Disolver 0,0384 g de sal amnica cristalizada de ABTS en 10 ml de
agua destilada.
- Solucin persulfato potsico 2,45mM. Para 100 ml Disolver 0,0662 g del reactivo en 100
ml de agua destilada.
-Etanol al 96 % v/v.
- Preparacin radical ABTS*. Mezclar a partes iguales la solucin de ABTS 7mM y la de
persulfato pototsico 2,45mM. La mezcla se mantiene en oscuridad a temperatura ambiente
durante 16 horas para la formacin del radical. Esta solucin es estable durante dos das. La
solucin de ABTS* se diluye con etanol para obtener una absorbancia de 0,8 730 nm. Esto se
consigue mezclando 2,5 ml de la solucin del radical con aproximadamente 100 ml de etanol.
Recta de calibracin con la disolucin de TROLOX. La solucin madre se prepara
disolviendo 0,01gr de Trolox en 5 ml de metanol y 5ml de agua destilada. A partir de esta
solucin se hacen las diluciones que sern los distintos puntos de la recta, con unas
concentraciones de 19, 39, 59, 79, 99, 119, 159 y 199 M.

3.1.2.- Mtodo FRAP (Ferric ion Reducing Antioxidant Power).Benzi y strain,
1996; Pulido y col; 2000
En este mtodo se determina la capacidad antioxidante de forma indirecta. Se basa
en el poder que tiene una sustancia antioxidante para reducir el Fe
3+
a Fe
2+
que es
menos antioxidante. El complejo frrico-2,4,6-tripiridil-s-triazina (TPTZ) incoloro es
reducido al complejo ferroso coloreado.
Se trata de un mtodo espectrofotomtrico ya que se mide la absorbancia del Fe
2+
.
As, cuanto ms antioxidante es la sustancia objeto de estudio, mayor es la reduccin
y mayor la concentracin de Fe
2+
y ms alta la seal de absorbancia. El complejo va a
poder ser reducido por productos con potenciales redox menores a 0,7 V (potencial
redox del Fe
3+
-TPTZ).
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Debido a que el potencial redox del Fe
3+
-TPTZ es comparable con el del ABTS se
pueden analizar compuestos similares con ambos mtodos aunque las condiciones de la
reaccin sean distintas. El mecanismo del FRAP es de transferencia de electrones, a
diferencia de otros mtodos donde se produce captura de radicales libres, segn esto, el
FRAP puede ser til, en combinacin con otros mtodos, en la determinacin de la
capacidad antioxidante de productos que contengan distintos tipos de antioxidantes.
Preparacin de reactivos:
- cido clorhdrico (HCl) 40mM. Diluir 535 l de HCl (37%) en 100 ml de agua destilada.
- Solucin TPTZ 10 mM. Pesar 0,0312 g del reactivo TPTZ y disolverlos en un matraz de 10
ml con HCl 40 mM.
- Solucin FeCl
3
-6H
2
O 20 mM. Disolver 0,1352 g de FeCl
3
-6H2O en 25 ml de agua destilada.
- Tampn acetato 0,3 mM pH 3,6. Para 250 ml, disolver 0,0061 g de acetato sdico (NaAc)
en 200 ml de agua destilada. Ajustar el pH a 3,6 utilizando HCl 40mM, y completar hasta los
250 con agua destilada.
- Solucin de trabajo diario FRAP: Esta solucin de trabajo deber de prepararse a diario.
Mezclar 2,5 ml de solucin TPTZ con 2,5 ml de solucin FeCl3-6H2O 20 mM y 25 ml de tampn
acetato. Esta preparacin debe mantenerse durante todo el proceso en el bao a 37C.
Recta de calibracin con la disolucin de TROLOX. La solucin madre se prepara
disolviendo 0,01g de Trolox en 5 ml de metanol y 5ml de agua destilada. A partir de esta
solucin se hacen diluciones que sern los distintos puntos de la recta, con unas
concentraciones de 79, 119, 159, 199, 239, 279, 319, 359 y 399 M.

3.1.3.- Mtodo ORAC (Oxigen Radical Absorbance Capacity).
El fundamento del mtodo ORAC se basa en la habilidad que tienen los
compuestos antioxidantes para bloquear radicales libres por donacin de un tomo de
hidrgeno:
X + AH XH + A

En este mtodo, el radical artificial AAPH (2,2-Azobis-(2-aminopropano)-
dihidrocloruro) oxida a la fluorescena de forma que esta pierde su fluorescencia. De
esta forma, las sustancias antioxidantes presentes en el extracto obtenido a partir del
alimento disminuiran dicha prdida de fluorescencia.
Preparacin de soluciones
Disolucin reguladora de fosfato 75mM pH 7,4. Para 1000 ml, disolver 10,35 g de
NaH
2
PO
4
, H
2
O en 800 ml de agua destilada. Ajustar el pH a 7,4 y completar hasta 1 litro.
Solucin de AAPH 300 mM. Para 10 ml, disolver 0,8136 g de dihidrocloruro de 2,2-
azobis-2-amidinopropano en 10 ml de disolucin reguladora de fosfato 75 mM pH=7,4.
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Solucin de fluoresceina patrn 7,0 mM. Para 10 ml, disolver 0,0263 g de fluoresceina
en 10 ml de disolucin reguladora de fosfato 75 mM pH=7,4.
Solucin diaria de trabajo de fluoresceina 70 mM. Para 50 ml, diluir 10 l de la
solucin patrn en disolucin reguladora de fosfato 75 mM pH=7,4 y completar hasta 10 ml.
De aqu se toman 500 l y se llevan hasta 50 ml con la misma disolucin reguladora.

Recta de calibracin con la disolucin de TROLOX. La solucin madre se prepara
disolviendo 0,01g de Trolox en 5 ml de metanol y 5 ml de agua destilada. A partir de esta se
hacen diluciones que sern los distintos puntos de la recta, con unas concentraciones de 10,
20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90 y 100 M.
Mtodo Folin-Ciocalteau
La medida del contenido de fenoles totales se realiza utilizando el mtodo de Folin
Ciocalteau (Singleton, y col., 1999), que determina la capacidad que tienen los polifenoles para
reducir el Mo(VI) a Mo (V), como resultado de tal reaccin, el reactivo de color amarillo
adquiere un intenso color azul que se mide con el espectrofotmetro.
Preparacin de reactivos:
Reactivo de Folin-Ciocalteau (Sigma- Aldrich)
Reactivo de Carbonato sdico al 10%. Disolver 10g de Na
2
CO
3
en 100ml de agua
bidestilada.

Recta de calibracin con la disolucin de cido glico. La solucin madre se prepara
disolviendo 0,01g de cido glico en 10ml de agua bidestilada. A partir de esta solucin se
hacen diluciones que sern los distintos puntos de la recta, con unas concentraciones de 10,
20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90 y 100 ppm.

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