Algunos conceptos sobre centrifugacin

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Centrifugacin
Bibliografa:
Freifelder, D. (1991). Tcnicas de bioqumica y biologa molecular. Revert.
Luque, J. y Herrez, A. (2001) Texto ilustrado de biologa molecular e ingeniera gentica: conceptos,
tcnicas y aplicaciones en ciencias de la salud. Harcourt-Elsevier.
La centrifugacin es una tcnica de sedimentacin acelerada gracias al uso de fuerza centrfuga que
permite aumentar un determinado nmero de veces la fuerza de la gravedad. Se aplica al anlisis o a la
separacin de mezclas de partculas, clulas, orgnulos o molculas.
Teora de la centrifugacin y aspectos cuantitativos: vase Luque, p.123 o Freifelder, p.298.
Instrumental
1. Tubos
De vidrio o plstico. Resistentes qumicamente (disolventes, reactivos) y fsicamente (tensin a las
velocidades elevadas que se emplean). Diversos tamaos y formas. Plsticos especiales para altas
velocidades.

2. Centrfugas







Se puede regular velocidad, tiempo, temperatura. Elevadas velocidades (10
2
-10
5
rpm).
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3. Rotores
Dos
tipos:
rotor angular o de
ngulo fijo
rotor basculante



Modalidades
Segn la velocidad:
Criterio aproximado:
Centrifugacin a baja velocidad menos de 10.000 rpm
Centrifugacin a alta velocidad entre 10.000 y 20.000 rpm
Ultracentrifugacin ms de 20.000 rpm
Segn el propsito:
1. Centrifugacin analtica
Objetivo: medir las propiedades fsicas de las partculas que sedimentan, tales como su coeficiente de
sedimentacin o su masa molecular. Especialmente en la variante ultracentrifugacin analtica.
Las molculas se observan mediante un sistema ptico durante la centrifugacin. Los tubos de centrfuga
deben ser de cuarzo para dejar pasar la luz visible y ultravioleta. Rotor basculante, observacin en
vertical.
2. Centrifugacin preparativa
De uso ms comn. Objetivo: aislar partculas, clulas o molculas para su anlisis o utilizacin posterior.
En general, se emplea mayor cantidad de muestra que en la analtica.
Segn el medio en el que se centrifuga y la forma como se aplica la muestra:
1. Centrifugacin diferencial
(Tambin llamada de frontera mvil). El tubo se llena con muestra y se centrifuga. El comportamiento de
cada componente de la muestra depende de su forma, tamao, densidad y, lgicamente, de las
condiciones de centrifugacin. Se obtienen slo 2 fracciones: sedimento y sobrenadante.
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[Nota: la palabra precipitado es ms adecuada para algo insoluble, que precipita por centrifugacin o por
otros mecanismos (por ej., una reaccin qumica);sedimento es ms correcto para lo que se ha forzado a
ir al fondo pero seguira siendo soluble; pellet es una palabra inglesa para lo que queda compactado en el
fondo como consecuencia de la centrifugacin]
Una aplicacin tpica es el fraccionamiento subcelular (separacin de los distintos componentes de una
clula, principalmente de los orgnulos) (vase Luque o Alberts) empleando sucesivas centrifugaciones a
velocidad creciente.






2. Centrifugacin zonal o de velocidad de sedimentacin
La muestra se aplica en una capa delgada sobre el medio de centrifugacin, que es un gradiente de
densidad. Bajo la fuerza centrfuga, las partculas sedimentan a travs del gradiente concentrndose en
zonas o bandas discretas. Su velocidad de avance (y, por tanto, el mecanismo de la separacin) depende
de su tamao, forma y densidad; todos estos parmetros se combinan en el coeficiente de
sedimentacin


que se mide en unidades svedberg (1 S = 10
13
segundos).
La centrifugacin debe terminar antes de que alguna de las partculas separadas llegue al fondo del tubo.
Los componentes separados se recogen individualmente aspirando con mucho cuidado las diferentes
bandas o, mejor, perforando el fondo del tubo y recogiendo en fracciones el lquido que cae.
El gradiente de densidad se crea mediante un gradiente de concentracin: concentraciones crecientes, al
bajar en el tubo, de un componente adecuado. Se usan para ello sacarosa, cloruro de cesio, albmina,
suero fetal bovino..., o medios comerciales como Ficoll un polisacrido sinttico, Percoll, metrizamida....
Se puede preparar:
a) un gradiente discontinuo o escalonado, manualmente
b) un gradiente continuo, empleando un dispositivo formador de gradientes
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c) un gradiente continuo autoformado, si se crea mediante centrifugacin, normalmente a la vez que se
fracciona la muestra


Centrifugacin zonal.
A) Preparacin de un gradiente continuo de densidad usando un mezclador.
B) Aplicacin de la muestra sobre el gradiente.
C) Colocacin de los tubos en un rotor basculante y centrifugacin.
D) Recogida en fracciones de los componentes separados.
Con esta tcnica se consigue, por ejemplo, separar todos los tipos celulares sanguneos, purificar
espermatozoides viables, separar clulas viables y no viables de tejidos desagregados y muestras con
clulas en suspensin, etc.








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3. Centrifugacin isopcnica o de equilibrio de sedimentacin
Se utiliza tambin un gradiente de densidad, pero en este caso el tiempo de centrifugacin es lo
suficientemente largo (hasta 1 o 2 das) como para que se alcance el equilibrio de sedimentacin (entre
la fuerza centrfuga, el empuje hidrosttico de la clula y su difusin). Para conseguirlo, se usan gradientes
continuos que cubren todo el intervalo de densidades de los componentes de la muestra: en el fondo del
tubo la densidad del medio ha de ser mayor que la del componente ms denso. De esta forma,
independientemente del tiempo de centrifugacin, las partculas, clulas, etc. nunca sedimentarn en el
fondo, sino que alcanzan una posicin estable intermedia en el gradiente, donde se concentran en una
banda muy estrecha (mejor resolucin). Lo ms frecuente es mezclar la muestra con el material que
formar el gradiente y generar un gradiente autoformado a la vez que se hace la separacin. Requiere
velocidades muy altas (ultracentrifugacin) para que se forme el gradiente.
Adems de la mayor resolucin, lo interesante de esta tcnica es que separa exclusivamente segn la
densidad de los componentes de la muestra, que se sitan en la posicin del gradiente donde la densidad
del medio es igual a la suya propia (isopcnica = de igual densidad, en griego).
Comparacin e informacin adicional:

Centrifugacin diferencial
Centrifugacin zonal o de velocidad de
sedimentacin
Centrifugacin isopcnica o de
equilibrio de sedimentacin

(en gradiente preformado, continuo o
discontinuo)
(generalmente en gradiente
preformado o auto-formado, continuo)






Rotor angular, generalmente.
Separacin en funcin principalmente
del tamao, pero tambin del
coeficiente de sedimentacin s, que
depende de la masa (tamao
densidad) y de la forma. (medido en
Svedbergs, 1S = 10
-13
segundos)
Aplicacin: separacin de tipos
celulares, fraccionamiento subcelular
(separacin de orgnulos), separacin
de asociaciones macromoleculares,
etc.

Rotor basculante.
Separacin en funcin del coeficiente de
sedimentacin s, que depende de masa y
forma. El gradiente evita la mezcla por
conveccin/difusin: bandas bien separadas.
Se detiene la centrifugacin antes de
alcanzar el equilibrio. Densidad mxima del
gradiente < densidad de los componentes de
la muestra.
Aplicacin: separacin de macromolculas,
de orgnulos similares, etc.

Rotor basculante.
Separacin en funcin de la densidad.
El gradiente evita la mezcla por
conveccin/difusin: bandas bien
separadas. El tiempo de centrifugacin
es lo suficientemente largo como para
que se alcance el equilibrio. Densidad
mxima del gradiente > densidad de los
componentes de la muestra.
Aplicacin: separacin de molculas de
cido nucleico, purificacin de cidos
nucleicos, etc.



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4. Mtodos de barrera
Mtodo rpido, tpico por ejemplo en la obtencin de leucocitos de sangre circulante libres del resto de
clulas sanguneas. Se trata de una centrifugacin a travs de un medio de densidad constante (se podra
considerar como un gradiente escalonado de una sola etapa). La densidad de este lecho debe ser
intermedia entre la de los tipos celulares que se quieren separar. Se emplean para ello medios
comerciales como Ficoll-Paque, Lymphoprep y otros muchos, formados generalmente por mezclas
de Ficoll (un polisacrido sinttico) y metrizamida (un compuesto sinttico yodado). Se dispone de varios
medios con densidades adecuadas para la separacin de tipos celulares concretos; por ej., Nycoprep
1.077 para clulas mononucleares, Nycoprep 1.068 para monocitos,Polymorhoprep para clulas
polimorfonucleares, o Nycoprep 1.063 para plaquetas.
Clculos
Conversin de velocidad de giro (revoluciones por minuto, rpm) a aceleracin centrfuga (fuerza
centrfuga relativa, FCR, sin unidades):
Se conseguir una misma separacin en 2 centrfugas distintas cuando sea igual FCR, no si es igual la
velocidad de giro (rpm). Es importante, por ello, dar las condiciones de centrifugacin en FCR, no en rpm.
La FCR es lo que coloquialmente se llama nmero de ges, porque se mide empleando como unidad la
aceleracin de la gravedad, g. Se expresa as, por ej., una centrifugacin de 15 min a 20.000 g (o a
20.000 g ).
La relacin entre ambas depende del radio del rotor (medido desde el eje de giro hasta la posicin de la
muestra en el tubo) as:
La separacin por centrifugacin depende de la masa celular (m), del radio de giro del tubo o radio del
rotor donde se coloca la muestra (r) y de la velocidad alcanzada por la centrfuga ( o n):

Siendo:
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Fc = fuerza centrifuga
m = masa de la clula
a=v2r = aceleracin; si se trata de sedimentacin a gravedad unidad, a=g= 9,8 m/s
2
= 980 cm/s
2

v=et = velocidad lineal de la muestra en el tubo (cm/min)
r = radio de giro, medido entre el punto medio del tubo de centrfuga y el eje de rotacin (cm)
e = espacio lineal recorrido, si el movimiento fuese lineal (cm)
t = tiempo de sedimentacin empleado al centrifugar (min)
= ngulo recorrido en el movimiento de rotacin (radianes = ngulo cuyo arco es igual a r); =er
=t = velocidad angular, pues el movimiento es de rotacin (rad/min = min
1
)
n = velocidad de giro (revoluciones por segundo = rps, o revoluciones por minuto = rpm); =2 n
Calculando la fuerza centrfuga relativa:







Como ejemplo, veamos un ejercicio resuelto:
El n de g alcanzado en un rotor de centrfuga de 5 cm de radio, que gira a una velocidad de 10 000 rpm
es:
FCR=(10000)2589365=5600g
Conviene saber manejar esta conversin.
Clculo de FCR a partir de rpm, y viceversa, para distintos radios de giro del rotor