ANLISIS DE ALIMENTOS

Aplicaciones
Investigacin y desarrollo
Monitoreo de la calidad
Rotulado
Objetivos
Composicin
Estructura
Propiedades fsicas, qumicas y biolgicas
Tipos
De acuerdo al objetivo y alimento
COMPOSICIN
Anlisis proximal o de Weende (Humedad, Ceniza, Protena
Cruda, Extracto Etreo, Fibra Cruda y Extracto Libre de Nitrgeno)
Anlisis especficos ( -casena, fsforo, colesterol)
ESTRUCTURA
Macro
Micro (glbulos grasos)
Ultraestructura (micelas de casena)
PROPIEDADES FISICOQUMICAS y SENSORIALES
Anlisis sensorial (flavor, aroma)
Anlisis reolgico (dureza, elasticidad)
Estabilidad (oxidacin de lpidos, exudado de suero)
Propiedades trmicas (perfil de fusin)
PROPIEDADES BIOLGICAS
Crecimiento de microorganismos (bacterias starters, hongos)
Procesos y productos metablicos (pptidos, enzimas)
Anlisis proximal o de Weende
Resea
Ideado por Henneberg y Stohmann (1867) en la estacin experimental de
Weende (Alemania).
Aplicaciones
Materiales para formular una dieta como fuente de protena o de energa
Alimentos terminados, como control para verificar que cumplan con las
especificaciones o requerimientos establecidos durante la formulacin.
Fundamento y objetivo
Separar, a partir de la muestra seca, una serie de fracciones con
caractersticas comunes. Se determinan grupos de compuestos con
propiedades similares, no compuestos individuales. Se denominan
contenidos brutos o crudos.
Determinaciones
Humedad, protena cruda (nitrgeno total), fibra cruda, Extracto etreo o
pidos crudos, ceniza y extracto libre de nitrgeno.
MUESTRA
105 C
HUMEDAD
Mtodo
Kjeldahl
Nitrgeno
total x 6,25
PROTENA
CRUDA
Extraccin
con
solventes
GRASA
CRUDA
Evaporacin
CENIZAS
550 C
M
A
T
E
R
I
A

S
E
C
A
RESIDUO
FIBRA
CRUDA
Tratamiento
con cido
y base
550 C
M
U
E
S
T
R
A
AGUA
MATERIA
SECA
MATERIA
INORGNICA
MATERIA
ORGNICA
PROTENA
BRUTA
Protenas
Aminocidos
Pptidos
cidos nucleicos
Amidas
Nitratos
GRASA
BRUTA
Triglcridos
cidos grasos
Ceras
Esteroles
Pigmentos
Vitaminas liposolubles
FIBRA
BRUTA
Celulosa*
Hemicelulosas*
Lignina*
Cutina
EXTRACTO
LIBRE DE N
Almidn, glucgeno
Azcares
Pectinas
Celulosa*, hemicelulosas*
Lignina*
Vitaminas hidrosolubles*
cidos orgnicos*, pigmentos*
Fracciones obtenidas
Cenizas: sustancias inorgnicas
Protena Bruta: protenas + pptidos + aminocidos + bases
nitrogenadas + amidas + N vitamnico
Grasa bruta o extracto etreo: triglicridos + cidos grasos +
ceras + lpidos complejos + vitaminas liposolubles
Fibra bruta: celulosa* + hemicelulosas* + lignina* + cutina
Extracto libre de N: almidn, glucgeno + azcares + celulosa*
+ hemicelulosa* + lignina* + pectinas + pigmentos + cidos
orgnicos + vitaminas hidrosolubles
(*) fracciones del total
Principal deficiencia del Sistema Weende
Valores de fraccin hidrocarbonada del alimento tienen poca precisin
(fibra bruta y ELN)
Otros sistemas propuestos para salvar esta deficiencia
POR
ANLISIS
POR
DIFERENCIA
MUESTRA
Ebullicin Detergente neutro
Fraccin soluble
(SND)
Contenido celular
Lpidos
Azcares
Almidn
Protenas
cidos orgnicos
Pectinas
Fibra detergente
neutro (FDN)
Componentes de la pared celular
Ebullicin Detergente cido
Fibra detergente
cido (FDA)
Celulosa
Lignina
Cutina
Nitrgeno no proteico
Fraccin soluble
(hemicelulosas
hidrolizadas)
Mtodo Van Soest y Wine, 1967
CENIZAS
Componentes minerales que resultan de incinerar la muestra seca a ms de 500 C
T media de calcinacin: 550 C
> 600 C: prdidas de halogenuros alcalinos
Digestin seca, se elimina toda la materia orgnica:
MATERIA ORGNICA + O
2
CO
2
+ H
2
O + N
2
O + NO + SO
2
+
Algunas sales se descomponen:
CO
3
2-
xidos bsicos
Sales de cidos orgnicos xidos bsicos
Cl
-
, SO
4
2-
, PO
4
3-
(de Na, K, Ca, Mg, etc.) no se modifican
Se expresan en base fresca del alimento (salvo casos especiales)
ANLISIS DE MICRONUTRIENTES
A partir de cenizas de la muestra
A partir de la muestra luego de tratarla con H
2
SO
4
o HNO
3
(oxidacin de
materia orgnica por digestin hmeda)
En casos especficos, directamente de extractos de la muestra
CENIZAS
HCl 10%
Insoluble: silicatos (vidrio, arena, tierra)
Solucin
Tcnicas electroqumicas,
espectroscpicas (emisin,
absorcin y fluorescencia),
cromatogrficas, volumtricas
y gravimtricas
Ca, Mg, Na, K, Cu, Zn, Fe, Mn
CENIZAS
HCl
Espectrofotometra
de absorcin atmica
Na y K
Fotometra de
emisin en llama
Espectrofotometra
UV-V
P total
Anlisis de cloruros: se realiza en un extracto del alimento (Ej. volumetra de precipitacin:
Mtodo de Mohr)
Incineracin de la muestra en crisol mediante una llama
Crisoles (porcelana, platino) y hornos mufla
(MATERIA SECA)
HUMEDAD
El agua es el constituyente ms abundante de la mayora
de los alimentos naturales (excepto granos y frutos secos)
Agua de tejidos animales y vegetales puede estar ms o menos disponible
(perecibilidad)
Agua ibre y confinada (en general, predominante) se libera con facilidad:
estimada en los mtodos convencionales usados para determinar humedad
Eliminar agua ligada puede requerir temperaturas a las que el alimento se
degrada
Mtodos de determinacin de humedad
Directos: Estiman la cantidad de agua perdida del alimento por algn mtodo de
deshidratacin o directamente la cantidad de agua extrada del alimento
Indirectos: Estiman la cantidad de agua presente en un alimento mediante la
medida de alguna propiedad que dependa de dicha cantidad
MTODOS DIRECTOS
I. Por determinacin de la materia seca del alimento
Resultados confiables (asumiendo que la muestra no se descompone
trmicamente y/o que no hay eliminacin de otros componentes voltiles)
Debe ajustarse temperatura y tiempo (fijo, hasta peso constante, etc.)
Distintas tcnicas de secado:
Estufa de aire (de conveccin natural o forzada): 70-140 C
Estufa de vaco: < 60 C; alimentos ricos en protenas y azcares
Balanza con lmpara de luz infrarroja: secado rpido
Estufa de conveccin natural
Estufa de conveccin forzada
Estufa de vaco
Balanza con IR
II. Por medida de la cantidad de agua extrada del alimento
Destilacin continua con un solvente inmiscible de
punto de ebullicin mayor al del agua (desde 110 C para
el tolueno hasta aproximadamente 140 C para los
xilenos)
Aplicable a alimentos grasos y a productos con
cantidades apreciables de voltiles distintos del agua
Puede presentar problemas en muestras que sufren
descomposicin trmica
Mtodo de Dean y Stark: agua de la muestra, junto con
tolueno, destilan a T de ebullicin constante de un
azetropo a 84 C
Se recoge el destilado bifsico y se mide cantidad de
agua en tubo graduado
MTODOS INDIRECTOS
Se mide alguna propiedad fsica del producto que cambia de manera conocida
con el contenido de agua del mismo
Requieren calibracin previa
Aptitud del mtodo depende de sensibilidad y presencia de interferencias
Aplicables a alimentos con contenidos de agua del 5 al 95%
Medidas elctricas
Conductividad
Resistencia
Capacitancia
Constante dielctrica
Anlisis espectroscpicos
RMN
IR
Medidas fsicas
Densidad
Presin de vapor
ndice de refraccin
MTODOS QUE DEPENDEN DE LA REACTIVIDAD QUMICA DEL AGUA
Titulacin de Kart Fischer (1935)
Ideado para determinar pequeas cantidades de agua en solventes orgnicos
Recomendado para alimentos de bajo contenido de humedad (< 10 %, azcar
de pastelera, chocolates, melazas, legumbres secas, etc.)
Agua de la muestra se extrae con metanol y extracto se titula con una solucin
metanlica de yodo, SO
2
y piridina
Punto final se determina por cambio de color ante el primer exceso de yodo o
electromtricamente
En ausencia de interferencias (aldehdos y cetonas) la reaccin es prcticamente
estequiomtrica
Exactitud del mtodo depende de calibracin y de eficiencia con que se evita
captacin de humedad de la muestra durante el anlisis
Fundamento
El mtodo original consiste de una mezcla de I
2
en metanol a la que se le agrega
piridina y SO
2
La reaccin propuesta original ha sido corregida y se ha reemplazado la piridina por
otras sustancias bsicas menos nocivas (imidazol)
Se establece el siguiente equilibrio:
2 CH
3
OH + SO
2
CH
3
OH
2
+
+ SO
3
CH
3

que la sustancia bsica desplaza hacia la derecha:

CH
3
OH + SO
2
+ RN [RNH]
+
SO
3
CH
3

producindose la siguiente reaccin neta:

H
2
O + I
2
+ [RNH]
+
SO
3
CH
3

+ 2 RN [RNH]
+
SO
4
CH
3

+ 2 [RNH]
+
I

1 : 1
PROTENAS
Macromolculas nitrogenadas complejas de origen animal y vegetal
que representan la fuente prcticamente exclusiva de N proveniente de la dieta
Mtodos de determinacin de protenas
Extractivos: requieren de una solubilizacin previa de la protena del alimento.
Pueden requerir diferentes grados de purificacin
Mtodos qumicos
Biuret
Bradford
Lowry
Mtodos fsicos
Espectrofotometra UV
(280nm aa aromticos,190 nm uniones peptdicas)
IR
Fluorometra (se excita a 275 nmy se emite a 340 nm)
Turbidimetra (protenas insolubles, DO a 600 nm)
No extractivos: no se requiere una separacin previa de la protena del alimento
Determinacin de N
Kjeldahl (protena cruda o bruta)
Sorensen (N amnico)
Dumas
Interaccin protena-colorante (mtodo UDY)
NIR (reflectancia)
El anlisis de la composicin aminoacdica de una protena, en general, requiere
una extraccin, purificacin y posterior hidrlisis para su estudio mediante
tcnicas instrumentales tales como HPLC.
Reaccin de Biuret
Se forma un complejo entre iones Cu
2+
y uniones amida de enlaces peptdicos,
en solucin fuertemente alcalina
Violeta (500 nm)
Cada Cu
2+
quela de 4 a 6 N peptdicos, dependiendo de la protena
Reaccionan compuestos con dos grupos CO-NH ligados:
directamente (e.g., diamida de cido oxlico: H
2
NCOCONH
2
)
via N (biuret: H
2
NCONHCONH
2
)
va C (e.g., diamidas de cido malnico: H
2
NCOCH
2
CONH
2
y succnico: H
2
NCOCH
2
CH
2
CONH
2
y en productos de hidrlisis de
protenas)
2 + Cu
2+
(aq)
OH
-
Consideraciones generales mtodo de Biuret
Aminocidos libres no reaccionan
Pptidos de prolina no forman complejos con Cu
2+
(gelatina poco reactiva)
Casena y protenas miofibrilares producen color menos intenso a igual
concentracin que albminas y protenas sarcoplsmicas
Sales como tartrato y citrato aumentan la estabilidad de los reactivos utilizados
Mtodo simple y rpido
Poco sensible y especfico (interfieren tioles, DNA, sacridos y lpidos)
Varias modificaciones disponibles de acuerdo a interferencias
Interferencias
El reactivo de Folin-Ciocalteau reacciona con otros compuestos tales como:
aminocidos, tioles, sacarosa y otros sacridos, cidos grasos, aminas, agentes
quelantes (EDTA)
Mtodo de Lowry (1951)
Se forma un compuesto coloreado entre el reactivo de Folin-Ciocalteau y los
enlaces peptdicos de protenas, pptidos y aminocidos aromticos en medio
alcalino
La reaccin procede en dos etapas:
1. Reaccin Biuret: se forma el complejo con Cu
2+
que contiene al menos dos
enlaces peptdicos
2. Reduccin del cido fosfomolbdico (reactivo de Folin) en presencia del
complejo formado a un compuesto con molibdeno de color azul
Absorcin a 280 nm
La mayora de las protenas absorben a 280 nm por presencia de fenol de
tirosina e indol del triptfano
Mtodo no destructivo y no requiere reactivos
Debe tomarse en cuenta absorcin del solvente de la muestra
Interfieren compuestos con purinas y pirimidinas
Debe realizarse curva de calibracin
Mtodo de Kjeldahl (1883)
Comprende la mineralizacin de la materia orgnica de la muestra usando una
mezcla de cido sulfrico y sales a ebullicin entre 340 y 370 C. En esta digestin , el
N orgnico se convierte en sulfato de amonio. Alcalinizando la solucin resultante, se
libera amonaco que se recoge cuantitativamente mediante una destilacin por
arrastre de vapor, para luego ser determinado por titulacin.
Digestin de la muestra
(CHNO) + H
2
SO
4
+ calor + catalizador CO
2
+ SO
2
+ H
2
O + NH
4
+
Neutralizacin del digerido: liberacin de amonaco y captura del mismo
H
2
SO
4
(exceso) + NH
4
+
+ 3 NaOH NH
3 (gas)
+ 3 Na
+
+ SO
4
2-
+ 3 H
2
O
NH
3 (gas)
+ B(OH)
3
+ H
2
O NH
4
+
+ B(OH)
4
-
Titulacin del amonio
NH
4
+
+ B(OH)
4
-
+ HCl B(OH)
3
+ H
2
O
N en formas oxidadas como nitratos o nitritos y en general, N de heterociclos
aromticos no representan fuentes de error en la determinacin de amonaco
Reaccin general de oxidacin de compuestos que contienen N orgnico:
CHON
(a+b+c)
+ O
2
a NH
3
+ b HNO
3
+ c/2 N
2
Compuestos Recuperacin (%)
Nitratos, nitritos
(orgnicos e
inorgnicos)
< 1
Heterociclos
nitrogenados
aromticos (piridina,
pirimidina, tiazol,
imidazol, pirazol)
1- < 80
Azo compuestos 30-85
Hidrazinas < 50
Nombre Grupo funcional Producto de
degradacin
Fraccin
Amida
Amina
N heterognico
Imina
Isocianuro
Isooxocianato
Isotiocianato
Oxocianato
Pptido
Nitrilo
CONH
2
NH
2
N
NH
2
NC
NCO
NCS
OCN
CONH
CN
NH
3
a
Hidroxilamina
Isonitro
Nitro
Oxima
NHOH
NOOH
NO
2
NOH
HNO
3
b
Nitroso
Azo
Azino
Diazonio
Hidrazona
Hidrazina
NO
N N
NN
NN
+
NNHR
NHNH
2
N
2
c
Unidad de digestin y depurador de gases
Unidad de destilacin
Mtodo de Dumas (1826)
Combustin seca de la muestra a 900 C y en presencia de O
2
Se libera CO
2
H
2
O y N
2
Los gases pasan por una columna para separar el N
2
controlando el eluato con un
detector de conductividad trmica
Requiere calibracin con muestras de concentracin de N
2
conocida
Se usan factores para obtener el valor de protena cruda
Ventajas y desventajas
Fcil de usar y posibilidad de automatizacin
Ms rpido que el mtodo de Kjeldahl
No se utilizan reactivos txicos y corrosivos
Alto costo
Se detecta N no proteico
Se requiere un factor por protena (de acuerdo a secuencia aminoacdica)
Equipo de determinacin de N
2
por
el mtodo de Dumas con estacin
de procesamiento de datos
Mtodos basados en la interaccin protena-colorante
Colorantes conteniendo grupos sulfonicos cidos (SO
3
H) reaccionan con
grupos funcionales de protenas, especialmente bsicos (arginina, lisina e
histidina) y reducen el colorante en proporcin a la cantidad de protena
presente
La protena se liga al colorante mediante interacciones inicas, electrostticas y
de van der Waals
La reaccin es ptima en medio cido fuerte y genera complejos solubles o
insolubles
La concentracin de protena se determina midiendo A de la solucin del
colorante antes y despus de la adicin de la muestra con protena o por
separacin del complejo insoluble por centrifugacin o filtracin
Colorantes de aplicacin comn en alimentos: Amido Black 10B, Coomassie
Brilliant Blue G-250, Orange G y Acid Orange 12
Mtodo de Bradford (1976)
Colorante: Coomassie Brilliant Blue G-250
Se produce un complejo poco soluble
Protena puede precipitarse a 0C o mediante TCA
Mtodo de Udy (1971)
Colorante: Acid Orange 12
Se produce un precipitado protena-colorante
Tcnicas recomendadas para:
Protenas de leche (Mtodo AOAC 967.12)
Alimentos de bajo contenido proteico (cerveza, vino, jugos de frutas, etc.)
Ventajas y desventajas
Mtodos simples y rpidos (especialmente los de un solo paso)
Aptos para rutina
Muy sensibles y de bajo costo
El color se desarrolla en menos de 5 min y es estable
Pocas interferencias
Diferente afinidade de un colorante de acuerdo a la protena (requiere
calibracin segn tipo de protena)
LPIDOS
Grupo de biomolculas insolubles en agua y solubles en solventes orgnicos no
polares (hexano, ter etlico, cloroformo)
Triglicridos: principales componentes de grasas y aceites
Otros lpidos comunes en alimentos: fosfolpidos, esteroles, tocoferoles,
carotenoides
MTODOS PARA DETERMINACIN DE GRASA TOTAL O BRUTA
Mtodo de extraccin de Soxhlet (1939)
Extraccin semicontinua con solventes no polares como ter etlico o hexano
Extrae con eficiencia lpidos no polares
Poca eficiencia para fosfo y glicolpidos
Condensador de bolas
Unidad de extraccin
Sifn
Solvente
Manta calefactora
Cartucho con muestra
EQUIPO DE EXTRACCIN SOXHLET
Batera de extractores Soxhlet
Mtodo de Goldfish: extraccin continua
Para extraer lpidos polares deben usarse otros solventes. Debe tenerse en cuenta el
contenido de agua de la muestra
Mtodo de Folch
1 g de muestra se extrae con 20 mL de una mezcla cloroformo:metanol, 2:1
El agua de la muestra representa el tercer solvente de la mezcla monofsica
Se agrega agua o solucin salina
Se obtienen en el equilibrio dos fases: inferior contiene lpidos
Mtodo de Bligh y Dyer
Desarrollado para pescado. Aplicable a numerosos tejidos animales y vegetales
Usa cloroformo:metanol:agua endgena, 1:2:0,8
Se agrega cloroformo: agua, 1:1 (monofase)
Se obtienen en el equilibrio dos fases: inferior contiene lpidos
CARBOHIDRATOS
Polihidroxialdehdos o polihIdroxicetonas en forma de monmeros, dmeros,
oligmeros y polmeros de distinta complejidad estructural
Mtodos para carbohidratos totales
Mtodo fenol-sulfrico (Dubois, 1956)
Azcares en presencia de cidos fuertes y T se deshidtaran dando derivados
del furano que condensan con el fenol para dar productos coloreados
Mtodo fcil, rpido y eficaz
Pueden determinarse todos los carbohidratos simples, oligo y polisacridos
(hidrolizan dando monosacridos)
La reaccin no es estequiomtrica y depende de estructura del azcar
Debe realizarse curva patrn
Anlisis de Almidn
Extraccin del almidn
Agua caliente: extrae la mayor parte de amilosa y dextrinas
CaCl
2
: para almidn de cereales
HClO
4
: se extrae almidn de muestra seca y se precipita como complejo de
yodo. Luego se hidroliza y analiza la glucosa liberada
Etanol y HClO4: extraccin de azcares libres con etanol acuoso y luego
almidn con HClO4
DMSO: almidn se dispersa en este solvente y se convierte cuantitativamente
en D-glucosa con -amilasa termoestable y glucoamilasa
Cuantificacin del almidn
Hidrlisis directa con H
2
SO
4
0,2 M durante 4 h en reflujo
Protenas y cidos grasos interfieren al dar productos de condensacin
Reaccin con yodo: amilosa forma un complejo de inlcusin
ANLISIS DE AZCARES TOTALES EN SOLUCIN
Medicin del ndice de refraccin
Vara con naturaleza del compuesto, T, long de onda de la luz y concentracin
del compuesto
Se determinan slidos totales en solucin
Para obtener la concentracin de azcar, los valores deben corregirse
Distintos mtodos basados en poder reductor (ej. Fehling)
Ley de Snell: n
1
sen
1
= n
2
sen
2
n
1
: ndice de refraccin del primer medio
1
: ngulo de incidencia
n
2
: ndice de refraccin del segundo medio
2
: ngulo de refraccin
Refractmetro de Abbe
con sistema de control de T
Refractmetro
manual
FIBRA ALIMENTARIA
Fraccin del alimento que no es digerido por las enzimas del tracto digestivo
humano
Determinacin de Fibra Cruda
(harinas, AOAC 920.86 y forrajes AOAC 962.09)
Digestiones sucesivas de la muestra con cido diluido y base en ebullicin
Correccin final por cenizas
Se pierde la fraccin soluble en su totalidad
Se pierden cantidades variables de la fraccin insoluble
Se determinan parcialmente lignina y celulosa
Valores obtenidos representan 10-40% y 50-90%, respectivamente, de valores
verdaderos
Determinacin de Fibra Alimentaria Total (FAT)
(Mtodo enzimtico-gravimtrico, AOAC 985.29, Prosky y col., 1988)
Digestiones enzimticas secuenciales de la muestra (solubilizan almidn y
protenas)
Precipitacin de la Fibra Alimentaria Soluble (FAS) con etanol 95% y filtracin
Residuo (celulosa, hemicelulosas, lignina y pectinas)
Se realizan correcciones por protenas residuales y cenizas
Para determinar Fibra alimentaria Insoluble (FAI) y FAS se filtra digerido antes de
agregar etanol
Residuo: FAI
Filtrado: se obtiene FAS por adicin de etanol
-amilasa (pH 6.0, 30 min, 100 C)
proteasa (pH 7.5, 30 min, 60 C)
amiloglucosidasa (pH 4.5, 30 min, 60 C)
Lavado con etanol y
acetona
Secado a 105 C
Pesado
Correccin de blanco,
cenizas y protenas
Precipitacin con etanol
95 %
Filtracin sobre Celite
Pesado del residuo
Correccin de blanco,
cenizas y protenas
%FAT
Residuo Sobrenadante
Precipitacin con etanol 95 %
Filtracin sobre Celite
Filtracin sobre Celite
Lavado con etanol y acetona
Secado a 105 C
Pesado
Correccin de blanco, cenizas
y protenas
MUESTRA
FAT = FAI + FAS
Residuo Sobrenadante
Consideraciones del mtodo enzimtico-gravimtrico
Tratamientos enzimticos a temperaturas muy diferentes de las fisiolgicas
Valores corresponden a alimentos secados, molidos y hervidos
En la prctica no se consigue eliminar almidn completamente (altera FAI)
Etanol pueden co-precipitar otros componentes del alimento
Componentes de la fraccin de FAS no precipitan
Correcciones de cenizas y protena poco significativas
Mtodo ptimo para cereales y alimentos ricos en almidn