Toxicologia

Toxicologia
in vitro
in vitro
:
:
Principais modelos utilizados
Principais modelos utilizados
Alexandre Bella Cruz
Rilton Alves de Freitas

Objetivo
Conhecer Mtodos para Avaliao de Genotoxicidade
Contedo
Introduo
Testes
- Micro-organismos
- Eletroforese para clula nica em gel !"CGE#
$Teste do Cometa%
- Microncleo
Toxicologia
Toxicologia
in vitro
in vitro
:
:
Principais modelos utilizados
Principais modelos utilizados

&ualidade M' (
- Efic)cia
- "egurana
- &ualidade final

&ualidade M' (
- Efic)cia
Comprovao de ensaios farmacol*gicos
pr-cl+nicos e cl+nicos
- "egurana
Ensaios ,ue comprovem aus-ncia
de efeitos t*xicos
- Aus-ncia de contaminantes
Metais pesados. Agrot*xicos. 'rodutos de degradao.
Micro-organismos e meta/*litos. etc0

&ualidade M' (
- Efic)cia
Comprovao de ensaios farmacol*gicos
pr-cl+nicos e cl+nicos
- "egurana
Ensaios ,ue comprovem aus-ncia
de efeitos t*xicos
- Aus-ncia de contaminantes
Metais pesados. Agrot*xicos. 'rodutos de degradao.
Micro-organismos e meta/*litos. etc0
n ensaios toxicolgicos GENOTOXICIDADE
n ensaios toxicolgicos GENOTOXICIDADE

Testes de produtos farmac-uticos para a toxicidade gentica
1nio Europeia !2345#
6apo !2343#
E1A !2337#

Testes de produtos farmac-uticos para a toxicidade gentica
8esoluo 8E n039 !2:;97;<99=#
>Guia para a reali?ao de estudos de
toxicidade pr-cl+nica de fitoter)picos>

Toxicidade aguda.

Toxicidade de doses repetidas !longa durao#.

Estudo especial - Genotoxicidade

Testes de produtos farmac-uticos para a toxicidade gentica
>Guia para a reali?ao de estudos de
toxicidade pr-cl+nica de fitoter)picos>

Estudo especial - Genotoxicidade

2 - Genotoxicidade@ Avaliao in vitro da reverso de mutao
em /actrias incluindo ativao meta/*lica ou de dano a
cromossomas de clulas de mam+feros ou de linfoma de
camundongo0
< - Avaliao in vivo do dano em cromossoma em clulas
hematopoiticas de roedores !teste de microncleo#0

8elao@
Agentes genotxicos X eeitos nocivos ! sade
- incid-ncia de cAnceres
- pro/lemas reprodutivos
Ocupacional" la/orat*rios ,u+micos. cl+nicos. toxicol*gicos e
indstrias em geral
Agentes #u$%icos" medicamentos. inseticidas. fungicidas.
her/icidas. fertili?antes e outros produtos

DNA
6ames B0 Catson D Erancis CricF !23G7#
Ho uma molcula est)vel
'ara $garantir% integridade
"istemas de reparo
"istemas de tolerAncia

DNA
IesJes !Kumanos#
'rocessos degenerativos
!envelhecimento. cAncer#

Deini&'es
Deini&'es
Genotoxicidade"
L estudo dos efeitos adversos de agentes f+sicos e ,u+micos no
material gentico de clulas !BHA ou cromossomos# e a
su/se,uente expresso de tais mudanas0
(utagenicidade"
Mudana ou dano g-nico ou ini/io ou dano do mecanismo de
reparo ao BHA resultando em uma clula alterada0

Deini&'es
Deini&'es
(uta&)o"
'rocesso pelo ,ual um gene sofre mudana estrutural
Indica mudana fenot+pica resultante de um gene mutado
L termo mutante usado para designar um indiv+duo ,ue
expressa a alterao do gen*tipo resultante de mutao

Deini&'es
Deini&'es
(uta&)o"
M uma mudana na se,u-ncia do BHA. ,ue leva a uma alterao
herd)vel da funo g-nica
Ls agentes ,ue mudam a se,u-ncia do BHA so $t*xicos% para
o gene e so. ento. chamados de $genotxicos%

Genotoxicidade no uma medida de carcinogenicidade
Indicador para o cAncer
Testes de mutagenicidade medem um evento inicial ou
intermedi)rio da tumorig-nese
Alta associa&)o
Testes de genotoxicidade N Carcinogenicidade
'or isso so utili?ados avaliao do espectro toxicol*gico

*ida
DNA
+alte,a&'es-
E,,os du,ante duplica&)o
Todos se,es vivos (uta&)o
Evolu&)o e dive,sidade das esp.cies

Agentes %utag/nicos
Alterao da se,O-ncia das /ases !BHA#
Acele,a ou au%enta %uta&'es
Neoplasias
!cAncer#

Testes de genotoxicidade
- Biversas metodologias
- Importante pes,uisa para avaliao da toxicidade celular
- Identificar potencial carcinog-nico e a mutagenicidade
- 'roteger o material gentico humano

Genotoxicidade - 0iste%a expe,i%ental +1 N$veis-"
2,i%ei,o n$vel" englo/a ensaios moleculares e em /actrias
!mutao em gene /acteriano#
0egundo" provas in vitro em clulas de cultivo
!a/erraJes cromossPmicas#
Te,cei,o" compreende an)lises in vivo
!mutao g-nica em clulas de mam+feros#
3ua,to" corresponde a estudos em populaJes expostas

Genotoxicidade - 0iste%a expe,i%ental +1 N$veis-"
Lutras tcnicas@
- coeficiente BHA;prote+na
- atividade das en?imas mitocondriais
- proliferao celular
- +ndices mit*ticos
- identificao de danos
- ,ue/ras e reparos no BHA
- a/erraJes cromossPmicas
- no disQunJes
- a deteco de apoptose e necrose

"istema de avaliao de novos agentes ,u+micos@
Testes de Genotoxicidade R
"istema apropriado e protocolo@
Em construo
Testes
- Micro-organismos
- Eletroforese para clula nica em gel !"CGE#
$Teste do Cometa%
- Microncleo

(utagenicidade
Teste de A%es
Sruce Ames. 2359
Cepas !estirpes# Salmonella typhimurium
Mede a induo de mutaJes reversas em cepas auxotr*ficas
!His-# para o amino)cido histidina ,ue revertem as mesmas T
prototrofia !His+# !selvagem#0

Teste de A%es
4esultados de u% teste sob,e as bact.,ias t/% algu% signiicado
4esultados de u% teste sob,e as bact.,ias t/% algu% signiicado
na detec&)o de agentes txicos pa,a os 5u%anos6
na detec&)o de agentes txicos pa,a os 5u%anos6
20 A nature?a gentica e ,u+mica do BHA id-ntica em todos os
organismos
<0 Ames e Cola/oradores desenvolveram uma forma de simular o
meta/olismo humano no sistema /acteriano0

Teste de A%es
Mam+feros maior parte do processamento de produtos
,u+micos ocorre no f+gado !onde so decompostos#
Em alguns casos. a ao de en?imas do f+gado pode criar um
composto t*xico ou mutag-nico de uma su/stAncia ,ue no era
originalmente perigosa0
Ames incorporou en?imas do f+gado de mam+fero !rato# em seu
sistema de teste de /actrias0

Teste de A%es
8eali?ado em presena e aus-ncia de sistema de meta/oli?ao
ex*geno !mistura S9#
'ermite monitorar@
- ao direta so/re o material gentico
- atividade positiva ou negativa meta/*litos /iotransformao
"emelhante o ,ue ocorreria nos f+gados de mam+feros0

Culturas auxotrficas (exigncia nutricional)

Teste de A%es
Eundamenta-se na restaurao ou compensao de um defeito
gentico espec+fico ,ue causa exig-ncia a um determinado
nutriente0
A fre,u-ncia de mutao reversa facilmente medida pela
contagem do nmero de colPnias ,ue crescem em meio
m+nimo ap*s exposio de uma populao a um agente
mutag-nico0

Teste de A%es - 2,ocedi%ento

Teste de A%es - 2,ocedi%ento

Teste de A%es - 7ndice de (utagenicidade

IM U 2.9 !indica no houve induo de revertentes#
IM entre V9.: e 9.5 !pode ser indicativo de toxicidade#
IM W 2.9 !pode indicar induo de revertentes#
IM X <.9 !su/stAncia considerada mutag-nica#
Eonte@ Invitox. <99=Y Sorgo. 8osa. Zargas. <99=Y 6a[apraFasha. Hegi. 6ena. <99:
n0 revertentes indu?idos
n0 revertentes espontAneos
IM U
Teste de A%es - 7ndice de (utagenicidade

(utagenicidade
Teste alte,nativo" Sacchamomyces cerevisiae
Ievedura !fungo unicelular# - Eucorioto
Eerramenta importante em pes,uisas
- mutagenicidade
- reparo de BHA
- mecanismos estresse oxidativo
Complementam os ensaios reali?ados em /actrias

Teste de %utagenicidade e% Saccharomyces cerevisiae
!NZ-24G-2=c#

Dano gen.tico
Ensaio Co%eta +Single CeII GeI Electrophoresis - 0CGE-
8[d/erg D 6ohanson@
3uantiica&)o danos DNA e% c.lulas e% aga,ose
- no detecta mutaJes
- detecta lesJes genPmicas mutao
- IesJes genPmicas so pass+vel de correo 0\0
estudo de reparo do BHA

Ensaio Co%eta +Single CeII GeI Electrophoresis - 0CGE-
8[d/erg D 6ohanson@
3uantiica&)o danos DNA e% c.lulas e% aga,ose
Banos BHA so clula e tecido-espec+ficos 0\0
'ermite deteco danos e reparo em uma nica clula
8elevante para avaliao de compostos genot*xicos0

Co%eta - *ias de ,epa,o DNA
- reverso da leso
- reparo por exciso
- reparo recom/inacional
- tolerAncia a lesJes
Atuam em conQunto garantir a manuteno gentica
!so/reviv-ncia dos organismos#

Ensaio Co%eta +Single CeII GeI Electrophoresis - 0CGE-
'rocedimento
2- Clulas em/e/idas em gel de agarose !lAminas#
<- Iisar so/ condiJes alcalinas !ou neutras#
7- Eletroforese
=- "egmentos BHA livres migram fora do ncleo
G- L/servao microsc*pica
:- Classificao das clulas em classes !9-=#

Teste co%eta co% v8,ios g,aus de dano ao DNA"
A - clula sem dano
S - clula com leves danos
C - clula danificada ou cl)ssico cometa
B - clula altamente danificada
Eonte@ Ie/aill[ et al0 Lccup Environ Med. :9@ 329-325. <9970

Ensaio Co%eta +Single CeII GeI Electrophoresis - 0CGE-
Tipo de dano detectado
Eonte@ 6un,ueira. A0'0E0. <99:

Ensaio Co%eta +Single CeII GeI Electrophoresis - 0CGE-
CondiJes de ensaio

Teste do (ic,oncleo
Ensaio in vivo para a deteco de agentes
- clastog-nicos
!,ue/ram cromossomos#Y
- aneug-nicos
!indu?em aneuploidia ou segregao cromossPmica anormal#
Teste desenvolvido em eritr*citos de medula *ssea
!camundongos. ratos#

Teste do (ic,oncleo
'rocedimento
2- Camundongos Qovens machos !=-G semanas#
Grupos 29
Controle positivo@ ciclofosfamida G9 mg;Fg
Controle negativo
Teste
Bieta. Temp0 1midade. Ciclo de lu?
<- Administrao su/stAncia !2< - 79 h#
7- "acrificio !medula *ssea f-mur. lava. centrifuga 2999 rpm ; G min0#
=- "edimento !duas lAminas. seca am/iente#

Teste do (ic,oncleo
'rocedimento
G- Colorao Ieishmann
:- Microscopia de fluorec-ncia
5- Contagem dos eritro/lastos policrom)ticos com microncleo
em relao ao total !m+nimo 2999 E';lAmina#
'ode ser corado com Giemsa ou fluoresce+na

Teste (ic,oncleo

Teste de ca,cinogenicidade
in vivo Empregando roedores
in vitro Transformao celular SAIS;C7T7 !LEBC#]