Pode ser utilizada isoladamente ou em conjunto com outras tecnicas instrumentais

de analise, vem tendo destaque devido a facilidade em efetuar a separao,

identificao e quantificao de espcies qumicas.
Trata-se de um mtodo fsico-qumico e fundamenta-se no deslocamento
diferencial dos componentes de uma mistura, devido a diferentes interaes entre
duas fases imiscveis (fase mvel e estacion!ria".
#tiliza colunas fec$adas que cont%m partculas muito finas que proporcionam
separaes muito eficientes, so utilizadas altas presses para forar a passa&em
do solvente e assim diminuir o tempo da an!lise.
2.2 Tipos de Cromatografia
' classificao dos mtodos cromato&r!ficos pode ser quanto ao
mecanismo de separao, quanto a tcnica empre&ada e em relao ao tipo de
fase utilizada. (o entanto, a classificao mais popular a que leva em
considerao o tipo de superfcie na qual ocorre a separao, sendo dividida em
cromato&rafia em coluna e cromato&rafia planar.
)romato&rafia
Planar )oluna
)l!ssica
*ludo
+upercrtico
)amada
del&ada
Papel
,quida
-asosa
HPLC
3.2 Diferenas entre a HPLC e a cromatografia lquida clssica (CLC
' cromato&rafia lquida cl!ssica utiliza-se de um equipamento .arato no
qual o empacotamento da coluna descartado, pois parte da amostra pode se
adsorver de forma irreversvel/ a coluna deve ser c$eia a cada separao
acarretando desperdcio de material e de mo-de-o.ra/ o analista deve ser
e0periente/ a eluio feita pela ao da &ravidade tornando o processo
demorado/ a quantificao e deteco so feitas pela an!lise manual das fraes
individuais, o que requer muito tempo devido ao &rande n1mero de fraes
coletadas, tam.m pode ser usada al&uma tcnica que au0ilie neste processo,
como, espectrofotometria, an!lise qumica ou re&istro &ravimtrico e os resultados
so re&istrados em forma de cromato&rama, um &r!fico da concentrao da
amostra versus o n1mero da frao.
2tapas da cromato&rafia lquida cl!ssica
(a cromato&rafia lquida de alta efici%ncia a coluna fec$ada, podendo
ser utilizada in1meras vezes/ as colunas utilizadas so .astante eficientes, mas
oferecem resist%ncia 3 vazo da fase mvel necessitando aplicao de sistemas
de .om.as de alta presso, isso faz com que a velocidade da eluio aumente. 's
an!lises so mais precisas, pois a vazo da fase mvel facilmente controlada. '
injeo feita com microsserin&as ou atravs de v!lvulas de injeo e diversos
tipos de detectores podem ser utilizados. 2ste mtodo no necessita tanta
e0peri%ncia do operador/ tem alta resoluo, sensi.ilidade e reproduti.ilidade, mas
dispe de equipamentos caros e de alto custo de manuteno e operao.
Preparao de
coluna
'plicao de
'mostra
2luio 4eteco e
5uantificao
2vaporar para
pesa&em
'n!lise 5umica
2spectrofoto-
mtrica
2tc
2tapas da cromato&rafia lquida de alta efici%ncia
3.3 Compara!o da CL"# com a cromatografia gasosa (C$
(a cromato&rafia &asosa as amostras devem ser vol!teis, para que
possam passar pela coluna na forma de vapor, e termicamente est!veis, a fim de
que no se decompon$am nas condies da separao. ' amostra no deve
intera&ir com a fase mvel, por este motivo que a fase mvel um &!s inerte
tendo como funo somente carre&ar a amostra volatilizada. (este mtodo os
equipamentos so mais .aratos e o tempo de an!lise reduzido.
(a 6P,) as amostras no precisam ser vol!teis nem termicamente est!veis,
.asta que sejam sol1veis na fase mvel, por isso tem uma maior aplicao. '
amostra intera&e com as duas fases enquanto que na )- a amostra s intera&e
com a fase estacion!ria. 2ste mtodo possui maior versatilidade, pois pode
ocorrer a variao tanto na fase mvel como na fase estacion!ria, o que ocorre
no na )-, pois a fase mvel sempre um &!s inerte.
%antagens e des&antagens
O PROCESSO CROMATOGRFICO
O processo cromatogrfico consiste na partio dos componentes de uma mistura entre a
fase mvel e a fase estacionria. No caso da cromatografia gasosa o fluido um gs e na
cromatografia luida o fluido um solvente. Na cromatografia luida a fase estacionria
constituda de partculas slidas empacotadas em uma coluna! a ual atravessada pela fase
mvel. "o as foras fsicas e umicas ue atuam entre os solutos e as duas fases so
responsveis pela reteno dos solutos so#re a coluna cromatogrfica. $ diferena na
magnitude dessas foras ue determina a resoluo e portanto a separao dos solutos
individuais.
$s foras elementares ue agem so#re as molculas so de cinco tipos%
&' (oras de disperso de London ou (oras de )an der *aals+
,' -ntera.es de dipolo indu/ido+
0' Liga.es de 1idrog2nio+
3' -ntera.es dieltricas+
4' -ntera.es eletrostticas e coulom#ianas.
3.' (ases
3.'.) (ases *+&eis ((*
Para que um solvente possa ser utilizado como fase mvel na 6P,) este
deve apresentar alto &rau de pureza ou ser de f!cil purificao/ deve dissolver a
fase mvel sem decompor seus componentes, para que estes sejam
transportados pela coluna sem que $aja modificao/ no deve dissolver a fase
estacion!ria/ deve ser compatvel com o detector/ no ser t0ico e deve ter .ai0a
viscosidade, pois isso ir! interferir diretamente na efici%ncia da separao, devido
ao fato de solventes viscosos alm de dificultarem a transfer%ncia de massa entre
a fase mvel e a fase estacion!ria, tam.m influenciarem na intensidade da
vazo.
#ma fase mvel adequada indispens!vel para a 6P,), por isso
necess!rio e0aminar fatores que determinam sua escol$a, como a polaridade
desta, que determina seu poder de eluio juntamente com a polaridade da fase
estacion!ria e com a natureza dos componentes da amostra. +e a separao for
com fase normal, o poder de eluio aumenta com o aumento da polaridade, se a
separao for em fase reversa, o poder de eluio diminui com o aumento da
polaridade. 7utros fatores que tam.m devem ser considerados so o ponto de
e.ulio, a viscosidade, a compati.ilidade com o detector e a to0idez.
3.'.2 (ases #stacionrias ((#
4evem ter alta resoluo entre os componentes da amostra, devem ser de
f!cil introduo na coluna, ter di8metro uniforme, partculas porosas ou peliculares
e serem slidos r&idos, semi-r&idos ou no r&idos.
's partculas da fase estacion!rias podem ser classificadas quanto ao
seu taman$o em9
- macropartculas, quando apresentam di8metro entre :; e <;=m/
- intermedi!rias, quando tem entre :; e >;=m/
- micropartculas, de ? a >;=m
5uanto menor for a partcula, maior ser! a efici%ncia da separao, mel$orando
assim o processo de difuso das molculas da amostra dentro e fora das
partculas, pois partculas menores reduzem a dist8ncia de contato do soluto com
as fases estacion!ria e mvel, facilitando o equil.rio e, consequentemente,
mel$orando a efici%ncia da coluna. 2las podem ser de formato esfrico, tam.m
c$amado de re&ular, e de formato irre&ular, sendo que as re&ulares so mais
eficientes por oferecerem um enc$imento mais uniforme e mais reprodutvel da
coluna e por esse motivo so mais caras.
4e acordo com a natureza das fases mvel e estacion!ria pode-se
classificar o processo como9 cromato&rafia em fase normal e cromato&rafia em
fase reversa.
Cromatografia em fase normal, a fase estacion!ria utilizada polar e a
fase mvel apolar, em relao 3 eluio, os solutos mais apolares so eludos
primeiramente, enquanto que os polares so retidos pela fase estacion!ria e so
eludos depois.
Cromatografia com fase re&ersa ((-, a fase estacion!ria apolar e a
fase mvel polar, portanto os compostos polares so eludos primeiro e os mais
apolares eludos posteriormente.
+endo o material mais utilizado como empacotamento de colunas a slica,
que consiste principalmente em di0ido de silcio (+i7
:
" com o !tomo de silcio no
centro de um tetraedro, sendo a val%ncia remanescente na superfcie ocupada por
uma $idro0ila (-76". 2sta no deve ser utilizada em p6 acima de @,;, pois isso
acarretaria sua dissoluo, ento, para a cromato&rafia de compostos .!sicos
com p6 entre @,; e >:,; recomenda-se o uso de compostos polimricos como
poliestireno (o poliestireno e0pandido o isopor", li&ado covalentemente a fase
estacion!ria.
2strutura esquem!tica da slica &el.
' slica sozin$a pode ser usada como fase estacion!ria para a cromato&rafia de
adsoro, j! para sua utilizao na cromato&rafia de partio esta deve estar
quimicamente li&ada, na qual dependendo do radical A esta pode ser utilizada
como fase normal ou fase reversa. ' fase estacion!ria de octadecil ()
>@
" a mais
utilizada na cromato&rafia lquida de alta efici%ncia, sendo representada por 74+
(octadecilsilano".
)omo fase estacion!ria, alm da slica, podem ser utilizados slidos semi-
ri&dos, que &eralmente, so constitudas de partculas porosas de poliestireno
entrecruzado com divinil.enzeno. 2stes podem ser usados em 6P,) por e0cluso
com fase mvel or&8nica e ainda so muito utilizados na cromato&rafia por troca
iBnica.
(a cromato&rafia lquido-slido pode ser utilizada a alumina, alm da
slica, podendo esta tam.m ser utilizada na cromato&rafia lquido-lquido, assim
como o vidro de porosidade controlada, car.ono &rafitizado, tit8nia, zircBnia e
slica reco.erta com zircBnio.
3.. *ecanismos da HPLC
3...) Lquido/lquido ou parti!o
' cromato&rafia lquido-lquido ou partio foi desenvolvida por Cartin e +Dn&e,
em >E<> com a finalidade de o.ter a separao de 'CF(7G)F47+ , utilizando
como fase estacion!ria !&ua em slica e como fase mvel clorofrmio.
7 mtodo consiste de uma fase lquida (estacion!ria" que por adsoro fsica
retida na superfcie da coluna empacotada &eralmente com slica e de uma fase
mvel, tam.m lquida, que passa so.re esta fase estacion!ria sendo uma destas
polares e a outra apolar. 2sse mecanismo de separao .aseia-se nas diferentes
solu.ilidades que apresentam os componentes da amostra da fase mvel e
estacion!ria. 7s componentes da amostra que so mais sol1veis na fase mvel
so eluidos primeiro enquanto os que t%m maior afinidade com a fase estacion!ria
so seletivamente retidos por ela.
Des&antagem da CLL, 7 inconveniente desta tcnica a solu.ilidade da fase
estacionaria e mvel que pode acarretar a deteriorao da coluna, levando a no
reproduti.ilidade nas separaes repetidas. Pode ser resolvido de duas maneiras9
>H +aturando a fase mvel com a fase estacionaria por meio de uma pr-coluna,
colocada antes do injetor que ten$a uma alta percenta&em de fase estacionaria. :H
#tilizado materiais que conten$am a fase estacionaria quimicamente li&ada a um
suporte solido.
3...2 Cromatografia Lquida com (ase Ligada
' fase estacionaria para cromato&rafia liquida com fase li&ada sur&iu como
resposta aos pro.lemas com ),,. )omo a fase estacion!ria quimicamente
li&ada 3 superfcie do suporte, no $! mais solu.ilidade da fase estacion!ria na
fase mvel. 7 mecanismo principal desta tcnica .aseia-se na partio.
)omo esta fase estacion!ria apresenta influ%ncia de &rupos ativos (polares" da
superfcie (isto , tam.m ocorre o mecanismo de adsoro". Iariando a natureza
dos &rupos funcionais da fase estacion!ria possvel o.ter diferentes tipos de
seletividade. 2stes &rupos podem ser polares, como o &rupo amino (-(6:" e o
&rupo nitrilo (-)(", que funcionam similarmente 3s fases polares da ),+, sendo
c$amados de fase normal. 2 $! os de natureza apolar, como os &rupos octil (-
)@6>J", octadecil (-)>@6?J", fenil (-)K6L", que so c$amados de fase reversa.
3...3 Lquido/s+lido ou a0sor!o
' forma mais cl!ssica da cromato&rafia lquida e devido a recentes adaptaes
tornou-se o mais importante mem.ro dos mtodos de 6P,). 7 mecanismo de
separao se .aseia na competio que e0iste entre molculas da amostra e as
da fase mvel em ocupar os stios ativos na superfcie de um slido (fase
estacion!ria".
7 equil.rio esta.elecido 9


Para que a molcula do soluto possa ser adsorvida na fase estacion!ria, primeiro
uma molcula da fase mvel deve ser deslocada da superfcie. +e assumir que o
adsorvente possui uma superfcie polar (por e0emplo9 slica ou alumina", &rupos
apolares (por e0./ $idrocar.onetos" tero pouca afinidade por essa superfcie e
no iro deslocar a molcula da fase mvel/ por isso, no sero retidos. -rupos
funcionais polares capazes de formar pontes de $idro&%nio tero fortes afinidades
pela superfcie e sero fortemente retidos.
3...' Cromatografia por troca i1nica
' )romato&rafia por troca iBnica um mtodo de a.soro que .aseia-se na
interao eletrost!tica entre o soluto e a fase estacion!ria, .uscando o equil.rio
de troca entre ons em soluo e ons de mesmo sinal na superfcie de um slido
que deve ser insol1vel e de alto peso molecular. ' amostra a ser separada
&eralmente uma soluo aquosa contendo ons or&8nicos e inor&8nicos.
-eralmente os compostos que so separados por este mtodo so !cidos
car.o0licos, .ases or&8nicas, peptdeos e amino!cidos, que podem se ionizar em
solues com p6 devidamente tamponado, .em como 8nions inor&8nicos e
c!tions met!licos ou comple0os.
3.... Cromatografia por e2clus!o
-eralmente utilizada na separao de componentes de alto peso molecular, a
cromato&rafia por e0cluso ()2" .aseia-se na separao de acordo com o
taman$o efetivo das molculas. 2ste mtodo su.dividido em cromato&rafia por
filtrao em &el (-*)" e cromato&rafia com permeao em &el (-P)". ' -*)
utilizada na separao de espcies sol1veis !&ua (polares" sendo a fase
estacion!ria $idroflica, na -*) os solventes utilizados so or&8nicos apolares e
fases estacion!rias $idrof.icas, o que torna o mtodo complementar sendo que
podem ser analisadas su.st8ncias polares e apolares.
3uanto 4 rigide5 e2istem tr6s tipos de materiais,
'" (no r&idos", constitudos de &is de polide0trano (+ep$ade0", poliacrilamidas
(Mio--el P " e polia&aroses (+ep$arose e Mio -el '", usados quase sempre com
fases mveis aquosas.
M" semi-r&idos que normalmente resistem a presses da ordem de >;; a >L;
.ars. 2stes materiais so constitudos de microesferas de al&um copolmero,
como o poliestireno-divinil.enzeno. Podem ser empre&ados com fases mveis
aquosas ou no aquosas e e0istem em uma &rande variedade de porosidade.
)" materiais r&idos que resistem a qualquer presso e so &eralmente
constitudos de partculas de slica porosa ou de vidro poroso. 4evido a sua ri&idez
podem-se o.ter separaes muito r!pidas com flu0o de fase mvel muito alto, o
que produz presses elevadas
#quipamentos
$s principais caractersticas ue devem ser levadas em considerao na escol1a de um
euipamento para CL$5 so%
a' )ersatilidade% o euipamento deve resolver amostras de diferentes tipos! servir a distintas
tcnicas cromatogrficas e reali/ar o m6imo de opera.es! tais como! gradiente de fase
mvel! coleta das fra.es! reciclagem de fra.es! etc.! necessrias 7s anlises sofisticadas.
#' 8apide/% Para se conseguir anlises rpidas! deve9se o#ter as mel1ores condi.es de
CL$5! isto ! fase mvel de #ai6a viscosidade! #om#a de alta presso e colunas com
partculas de peueno di:metro ;grande rea de superfcie! ue a<uda os processos de
separao'.
c' 8eproduti#ilidade e 5sta#ilidade% caractersticas essenciais para o#ter do euipamento
um #om funcionamento em longo pra/o. O euipamento deve ter controle adeuado so#re
os par:metros de operao! como va/o! temperatura! presso e composio da fase mvel.
d' "ensi#ilidade% =m #om euipamento! mesmo tra#al1ando com peuenas uantidades de
amostra! deve gerar sinais de intensidade aprecivel.