Producción de Bioetanol A Partir de Residuos de Piña

Produccin de bioetanol a partir
de residuos agroindustriales de pia

(Ananas comosus) va fermentacin
utilizando Saccharomyces cerevisiae
y Zymomonas mobilis
1
Defensa Oral del Trabajo Final de Graduacin
Justificacin: Exportacin de pia
2
121
430
573
663
717
774
818
0
100
200
300
400
500
600
700
800
900
2000 2006 2009 2010 2011 2012 2013
M
o
n
t
o

e
x
p
o
r
t
a
d
o

(
M
i
l
l
o
n
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s

d
e

d
l
a
r
e
s
)

Figura 1. Exportaciones de pia en los ltimos aos
Fuente: Procomer, 2014
Comercializacin de pia
3
15% - 26% Pia no apta para exportacin
Generacin de residuos
4
Comercializacin nacional
345 140,5 Ton
69 028,1 Ton
40 65%
del peso
original de la
fruta
Hasta 80%
del peso
original de la
fruta
Residuos de pia
5
Residuos agroindustriales
Impacto ambiental
Productos con valor agregado
Reglamento de Biocombustibles
Objetivo General
Comparar la produccin de bioetanol a
partir de residuos agroindustriales de pia
(Ananas comosus) va fermentacin,
utilizando Saccharomyces cerevisiae y
Zymomonas mobilis.
6
Objetivo Especficos
7
Evaluar la produccin de bioetanol a partir del jugo de los
residuos agroindustriales de pia utilizando Saccharomyces
cerevisiae y Zymomonas mobilis en bioreactores con un volumen
de trabajo de 5,0 L.

Evaluar el uso de un preparado enzimtico comercial,
variando la concentracin y el tiempo de tratamiento, con el
fin de aumentar el contenido de azcares fermentables en el
sustrato.
Realizar la caracterizacin fisicoqumica de los residuos
agroindustriales de una empresa procesadora de pia para
evaluar si existe diferencia entre varios lotes.
Materiales y mtodos
8
Cscaras de pia
(Ananas comosus)
Produccin de
trocitos
congelados
Cantidades
variables de
pulpa adherida
Jugo: Molienda y
prensado
Ubicacin del proyecto
9
Centro de Investigaciones en
Productos Naturales (CIPRONA)
Centro Nacional de Ciencia y Tecnologa
de Alimentos (CITA)
Centro Nacional de Innovaciones
Biotecnolgicas (CENIBiot)
Presentacin datos
10
Conclusiones Resultados
Materiales y
mtodos

Para cada objetivo especfico

Objetivo Especfico 1.

Caracterizacin de materia
prima
11
Objetivo 1. Anlisis aplicados
Contenido de humedad
Concentracin de azcares fermentables
Contenido de slidos solubles
Contenido de cenizas
Acidez titulable
pH
12
Los anlisis se llevaron a cabo por triplicado a tres lotes
distintos de materia prima
Anlisis estadstico
Anlisis de varianza
Prueba de Tukey
Promedio con
intervalo de
confianza
Objetivo 1. Anlisis aplicados
Contenido de lignina
Contenido de celulosa
Contenido de hemicelulosa
13
Los anlisis se llevaron a cabo por triplicado
a dos lotes distintos de materia prima
Anlisis estadstico
Anlisis de varianza
Prueba de Tukey
Promedio con
intervalo de
confianza

Fibra insoluble
Objetivo 1. Resultados
14
Anlisis
Lote
1 2 3
Contenido de humedad (%) 87,4 0,4
a
86,2 0,4
b
85,2 0,2
c

Concentracin de azcares fermentables (g/L)
3,4
112 12
b
134 10
a
91 12
c

Contenido de slidos solubles (Brix)
4
10,9 0,2
b
11,9 0,2
a
10,2 0,6
c

Acidez titulable (g de cido ctrico / 100 mL)
4
0,20 0,02
a
0,13 0,02
b
0,14 0,02
b

pH 3,74 0,02
c
4,0 0,2
b
4,74 0,02
a

Contenido de cenizas (% m/m) 0,21 0,02
c
0,32 0,01
a
0,24 0,02
b

Contenido de lignina (g/100 g muestra)
5
- 5 1
a
5 1
a

Contenido de celulosa (g/100 g muestra)
5
- 15 2
a
16 2
a

Contenido de hemicelulosa (g/100 g muestra)
5
- 18 2
a
19 2
a

Cuadro 1. Caracterizacin fisicoqumica de distintos lotes del residuo de pia
obtenido en una empresa procesadora costarricense
1,2

1
Promedio de tres rplicas intervalo de confianza (=95%).
2
En una misma fila, promedios con letras distintas son
significativamente diferentes (Tukey, p<0,05).
3
Suma del contenido individual de glucosa, fructosa y sacarosa.
4
Anlisis
realizados al residuo lquido obtenido al centrifugar las cscaras de pia.
5
Reportados en base seca.
Objetivo 1. Conclusiones
15
Las principales caractersticas
fisicoqumicas del residuo de cscaras de
pia presentan diferencias significativas
entre lote (p<0,05).

Los residuos de cscaras de pia tienen
cantidades de celulosa y hemicelulosa
potencialmente hidrolizables.
El residuo de cscaras de pia es un
sustrato apto para el crecimiento y
desempeo adecuado de
Saccharomyces cerevisiae y Zymomonas
mobilis.
Trabajar con un nico lote

Tratamiento enzimtico de la
materia prima
16
Objetivo 2. Enzima empleada
17
Ultrazym

AFP-L
Actividad
Pectinoltica
Actividad
Celulsica
Objetivos
Aumentar la
concentracin
de azcares
Aumentar el
rendimiento del
prensado
Disminuir el
tiempo de
proceso de
prensado
Objetivo 2. Flujo de proceso
18
Alta carga
microbiana
Objetivo 2. Diseo experimental
19
Cuadro 2. Tratamientos aplicados para la evaluacin del efecto del tratamiento enzimtico
del residuo de cscaras de pia con el preparado comercial Ultrazym AFP-L
Tratamiento
Concentracin del
preparado enzimtico
(mg/kg)
Tiempo de
tratamiento (min)
Parmetros fijos
1
a
0 0
Temperatura: 52 C
pH: Natural del
residuo de pia
Agitacin: 200 rpm
2 150 90
3 150 120
4 250 90
5 250 120
6
b
0 0
a
Control: Cscaras molidas y esterilizadas.
b
Natural: Cscaras molidas sin tratamiento enzimtico ni trmico
20
Variables
respuesta
Contenido de
azcares
fermentables
Contenido de
slidos solubles
Rendimiento de
extraccin de
jugo por
prensado
Anlisis
estadstico
Anlisis de
varianza
Prueba de Tukey
Promedio con
desviacin
estndar
21
Cuadro 3. Efecto de la aplicacin del preparado enzimtico Ultrazym AFP-L
sobre las variables respuesta analizadas para el residuo de cscaras de pia
Tratamiento
Variables evaluadas Variables respuesta
Concentracin
preparado
enzimtico
(mg/kg)
Tiempo de
incubacin
(min)
Contenido de
azcares
fermentables
3,4
(g/L)
Contenido de
slidos
solubles
5,6
(Brix)
Rendimiento de
extraccin de
jugo por
prensado
5,6

(%m/m)
1 (Control)
1
0 0 127 4
a
10,8 0
a
77 2
a

2 150 90 116 2
a
10,8 0,3
a
78,5 0,7
a

3 150 120 120 1
a
10,6 0,1
a
79,1 0,6
a

4 250 90 124 2
a
10,8 0,3
a
79 1
a

5 250 120 131 4
a
10,7 0,3
a
78,8 0,9
a

6 (Natural)
2
0 0 96 3
b
9,8 0
b
66 1
b

1
Control: Esterilizacin.
2
Natural: Sin tratamiento trmico ni enzimtico.
3
Promedio de dos rplicas desviacin estndar.
4
En una misma
columna, promedios con letras distintas son significativamente diferentes (Tukey, p<0,01).
5
Promedio de tres rplicas desviacin estndar.
6
En una misma columna, promedios con letras distintas son significativamente diferentes (Tukey, p<0,05)
Objetivo 2. Conclusiones
22
La esterilizacin (121 C - 15 min) del residuo
agroindustrial de pia provoca un aumento
(p<0,05) en el contenido de azcares
fermentables, el contenido de slidos solubles y el
rendimiento de extraccin de jugo por prensado.

El tratamiento enzimtico de las cscaras molidas
de pia con Ultrazym AFP-L, en las condiciones
de concentracin y tiempo de tratamiento
evaluadas, no genera cambios significativos en las
variables respuesta estudiadas.
Omitir tratamiento enzimtico

Fermentacin alcohlica de
la materia prima
23
24
Medicin de
densidad ptica
Objetivo 3. Flujo de proceso
25
Cuadro 4. Diseo experimental empleado para estudiar la produccin de
bioetanol va fermentacin alcohlica a partir del jugo obtenido del residuo de
cscaras de pia
Tratamiento Microorganismo
Nivel de suplementacin del
medio
1 Saccharomyces cerevisiae A
2 Saccharomyces cerevisiae B
3 Zymomonas mobilis A
4 Zymomonas mobilis B
Diferentes sustancias para cada microorganismo
Cada tratamiento se llev a cabo por triplicado.
Objetivo 3. Curvas respuesta
26
Curvas
respuesta
Cintica de
crecimiento
Produccin
de etanol
en el
tiempo
Produccin
de glicerol
en el
tiempo
Consumo
de
azcares
en el
tiempo
Contenido
de slidos
solubles en
el tiempo
Objetivo 3.
Resultados: Nivel de suplementacin
27
7,20
7,50
7,80
8,10
8,40
0,0
20,0
40,0
60,0
80,0
100,0
0 10 20 30 40 50 60 70
C
o
n
c
e
n
t
r
a
c
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n

m
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c
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b
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L
)

C
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s
,

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n
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l

(
g
/
L
)

Tiempo de fermentacin (h)
Azcares - Suplementacin A Azcares - Suplementacin B
Etanol - Suplementacin A Etanol - Suplementacin B
Concentracin microbiana - Suplementacin A Concentracin microbiana - Suplementacin B
Figura 3. Variacin de la concentracin de azcares, etanol y poblacin
microbiana en el tiempo para la fermentacin de jugo de cscaras de
pia con Saccharomyces cerevisiae en dos niveles de suplementacin a
escala piloto
Objetivo 3.
Resultados: Nivel de suplementacin
28
Figura 4. Variacin de la concentracin de azcares, etanol y poblacin
microbiana en el tiempo para la fermentacin de jugo de cscaras de pia
con Zymomonas mobilis en dos niveles de suplementacin diferentes a
escala piloto
8,70
9,00
9,30
9,60
9,90
10,20
0,0
20,0
40,0
60,0
80,0
100,0
0 10 20 30 40
C
o
n
c
e
n
t
r
a
c
i
n

m
i
c
r
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b
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a

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m
L
)

C
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,

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a
n
o
l

(
g
/
L
)

Azcares - Suplementacin A Azcares - Suplementacin B
Etanol - Suplementacin A Etanol - Suplementacin B
Concentracin microbiana - Suplementacin A Concentracin microbiana - Suplementacin B
Objetivo 3.
Conclusiones: Nivel de suplementacin
29
La suplementacin de los medios de
fermentacin en los dos niveles estudiados
no produce diferencias significativas
(p<0,05) en los parmetros cinticos
evaluados.
8,20
8,50
8,80
9,10
9,40
9,70
10,00
7,50
7,80
8,10
8,40
8,70
9,00
9,30
0 10 20 30 40 50 60 70
C
o
n
c
e
n
t
r
a
c
i
n

d
e

b
a
c
t
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b
a
c
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/
m
L
)

C
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c
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c
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n

d
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l
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v
a
d
u
r
a

(
l
o
g

l
e
v
/
m
L
)

Poblacin - S. cerevisiae Poblacin - Z. mobilis Saccharomyces cerevisiae Zymomonas mobilis
Objetivo 3.
Resultados: Microorganismo
30
Figura 5. Variacin de la poblacin microbiana en el tiempo, para la
fermentacin alcohlica con Saccharomyces cerevisiae y Zymomonas mobilis
de jugo de cscaras de pia a escala piloto
0,0
20,0
40,0
60,0
80,0
100,0
0 10 20 30 40 50 60 70
C
o
n
c
e
n
t
r
a
c
i
n

a
z
c
a
r
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s
,

e
t
a
n
o
l

(
g
/
L
)

Azcares - S. cerevisiae Azcares - Z. mobilis Etanol - S. cerevisiae Etanol - Z. mobilis Azcares - S. cerevisiae Etanol - S. cerevisiae Etanol - Z. mobilis
Azcares - Z. mobilis
Objetivo 3.
31
Figura 6. Variacin de la concentracin de azcares y etanol en el tiempo, para la
fermentacin alcohlica con Saccharomyces cerevisiae y Zymomonas mobilis de jugo
de cscaras de pia a escala piloto
4,00
6,00
8,00
10,00
12,00
0 10 20 30 40 50 60 70
C
o
n
t
e
n
i
d
o

d
e

s
l
i
d
o
s

s
o
l
u
b
l
e
s

(
B
r
i
x
)

Slidos solubles - S. cerevisiae Slidos Solubles - Z. mobilis
Saccharomyces cerevisiae Zymomonas mobilis
Objetivo 3.
32
Figura 7. Variacin del contenido de slidos solubles en el tiempo, para la
de jugo de cscaras de pia a escala piloto
Objetivo 3. Variables respuesta
33
Variables respuesta
Productividad total, mxima y al trmino del
consumo de azcares
Rendimiento de etanol respecto al sustrato
inicial y respecto al mximo terico
Proporcin de azcares consumidos
Concentracin final del etanol
Tiempo final del proceso fermentativo
Mxima velocidad especfica de crecimiento
Objetivo 3.
34
Variable respuesta
Microorganismo
Saccharomyces
cerevisiae
Reportado
Zymomonas
mobilis
Reportado
Productividad mxima (g/Lh)
2,4 0,2 1,48 2,56
a
2,4 0,4 NR
Productividad total (g/Lh)
0,55 0,02* NR 0,88 0,08* NR
Productividad al trmino del
consumo de azcares (g/Lh)
2,0 0,3 1,16 - 2,51
a
1,7 0,2 1,24
b
- 2,81
c
Rendimiento de etanol respecto al
sustrato inicial (% m/m)
40 2 42 46
a
44 4 46
b
Rendimiento de etanol respecto al
mximo terico (% m/m)
1

79 3 83 91
a
87 9 90,7
b
Cuadro 5. Resultados de las pruebas de fermentacin alcohlica de jugo de
cscaras de pia utilizando Saccharomyces cerevisiae y Zymomonas mobilis en
bioreactores de 5,0 L
Resultados reportados como promedio de seis rplicas desviacin estndar.
*Significativamente diferentes (p<0,05).
1
Para ambos microorganismos el rendimiento terico es 51% (m/m)
Fuentes:
a
Leiva, 2012;
b
Kesava et al., 1995;
c
Tanaka et al 1999
Variable respuesta
Microorganismo
Saccharomyces
cerevisiae
Reportado
Zymomonas
mobilis
Reportado
Azcares consumidos (%)
99,7 0,1* 100
a
93 3* 92,3
b
Concentracin final de etanol (g/L)
37 1 61 - 74
a
40 3 64,5
b
Tiempo final del proceso
fermentativo (h)
23 2 32 48
a
25 3 25
c
Mxima velocidad especfica de
crecimiento (h
-1
)
0,06 0,02 0,08 0,09
a
0,05 0,01 0,3 0,5
d,e,f
Objetivo 3.
35
(Continuacin) Cuadro 5. Resultados de las pruebas de fermentacin
alcohlica de jugo de cscaras de pia utilizando Saccharomyces
cerevisiae y Zymomonas mobilis en bioreactores de 5,0 L
Resultados reportados como promedio de seis rplicas desviacin estndar.
*Significativamente diferentes (p<0,05).
Fuentes:
a
Leiva, 2012;
b
Victoria, 2010;
c
Kesava et al., 1995;
d
lvarez et al., 2009;
e
Yang et al., 2013;
f
Zikmanis et al., 1997
Objetivo 3.
Conclusiones: Efecto de microorganismo
36
La bacteria Zymomonas mobilis presenta
dificultades para adaptarse al medio de
fermentacin, en las condiciones en las
que se llev a cabo el proceso, lo que se
reflej principalmente en un consumo
deficiente de los azcares presentes en el
sustrato.
La levadura Saccharomyces
cerevisiae presenta una menor
productividad total (p<0,05) que
Zymomonas mobilis, consecuencia
de una prolongacin excesiva del
proceso de fermentacin.
Objetivo 3.
Conclusiones: Efecto de microorganismo
37
El comportamiento de los
microorganismos estudiados en las
fermentaciones es muy similar, por lo
que no se presentaron diferencias
significativas (p<0,05) en la mayor parte
de las variables respuesta evaluadas.
Para un proceso fermentativo con el
sustrato de cscaras de pia a nivel
industrial se sugiere el uso de
Saccharomyces cerevisiae, dado que
presenta un comportamiento similar al
de Zymomonas mobilis y se ve menos
afectado por las condiciones del
medio.
Conclusiones generales:
Fermentacin alcohlica
38
Omitir el tratamiento con Ultrazym AFP-L en
cualquiera de las condiciones estudiadas.
Seleccionar Saccharomyces cerevisiae como el
microorganismo idneo, en contraste con la
bacteria Zymomonas mobilis.
Emplear el nivel de suplementacin B (bajo) y
prolongar la fermentacin por 25 h.
Se esperara obtener:
Rendimiento respecto al terico: 76 - 82%
Concentracin final de etanol: 36 - 38 g/L
39
Evaluar condiciones ms drsticas de uso de
Ultrazym AFP-L: Tiempo y concentracin
Estudiar el efecto de otros preparados enzimticos
(celulasas y hemicelulasas)
Efectuar fermentaciones del jugo de cscaras de
pia enriquecido con azcares o con jugo
proveniente de algn otro residuo industrial
Realizar pruebas de fermentaciones en sistemas en
continuo o tipo lote alimentado

Recomendaciones generales
40
Estudiar el impacto de la
inmovilizacin de los
microorganismos estudiados
Evaluar el efecto de otras
condiciones de proceso sobre los
parmetros fermentativos de
Zymomonas mobilis
Efectuar pruebas para evaluar
escalamiento a nivel industrial
Realizar el estudio econmico
asociado al estudio tcnico:
Viabilidad de industrializar el proceso

Recomendaciones generales
41
Anexos
JUSTIFICACIN
Uso del bioetanol como aditivo oxigenante
Situacin Nacional del bioetanol
OBJETIVO ESPECFICO 1
Mtodos Anlisis Fisicoqumicos
Anlisis Estadstico

42
Anexos
Preparado enzimtico
Resultados obtenidos: Promedio de valores
Seleccin de condiciones de los tratamientos
Resultados obtenidos: Posibles causas
Resultados obtenidos: Principales observaciones

43
Anexos
Microorganismos productores de bioetanol
Saccharomyces cerevisiae: Caractersticas
Zymomonas mobilis: Caractersticas
Pruebas preliminares: Condiciones
Pruebas preliminares: Resultados y
observaciones

44
Anexos
Acondicionamiento de materia prima: Rendimientos
Razones para evaluar suplementacin
Descripcin variables respuesta
Observaciones Productividad Total
Variacin del contenido de glicerol en el tiempo
Anlisis estadstico

Bioetanol
- Es de naturaleza renovable
- Aumenta el octanaje de la
gasolina
- Puede reemplazar el MTBE
- Se puede utilizar en todos los
vehculos
- E10: Reduce emisin de CO en
30%
- Equilibra emisiones de CO
2

- 12 25% menos gases del
efecto invernadero

- Es necesario realizar cambios
de filtro
- Podra presentarse corrosin:
Cantidad de agua en el etanol
- Al usar productos alimenticios
para producirlo la seguridad
alimentaria podra verse
amenazada
45
Bioetanol: Situacin nacional
1974
Programa de
Energas
Renovables
1995
Ley Orgnica del
Ambiente
2003
Decreto
Ejecutivo N
31087-MAG-
2003
2009
Reglamento
Nacional de
Biocombustibles

Proyectos de masificacin no se han concretado:
* Falta de acondicionamiento en planteles (RECOPE y gasolineras)
* Precio no competitivo del etanol anhidro importado

46
Anlisis aplicados
Mtodo de desecacin en estufa de vaco (70 C
hasta masa constante)
Concentracin de azcares fermentables
Determinacin con HPLC: Glc, Fru, Sac
Contenido de slidos solubles
Medicin por refractometra
Mtodo de calcinacin en mufla (550 C hasta masa
constante)
47
Anlisis aplicados
Acidez titulable
Titulacin con patrn de NaOH 0,1 mol/L
pH
Medicin con pH-metro
48
Mtodo de lavado y calcinacin del MIAA
Mtodo de lavado con detergentes neutros y cidos
Contenido de hemicelulosa
Mtodo de lavado con detergentes neutros y cidos
Objetivo 1. Anlisis de materia prima
-Resultados estadsticos-
Anlisis Efecto G.L. Valor de F Prob>F
Lote 2 113,207 0,0003*
Repeticin 2 1,356 0,355
Concentracin de azcares
fermentables
Lote 2 1078,729 0,001*
Repeticin 2 13,049 0,090
Contenido de slidos
solubles
Lote 2 52,975 0,001*
Repeticin 2 0,475 0,653
Acidez titulable
Lote 2 53,200 0,001*
Repeticin 2 1,600 0,309
49
Cuadro B1. Anlisis de varianza aplicado a los resultados de la caracterizacin fisicoqumica de
distintos lotes de materia prima obtenida de cscaras molidas de pia
*Significancia al p<0,05
Objetivo 1. Anlisis de materia prima
-Resultados estadsticos-
Anlisis Efecto G.L. Valor de F Prob>F
pH
Lote 2 367,260 < 0,0001*
Repeticin 2 0,862 0,488
Lote 2 215,474 < 0,0001*
Repeticin 2 7,229 0,070
Lote 2 0,058 0,832
Repeticin 2 0,097 0,912
Lote 2 0,632 0,510
Repeticin 2 1,592 0,386
Contenido de
hemicelulosa
Lote 2 0,701 0,491
Repeticin 2 0,089 0,919
50
(Continuacin) Cuadro B1. Anlisis de varianza aplicado a los resultados de la caracterizacin
fisicoqumica de distintos lotes de materia prima obtenida de cscaras molidas de pia
*Significancia al p<0,05
Preparado enzimtico
Ultrazym
AFP-L
Actividad
pectinoltica
Actividad
celulsica
Degrada pectina en
cido D-galacturnico
y otros azcares
fermentables
Degrada polisacridos
como celulosa, glucanos
y xilanos: Fracciona la
pared celular
51
52
Cuadro 3. Efecto de la aplicacin del preparado enzimtico Ultrazym AFP-L
sobre las variables respuesta analizadas para el residuo de cscaras de pia
Tratamiento
Variables evaluadas Variables respuesta
Concentracin
preparado
enzimtico
(mg/kg)
Tiempo de
incubacin
(min)
Contenido de
azcares
fermentables
3,4
(g/L)
Contenido de
slidos
solubles
5,6
(Brix)
Rendimiento de
extraccin de
jugo por
prensado
5,6

(%m/m)
1 (Control)
1
0 0 127 4
a
10,8 0
a
77 2
a

2 150 90 116 2
a
10,8 0,3
a
78,5 0,7
a

3 150 120 120 1
a
10,6 0,1
a
79,1 0,6
a

4 250 90 124 2
a
10,8 0,3
a
79 1
a

5 250 120 131 4
a
10,7 0,3
a
78,8 0,9
a

6 (Natural)
2
0 0 96 3
b
9,8 0
b
66 1
b

1
Control: Esterilizacin.
2
Natural: Sin tratamiento trmico ni enzimtico.
3
Promedio de dos rplicas desviacin estndar.
4
En una misma
columna, promedios con letras distintas son significativamente diferentes (Tukey, p<0,01).
5
Promedio de tres rplicas desviacin estndar.
6
En una misma columna, promedios con letras distintas son significativamente diferentes (Tukey, p<0,05)
Promedio: 123,6 g/L
Promedio: 10,7 Brix Promedio: 78,5%
Seleccin de condiciones
1. Esterilizacin:

- Eliminar carga bacteriana: Evitar consumo prematuro de los azcares

- Calor: Degrada diversas estructuras celulares y desnaturaliza protenas

2. Concentracin y tiempo:

- Ficha tcnica:
Concentracin: 200 mg/kg - 300 mg/kg
Tiempo: 30 120 min
Temperatura: 55 C

Degrad pectinas y paredes celulares de pur de manzana y de
pera casi en su totalidad
53
Seleccin de condiciones
2. Concentracin y tiempo:

- Estudio Gutirrez (2012) - CIPRONA:
Materia prima: Pulpa de pia (residuo de la clarificacin del jugo)
Concentracin: 200 mg/kg
Tiempo: 120 min
Temperatura: 55 C
Incremento significativo (p<0,05) en el contenido de glucosa del
13% , disminucin del 10,5% en la cantidad de slidos totales

Concentracin: 100 mg/kg
Tiempo: 60 min
Temperatura: 55 C
Aumento significativo (p<0,05) en el rendimiento de extraccin
por prensado del 23%
54
Objetivo 2. Posibles causas

- La composicin de las cscaras de pia podra requerir el
uso de preparados con hemicelulosa, combinados con
pectinasas y celulasas.

- La presencia de ligninca pudo haber afectado el
desempeo de las enzimas al formar enlaces con estas.

- La esterilizacin pudo haber provocado la condensacin y
precipitacin de compuestos insolubles de lignina.
Preparado Enzimtico no genera los cambios deseados
55
Objetivo 2. Principales observaciones
En las condiciones evaluadas el tratamiento
enzimtico no provoc el efecto deseado

Diferencias en la composicin de la materia prima con
respecto a FT y Gutirrez (2012)

Celulosa: Sustrato de difcil degradacin (amorfo e
irregular, presencia de hemicelulosa)

Tiempos y concentraciones ms drsticos: Incompatibles
con proceso industrial
56
Objetivo 2. Principales observaciones
POSIBILIDAD:
Evaluar condiciones ms drsticas
Costos de operacin y
tiempos de proceso
- Se descart el uso del preparado Ultrazym AFP-L
en las etapas posteriores

- Concentracin de azcares fermentables permite
fermentacin alcohlica de forma directa.
57
Microorganismos productores de etanol
Microorganismo
Principales sustratos
fermentables
Condiciones de
fermentacin
Tolerancia al
etanol
Indicaciones
adicionales
Saccharomyces
cerevisiae
Glucosa, fructosa,
maltosa, sacarosa
Anaerbico facultativo,
30 - 37 C
150 g/L
Hasta un 95% del
rendimiento terico
Schizosaccharomyces
pombe
Glucosa, fructosa,
maltosa, sacarosa
Anaerbico,
30 - 35 C
N.I. Alta tolerancia osmtica
Kluyveromyces
marxianus
Glucosa
Anaerbico,
40 - 45 C
N.I.
Entre 80% y 90% del
rendimiento terico
Candida shehatae Glucosa, xilosa
Microaeroflico,
20 - 31 C
30 45 g/L
Hasta 94% del rendimiento
terico en xilosa,
produccin moderada de
xilitol
Pichia stipitis Glucosa, xilosa
Microaeroflico,
26 - 35 C
35 47 g/L
Hasta un 92% del
rendimiento terico
Pachysolen tannophilus Glucosa, xilosa, glicerol Microaeroflico 37,5 75 g/L
Entre 47% y 55% del
rendimiento terico en
xilosa, produccin
considerable de xilitol
Zymomonas mobilis
Glucosa, fructosa,
sacarosa
30 C
100 g/L
Hasta un 97% del
rendimiento terico
Clostridium
thermocellum
Glucosa, celulosa
Anaerbico,
55 - 65 C
10 30 g/L Produce cido actico
Clostridium
thermosaccharolyticum
Glucosa, xilosa
Anaerbico,
60 C
<30 g/L
41% del rendimiento
terico en xilosa
Cuadro 4. Principales levaduras y bacterias productoras de etanol
Fuente: Cardona et al., 2009. N.I.: No indicado
58
Microorganismos productores de etanol
Microorganismo
Principales sustratos
fermentables
Condiciones de
fermentacin
Tolerancia al
etanol
Indicaciones
adicionales
Saccharomyces
cerevisiae
Glucosa, fructosa,
maltosa, sacarosa
30 - 37 C
150 g/L
Hasta un 95% del
rendimiento terico
Schizosaccharomyces
pombe
Glucosa, fructosa,
maltosa, sacarosa
Anaerbico,
30 - 35 C
N.I. Alta tolerancia osmtica
Kluyveromyces
marxianus
Glucosa
Anaerbico,
40 - 45 C
N.I.
Entre 80% y 90% del
rendimiento terico
Candida shehatae Glucosa, xilosa
Microaeroflico,
20 - 31 C
30 45 g/L
Hasta 94% del rendimiento
terico en xilosa,
produccin moderada de
xilitol
Pichia stipitis Glucosa, xilosa
Microaeroflico,
26 - 35 C
35 47 g/L
Hasta un 92% del
rendimiento terico
Pachysolen tannophilus Glucosa, xilosa, glicerol Microaeroflico 37,5 75 g/L
Entre 47% y 55% del
rendimiento terico en
xilosa, produccin
considerable de xilitol
Zymomonas mobilis
Glucosa, fructosa,
sacarosa
30 C
100 g/L
Hasta un 97% del
rendimiento terico
Clostridium
thermocellum
Glucosa, celulosa
Anaerbico,
55 - 65 C
10 30 g/L Produce cido actico
Clostridium
thermosaccharolyticum
Glucosa, xilosa
Anaerbico,
60 C
<30 g/L
41% del rendimiento
terico en xilosa
Cuadro 4. Principales levaduras y bacterias productoras de etanol
Fuente: Cardona et al., 2009. N.I.: No indicado
59

Es la levadura ms empleada
para la produccin de etanol

Metabolismo de azcares:

Aerobio

Anaerobio (Va Embden-Meyerhof-Parnas)
60
C
6
H
12
O
6
+ 6O
2
+ 36ADP
3-
+ 36P
i
2-
+36H
+
42H
2
O + 36ATP
4-
+ 6CO
2
C
6
H
12
O
6
+ 2ADP + 2P
i
2C
2
H
5
OH + 2ATP + 2CO
2

Sustratos: Glc, Fru, Sac, entre otros

Rendimiento de obtencin de etanol:
90% - 95% con respecto al terico
(0,511 g EtOH / 1 g Glc)

Tolerancia al etanol: Hasta 150 g/L

Se utiliz en forma de levadura seca activa

61

Efecto Crabtree:

Altas concentraciones de azcares
(100 g/L)
Inhibe produccin de enzimas oxidativas
Presenta metabolismo anaerobio

Ventaja:
A pesar de menor produccin de energa,
genera etanol competencia
62

Es la bacteria ms efectiva para la
produccin de etanol

Bacteria Gram negativa, anaerobia facultativa,
no esporulada, mvil

Metabolismo de azcares:

Aerobio
No se conoce con certeza

Anaerobio (Va Entner-Doudoroff)
Va Embden-Meyerhof-Parnas
63
C
6
H
12
O
6
+ 6O
2
+ 36ADP
3-
+ 36P
i
2-
+36H
+
42H
2
O + 36ATP
4-
+ 6CO
2
C
6
H
12
O
6
+ ADP + P
i
2C
2
H
5
OH + ATP + 2CO
2

Sustratos: Glc, Fru, Sac

Rendimiento de obtencin de etanol:
Hasta 97% con respecto al terico
(0,511 g EtOH / 1 g Glc)

Tolerancia al etanol: Hasta 100 g/L

Medio de mantenimiento lquido: glucosa,
extracto de levadura y peptona
64
Permite transporte de e
-
: Mantiene balance de
cargas en el interior de la clula
-sin que haya una conversin del sustrato en
biomasa-

Metabolismo desacoplado:

Continua produciendo etanol aun cuando la
concentracin de azcares permanece
constante
65
Pruebas preliminares:
Fermentacin en matraz
Saccharomyces cerevisiae
Mosto de glucosa con suplementacin A
Aireacin durante las primeras 18 h
Agitacin a 250 rpm
pH= 4,0 (no se control)
T= 30 C
Zymomonas mobilis
Jugo de pia a 17 Brix
Sin suplementacin
Sin aireacin
Esttico
pH= 4,0 (natural del jugo, no se control)
T= 30 C
66
Pruebas preliminares
Mosto de glucosa con suplementacin A
Aireacin durante las primeras 18 h
Agitacin a 250 rpm
pH= 4,0 (no se control)
T= 30 C
Sistema adaptado con matraz de 2,0 L
67
Pruebas preliminares
Zymomonas mobilis
Jugo de pia a 17 Brix
Sin suplementacin
Sin aireacin
Esttico
pH= 4,0 (natural del jugo, no se control)
T= 30 C
68
Pruebas preliminares: Resultados
3,00
3,50
4,00
4,50
5,00
5,50
0,00
2,00
4,00
6,00
8,00
10,00
12,00
14,00
16,00
18,00
0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50
P
o
b
l
a
c
i
n

m
i
c
r
o
b
i
a
n
a

(
l
o
g

l
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v
/
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L
)

C
o
n
c
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n
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r
a
c
i
n

(
x
1
0

g
/
L
)

C
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n
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n
i
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o

s
l
i
d
o
s

s
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l
u
b
l
e
s

(
B
r
i
x
)

Contenido de slidos solubles Concentracin glucosa
Concentracin etanol Poblacin microbiana
Figura 1. Variacin en el tiempo del contenido de glucosa, etanol,
slidos solubles y concentracin microbiana en la fermentacin con
Saccharomyces cerevisiae a nivel de matraz de 2,0 L utilizando un mosto
de glucosa como fuente de carbono
69
3,00
3,50
4,00
4,50
5,00
5,50
0,00
2,00
4,00
6,00
8,00
10,00
12,00
14,00
16,00
18,00
0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50
P
o
b
l
a
c
i
n

m
i
c
r
o
b
i
a
n
a

(
l
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c
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x
1
0

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s

s
o
l
u
b
l
e
s

(
B
r
i
x
)

70
3,00
3,50
4,00
4,50
5,00
5,50
0,00
2,00
4,00
6,00
8,00
10,00
12,00
14,00
16,00
18,00
0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50
P
o
b
l
a
c
i
n

m
i
c
r
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b
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n
a

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l
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c
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c
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x
1
0

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L
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s
o
l
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b
l
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s

(
B
r
i
x
)

71
3,00
3,50
4,00
4,50
5,00
5,50
0,00
2,00
4,00
6,00
8,00
10,00
12,00
14,00
16,00
18,00
0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50
P
o
b
l
a
c
i
n

m
i
c
r
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b
i
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a

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C
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x
1
0

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l
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o
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s
o
l
u
b
l
e
s

(
B
r
i
x
)

72
3,00
3,50
4,00
4,50
5,00
5,50
0,00
2,00
4,00
6,00
8,00
10,00
12,00
14,00
16,00
18,00
0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50
P
o
b
l
a
c
i
n

m
i
c
r
o
b
i
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)

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x
1
0

g
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L
)

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s
l
i
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s

s
o
l
u
b
l
e
s

(
B
r
i
x
)

73
3,00
3,50
4,00
4,50
5,00
5,50
0,00
2,00
4,00
6,00
8,00
10,00
12,00
14,00
16,00
18,00
0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50
P
o
b
l
a
c
i
n

m
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c
r
o
b
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c
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x
1
0

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s
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l
u
b
l
e
s

(
B
r
i
x
)

Consumo de azcares: 96% m/m
Rendimiento respecto al terico: 93% m/m
Glicerol y produccin de biomasa
74
Zymomonas mobilis a nivel de matraz de 125 mL utilizando jugo de
cscaras de pia como fuente de carbono
9,00
9,20
9,40
9,60
9,80
10,00
10,20
10,40
0,00
2,00
4,00
6,00
8,00
10,00
12,00
14,00
0,00 10,00 20,00 30,00 40,00 50,00 60,00 70,00
P
o
b
l
a
c
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c
r
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b
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x
1
0

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L
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l
u
b
l
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s

(
B
r
i
x
)

Tiempo fermentacin (h)
Contenido slidos solubles Concentracin azcares
75
9,00
9,20
9,40
9,60
9,80
10,00
10,20
10,40
0,00
2,00
4,00
6,00
8,00
10,00
12,00
14,00
0,00 10,00 20,00 30,00 40,00 50,00 60,00 70,00
P
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b
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c
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x
1
0

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l
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s
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l
u
b
l
e
s

(
B
r
i
x
)

76
9,00
9,20
9,40
9,60
9,80
10,00
10,20
10,40
0,00
2,00
4,00
6,00
8,00
10,00
12,00
14,00
0,00 10,00 20,00 30,00 40,00 50,00 60,00 70,00
P
o
b
l
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x
1
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l
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b
l
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B
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i
x
)

77
9,00
9,20
9,40
9,60
9,80
10,00
10,20
10,40
0,00
2,00
4,00
6,00
8,00
10,00
12,00
14,00
0,00 10,00 20,00 30,00 40,00 50,00 60,00 70,00
P
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x
1
0

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L
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l
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l
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(
B
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i
x
)

78
9,00
9,20
9,40
9,60
9,80
10,00
10,20
10,40
0,00
2,00
4,00
6,00
8,00
10,00
12,00
14,00
0,00 10,00 20,00 30,00 40,00 50,00 60,00 70,00
P
o
b
l
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c
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m
i
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b
i
a
n
a

(
l
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c
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/
m
L
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C
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c
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c
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(
x
1
0

g
/
L
)

C
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i
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e

s
l
i
d
o
s

s
o
l
u
b
l
e
s

(
B
r
i
x
)

Consumo de azcares: 63% m/m
Rendimiento respecto al terico: 62% m/m
Rendimiento de azcares consumidos respecto al terico:
98% m/m
79
Extensin de fase de latencia
Inhibicin de Zymomonas mobilis
Ausencia de suplementacin
Presencia de CO
2

Presencia de etanol (concentracin,
tolerancia)
Contenido inicial de azcares (cepa)
80
Objetivo 3. Flujo de proceso: Rendimientos
81
Rendimiento:
99,2%
Rendimiento:
77,7%
Rendimiento:
97,9%
Razones para evaluar suplementacin
Forma sencilla y accesible (en condiciones adecuadas) de
aumentar la productividad y el rendimiento de estos procesos.
Araya (2010):

- Informacin de literatura y resultados obtenidos:
El jugo de pia aporta minerales y nutrientes propios
necesarios para el crecimiento de microorganismos.

- Medio de cultivo no enriquecido: Productividades de cido
lctico fueron muy bajas.

- Jugo de pia no aporta la cantidad de nitrgeno y de fsforo
necesaria para un crecimiento adecuado de la bacteria
estudiada (Lactobacillus casei).

- Microorganismos diferentes: Estos compuestos son necesarios
para un crecimiento celular adecuado
82
Variables Respuesta
Pendiente mxima de la curva de produccin de etanol (se presenta en la fase logartmica del crecimiento
microbiano)
Rendimiento respecto al sustrato inicial
Rendimiento etanol respecto al sustrato inicial (%) =
Concentracin final etanol (g/L)
Concentracin inicial azcares (g/L)
x100
Rendimiento respecto al terico
Rendimiento etanol respecto al terico (%) =
Rendimiento etanol respecto al sustrato inicial (%)
Rendimiento terico reportado (%)
x100
Productividad mxima
Productividad total
Cociente de la concentracin final de etanol y el tiempo en el que se detuvo el proceso fermentativo (67
h para Saccharomyces cerevisiae - 45 h para Zymomonas mobilis)
Productividad al trmino de los azcares
Relaciona la concentracin final de etanol con el tiempo en que los azcares llegaron a 0 g/L o a partir
del momento en que se mantuvo constante
83
Variables Respuesta
Mxima velocidad especfica de crecimiento
Proporcin de azcares consumidos
Tiempo final del proceso fermentativo
Concentracin final de etanol
Concentracin obtenida al promediar los valores en los que el parmetro se consider estable
Pendiente mxima de la cintica de crecimiento de cada microorganismo (coincide con la fase logartmica)
Proporcin azcares consumidos =
Conc. inicial azcares (g/L) Conc. remanente azcares (g/L)
Conc. Inicial azcares (g/L)
x100
Momento a partir del cual la concentracin de etanol se mantuvo constante. Se seleccion la ecuacion
polinomial de mejor ajuste para cada curva de produccin de etanol en el tiempo (mayor coeficiente de
correlacin) y se determin la derivada, lo que corresponde al tiempo en el que la concentracin de etanol
alcanz un mximo.
84
Resultados: Productividad total
Diferencia significativa (p<0,05):
El proceso con Zymomonas mobilis se
extendi menos tiempo que el de

Importante: Finalizar el proceso en el
momento adecuado
85
Objetivo 3.
Resultados: Efecto de microorganismo
86
Figura 8. Variacin de la concentracin de glicerol en el tiempo, para la
de jugo de cscaras de pia en bioreactores de 5,0 L
0,00
1,00
2,00
3,00
4,00
5,00
0 10 20 30 40 50 60 70
C
o
n
c
e
n
t
r
a
c
i
n

d
e

g
l
i
c
e
r
o
l

(
g
/
L
)

Glicerol - S. cerevisiae Glicerol - Z. mobilis Saccharomyces cerevisiae Zymomonas mobilis
Objetivo 3. Anlisis de varianza
87
Variable respuesta Efecto G.L.
1
Valor de F Prob>F
Rendimiento de etanol
respecto al sustrato inicial
Microorganismo 1 5,1079 0,0645
Suplementacin 1 0,9048 0,3782
Microorganismo*
Suplementacin
1 1,9691 0,2101
Rplica 2 1,1994 0,3646
Rendimiento de etanol
respecto al mximo
reportado en la literatura
Microorganismo*
Suplementacin
1 1,9708 0,2099
Rplica 2 1,1986 0,3648
Productividad mxima
Microorganismo*
Suplementacin
1 0,8335 0,3965
Rplica 2 0,4302 0,6690
Cuadro 10. Anlisis de varianza del efecto del microorganismo, suplementacin y repeticin sobre los valores obtenidos para las variables respuesta evaluadas en la produccin de bioetanol a partir del jugo de cscaras de pia
1
Grados de libertad
*Significancia a p<0,05
88
1
Valor de F Prob>F
Productividad total
Microorganismo 1 155,0824 <0,0001*
Microorganismo*
Suplementacin
1 3,5034 0,1104
Rplica 2 2,3376 0,1776
Productividad al
trmino del consumo
de azcares
Microorganismo*
Suplementacin
1 2,0618 0,2010
Rplica 2 0,7519 0,5112
Tiempo final del
proceso fermentativo
Microorganismo*
Suplementacin
1 0,7889 0,4086
Rplica 2 1,5042 0,2955
1
Grados de libertad
89
1
Valor de F Prob>F
Mxima velocidad
especfica de
crecimiento
Microorganismo*
Suplementacin
1 1,2006 0,3152
Rplica 2 0,2389 0,7946
Proporcin de azcares
consumidos
Microorganismo 1 22,3655 0,0032*
Microorganismo*
Suplementacin
1 0,3069 0,5996
Rplica 2 1,3820 0,3209
Concentracin final de
etanol
Microorganismo*
Suplementacin
1 4,2034 0,0862
Rplica 2 2,3366 0,1776
1
Grados de libertad

Producción de Bioetanol A Partir de Residuos de Piña

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de residuos agroindustriales de pia

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