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TRABAJO DE
LABORATORIO



TRATAMIENTO DE SUEROS
MEDIANTE UN BIORREACTOR
CON -GALACTOSIDA
INMOVILIZADA

Hecho por: Jos Montalbn Snchez


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1; Resumen:
El trabajo realizado tiene como objetivo el tratamiento de sueros lcteos mediante un
biorreactor con -galactosidasa inmovilizada como enzima, obtenida del Aspergillus
oryzae. En primer lugar se utiliza como sustrato el ONPG (o-nitrofenil--D-
Galactopiransido) que se hidroliza a ONP (orto-nitrofenol) y mediante varios ensayos
con la enzima a diferentes pH y diferentes temperaturas se obtiene un pH ptimo igual a
4 y su estabilidad trmica a pH = 4 es a 40C ya que a esa temperatura la actividad se
mantiene aproximadamente constante es decir, no se desnaturaliza. Posteriormente
mediante varios ensayos de actividad con y sin inhibidor (galactosa) a diferente
concentracin de sustrato se obtuvo:
- Con inhibidor:

= 12,806 mM;

= 8,91 U/mg;
- Sin inhibidor:

= 2,301;

=8,412 U/mg;
-

(galactosa 30 mM)=6,57 mM
-K cat= 883,26

A continuacin se inmovilizo la resina amberlita IRC-50 produciendo una
inmovilizacin del 86% y tambin se determin la porosidad de la amberlita que fue del
46,5 %. En segundo lugar se utiliz como sustrato lactosa que mediante varios ensayos
de tiempo a diferentes concentraciones de lactosa se obtuvo:
-

= 2, 8518 mM;
-

=1, 1213 mM/min;

-K cat= 39,235

Finalmente se produjo la hidrlisis de lactosa en el biorreactor con distintos caudales y
se calcul las conversiones a los diferentes ensayos.



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2; Objetivo del proyecto:
El objetivo de este estudio es construir un biorreactor para la hidrlisis de la lactosa
procedente de lactosueros.

3; Introduccin:
La -galactosidasa es una enzima que cataliza la hidrlisis de galactsidos
a monosacridos. El -galactsido ms comn es la lactosa, un disacrido entre
galactosa y glucosa ( 1,4 Galactosa-Glucosa) .
Esta enzima se encuentran distribuida en la naturaleza en numerosos microorganismos
(kluyveromyces lactis, kluyveromyces fragilis y Candida pseudotropicalis), en plantas
(caf cereza, almendra y durazno) y en rganos animales (intestino, tejido cerebral y
piel) [1][5]. El motivo fundamental de su aplicacin radica esencialmente en:

-La enzima -galactosidasa permite la eliminacin de la lactosa de la leche que
constituye un contratiempo importante para personas que no son capaces de metabolizar
naturalmente este disacrido, ya sea, porque hayan perdido esa capacidad de forma
hereditaria o por algn accidente de tipo metablico. La lactosa ingerida y no
hidrolizada en el intestino, no se absorbe y se mueve a travs del intestino grueso donde
la accin bacteriana y los efectos osmticos producen trastornos intestinales como
diarrea y flatulencias. Este problema lo padece una gran parte de la poblacin mundial
(en torno al 70%), siendo ms severo en las poblaciones de raza negra debido a la falta
de ayudas.
- La escala industrial ya que su eliminacin, constituye un importante avance en la
produccin y maduracin de quesos, ya que el proceso se vera acelerado al usar las
bacterias responsables en los procesos fermentativos usando glucosa, dirigida ms
fcilmente que usndolo con lactosa. Cabe destacar que si aplicamos las tcnicas de
ingeniera como la gentica para clonacin de microorganismos termfilos,
facilitaramos su fermentacin y procesamiento a escala industrial, constituyendo un
importante ahorro en trminos econmicos [2][3][5].

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Las enzimas pueden ser utilizadas tanto libres como inmovilizadas, la inmovilizacin
facilita la recuperacin final del catalizador y su reutilizacin y por consiguiente
constituye un importante ahorro econmico [4].


Tras esto nos planteamos el objetivo de este trabajo, construiremos un biorreactor para
la hidrlisis de la lactosa procedente de lactosueros, utilizando la enzima -
galactosidasa procedente del hongo Aspergillus oryzae. Para ello caracterizaremos la
enzima, en sus dos estados: libre e inmovilizada en amberlita, estudiaremos la
inhibicin de la actividad por galactosa y tambin estudiaremos la actividad para la
variacin de pH, concentracin de sustrato y temperatura.

4; Materiales:
- -galactosidasa obtenida de Aspergillus oryzae.
- ONPG 4 mM y 40 mM
- Tampn fosfato-citrato 40 mM
- Galactosa 30 mM
- Tampn borato 200 mM a pH=8
- Lactosa
- Mezcla enzimtica, reactivo en exceso de enzimas glucosa oxidasa y peroxidasa
junto con ABTS en tampn fosfato-tris pH=7,3
- Amberlita preactivada IRC-50
- Agua destilada






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5; Mtodos:

Medida de la actividad de la -galactosidasa:

El protocolo para medir la actividad requiere de 1 ml de mezcla de reaccin compuesta
por: tampn fosfato-citrato 40 mM, pH 4,5 (200 l), ONPG 4 mM (500 l), -
galatosidasa 100 g/ml (100l) y agua hasta 1 ml. Esta mezcla de reaccin fue
introducida en diferentes tubos de 10 ml, aadiendo luego la enzima para disparar la
reaccin. La mezcla se tapa con papel de parafina, se agita y se deja incubar durante 10
minutos. Luego se aaden 3 ml de tampn borato 200 mM (a pH 9,8) para detener la
reaccin y medimos su absorbancia.
Se sigui un ensayo para medir la actividad de la -galactosidasa en los diferentes
experimentos realizados: efecto de la variacin del pH del tampn fosfato, la estabilidad
de la enzima a diferentes temperaturas, ensayo en presencia de galactosa a diferentes
concentraciones de ONPG.
Para el caso del efecto del pH en la actividad de la -galactosa, la mezcla de reaccin es
igual que la del ensayo estndar, excepto que el pH del tampn fosfato-citrato va
variando (3,4,5,6,7,8,9,10). A cada pH le corresponde un mismo blanco. Se representar
la actividad frente al pH para obtener el pH ptimo de la enzima.
Cabe anotar que la actividad se ha calculado aplicando la ecuacin de Lambert-Beer.
Con respecto a la medida de la estabilidad trmica de la enzima se prepararon 4 tubos
eppendorf con 1 ml de una disolucin de -galactosidasa a 100 g/ml repartindolos en
baos a 40, 60 y 70 C. Se representara grficamente la actividad enzimtica frente al
tiempo para calcular aproximadamente la vida media de la enzima.





6

Determinacin de las constantes cinticas con ONPG como sustrato:

Se medi la actividad a diferentes concentraciones de ONPG (0.1, 0.2, 0.4, 0.6, 1, 5, 10
y 20 mM) con 30 mM de galactosa y sin galactosa. Al representar la actividad
enzimtica frente a la concentracin de ONPG, con y sin inhibidor, y mediante
regresin no lineal podemos obtener km y Vmax. Conociendo el peso molecular de la
enzima y manipulando las unidades, podemos obtener Kcat y la constante de inhibicin
tambin se puede obtener aplicando la siguiente frmula:
=
[]
1


Determinacin de las constantes cinticas con lactosa como sustrato:

Se realizaran incubaciones en 4 tubos de ensayo, cada tubo contendr 2,8 ml de
disoluciones de lactosa con concentraciones de 100, 70, 40 y 20 mM en tampn fosfato
a pH 4. Se dispara la reaccin aadiendo -galactosidasa (3 mg/ml) tomando una
muestra 200 l a los 5, 10, 20, 40, 60 minutos. Y posteriormente se diluir y se tomaran
0,4 ml para medir luego la glucosa formada por el mtodo de la glucosa-perosidasa.
En primer lugar calcularemos la recta patrn, luego calcularemos la conversiones para
cada tiempo de cada concentracin y luego mediante regresin no lineal obtendremos
las constantes A y B de la siguiente frmula:
ln1 =
Y a partir de A y B obtenemos las constantes cinticas y tambin Kcat ya que
conocemos el peso molecular de la enzima.




7

Inmovilizacin de la -galactosa en amberlita:

La preactivacin de la resina la llevo a cabo el tcnico de laboratorio. Una vez
preactivada la amberlita se dej reposar el tubo con amberlita eliminndose el
sobrenadante por decantacin, a continuacin se aadieron 30 ml de una solucin de -
galactosidasa (3 mg/ml en tampn fosfato 50 mM, pH 7). Se dej incubar con agitacin
durante 80 minutos recogiendo muestras del sobrenadante (100 l) a los 5, 10, 20, 40,
60, 80 minutos. Para determinar la cantidad de enzima en disolucin se realizara una
medida de actividad diluyendo la enzima con tampn fosfato-citrato pH 4,5. Se
representar la evolucin de la actividad con el tiempo, as como el porcentaje de
enzima inmovilizada. Para calcular porcentaje de enzima inmovilizada se utilizar la
siguiente frmula:
% =


100

Determinacin de la porosidad de la amberlita:

Para determinar la porosidad de la amberlita, se aadirn 2 ml de una disolucin
conteniendo ONP 2 mM a 2 ml de amberlita. Se determinar la absorbancia a 410 nm
de la disolucin inicial y de la diluida con amberlita usando un blanco con agua. Para
ello calculremos la absorbancia real y aplicaremos la frmula de concentracin por
volumen inicial sea igual al final.

Hidrolisis de lactosa en el biorreactor:

Se vierte el gel con la enzima inmovilizada en una columna de plstico de 20 ml y 1,3
cm de dimetro y aadimos el tampn fosfato pH 4.5. Despus, se operar el reactor a
distintos caudales para cada concentracin de lactosa: (13,3) (9,1) (4,5) (2,3) para 50
mM, (12,9) (9,4) (4,3) (3,7) para 20 mM, (14,7) (8) (4,1) (3) para 20 mM, (13) (7,7)

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(4,9) (2,9) para 20 mM. Luego dejamos bajar el nivel del reservatorio del tampn del
reservatorio a ras de gel y aadir suero lactosado poco a poco. Anotamos el tiempo de
comienzo y aadimos el suero lactosado, tomamos una muestra de tres gotas, diluimos
cada alcuota de la muestra con agua y medimos la glucosa formada por el mtodo de
glucosa oxidasa/peroxidasa.
Calculamos la conversin de la misma forma que hicimos en la determinacin de las
constantes cinticas con lactosa como sustrato, luego calculamos el tiempo de
resilencia para cada muestra. Conocido el tiempo de resilencia y la conversin mediante
la regresin no lineal Km Vmax y luego Ki. Y por ltimo utilizamos el programa
Berkeley-Madona para comparar los resultados de los diferentes flujos.

6; Exposicin y discusin de resultados:
a) Medida de la actividad de la -galactosidasa:

-Efecto del pH sobre la actividad -galactosidasa de Aspergillus oryzae:

Calculando la actividad mediante la ecuacin de Lambeert-Beer y representando
esta frente a los de pH, obtenemos:



Figura 1. Efecto de la actividad en funcin del pH. Las incubaciones se
llevaron a cabo a temperatura ambiente y se utiliz un mismo blanco.
0
1
2
3
4
5
0 2 4 6 8 10 12
A
c
t
i
v
i
d
a
d

(
U
/
m
g
)
pH
Series2

9


En esta grfica, se puede observar un pH ptimo de 4, ya que en ese punto es
mayor la actividad. A medida que el pH se hace ms bsico la enzima pierde
actividad ya que se desnaturaliza

- Medida de la estabilidad trmica de la enzima:

Calculando la actividad a distintas temperaturas (40, 60 y 70) y representando a
varios tiempos



Figura 2. Efecto de la actividad en funcin del tiempo. Se utiliz un mismo
blanco para todos los casos.
Se puede observar como a medida que aumenta el tiempo la actividad decrece
mucho en las temperaturas altas (60C, 70C), en cambio para 40C la enzima
mantiene su actividad prcticamente constante a partir de los 20 minutos.
Podemos concluir al aumentar la temperatura, la enzima se va desnaturalizando
y va disminuyendo su actividad.

b) Determinacin de las constantes cinticas con ONPG como sustrato:

Calculando la actividad sin y con inhibidor y representando con respecto la
concentracin de ONPG, obtenemos:
0
1
2
3
4
5
6
7
8
0 20 40 60 80
A
c
t
i
v
i
d
a
d

(
U
/
m
g
)
tiempo (min)
Temperatura 40 C
Temperatura 60C
Temperatura 70C

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Figura 3. Efecto de la galactosa sobre distintas disoluciones de ONPG

Se puede observar que a medida que aumenta la concentracin de ONPG la
actividad tambin aumenta, pero tambin cabe destacar como el ensayo en
presencia de galactosa posee menor actividad que el otro ensayo que no posee
inhibidor, esto se debe a que la galactosa al ser producto de la reaccin y tras
aadirla de forma externa desplaza la reaccin hacia la izquierda.

En segundo lugar aplicamos la regresin no lineal representando la actividad y la
concentracin de ONPG obteniendo:

Sin inhibidor: Vm = 8,412 U/mg ; Km = 2,301 mM

Con inhibidor: Vm = 8,91 U/mg; Km = 12,806 mM

Podemos apreciar que el inhibidor es competitivo ya el centro activo se une al
centro activo modificando su valor de Km pero no el de Vmax.

Tambin obtenemos:
Ki= 6, 57 mM
K cat= 883, 26

0
1
2
3
4
5
6
7
8
0 5 10 15 20 25
A
c
t
i
v
i
d
a
d

(
U
/
m
g
)
ONPG (mM)
Sin inhibidor
Con inhibidor
(galactosa 30 mM)

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c) Determinacin de las constantes cinticas con lactosa como sustrato:
Calculamos la absorbancia real (muestra blanco) y la representamos respecto a
la concentracin, obteniendo la recta patrn.




Figura 4. Recta de calibrado

Una vez obtenido calculamos las conversiones para cada caso, teniendo en
cuenta que hay que deshacer la dilucin:


100 mM 70 mM 40 mM 20 mM
tiempo (min) Conversin Conversin Conversin Conversin
5 0,0511 0,0749 0,1264 0,2329
10 0,104 0,14495 0,2384 0,4152
20 0,1977 0,27005 0,4227 0,6634
40 0,359 0,4713 0,6738 0,8945
60 0,4905 0,6206 0,8201 0,9741

Figura 5. Tablas de conversiones respecto al tiempo

y = 8,7688x + 0,0402
R = 0,9996
0
0,2
0,4
0,6
0,8
1
1,2
1,4
1,6
1,8
2
0 0,05 0,1 0,15 0,2 0,25
A
b
s
o
r
b
a
n
c
i
a
concentracin glucosa
RECTA DE CALIBRADO

12

Se puede apreciar como a medida que aumenta el tiempo la conversin tambin
aumenta lo cual es lgico y tambin se puede apreciar como a medida que la
concentracin de lactosa disminuye la conversin aumenta ya que al haber menos se
convierte ms rpido.

Una vez conocidos los datos del tiempo y de las conversiones, mediante regresin lineal
obtenemos A y B. Sumando A y B y representando frente a la concentracin de lactosa,
obtenemos:

Figura 6. Obtencin de la ecuacin de la recta representando (A+B) frente So.
A partir de la recta, se obtiene las constantes cinticas:
Vm = 1, 1213 mM/min; Km = 2, 8518 mM; K cat= 39,235

D) Inmovilizacin de la -galactosa en amberita:
Calculamos las actividades y la representamos con el tiempo, obteniendo:

y = 0,8918x + 2,5433
R = 0,9997
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
0 20 40 60 80 100 120
A
+
B
So (mM)

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Figura 7. Variacin de la actividad de la -galactosidasa en el sobrenadante
respecto al tiempo.
Se puede observar que a medida que pasa el tiempo, la actividad disminuye hasta el
punto de mxima retencin por parte de la amberlita. Como podemos ver a tiempos
mayores de 20 minutos la actividad de la enzima se mantiene prcticamente constante
ya que la resina a este tiempo de 20 minutos no poda retener ms enzima.
Tambin calculamos el porcentaje de enzima inmovilizada que fue del 86%

-Determinacin de la porosidad de la amberlita:
Sabiendo que la mitad de la diferencia del volumen final respecto al inicial es la
porosidad, se obtiene un 46,5 %.

E) Hidrlisis de lactosa en el biorreactor:
Representamos la absorbancia respecto la concentracin de glucosa, obteniendo la recta
patrn:
0
0,002
0,004
0,006
0,008
0,01
0,012
0,014
0,016
0,018
0 20 40 60 80 100
A
c
t
i
v
i
d
a
d

(
U
/
m
g
)
tiempo (min)

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Figura 8. Recta patrn en la hidrlisis de lactosa del biorreactor.

Calculamos las conversiones, para cada muestra y la representamos respecto el caudal
de la siguiente forma:

Figura 9. Efecto del caudal sobre la conversin para diferentes concentraciones de
lactosa.
Se puede observar que a medida que aumenta el caudal la conversin disminuye y que
como es lgico a mayor concentracin, su conversin ser menor.
y = 8,6134x + 0,0393
R = 0,9987
0
0,2
0,4
0,6
0,8
1
1,2
1,4
1,6
1,8
2
0 0,05 0,1 0,15 0,2 0,25
A
b
s
o
r
v
a
n
c
i
a
Concentracin glucosa (mM)
0
0,2
0,4
0,6
0,8
1
1,2
0,0 5,0 10,0 15,0 20,0
C
o
n
v
e
r
s
i

n
Caudal (ml/min)
50 mM
20 mM
10 mM
5 mM

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Calculando el volumen de exclusin igual a 9,2 ml obtenido multiplicando el volumen
de la columna por la porosidad de la amberlita, se puede obtener el tiempo de resilencia
ya que conocemos su caudal. Y aplicando la regresin no lineal obtenemos A y B
So (mM) A B A+B
50 0,131 1,656 1,787
20 0,053 0,946 0,999
10 0,026 0,71 0,736
5 0,013 0,591 0,604

Figura 10. Datos obtenidos mediante la regresin no lineal
Sumando A y B y representando frente la concentracin de lactosa podemos obtener las
constantes cinticas:

Figura11. Obtencin de la ecuacin de la recta
Una vez obtenida la ecuacin calculamos las constantes cinticas:
Vm = 38, 02 mM/min; Km = 18 mM;
Posteriormente, utilizando estas frmulas a las concentraciones ms bajas se obtiene Ki.
= 1

= 1 +

y = 0,0263x + 0,473
R = 1
0
0,2
0,4
0,6
0,8
1
1,2
1,4
1,6
1,8
2
0 10 20 30 40 50 60
A
+
B
So (mM)

16

Aplicando el mtodo Berkeley, obtenemos los siguientes resultados:
50 mM
Tiempo
(min)
C. glucosa
(mM)
X
13,3 4,8 45,83 0,0834
9,1 6,8 44,9 0,102
4,5 13,5 42,7 0,146
2,3 22 39,92 0,2016
20 mM
Tiempo
(min)
C. glucosa
(mM)
X
12,9 4,8 17,35 0,1325
9,4 6,2 16,89 0,1555
4,3 13,4 15,47 0,2265
3,7 15,6 15,1 0,245
10 mM
Tiempo
(min)
C. glucosa
(mM)
X
14,7 3,9 8,31 0,169
8,0 6,5 7,72 0,228
4,1 13,3 6,91 0,309
3,0 15,9 6,48 0,352
5 mM
Tiempo
(min)
C. glucosa
(mM)
X
13 4,3 3,8 0,24
7,7 6,2 3,4 0,32
4,9 9,3 3,14 0,372
2,9 15,6 2,72 0,456

Figura 12. Obtencin de tiempo y concentracin de glucosa. Calculo de conversin.
Representamos la conversin frente al caudal obteniendo:


Figura 13. Efecto del caudal sobre la conversin para diferentes concentraciones
de lactosa.
0
0,1
0,2
0,3
0,4
0,5
0,0 5,0 10,0 15,0 20,0
C
o
n
v
e
r
s
i

n
Caudal (ml/min)
50 mM
20 mM
10 mM
5 mM

17

Se puede observar que siguen la misma relacin que las calculadas anteriormente, ya
que la conversin aumenta a medida que el caudal disminuye.

7; Anexos:

Figura 13. Simulacin del biorreactor. Evolucin de las concentraciones de glucosa
(S) y lactosa (P) con una concentracin inicial de lactosa de 50 mM y un caudal
13,3 ml/min.



Figura 14. Simulacin del biorreactor. Evolucin de las concentraciones de glucosa
(S) y lactosa (P) con una concentracin inicial de lactosa de 50 mM y un caudal 9,1
ml/min.


18


Figura 15. Simulacin del biorreactor. Evolucin de las concentraciones de glucosa
(S) y lactosa (P) con una concentracin inicial de lactosa de 50 mM y un caudal 4,5
ml/min.


Figura 16. Simulacin del biorreactor. Evolucin de las concentraciones de glucosa
(S) y lactosa (P) con una concentracin inicial de lactosa de 50 mM y un caudal 2,3
ml/min.


Figura 17. Simulacin del biorreactor. Evolucin de las concentraciones de glucosa
(S) y lactosa (P) con una concentracin inicial de lactosa de 20 mM y un caudal
12,9 ml/min.


19


Figura 18. Simulacin del biorreactor. Evolucin de las concentraciones de glucosa
(S) y lactosa (P) con una concentracin inicial de lactosa de 20 mM y un caudal 9,4
ml/min.


Figura 19. Simulacin del biorreactor. Evolucin de las concentraciones de glucosa
(S) y lactosa (P) con una concentracin inicial de lactosa de 20 mM y un caudal 4,3
ml/min.


Figura 20. Simulacin del biorreactor. Evolucin de las concentraciones de glucosa
(S) y lactosa (P) con una concentracin inicial de lactosa de 20 mM y un caudal 3,7
ml/min.


20


Figura 21. Simulacin del biorreactor. Evolucin de las concentraciones de glucosa
(S) y lactosa (P) con una concentracin inicial de lactosa de 10 mM y un caudal
14,7 ml/min.


Figura 22. Simulacin del biorreactor. Evolucin de las concentraciones de glucosa
(S) y lactosa (P) con una concentracin inicial de lactosa de 10 mM y un caudal 8
ml/min.

Figura 23. Simulacin del biorreactor. Evolucin de las concentraciones de glucosa
(S) y lactosa (P) con una concentracin inicial de lactosa de 10 mM y un caudal 4,1
ml/min.


21


Figura 24. Simulacin del biorreactor. Evolucin de las concentraciones de glucosa
(S) y lactosa (P) con una concentracin inicial de lactosa de 10 mM y un caudal 3
ml/min.


Figura 25. Simulacin del biorreactor. Evolucin de las concentraciones de glucosa
(S) y lactosa (P) con una concentracin inicial de lactosa de 5 mM y un caudal 13
ml/min.


Figura 26. Simulacin del biorreactor. Evolucin de las concentraciones de glucosa
(S) y lactosa (P) con una concentracin inicial de lactosa de 5 mM y un caudal 7,7
ml/min.

22


Figura 27. Simulacin del biorreactor. Evolucin de las concentraciones de glucosa
(S) y lactosa (P) con una concentracin inicial de lactosa de 5 mM y un caudal 4,9
ml/min.

Figura 28. Simulacin del biorreactor. Evolucin de las concentraciones de glucosa
(S) y lactosa (P) con una concentracin inicial de lactosa de 5 mM y un caudal 2,9
ml/min.

7; Bibliografa:

[1] Wierzbicki, L.E. y Korikowski (Lactase potencial of microorganisms grow
in whey). P 26
[2] Rodrguez Martnez, D y Prez Mndez. (Intolerancia a la lactosa). P 143
[3] Garcia Garibay, Quintero R, Mungua Canales. Biotecnologa alimentaria.
Limusa. P 152- 161
[4] Toshiba Haider, Qayyum Husain. Depatment of Biochemistry, Faculty of life
Sciences, Aligarh Muslim University, Aligarh 202002, UP, India.
[5] REACTORES ENZIMATICOS EN EL PROCESAMIENTO DE
RESIDUOS AGROINDUSTRIALES. Residuos lcteos con -galactosidasa
inmovilizada. Julio A. Sols-Fuentes. Carmen Duran-Domnguez. P 98 y 99.