Manual 2008

1
UNIVERSIDAD DE ANTIOQUIA
FACULTAD DE QUMICA FARMACUTICA
DEPARTAMENTO DE FARMACIA

MANUAL DE PRCTICAS DE LABORATORIO DE
FARMACOGNOSIA Y FITOQUMICA 200 8

Recopilado y revisado por:
ALEJANDRO MARTINEZ M.
GLORIA AMPARO VALENCIA P.
NORA JIMENEZ U.
MONICA MESA
ELKIN GALEANO J.

Medelln, Mayo de 2008
2

PROGRAMA DEL CURSO DE LABORATORIO DE FARMACOGNOSIA Y
FITOQUMICA 2008

Objetivo general

Al finalizar el curso el estudiante estar en capacidad de evaluar, extraer,
aislar, caracterizar e ident ificar sustancias naturales de origen biolgico.

Temas del curso

1. INTRODUCCIN. Duracin: 6 Horas
Presentacin del curso
Entrega de Equipos
Normas de laboratorio

2. RECONOCIMIENTO DE LA FLORA UNIVERSITARIA. TAXONOMIA
VEGETAL. PRESENTACIN DE UN EJEMPLAR CON SU CLASIFICACIN.
Duracin: 6 Horas

3. RECONOCIMIENTO DE METABOLITOS SECUNDARIOS. Duracin: 6 Horas

4. TECNICAS GENERALES DE AISLAMIENTO, SEPARACIN Y
PURIFICACIN (CROMATOGRAFIA EN CAPA FINA Y EN COLUMNA).
Duracin: 12 Horas

5. RECONOCIMIENTO DE ADULTERACI ONES Y/O FALSIFICACIONES
(OBSERVACIN DE DROGAS PULVERIZADAS). Duracin: 6 Horas

6. RECONOCIMIENTO CROMATOGRFICO DE PLANTAS MEDICINALES
APROBADAS EN COLOMBIA. Duracin: 6 Horas

7. FENILPROPANOS (ACEITES ESENCIALES). Duracin: 12 Horas

8. TECNICAS GENERALES DE E XTRACCIN Y VALORACION DE UNA
DROGA Duracin: 12 Horas

9. MARCHA FITOQUIMICA. Duracin: 18 Horas
3

10. PRACTICA ESPECIAL. Duracin: 60 Horas
Revisin bibliogrfica y elaboracin de un anteproyecto. Duracin: 12 Horas
Trabajo en el Laboratorio (Desarrollo exper imental). Duracin: 36 Horas
Pster: Elaboracin 6 Horas, Presentacin: 6 Horas

Contenido: Elaboracin de un fitofrmaco. Aislamiento y caracterizacin de
metabolitos secundarios.

PRESENTACIN

Este MANUAL DE PRCTICAS DE LABORATORIO DE FARMACOGNOSIA Y
FITOQUMCA 2008, corrige y modifica parcialmente el manual publicado en marzo
de 2003 (ISBN 958-655-682-4).

CONTENIDO

Pg.
PRACTICA
No. 1
RECONOCIMIENTO DE LA FLORA UNIVERSITARIA,
TAXONOMA VEGETAL, PRESENTACIN DE UN
EJEMPLAR CON SU CLASIFICACIN

-
PRACTICA
No. 2
RECONOCIMIENTO DE METABOLITOS SECUNDARIOS 19
PRACTICA
No. 3
TCNICAS GENERALES DE AISLAMIENTO, SEPARACIN
Y PURIFICACIN (CROMATOGRAFA EN CAPA FINA Y EN
COLUMNA)

5
PRACTICA
No. 4
RECONOCIMIENTO DE ADULTERACIONES Y/O
FALSIFICACIONES (OBSERVACIN MICROSCPICA DE
DROGAS PULVERIZADAS)

22
PRACTICA
No. 5
RECONOCIMIENTO CROMATOGRFICO DE PLANTAS
MEDICINALES APROBADAS EN COLOMBIA

38
RECONOCIMIENTO POR CCF DEL AJENJO 38
RECONOCIMIENTO POR CCF DEL AJO 38
RECONOCIMIENTO POR CCF DE LA ALCACHOFA 39
RECONOCIMIENTO POR CCF DE LA ALBAHACA 40
RECONOCIMIENTO POR CCF DE LA HIERBABUENA 40
RECONOCIMIENTO POR CCF DEL HINOJO 41
RECONOCIMIENTO POR CCF DE LA MALVA 42
RECONOCIMIENTO POR CCF DE LA MANZANILLA 43
4
MATRICARIA
RECONOCIMIENTO POR CCF DEL ROMERO 43
RECONOCIMIENTO POR CCF DE LA SABILA 44
RECONOCIMIENTO POR CCF DE FLORES DE SAUCO 45
RECONOCIMIENTO POR CCF DE HOJAS DE TORONJIL 45
RECONOCIMIENTO POR CCF DE VALERIANA 46
PRACTICA
No. 6
FENILPROPANOS (ACEITES ESENCIALES) 47
PRACTICA
No. 7
TCNICAS GENERALES DE EXTRACCIN Y VALORACIN
DE UNA DROGA: VALORACION DE ALCALOIDES DEL
TROPANO, VALORACION DE RUTINA, VALORACION DE
ANETOL

52
PRACTICA
No. 8
MARCHA FITOQUMICA 68
PRACTICA
No. 9
PRACTICA ESPECIAL -
Pautas para la elaborac in del informe de laboratorio 80

5
PRACTICA N 2
RECONOCIMIENTO DE METABOLITOS SECUNDARIOS
OBJETIVO
Distinguir y clasificar los diferentes metabolitos secundarios presentes en el tejido
vegetal por medio de pruebas qumicas de coloracin y precipitacin.

Consultar:
Domnguez, X. A., Mtodos de Investigacin Fitoqumica, Ed.Limusa,Mxico,
1973.Captulo 3.

MARCO TERICO

Metabolitos Primarios:
Son los productos qumicos necesarios para la vida, resultantes del metabolismo
vital de todo ser vivo, son: los carbohidratos, los lpidos, las protenas y los cidos
nucleicos.

Metabolitos Secundarios:
Otros compuestos llamados metabolitos secundarios son subproductos de rutas
metablicas normales que ocurren en ciertas especies, siendo particulares dentro
de un grupo taxonmico, estado de vida o tejido presentando una distribucin
restringida dentro del Reino Vegetal dando origen a la quimiotaxonoma. Su
ocurrencia depende de condiciones externas tales como ataques de patgenos,
predadores, cambios trmicos o l umnicos, deficiencias nutricionales o presencia
de otros organismos intra o interespecficos. El metabolismo secundario es una
caracterstica fundamental de la especializacin, es decir que el compuesto
resultante, puede no ser importante para la clula pero s para el organismo como
un todo. Los metabolitos secundarios pueden ser bioactivos, pero no jugar un
papel esencial en los procesos fisiolgicos del organismo. Algunos metabolitos
secundarios son residuos bioqumicos, es decir, productos de activ idad
enzimtica de substratos no apropiados o productos de destoxificacin o desecho
de importancia para la supervivencia y la buena condicin de los organismos. Con
pocas excepciones, los metabolitos secundarios pueden clasificados dentro de
cinco grupos, de acuerdo con su base biosinttica: fenilpropanos, acetogeninas,
terpenoides, esteroides y alcaloides.

Reconocimientos de Metabolitos:
El reconocimiento de metabolitos secundarios se realiza por medio de pruebas
fitoqumicas preliminares, las cuales son una prueba qumica de caracterizacin
consistente en una reaccin qumica que produce alteracin rpida en la
6
estructura molecular de un compuesto, por ejemplo, la modificacin de un grupo
funcional, la apertura de un sistema anular, la formacin de un ad ucto o un
complejo, lo cual da por resultado una manifestacin sensible como el cambio de
un color, la formacin de un precipitado o el desprendimiento de un gas, dndonos
indicios de la presencia o ausencia de un metabolito secundario en particular.

Reconocimiento de Alcaloides:
Los alcaloides son sustancias bsicas que contienen nitrgeno en un anillo
heterocclico, son derivados de aminocidos, presentan distribucin taxonmica
limitada y se encuentran en plantas superiores como sales de un cido org nico.
N
N
CH
3
Nicotina

Atendiendo a su solubilidad, propiedad empleada para extraerlos y purificarlos, la
base del alcaloide es soluble en solventes orgnicos y pueden formar sales
solubles en solventes polares cuando se encuentra en cidos minerales diluidos.

Reconocimiento de Flavonoides:
O
OH
(+)-Catequina

Los Flavonoides son compuestos polifenlicos con quince tomos de carbono,
cuya estructura consta de 2 anillos de benceno unidos por una cadena lineal de
tres carbonos. El esqueleto de los flavonoides se representa por el sistema C6
C3 C6.

Reconocimiento de Cardiotnicos:
Una aglicona cardiotnica, estructuralmente esta constituida por el sistema anular
esteroidal (ciclo pentano perhidrofenantreno) con los grupos metilos C18 y C-19,
7
un grupo hidroxilo en el carbono 3 y un anillo lactnico - insaturado de cuatro
carbonos unido al carbono 17 del ncleo esteroidal.
3
O
CH
3
OH
CH
3
OH
O
O
O
C H
3
OH
O H
Digoxin

Estas agliconas toman el nombre de cardenlidas por presentar acti vidad
estimulante sobre el msculo cardiaco, cuando estn en forma de glicsidos.

Reconocimiento de Saponinas:
Las saponinas son un grupo de glicsidos solubles en agua, que tienen la
propiedad de hemolizar la sangre y disminuir la tensin superficial d el agua,
formando espuma abundante. Las saponinas por hidrlisis se desdoblan en
carbohidratos y una aglicona llamada sapogenina.
CH
3
CH
3
O H
O
C H
3
O
CH
3
Diosgenina

La sapogenina puede tener el sistema anular esteroidal o el de un triterpeno
pentacclico. Los anillos E y F de la saponina estereoidal conforman el llamado
sistema espirostanal. El en lace glicosdico siempre se forma con el oxigeno del
carbono 3.

8

Reconocimiento de Cumarinas:
Las cumarinas son un grupo muy amplio de principios activos fenlic os y tienen en
comn la estructura qumica de 1 -benzopiran-2-ona. Se caracterizan porque
presentan fluorescencia bajo la luz ultravioleta a 365 nm.

O O

Reconocimiento de Taninos:

Los taninos son productos de excrecin de muc has plantas, involucrados en
mecanismos de defensa de las mismas, contra organismos parsitos. Se
encuentran ms comnmente en hojas, ramas y debajo de la corteza.
Qumicamente los taninos son polmeros de polifenoles, sustancias con alto peso
molecular (comprendido entre 500 a 3000), se clasifican en:
Taninos Hidrosolubles o Piroglicos: Son steres fcilmente hidrolizables
formados por una molcula de azcar (en general glucosa) unida a un nmero
variable de molculas de cidos fenlicos (cido glico o su dmero, el cido
elgico). Son comunes de observar en plantas Dicotiledneas.
O
OH
OH
O H
OH
O
COOH
O H OH
OH
c. Glico
c. Elgico
O O H
OH OH
OH
OH
Leucoantocinidina
Flavan 3,4-diol
Leucopelargonidin

Taninos no Hidrosolubles Condensados : Tienen una estructura qumica similar a
la de los flavonoides. Por hidrlisis dan azcar y cido elgi co, algunos taninos
condensados son conocidos como pro -antocianidinas porque por hidrlisis cida
producen antocinidinas y leucoantocinidinas.
9
Reconocimiento de Esteroides y/o Triterpenoides:
CH
3
CH
3
C H
3
CH
3
CH
3
O H
CH
3
Ergosterol

Los esteroides son compuestos cuya estructura presenta el sistema anular del
ciclopentano perhidrofenantreno, metilos en los carbonos 10 y 13 y un radical
lineal en el carbono 17.

Reconocimiento de Quinonas:
Las quinonas son dicetonas cclicas insaturadas que por reduccin se convi erten
en polifenoles, siendo reversible esta reaccin. Las quinonas derivan su nombre
del miembro ms simple de la serie: la p -benzoquinona obtenida en 1838 por
Woskresensky, como producto de oxidacin del cido qunico.
O
O
Antraquinona

Las quinonas, por el sistema aromtico que dan al reducirse se pueden clasificar
en Benzoquinonas, Naftoquinonas, Antraquinonas (las ms numerosas) y
Fenantroquinonas (las menos numerosas).

Reconocimiento de Antocianinas:
Las antocianinas son pigmentos fla vonoides que se comportan como indicadores
cido base debido al proceso:
10
HO-
H+
HO-
H+
O
+
O H
OH
OH
OH
pH < 3
Catin cianina
O O H
OH
OH
O
pH 8.5
Base cianina
O O H
OH
O
-
O
pH > 11
Anin cianina
Pelargonidina

Estos pigmentos suelen presentarse en forma de glucsidos, lo que explica su
solubilidad en agua y la fcil extractabilidad por solventes acuosos. Se encuentran
en la savia de las plantas, y a menudo en forma de slidos amorfos o cristalinos
en las hojas de tejido leoso y frutos. Su color esta algunas veces enmascarado
pro otros pigmentos, como la clorofila.

Procedimiento Experimental
1. Recolectar y preparar las muestras frescas

2. Reconocimiento de alcaloides
Desmenuzar finamente en un mortero, unos 10 g. de muestra fresca y colocarlos
en un erlenmeyer. Aadir un volumen suficiente de HCl al 5% para que toda la
muestra est en contacto con la solucin cida. Calentar con agitacin al bao
mara durante unos 5 minutos. Enfriar. Filtrar.
Colocar en 4 tubos de ensayo 2 ml de filtrado cido fro. Aadir a cada uno 2 gotas
de los reactivos de Dragendorff, Mayer, Valser y Reineckato de amonio. Si se
observa t urbidez o precipitados en por lo menos 3 tubos, se considera que la
muestra contiene alcaloides.
Nota: antes de realizar el ensayo con la muestra biolgica, ensayar con un
estndar de quinina en solucin cida.

3. Reconocimiento de Flavonoides. Leucoantoc ianidinas y Cardiotnicos
En un erlenmeyer colocar unos 10 g. de muestra fresca finamente desmenuzada.
Aadir un volumen suficiente de alcohol etlico que cubra toda la muestra y le
confiera fluidez. Calentar al bao mara durante unos 5 minutos, con agita cin.
Enfriar. Filtrar. Si hay presencia de clorofilas, al filtrado aadirle un volumen igual
de solucin de acetato de plomo al 4% que contenga cido actico al 0.5 %,
11
agitar, dejar reposar 15 minutos y filtrar. Con el filtrado realizar ensayos de
reconocimiento de flavonoides, leucoantocianidinas y cardiotnicos.

a) Ensayo para flavonoides
Colocar varias limaduras de magnesio en un tubo de ensayo. Aadir unos 2 ml del
filtrado y por la pared del tubo, gota a gota dejar caer varias gotas de HCl
concentrado. La aparicin de colores naranja, rosado, rojo o violeta es prueba
positiva para la existencia de flavonoides en la muestra.
Nota: antes de realizar el ensayo con la muestra biolgica, ensayar con un
estndar de rutina o quercetina en solucin acuo -alcohlica.

b) Ensayo para Leucoantocianidinas
Colocar unos 2 ml del filtrado en un tubo de ensayo. Aadir 1 ml de cido
clorhdrico concentrado. Calentar en bao de agua hirviendo durante 15 minutos.
La aparicin de

coloraciones rojas es prueba positiva d e la existencia de leucoantocianidinas en la
muestra.

c) Ensayo para Cardiotnicos
En un tubo de ensayo colocar 1 ml de filtrado. Aadir 0.5 ml de Reactivo de Kedde
(mezclar 1 ml de solucin A con 1 ml de solucin B para preparar este reactivo
antes de
su uso). La aparicin de coloraciones violetas o prpuras es prueba positiva de la
existencia de cardiotnicos en la muestra.

4) Ensayo para saponinas
Desmenuzar con ayuda de un mortero unos 10 g de muestra fresca, con ayuda de
unos pocos ml de agua. Filtr ar. Agitar en un tubo de ensayo tapado, unos 4 ml de
filtrado acuoso, vigorosamente durante un minuto. La formacin de una espuma
abundante y estable es prueba presuntiva de la presencia de saponinas en la
muestra.

5) Ensayo para taninos
Desmenuzar con ay uda de un mortero unos 10 g de muestra fresca, con ayuda de
unos pocos ml de agua. Filtrar. Tomar 1 mL de filtrado acuoso en un tubo de
ensayo. aadir 1 ml del Reactivo Gelatina -Sal. Si se forma un precipitado,
centrifugar a 2000 RPM durante 5 minutos. Des echar el sobrenadante. Redisolver
12
el precipitado en 2 mL de Urea 10M. Aadir 2 -3 gotas de solucin de cloruro
frrico al 10%.
La formacin de precipitado al agregar el reactivo de gelatina, y la aparicin de
colores o precipitados verdes, azules o negros e s prueba positiva de la presencia
de taninos en la muestra.

6) Ensayo para Triterpenoides y/o esteroides
Moler la muestra vegetal seca. Agregar un volumen suficiente de cloroformo o
diclorometano y extraer por agitacin. Filtrar. Si el filtrado es turbio contiene
humedad, secarlo agregando sulfato de sodio anhidro y filtrar. En un tubo de
ensayo limpio y completamente seco, colocar 1 ml de filtrado orgnico. Aadir 1 ml
de anhdrido actico. Por la pared del tubo y con mucha precaucin, dejar resbalar
1-2 gotas de cido sulfrico concentrado. La formacin de colores azules, violetas,
rojos o verdes es prueba positiva de que la muestra contiene Esteroides y/o
Triterpenoides.

7) Ensayo para Quinonas
Ensayo con una fraccin :
Colocar en un tubo de ensayo unos 5 ml de filtrado acuoso. Aadir 1 ml de
perxido de hidrgeno al 20% y 1 ml de cido sulfrico al 50%. Calentar la mezcla
en un bao de agua hirviendo durante 15 minutos. Enfriar. Aadir 5 ml de tolueno.
Agitar sin emulsionar. Recuperar la fase tolunica. Trasvasar 2 ml fase tolunica a
un tubo de ensayo. Aadirle 1 ml de una solucin de NaOH al 5% con amoniaco al
2%. Agitar sin emulsionar. Si la capa acuosa toma una coloracin rosada a roja
intensa es prueba positiva de la presencia de quinonas en la mues tra.

Ensayo directo:
Colocar 5 g de muestra fresca ( 1 g de muestra seca y molida), en un sistema de
reflujo, agregar 25 ml de HCl 5%. Reflujar 5 minutos. Dejar enfriar y filtrar. Con el
filtrado acuoso proceder como se describe para el ensayo con una fraccin
acuosa.

8. Reconocimiento de Antocianinas
En un erlenmeyer colocar unos 100 g. de muestra fresca finamente desmenuzada.
Aadir unos 200 ml de agua. Calentar a ebullicin durante unos 5 minutos. Filtrar.

13
Ensayo
En un tubo de ensayo colocar 2 ml de f iltrado. Aadir 1 ml de NaOH diluido.
Observar el color formado.
En otro tubo de ensayo colocar otros 2 ml de filtrado. Aadir unas 6 gotas de un
cido mineral diluido. Observar el color formado. -
Las antocianinas se reconocen por producir diferentes color es a diferentes pH.

9. Reconociemiento de Cumarinas.
En un tubo de ensayo grande colocar 1 g de material vegetal fresco y macerado y
agregar cantidad suficiente de etanol comercial que cubra el material vegetal.
Cubrir la boca del tubo de ensayo con un pa pel filtro blanco y sujetarlo con unas
pinzas para tubo de ensayo o con una banda elstica. Agregarle unas gotas de
NaOH diluido en el papel filtro que cubre la boca del tubo de ensayo. Calentar
hasta ebullicin el tubo de ensayo por 5 minutos, enfriar y r etirar el papel filtro.
Observar bajo luz ultravioleta a 365 nm la aparicin de una coloracin fluorescente
que puede ser: verde, amarilla, roja en el papel filtro.
Nota: El papel filtro normalmente se observa azul fluorescente bajo la luz
ultravioleta de 365 nm.

Plantas con alcaloides: Datura sp. (borrachero), hojas y flores.
Catharantus roseus (cortejo), hojas.
Hojas de tabaco, t.
Plantas con flavonoides: Ptalos de rosas rojas y amarillas.
Ptalos de lirio africano.
Plantas con saponinas: Hojas de Agave sp.(penca sbila).
Fruto de Solanum quitoense (lulo).
Cscara de Dioscorea ssp. (ame).
Plantas con taninos: Hojas de plantago (llantn). Hojas de guayaba
T (Thea sinensis), hojas.
Uvas (Vitis vinifera).
Pltano o guineo (Musa ssp. ).
Agallas de alepo ( Querquis ssp. ).
Corteza de casco de vaca ( Bahuinia picta).
Plantas con esteroides: Semillas de Glicine max (soya).
Aceite de oliva (Olea europeae).
Plantas con cardiotnicos: Azuceno de la habana, hoj as.
Plantas con antocianinas: Repollo morado.
14
Hojas de guardaparque.
Moras.
Uvas sin hollejo.
Plantas con quinonas: Ruibarbo (rizomas)

6. Reactivos y materiales necesarios por grupo
150 ml HCl al 5%
1 ml perxido de hidrgeno al 20%
50 ml Acetato de plomo al 4% con cido actico al 0.5%
2 ml Urea 10M
gotas de FeCl
3
al 10%
2 ml de cido sulfrico al 50%
2 ml de solucin NaOH al 5% con amoniaco al 2%
R. Dragendorff, Valser, Mayer y Reineckato de amonio.
R. gelatina-sal
R. Kedde soluciones A y B
200 ml etanol
50 ml diclorometano
5 ml benceno
2 ml anhdrido actico
Acido sulfrico concentrado
Acido clorhdrico concentrado
5 papeles de filtro
limaduras de magnesio
sulfato de sodio anhidro
centrifuga 2000 RPM y 2 -4 tubos
cuchillo.

15
Prctica 3
TCNICAS GENERALES DE AISLAMIENTO, SEPARACIN Y PURIFICACIN
(CROMATOGRAFA EN CAPA FINA Y EN COLUMNA)

OBJETIVOS
Seleccionar de una serie eluotrpica el eluente que mejor separe los
carotenoides presentes en diferentes muestras vegetales.
Con el mejor eluente, fraccionar cromatogrficamente el extracto de
carotenoides, hasta aislar compuestos puros y caracterizarlos por mtodos
de coloracin, cromatogrficos y espectrales.
Identificar los carotenoides presentes en el material vegetal asignado para
anlisis.

BASE DEL MTODO
La muestra aplicada en la fase estacionaria es adsorbida en la superficie del
material por la accin de fuerzas electrostticas (fuerzas de Van der Waals,
puentes de Hidrgeno, efectos inductivos, etc.) y para su posterior liberacin de
acuerdo a la constante de afinidad de por los constituyentes de la muestra por la
fase mvil.

MARCO TERICO

CROMATOGRAFA
La cromatografa (chromo= color y graphie=escritura, escribir en colores) fue
inventada el 1903 por el botnico ruso Mikhail Tswe tt.
Ismailov y Scraiber utilizaron lminas de vidrio para colocar capas muy delgadas
de almina y luego aplicaron extractos vegetales, dando as la primera forma de
cromatografa de capa fina. Egon Stahl (1956) di el nombre de cromatografa de
capa fina, estandariz los procedimientos, equipos y adsorbentes dando un auge a
esta tcnica simple, econmica y eficiente.

TERMINOLOGA
Fase Estacionaria (Adsorbente)
Es una de las dos fases que forman un sistema cromatogrfico. Puede ser un
slido, un gel o un l quido. Si es un lquido, puede estar distribuido en un slido, el
cual puede o no contribuir al proceso de separacin. El lquido puede tambin
estar qumicamente unido al slido (Fase Ligada) o inmovilizado sobre l (Fase
Inmovilizada). Los adsorbentes m s utilizados son
16
Silica gel (se utiliza en el 80% de las separaciones)
xido de Aluminio Almina (cida, neutra bsica)
Tierra Silcea Kieselguhr
Celulosa (Nativa o micro -cristalina)
Poliamidas.
Estos sorbentes varian en tamao de partcula, da metro del poro, homogeneidad
y pureza.

Fase Mvil (eluente)
Es el fluido (solvente o mezcla de solventes) que se filtra a travs o a lo largo del
lecho estacionario (fase estacionaria), en una direccin definida. Puede ser un
lquido (Cromatografa Lquid a), un gas (Cromatografa de Gases) o un fluido
supercrtico (Cromatografa con Fluido Supercrtico). Cuando se utiliza un lquido
como fase mvil mediante una serie eluotrpica (Tabla 1) se escoge la mejor
combinacin de solventes miscibles para una buena separacin cromatogrfica de
una muestra en sus componentes.

Tabla 1. Serie eluotrpica de solventes
Hidrocarburos ligeros (ter de petrleo, hexano, heptano. etc.)
Ciclohexano
Tetracloruro de carbono
Tricloroetileno
Tolueno
Benceno
Diclorometano
Cloroformo
Eter etlico
Acetato de etilo
Acetona
n-Propanol
Etanol
Metanol
Agua

Muestra
Mezcla consistente en cierto nmero de componentes, cuya separacin se
pretende en el lecho cromatogrfico al ser arrastrados o eluidos por la fase mvil.

17
Componentes de la Muestra
Los constituyentes qumicamente puros de la muestra. Pueden no ser retenidos
por la fase estacionaria (es decir, no retardados), retenidos parcialmente (es decir,
eluidos a tiempos diferentes) o retenidos permanentemente.

CLASIFICACIN DE LA CROMATOGRAFA

Clasificacin de acuerdo a la forma del lecho cromatogrfico
Cromatografa en Columna
Cromatografa Plana

Clasificacin de acuerdo al estado fsico de la fase mvil
Cromatografa de Gases (GC)
Cromatografa Lquida (LC)
Cromatografa con Fluido Supercrtico (SFC)

Clasificacin de acuerdo al mecanismo de separacin
Cromatografa de Adsorcin
Cromatografa de Reparto
Cromatografa de Intercambio Inico
Cromatografa de Exclusin
Cromatografa de Afinidad

Tcnicas especiales
Cromatografa con Fase Invertida
Cromatografa con Fase Normal
Anlisis Isocrtico
Elusin con Gradiente
Cromatografa Bidimensional

CROMATOGRAFA EN COLUMNA (CC)
Es una tcnica de separacin en la que el lecho estacionario est contenido dentro
de un tubo de vidrio vertical. La muestra es aplicada lquida o slida (adsorbida por
fase la estacionaria). Posteriormente se agrega el eluente por la parte superior del
tubo cromatogrfico y se recogen volmenes definidos por el analista de eluente
luego de ser elu do por el tubo cromatogrfico, separando una muestra en sus
componentes como se ilustra en la figura 1:
18

Figura 1. Diagrama de una cromatografa en columna.

CROMATOGRAFA EN CAPA FINA (CCF)
Es la tcnica de separacin en la qu e la fase estacionaria est sobre un plano
formando una capa de partculas slidas extendida sobre un soporte, tal como una
placa de vidrio o aluminio ((Thin Layer Chromatography, TLC), la muestra es
aplicada en puntos o en banda, para posteriormente ser e luda dentro de un
tanque cromatogrfico como se ilustra en la figura 2.
Marca de
fin
Marca de
inicio
Muestra
Eluente

Figura 2. Diagrama de una cromatografa en capa fina

Recolector
de fracciones
19
Si los componentes de la muestra (manchas) no son coloreados, se requiere de
mtodos que nos permitan visualizarlos componente presentes. Este
procedimiento tambin se conoce este como revelado de la placa.
El revelado de las placas se puede realizar mediante dos mtodos:
Mtodo qumico (por inmersin o rociado de reactivos coloreantes). Se
obtienen derivados coloreados o fluo rescentes de los componentes de la
muestra.
Mtodo fsico (pticos). Generalmente se utiliza mediante la radiacin con
luz UV a la placa cromatogrfica a 254nm y/o 365nm.

La cromatografa en capa fina como mtodo cualitativo y cuantitativo, siempre
requiere contar con un estndar de referencia para comparar su valor de factor de
retardo (Rf) y el color de la mancha del estndar al ser revelada con agentes
qumicos, con los datos experimentales obtenidos.

El factor de retardo (Rf) es un valor relativo par a cada sustancia y depende de las
condiciones cromatogrficas con que se haya trabajado (fase mvil, fase
estacionaria, eluente y el tiempo de saturacin). Se define como el cociente entre
la distancia recorrida por el centro de la mancha y la distancia re corrida
simultneamente por la fase mvil como se ilustra en la figura 3.

Distancia
recorrida por
la fase mvil
(X)
Destancia recorrida
por cada muestra
a
b
c

Figura 3. Factor de retardo de una muestra.

Rf para la mancha 1 = a / X
Rf para la mancha 2 = b / X
Rf para la mancha 3 = c / X

Los valores de Rf siempre son menores o iguales a uno (Rf = 1).

20
CAROTENOIDES
Los tetraterpenoides ms conocidos son los pigmentos liposolubles amarillos -rojos
denominados carotenoides, los cuales se encuentran ampliamente distribuidos en
el reino vegetal y en diversos tipos de tejidos. Se conocen al go ms de 400
carotenoides. A los pigmentos hidrocarbonados se les denomina CAROTENOS, y
a los oxigenados XANTOFILAS. Se conocen tambin tetraterpenos incoloros
como el fitoeno y el fitoflueno, pero han sido menos estudiados que los
carotenoides. La nica diferencia estructural entre los tetraterpenoides coloreados
e incoloros es el mayor nmero de enlaces dobles conjugados en los primeros.
Los tetraterpenoides, a diferencia de otras clases de terpenoides, no poseen
sistemas anulares complejos y son acclic os, mono- o biciclicos. Los miembros
acclicos contienen bsicamente el siguiente esqueleto:

Debe notarse que la molcula es simtrica a cada lado de la lnea punteada y
puede racionalizarse como la unin de dos radicales diterpnicos tipo fitilo. Las
variaciones se introducen por enlaces dobles y grupos funcionales tales como
hidroxilos, epxidos, carboxilos, etc. A medida que se aumenta el nmero de
enlaces dobles se incrementa la posibilidad de isomerismo CIS-TRANS, y muchos
de los problemas de la q umica de los carotenoides proviene de la dificultad para
distinguir y separar ismeros geomtricos de este tipo. La mayora de los
carotenoides nativos son todo trans, y al nombrarlos se asume por defecto que
tienen la configuracin trans a menos que se cite la geometra cis.
La ciclizacin puede ser a uno o ambos lados de la cadena. Cuando solo hay
ciclizacin en uno de los extremos se les denomina carotenoides del tipo IONONA:

21
Algunos pigmentos como la bixina y la crocetina tienen menos de 40 carbono s
pero se clasifican como carotenoides porque las peculiaridades de su estructura
sugieren que se derivan de la degradacin de carotenoides, en lugar de producirse
a partir de unidades ms pequeas. Los apo -carotenoides son compuestos C -27 o
C-30 derivados probablemente de la degradacin de Xantofilas.
Hasta el momento no ha sido asignada ninguna funcin general a los
carotenoides.
Existen indicios de que son receptores de luz para el fototropismo. Como los
pigmentos florales podran participar en la atracc in de insectos, pero
principalmente se cree que funcionan como pigmentos de cloroplastos de las
hojas. Hasta cierto grado la luz absorbida por los carotenoides puede transferirse
a la ferredoxina o la clorofila, donde es usada para la fotosntesis. Tambi n se
tienen evidencias de que los carotenoides protegen a la clorofila contra la
fotodestruccin por luz de corta longitud de onda p. ej: Longitudes de onda
cercanas a 400 nm donde tanto las clorofilas como los carotenoides absorben
intensamente. Las plant as albinas carecen de carotenoides y clorofilas bajo
condiciones normales de crecimiento, pero bajo luz dbil son capaces de acumular
clorofila. En condiciones normales de luz la clorofila se destruye rpidamente
porque los carotenoides no estn presentes para protegerla.
El carotenoide ms ampliamente distribuido es el ? -caroteno, el cual constituye
casi el 0.1% de las hojas verdes secas. La lutena es la xantofila ms importante
de hojas y puede encontrarse en mayores concentraciones que el ? -caroteno. La
mayora de carotenoides tienen la misma cadena central del ? -caroteno y difieren
solamente en las porciones correspondientes a los dos anillos.

22
PROCEDIMIENTO EXPERIMENTAL

REACTIVOS Y MATERIALES NECESARIOS POR GRUPO
30g de muestra vegetal fresca triturada o rallada (Tomate de alio rojo,
Pimentn verde-rojo, zanahor ia, Pimentn rojo, ahuyama, mango cscara roja,
pasta de tomate, salsa de tomate, espinacas, etc.)

Erlenmeyer 250 ml
Slica gel para columna
1 columna de cromatografa
n-hexano puro ( ter de petrleo)
Acetato de etilo puro
Metanol etanol para extraer
(destilado)
Algodn o gasa
Papel filtro
Sulfato de sodio anhidro 15g.
Capilares

Tubos de ensayo limpios
Lpiz de grafito
Tanque para cromatografa
Bao Mara
Rotaevaporador
Mortero con pistilo
Licuadora
Espectrofotmetro UV-Visible
Etanol puro 50mL.

NOTA= Consultar los carotenoides presentes en el material vegetal asignado para
esta prctica y su color antes de ir a la seccin de clase.


OBJETIVOS
Seleccionar de una serie eluotrpica , el eluente que mejor separe los
carotenoides presentes en diferentes muestras vegetales.
Con el mejor eluente, fraccionar cromatogrficamente el extracto de
carotenoides, hasta aislar compuestos puros y caracterizarlos por mtodos
de coloracin, cromatogrficos y espectrales.
Conocer otros sist emas cromatogrficos para la separacin de
carotenoides.

a. Deshidratacin
En un erlenmeyer seco se colocan unos 30 g. de tejido fresco triturado finamente
en un mortero. Se aade un volumen suficiente de etanol al 95% para que recubra
la muestra. Se cal ienta a ebullicin sobre un bao mara durante 5 minutos. Se
23
filtra en caliente con un algodn, procurando que la masa semislida quede libre
del solvente.

b. Extraccin
A la masa semislida se adiciona un volumen suficiente de diclorometano
(tambin puede usarse cloroformo) en una campana de extraccin y se remueve
con una varilla de vidrio para que el solvente extraiga los carotenoides .
Debe tenerse precaucin con el manejo de estos solventes pues son bastante
voltiles y algunos son muy txicos.

El extracto se filtra. El residuo slido se puede reextraer varias veces con el fin de
obtener el mayor rendimiento posible. Los extractos filtrados se juntan, se
trasvasan a un embudo de separacin y se aade si es necesario un volumen de
solucin de NaCl satur ada. La fase orgnica se recupera, se seca con sulfato de
sodio anhidro y se filtra. El filtrado con los carotenoides se concentra hasta un
volumen aproximado de 5 ml, mediante aplicacin de calor suave (40 -50 C) y
vaco. El extracto concentrado de carotenoides se tapa y se guarda para
protegerlo de la luz, la humedad, el calor y el aire.

c. Seleccin de otra fase mvil El extracto de carotenoides se a nalizar por CCF
con la serie eluotrpica siguiente:

n-Hexano
n-Hexano/Acetato de Etilo 4:1
Acetato de etilo

Utilizar como reveladores en su orden los siguientes, dibujando lo ms
precisamente posible, y anotando en cada caso las observaciones como colores,
fluorescencia, manchas:

A simple vista
Luz UV 254 nm
Luz UV 366 nm
Vapores de yodo

d. Fraccionamiento cromatogrfico y anlisis espectral Con el mejor eluente
seleccionado previamente , proceder a realizar el fraccionamiento a escala mayor
24
del extracto por cromato grafa en columna CC cromatografa en capa
preparativa CCP. Las fracciones coloreadas se recogen ( se raspan en el caso
de la CCP), se enumeran y se les determina su espectro visible en el rango de 3 50
a 550 nm. Es importante tener en cuenta que para de terminar el espectro cada
compuesto debe estar disuelto en hexano, y no tener residuos de otros solventes.

La Tabla 2 muestra los Rf y los mximos de absorcin (en ter de petrleo) de
varios carotenoides comunes. La figura 2 muestra el espectro visible d el licopeno
obtenido de una muestra de tomate rojo.

25

Tabla 2. Valores Rf y mximos de absorcin de varios carotenoides
CAROTENOIDE Rf SISTEMA
1
MXIM0S
ABSORCIN (nm)
-Caroteno 0.80 1 422, 444, 473
-Caroteno 0.74 1 425h, 451, 482
-Caroteno 0.41 1 437, 462, 494
-Caroteno 0.84 1 419, 444, 475
Licopeno 0.13 1 446, 472, 505
Lutena 0.35 2 420, 447, 477
Zeaxantina 0.24 2 423, 451, 483
Violaxantina 0.21 2 443, 472
Criptoxantina 0.75 2 425, 451, 483
Capsantina 0.16 2 ----------------
Neoxantina - - 415, 437, 466
Rubixantina - - 432, 462, 494
Fucoxantina - - 425, 450, 478

Figura 2. Espectro Visible del Licopeno obtenido de tomate rojo

1
Sistema 1: Benceno/Eter de petrleo 9:1, Sistema 2: Diclorometano/Acetato de etilo 4:1
26

INFORME

Debe incluir nombre vulgar y cientfico de la muestra analizada, parte de la planta
analizada, familia vegetal, anlisis de los valores Rf y los espectros visible
comparndolos con los reportados en la literatura. Informar cules carotenoides se
logr identificar.

Reactivos y materiales necesarios por grupo
Muestra vegetal fresca triturada o rallada (Tomate de alio rojo, pimentn verde-
rojo, zanahoria, pimentn rojo, ahuyama, mango, pasta de tomate, salsa de
tomate, etc.)
Erlenmeyer 250 ml
Slica gel para columna
1 columna de cromatografa
N-hexano puro ( ter de petrleo)
Acetato de etilo puro
Etanol para deshidratar
Algodn
Papel filtro
Sulfato de sodio anhidro 15 g.
Capilares
Tubos de ensayo limpios y secos reactivo de Carr Price
Lpiz de grafito
Frasco para cromatografa
Rotavapor

Mortero con pistilo
Licuadora
Espectrofotmetro UV-Vsible

Bibliografa

1. Robinson T., "The Organic Constituents of Higher Plants", 5th. ed., Cordus
Press, North Amherst MA U.S.A., 1983. Pp. 162 -5.
2. Harborne J.B., "Phytochemical Methods", Chapman & Hall, 1973, 119 -128 pp.
3. Stahl E., Thin layer Chromatog raphy, 1969.
1.Merck Co. Inc., Reactivos de coloracin para cromatografa en capa fina y en
papel.
27
2. Dalmases, P., Bonet, J. J., Tcnicas de Cromatografa Lquido -Slido en
Columna, Afinidad 111 -126 (1984).

Cromatograma CCF de un extracto de carotenoide s del pimentn
(slica gel, n-hexano/acetato de etilo 4:1)
28

Prctica 4
RECONOCIMIENTO DE ADULTERACIONES Y/O FALSIFICACIONES
(OBSERVACIN DE DROGAS PULVERIZADAS)

El planteamiento sistemtico de la identificacin de drogas en polvo puede
realizarse por var ios caminos; sin embargo, cuando se trata de drogas
organizadas, todos los mtodos dependen del reconocimiento microscpico de los
tipos celulares caractersticos, as como de los contenidos de las clulas. Cuando
se trata de una mezcla de drogas es impres cindible una mayor experiencia y
prctica. Cuando se ha realizado un tanteo de la identificacin, deben llevarse a
cabo posteriores observaciones y ensayos qumicos confirmativos; la mayora de
las drogas de farmacopea, poseen en la actualidad ensayos para su
reconocimiento mediante cromatografa de capa fina (CCF).

ENSAYOS PRELIMINARES:
1. ANOTAR EL COLOR.

Blanco: gomas arbiga, tragacanto.
Amarillo: regaliz, jengibre, escila.
Marrn claro: Ipecacuana, nuez vomica, opio, hinojo, genciana, cilantro,
cardamomo, lino.
Castao canela: canela.
Castao oscuro: clavo, sbila.
Rojo: quina.
Anaranjado: ruibarbo
Verde: sen, digital, estramonio.

2. ANOTAR EL OLOR.

Los siguientes son especialmente caractersticos:
Jengibre, hinojo, genciana, opio, cilantro, cardamomo, canela, clavo, nuez
moscada.

3. ANOTAR EL SABOR:

Aromtico: Cilantro. cardamomo, canela, clavo.
Aromtico y picante: Jengibre.
29
Amargo: cuasia, genciana, loes, quina, escila.
Dulce: regaliz.
Astringente: catec.
4. Mezclar una pequea cantidad de polvo con unas gotas de agua y abandonarlo
un tiempo. Los extractos acuosos y jugos concentrados como el aloe se
disuelven casi completamente, mientras se pone de manifiesto la naturaleza
gomosa o mucilaginosa de drogas como l a goma arbiga, tragacanto y semillas
de lino.
5. Mezclar una pequea cantidad de polvo con cido sulfrico diluido, si existe
carbonato clcico (tiza) tiene lugar una efervescencia seguida de disolucin.
6. Comprimir una pequea cantidad de polvo entre pa pel de filtro. Una mancha
oleosa, que se extiende pero que persiste cuando el papel es calentado en una
estufa aparece cuando los polvos contienen aceite fijo (Ej.: lino, man, etc).
El aceite esencial desaparece por calentamiento en estufa. (todos los
aromticos)
7. Agitar una pequea cantidad de polvo en un tubo de ensayo lleno de agua
hasta la mitad y si aparece espuma abundante sospechar la presencia de
drogas saponinas como el clavo, nuez moscada; hervir suavemente y advertir
el olor si hay desprendimi ento de aceite esencial. Filtrar y dividir en dos
porciones que pueden ser ensayadas respecto a taninos y derivados
antraquinnicos de la siguiente manera:

a) Ensayo de taninos:
Se agregan gotas de FeCl
3
muy diluido, se producen coloraciones que van
desde el azul oscuro hasta el negro pasando por el verde oscuro.
Tambin se puede realizar la prueba de la gelatina; en la que precipitan los
taninos al agregar una solucin de gelatina al 1% que contenga 10% de cloruro
sdico.
Ausencia de taninos: pimienta, j engibre, cuasia, estrofanto.
Presencia de taninos: borraja. salvia, ratania, canela, quina, clavo y ruibarbo.

b) Ensayo de antraquinonas:
Mediante la agitacin del extracto acuoso con HCl diluido, y calentamiento para
producir la hidrlisis, las antraqui nonas liberadas se extraen con tolueno y dan
un color rosa-rojo cuando la solucin se agita con amoniaco diluido.
Positivo para: loes. ruibarbo, cscara sagrada, sen.

OBSERVACIN MICROSCPICA

30
Si los ensayos preliminares han demostrado que la droga se d isuelve en agua,
deben realizarse ensayos con otros lquidos, como alcohol, aceite de oliva, hasta
que se encuentre uno en el que la droga sea insoluble.

En la mayora de los casos, sin embargo, puede adoptarse el siguiente
procedimiento:

1. OBSERVACION DE ALMIDON
Montar placa en agua, observar y dibujar cualquier grnulo que se observe y
ensayar si se trata de almidn o no mediante adicin de agua de yodo.

2. OBSERVACIN DE TRICOMAS EPIDERMICOS Y OXALATO DE CALCIO
Montar en hidrato de cloral (disuelve almidn, protenas, clorofila,, resinas,
aceites esenciales y produce la expansin de clulas retradas), hervir
suavemente hasta que clarifique y observar. Para estar seguro de que el
oxalato clcico, no ha pasado inadvertido, debe utilizarse luz polariza da.

OBSERVACIN DE LIGNINA
Humedecer el polvo con una solucin alcohlica de floroglucina (1% en etanol del
90%) y dejarlo hasta que casi se seque. Aadir HCl concentrado, poner
cubreobjetos y observar. Advirtase la presencia o ausencia de vasos lignific ados,
fibras, parnquima, esclereidas, pelos. Si los vasos o fibras no se tien de rojizo,
sospechar presencia de jengibre o ruibarbo.
De los ensayos preliminares y de los tres montajes anteriores se obtendr una
considerable informacin. El examen puede c ontinuarse mediante la aplicacin de
otros ensayos microqumicos:
Cloro yoduro de cinc (Reactivo de Schultze); ensayo para paredes de celulosa.
Por lo general es conveniente desengrasar los polvos grasos, decolorar los
fuertemente coloreados y preparar una fibra bruta cuando contienen mucho
almidn.
La aplicacin de los conocimientos de anatoma de los rganos vegetales en que
se presentan las drogas har posible el reconocimiento. Esto deber ampliarse
con la utilizacin de referencias o tablas de caracter es diagnsticos de drogas en
polvo.
La identidad de un polvo no ha de considerarse como establecida hasta que haya
sido comparada con uno de reconocida autenticidad.

TABLAS RECOMENDADAS:
Wallis y Mirimanoff.
31
Jacksori Snowcson; Powered Vegetable Drugs. Londres: Thornes (1968)

DROGA CARACTERSTICAS
Alo Presencia: Montado en lactofenol, muestra fragmentos
amarillentos o cristales aciculares. Parcialmente soluble en
agua y completamente soluble en alcohol al 60%. Confirmar
con ensayos qumicos.
Ausencia: Tejido vegetal, almidn, Oxalato de Calcio.

Lino Presencia: Clulas epidrmicas isodiamtricas . colnquima,
esclernquima lignificado, clulas pigmentadas poligonales
con contenido pardo-rojizo, abundancia de aceite y granos de
aleurona 3-18 microgramos.
Ausencias almidn, vasos y sber

Presencia de Oxalato de Calcio y ausencia de almidn y pelos epidrmicos:
clavo
cilantro
alcaravea
escila
cscara de naranja y limn.
Presencia de pelos epidrmicos, ausencia de almidn y oxalato de calcio:
nuez vmica
hoja de digital
catec
lobelia
azafrn
Presencia de almidn, ausencia de oxalato de calcio y pelos epidrmicos.
tragacanto
nuez moscada
jengibre
valeriana
Presencia de pelos y oxalato de calcio, ausencia de almidn.
hojas de sen
estramonio
beleo
ans
hammamel is
32
manzanilla romana
Presencia de oxalato de Calcio y almidn, ausencia de pelos epidrmicos.
a) Deteccin de vasos lignificados con floroglucina y HCl si los hay.
cuasia
regaliz
jalapa
si no los hay
ruibarbo
cardamomo
canela

b) Presencia de esencias en c ardamomo y canela. En general:
semillas de cardamomo
cuasia
ruibarbo
regaliz
rawolfia
ipecacuana
genciana
canela

cscara sagrada
quina
podofilo
cerezo
quilaya
ratania
jalapa

BIBLIOGRAFIA:

1. Evans, W. C. "Farmacognosia. Trease -Evans". 13a Ed. Interamericana
McGraw Hill, Madrid-Auckland-Bogot, 1991.

2. Gattuso, M.A.; Gattuso, SJ. "Manual de procedimiento para el anlisis de
drogas de drogas en polvo", UNR Editora, Rosario, 1999. Cyted.

33

Anlisis microscpico de algunas drogas

Observaciones:

Las fotografas son tomadas a placas montadas con fluoroglucina/HCl,
vistas con ocular 6.3X
Solo para montar la placa de lino: presionar con el cubreobjetos hasta
lograr que el material quede como una delgada capa
La observacin de diferentes estructuras de una mis ma planta algunas
veces requiere el montaje de varias placas.

34

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43

44

Bibliografa

Deyson, G. Caractres analytiques des poudres vgtales. Paris, CDU et
SEDES runis, 1976
Evans, W. C. "Farmacognosia. Trease -Evans". 13a Ed. Interamericana
McGraw Hill, Madrid-Auckland-Bogot, 1991.
Gattuso, M.A.; Gattuso, SJ. "Manual de procedimiento para el anlisis de
drogas de drogas en polvo", UNR Editora, Rosario, 1999. Cyted.

45

Prctica 4b
CONTROL DE CALIDAD DE PLANTAS MEDICINALES
ANALISIS MACRO Y MICROSCPICO DE MATERIAL VEGETAL

OBJETIVO
Identificar los diferentes marcadores taxonmicos descritos en las
farmacopeas para el control de calidad de un material vegetal como materia
prima para productos fitoteraputicos utilizando agentes qumicos de
tincin.
Identificar una muestra problema de material vegetal en polvo mediante sus
caractersticas organolpticas, macro y microscpicas.

BASE DEL MTODO
El anlisis histoqumica del material vegetal en polvo ayuda en el proceso de
control de calidad, evi dencindose la presencia de material extrao (arena),
adulteraciones o falsificaciones. Este anlisis es de apoyo a los dems anlisis
farmacopicos.

MARCO TERICO
El material vegetal es clasificado de acuerdo a sus caractersticas sensoriales,
macroscpi cas y microscpicas. Un examen para determinar estas caractersticas
es en primer paso establecer la identidad y el grado de pureza del material, para
despus llevarse a cabo posteriores anlisis. Siempre que sea posible, patrones
del material o muestras d e calidad farmacopeica debe de estar disponible como
referencia.
Una inspeccin visual provee una simple y rpida medida para identificar el
material, pureza y, posiblemente, calidad. Si una muestra es encontrada ser
significativamente diferente, en trmin os de color, consistencia, olor o textura, de
las especificaciones, se considera una NO conformidad de los requerimientos. Sin
embargo, los juicios deben ser cautelosos con relacin al olor y la textura, debido
a las diferencias que existen entre personas o por la misma persona a diferentes
tiempos. Siendo entonces esta una habilidad sensorial que se afina con la
experiencia.

La identificacin macroscpica de una planta medicinal est basada en la forma,
tamao, color, caractersticas superficiales, textur a, caractersticas al quebrarla y
apariencia superficial de un corte. Sin embargo, mientras esas cualidades son
juzgadas subjetivamente y sustituciones o adulteraciones pueden ser muy
46
parecidas al material genuino, a menudo es necesario respaldarse en anl isis
microscpicos y/o fisicoqumicos.

La inspeccin microscpica del material vegetal es indispensable por la
identificacin del material quebrado o en polvo; el material debe de ser tratado con
reactivos qumicos. Un examen microscpico solo NUNCA prove e una completa
identificacin. Solo cuando esta asociado con otros mtodos analticos que
frecuentemente suplen invaluable evidencia.

Si la comparacin con material de referencia revela algunas caractersticas no
descritas en los requerimientos, estos pue den ser atribuidos a material extrao,
antes que un constituyente normal.


REACTIVOS Y MATERIALES NECESARIOS POR GRUPO
10g de muestra vegetal fresca o seca en polvo.
3 Porta objetos
3 Cubre objetos
1 microscpico por cada 3 gru pos
Tamiz malla #20.
Reactivos de coloracin

A cada grupo de estudiante se le asignar una monografa farmacopica, la cul
debern de analizar para el posterior desarrollo en el laboratorio de las tcnicas macro y
microscpicas descritas.

1. Pruebas organolpticas: Anotar el color, olor y sabor de la muestra asignada.

2. Con base en la monografa asignada y el material vegetal entregado, encontrar todos
los tejidos descritos dentro de la monografa siguiendo cuidadosamente el
procedimiento descrito de coloracin o limpieza. Dibujar cada una de las caractersticas
visualizadas al microscopio.

3. Comparar el material vegetal problema asignado con las monografas disponibles,
visualizar los marcadores taxonmicos descritos y concluir.

DETECCIN HISTOQU MICA DE TEJIDO VEGETAL Y SU CONTENIDO

1. Hidrato de cloral: Una solucin de hidrato de cloral (80 g de hidrato de cloral en 20
mL de agua) se utiliza como agente clarificante. Colocar 2 a 10 mg de la droga en
polvo sobre un portaobjetos y agregar de 2 -8 gotas que impregnen todo el material
Manual de Laboratorio de Far macognosia y Fitoqumica 20 08, http://farmacia.udea.edu.co/~ff 47
vegetal y calentar suavemente. El hidrato de clorar disuelve contenido celular y
sustancias extracelular (granos de almidn, granos de aleurona) y permite una mejor
visualizacin de tejidos celulares como: pared celular, fibras, vasos, cristales de
oxalato de calcio, tricomas, estomas y polen.

2. Glicerol: Se utiliza como medio para la visualizar material vegetal al microscopio y
para prevenir el secado de soluciones acuosas o de hidrato de cloral. Se agregan 2
3 gotas a l a muestra en el portaobjetos y se coloca el cubreobjetos.

3. Deteccin de concreciones de carbonato de calcio (cistolitos) y de cristales de
oxalato de calcio: Colocar 2 a 10 mg de la droga en polvo sobre un portaobjetos.
Verter 2 3 gotas de cido clorhdr ico 2M, con la precaucin de que el reactivo est
en ntimo contacto con todos los componentes del polvo. Colocar el cubreobjetos y
observar inmediatamente al microscopio a 10x. La presencia de carbonato de calcio
est indicada por la aparicin de burbujas . Los cristales de oxalato de calcio, que en
general tardan ms tiempo en disolverse, no desprenden burbujas.

4. Deteccin de almidn: Colocar 2 a 10 mg de la droga en polvo sobre un
portaobjetos. Verter 2 3 gotas de Solucin de Lugol diluida (1:5) en agua . Colocar
el cubreobjetos y observar al microscopio a 10x y 40x. Los granos de almidn se
colorean de azul -violceo intenso. (Esta reaccin en reversible al ser calentado el
portaobjetos)

5. Deteccin de lpidos y aceites esenciales: Colocar 2 a 10 mg de la droga en polvo
sobre un portaobjetos. Verter 2 3 gotas de solucin de Sudan III (0.5 g Sudan III
calentados a reflujo en etanol o isopropil alcohol) y dejar actuar durante 2 3
minutos. Escurrir el lquido y lavar bien con alcohol 70 %. Colocar el cubr eobjetos y
observar al microscopio a 10x y 40x. Los lpidos aparecen como gotas de color rojo.

6. Deteccin de taninos: Colocar 2 a 3 mg de la droga en polvo sobre un
portaobjetos. Verter 2 3 gotas de solucin de cloruro frrico al 5 %. Colocar el
cubreobjetos y observar al microscopio a 10x y 40x. La presencia de taninos se
traduce en la aparicin de masas oscuras de color pardo, azul o negro.

7. Deteccin de celulosa: Colocar 2 a 3 mg de la droga en polvo sobre un
portaobjetos. Verter 1 2 gotas de soluci n de cloruro de zinc yodado (Disolver 20 g
de cloruro de zinc y 6.5 g de yoduro de potasio en 10.5 mL de agua), dejar reposar 2
minutos y agregar 1 gota de yodo (0.1 mol/L), dejar reposar 1 minuos, remover el
exceso de reactivo con una tira de papel filtro y agregar 1 gota de H
2
SO
4
60%.
Colocar el cubreobjetos y observar al microscopio, las paredes de celulosa se
observan en colores desde el azul al violeta.

8. Deteccin de vasos lignificados (esclereidas, vasos, fibras, parenquima):
Colocar 2 a 3 mg de la d roga en polvo sobre un portaobjetos y mezclarlos con un
pequeo volumen de floroglucinol, dejar reposar hasta casi sequedad, agregar 1
gota de HCl 25%. Cubrir con un porta objeto y observar los vasos lignificados en
colores desde el rosado hasta el color c ereza (rojo carmin).

9. Deteccin de suber: Colocar 2 a 10 mg de la droga en polvo sobre un portaobjetos.
Verter 2 3 gotas de solucin de Sudan III y dejar actuar durante 2 3 minutos o
calentar suavemente. Los vasos suberizados o cuticulizados se observ al de color
rojo al rojo-naranja.

10. Deteccin de granos de aleurona: Colocar 2 a 10 mg de la droga en polvo sobre
un portaobjetos. Verter 2 3 gotas de solucin de yodo/etanol. Los granos de
aleurona se observan amarillentos caf o caf. Agregar luego unas 2 3 gotas de
trinitrofenol en etanol y los granos de tornarn amarillos.

11. Deteccin universal: Solucin A Diluir 20 mL de una solucin saturada de Sudan
III en cido lctico con 30 mL de cido lctico. Solucin B Disolver 0.55 g de
sulfato de anilina en 35 mL de agua. Solucin C Disolver 0.55 g de yoduro de
potasio y 0.05 g de yodo en 5 mL de agua y agregar 5 mL de etanol.
Procedimiento Combinar la solucin A, solucin B y la Solucin C y agregar 2.5
mL de HCl con agitacin (No filtrar). Colocar 2 a 10 mg de la droga en polvo sobre
un portaobjetos. Verter 2 3 gotas del reactivo y calentar suavemente. Cubrir con un
porta objeto y observar los elementos lignificados de amarillo, sber de marrn,
lpidos de color rojo y almidn de color azul -violeta.

12. Deteccin de estomas: Los estomas son unas aberturas que regulan la entrada y
salida de gases. Estas aberturas estn rodeadas por clulas especializadas
llamadas oclusivas que al cambiar de tamao y forma, modifican el dimetro de la
abertura estomtic a y de este modo regulan el intercambio gaseoso.


Imagen tomada de: British pharmacopoeia, Appendix XI H. Stomata. 2003.

1- Anomocticos (irregulares): Los estomas estn rodeados por un nmero variado de
clulas.

2 - Anisocticos (desiguales): Los est omas estn rodeados por tres clulas, de las
cules una es marcadamente ms pequea que las otras.

3 - Diacticos (Atravesando): Los estomas estn incrustados entre dos clulas vecinas.

4 - Paracticos (Paralelos): Los estomas tienen paralelamente a ello s una o ms clulas
vecinas.

BIBLIOGRAFA
1. British Pharmacopoeia, 2003.
2. USP 27, NF 22. 2003.
3. Quality control methods for medicinal plant materials, WHO Geneva, 1998

Prctica 5
RECONOCIMIENTO CROMATOGRFICO DE PLANTAS MEDICINALES
APROBADAS EN COLOMBIA

RECONOCIMIENTO POR CROMATOGRAFA EN CAPA FINA
DE AJENJO, Artemisia absinthium L., Asteraceae

Introduccin
La droga la constituyen las hojas y flores. Las hojas contienen 0.3% de principios
amargos (Absinthina y anabsinthina), mientras que las flores cont ienen un 0.15%.

Extraccin
1 g. de droga pulverizada se extrae durante 10 minutos con 10 ml de Metanol a 60C
sobre un bao de agua. La mezcla se filtra y el filtrado se evapora hasta un volumen
aprox. de 2 ml

Fase estacionaria: Slica gel 60F-254
Fase mvil: Cloroformo:Metanol 95:5
Revelador: Liebermann-Burchard/UV 365 nm

Rf SUSTANCIA COLOR
0.3-0.4 Absinthina amarillo ocre

DEL AJO, Allium sativum, Liliaceae

Introduccin
El bulbo o diente contiene cistena, cistina, sulfxido de metionina, cicloalina, alina (=
Sulfxido de S-alilcistena), y deoxialina (=S-alil-cistena), junto con otros aminocidos
azufrados y sulfxidos de cistena.

Extraccin
25 g. de dientes frescos finamente desmenuzados se extraen en fro (con ayuda de
hielo seco) con 2 porciones de 100 ml de metanol al 80%. Se purifica por cromatografa
en columna, controlando las fracciones con Reactivo de Ninhidrina.

Fase estacionaria: Slica gel 60
Fase mvil: n-Butanol : n-Propanol : Acido actico glacial : Agua
30 : 10 : 10 : 10
Revelador: Ninhidrina


Rf SUSTANCIA COLOR
0.5 Alicina Naranja
0.7 Alina Azul-violeta

RECONOCIMIENTO DE LA ALCACHOFA POR
CROMATOGRAFA EN CAPA FINA

Introduccin

La droga la constituyen las hojas, las cuales contienen sesquiterpenlactonas como
cinaropicrina, grossheimina y cinarina; cidos fenolcarboxilicos como 1,3 -
dicafeoilqunico, clorognico y neoclorognico; y luteolina -7-O-glucsido, un flavonoide.
Extraccin
1 g. de droga pulverizada se extrae durante 10 minutos con 10 ml de metanol sobre un
bao de agua. La mezcla se filtra y se evapora hasta un volumen de aprox. 2 ml

Fase mvil: Acetato de etilo:Acido frmico:Acido actico:Agua
100 : 11 : 11 : 27
Revelador: Polietilnglicol para productos naturales/UV 365 nm

Rf SIJSTANCIA COLOR
0.7 Cinarina Azul fluorescente
0.6 Luteolina-7-0-gluc. Amarillo
0.45 Acido clorognico Azul fluorescente
0.4 Rutina Amarillo


RECONOCIMIENTO POR CROMATOGRAFA EN CAPA FINA DE LA
ALBAHACA, Ocimum basilicum, Lamiaceae

Introduccin

La droga la constituyen las hojas, las cuales contienen 0.1 -0.45% de aceite esencial. El
aceite esencial contiene principalmente metilchavicol 55% y linalool.

Extraccin

a) Por arrastre con vapor de agua

Mtodo oficial de la Farmacopea Europea III, pg. 62.

b) Con Diclorometano

1 g. de droga pulverizada se extrae por agitacin durante 15 minutos con 10 ml de
diclorometano. El filtrado obtenido se evapora a sequedad. El residuo se disuelve en 1
ml de Tolueno, y se aplican 50 -100 L. en la placa cromatogrfica.

Fase mvil: Tolueno : Acetato de Etilo 93 : 7
Revelador: Vainillina- Acido sulfrico

Rf SUSTANCIA COLOR
0.3 Linalool Azul intenso
0.9 Metilchavicol Rojo violeta

RECONOCIMIENTO POR CROMATOGRAFA EN CAPA FINA DE
LA HIERBABUENA, Mentha viridis L., Lamiaceae

Introduccin

La droga la constituyen las hojas y ramas jvenes, las cuales contienen 1.2% de aceite
esencial. El aceite contiene principalmente L -Carvona 42-67%, mentol, acetato de
dihidrocarveol, alcohol dihidrocuminlico, pineno, limoneno y felandreno.


Extraccin

1) Destilacin por arrastre con vapor de agua
Se utiliza el mtodo oficial de la Farmacopea Europea III pg. 62 con 50 g de muestra,
500 ml de agua, 2 horas d e destilacin a un flujo de 3 -3.5 ml /min.

2) Extraccin con diclorometano
Como se describi para la albahaca

Revelador: Vainillina-Acido sulfrico

Rf SUSTANCIA COLOR
0.25 Alcohol dihidrocumnico Azul intenso
0.46 Carvona Rojo-Violeta
0.7 Acetato de dehidrocarveol Azul intenso

RECONOCIMIENTO POR CROMATOGRAFA EN CAPA FINA DE
HINOJO, Foeniculum vulgare, Apiaceae
Introduccin
La droga la constituyen los frutos, los cuales contienen 2 -7% de aceite esencial. El
aceite esencial contiene principalmente anetol (50 -80% en la variedad dulce, 60 -80% en
la variedad vulgare), metilchavicol, safrol, anisaldehdo y fenchona (0.4 -0.8% en la
variedad dulce, 12-22% en la variedad vulgare).

Extraccin

1) Destilacin por arrastre con vapor de agua
Segn el mtodo oficial de la Farmacopea Europea III, pg. 62, utilizando 10 g. de
muestra, 200 ml de agua, 2 horas de destilacin a una rat a de 2-3 ml /min.

2) Extraccin con diclorometano
Tal como se describi para la albahaca.
Reveladores: 1.Vainillina -Acido sulfri co
2. PMA-Permanganato de potasio
3. Acido sulfrico concentrado

Rf SUSTANCIA REVELADOR COLOR
0.6 Fenchona 3 Azul oscuro
0.9 Anetol 1
2
3
Rojo-Violeta
Rojo-Pardo
Azul oscuro

Nota: La fenchona no se detecta en estas condiciones para el ans, lo que permite
diferenciar las dos plantas.

DE LA MALVA, Malva sylvestris, Malvaceae

Introduccin
La flor contiene la malvina, un pigmento que le confiere el color caracterstico.

Extraccin
1 g. de droga pulverizada se extrae por agitacin durante 15 minutos con 6 ml de
Metanol:Acido Clorhdrico (9 partes de metanol, 1 parte de cido al 25%). Se utilizan 25
l del filtrado para la cromatografa.

Fase mvil: n -Butanol : Acido actico glacial : Agua
40 : 10 : 20
Reveladores: Ninguno

Rf SUSTANCIA COLOR
0.4 Malvina (=Malvidin-3,5-di-
glucsido
Violceo

DE LA MANZANILLA MATRICARIA, Matricaria chamomilla, Asteraceae

Introduccin
La droga la constituyen las flores, las cuales contienen 0.5 -1.5% de aceite esencial. El
aceite esencial a su vez contiene chamazuleno 0 -15%, bisabolol 10-25%, bisabolol
xidos A y B (ambos 10 -25%), polinas 1-40%, farneseno 15%.

Extraccin

a) Destilacin por arrastre con vapor de agua
Segn mtodo oficial de la F. Eur. III pg. 62 con:
50 g de muestra, 500 ml de agua destilada de una solucin de cloruro de sodio al 1%, 4
horas de destilacin a 3 -4 ml/minuto.

b) Extraccin con Dclorometano
Tal como se ha descrito para la albahaca.

Fase mvil: T olueno : Acetato de Etilo 93 : 7
Revelador: Vainillina -Acido sulfrico

Rf SUSTANCIA COLOR
0.2 Oxidos A y B de bisabolol Amarillo/Verde
0.25 Alcohol terpenoide Violeta
0.35 Bisabolol Violeta
0.5-0.6 Polinas Pardo
0.95 Azuleno Rojo violeta
0.99 Farneseno Azul-Violeta

DEL ROMERO, Rosmarinus officinalis , Lamiaceae
Introduccin
Las hojas contienen 1-2% de aceite esencial, el cual contiene principalmente 1,8 -cineol
15-30%, borneol 10-20%, acetato de bornilo, camfeno 5 -10%, alfa- y beta-pineno.

Extraccin
a) Destilacin por arrastre con vapor de agua

Segn mtodo oficial de la Farm. Eur. III pg. 62.

b) Extraccin con diclorometano

Tal como se describi para la albahaca.

Revelador: Vainillina -Acido sulfrico

Rf SUSTANCIA COLOR
0.25 Borneol Azul oscuro
0.45 Cineol Azul intenso
0.7 Acetato de bornil o Azul intenso
0.99 Alfa- y beta-pineno Violeta

DE LA SABILA, Aloe vera, Liliaceae

Introduccin

La droga la constituye el jugo desecado de las hojas el cual contiene 14 -28% de
principios antracnicos tal es como alona, aloesinas A y B, aloinsidos A y B, etc.

Extraccin
0.5 g. de droga pulverizada se extraen con 5 ml de Metanol, calentando durante 5
minutos sobre un bao de agua. El filtrado se aplica directamente sobre la placa
cromatogrfica.

Fase mvil: Acetato de etilo : Metanol : Agua
100 : 13.5 : 10

Reveladores: 1) Hidrxido de potasio/ UV 365 nm

2) Poiietilnglicol PN/UV 365 nm

Rf SUSTANCIA REVELADOR COLOR
0.3 Aloinsidos A y B 1 y 2 Amarillo
0.47 Alona 1 y 2 Amarillo
0.95 Alo-emodina 1 Rojo
---
Aloesinas A y B
1
Azul fluorescente


DE FLORES DE SAUCO, Sambucus nigra, Caprifoliaceae

Introduccin

La droga la constituyen las flores, las cuales contienen glicsidos de quercetina 1.5 -3%
como hipersido, isoquercitrina y rutina.

Extraccin
1 g. de droga pulverizada se extrae con 10 ml de metanol durante 5 minutos sobre un
bao de agua a aproximadamente 60 C. El filtrado se utiliza para la cromatografa.

Fase mvil: Acetato de etilo : Acido frmico : Acido actico : Agua
100 : 11 : 11 : 27

Reveladores: 1) R. productos naturales/UV 365 nm

2) Polietilnglicol para productos naturales/UV 365 nm

Rf SUSTANCIA COLOR
0.4 Rutina Amarillo
0.7 Isoquercitrina Amarillo
0.9 Acido cafeico Azul fluorescente

DE HOJAS DE TORONJIL, Melissa officinalis, Lamiaceae
Introduccin
Las hojas contienen 0.01 -0.25% de aceite esencial, el cual est constituido
principalmente de Citronelal 39%, Citral 30%, citronelol, linal ool, geraniol y cariofileno.

Extraccin

a) Por arrastre con vapor de agua

Segn el mtodo oficial de la Farmacopea Europea III pg. 62, con:
40 g. de muestra, 400 ml de agua, destilando a 2 -3 ml/min durante
2 horas.


b) Extraccin con Diclorometano
Como se describi para la albahaca.
Fase mvil: Cloroformo
Revelador: Anisaldehdo/Acido sulfrico
Rf SUSTANCIA COLOR
0.7 Citronelal Azul intenso
0.45 Citral Azul violceo
0.25-0.4 Geraniol, linalool y
Citronelol
Azul violceo

DE RAICES DE VALERIANA, Valeriana officinalis , Valerianaceae

Introduccin
La droga la constituyen las races o rizomas que contienen los valepotriatos como:
valtrato, isovaltrato, IVDH_Valtrato, didrovaltrato y acevaltrato, cuya concentracin
cambia de una variedad a otra. Adems contiene 0.25% de aceite esencial en los
rizomas frescos, el cual contiene valerenal, valeranona y cido valernico.

Extraccin
0.2 g. de droga pulverizada se extraen con 5 ml de diclorometano durante 5 minutos a
unos 60
0
C con agitacin ocasional. El residuo de la filtracin se lava con otros 2 ml de
diclorometano. Los extractos combinados se evaporan a sequedad, y el residuo d e
disuelve en 0.2 ml de acetato de etilo. Se aplican en la cromatoplaca 10 microlitros de
esta solucin.

Fase mvil: Tolueno : Acetato de etilo 75 : 25
Revelador: HCl concentrado : Acido actico glacial 2:8

Rf SUSTANCIA COLOR
0.73 Valtrato/Isovaltrato Azul
0.65 Didrovaltrato Pardo
0.55 Acevaltrato Azul
0.4 IVDH-Valtrato Azul
<0.4 Valtrahidrinas Azul
Origen Productos de degradacin

Prctica 6

ACEITES ESENCIALES

INTRODUCCIN
El caracterstico olor, aroma, de ciertas plantas es debido al aceite esencial o voltil all
presente y usado desde la antigedad como fuente natural de fragancias y perfumes.
Actualmente los aceites esenciales son usado en la perfu mera, en la industria
alimenticia o como fuente de materias primas. Algunos con propiedades adicionales son
usados como carminativos, aromatizantes, anestsicos locales y ltimamente otros con
propiedades antiemticas e insecticidas.
Los aceites esencial es o esencias vegetales son mezclas de un numero variables de
sustancias olorosas. En un aceite esencial pueden encontrarse hidrocarburos alicclicos
y aromticos , as como sus derivados oxigenados, alcoholes, aldehdos, cetonas,
steres, sustancias azuf radas y nitrogenadas. Los componentes mas frecuentes se
derivan del cido mevalnico; se les cataloga como monoterpenos de 10 unidades de
carbono y sesquiterpenoides con 15 unidades de carbono.
Todos los aceites esenciales oficinales se extraen por destila cin, con excepcin del de
limn y el de cade. La destilacin de las esencias por medio de agua o vapor se ha
practicado durante mucho tiempo, pero las modernas plantas industriales poseen
muchas ventajas sobre las antiguas destileras, en las que con frec uencia se produca
la carbonizacin y descomposicin de la esencia. En la moderna destilera de aceites
esenciales, la materia prima esta contenida en cestos o bandejas perforados. El
destilador contiene agua en el fondo, la cual se calienta mediante ser pentines por los
que circula vapor, o tambin haciendo pasar a su travs vapor de agua a presin.
Algunas esencias como las de cayeput, alcaravea, trementina y de leo sndalo
australiano, son rectificadas. Esta consiste, generalmente en una segunda desti lacin
en corriente de vapor, que libera la esencia de resinas y otras impurezas. La luz y el
oxigeno atmosfrico parecen ejercer un efecto adverso sobre la mayora de los aceites
esenciales, por lo que deben de seguirse estrictamente las directrices ofici ales respecto
del almacenamiento.
Las esencias utilizadas en perfumera, se pueden extraer por arrastre con vapor, como
se describi anteriormente. Pero algunos requieren de otro tipo de tratamiento, como
son el enflorado, digestin en grasas calientes, m todos neumticos o por medio de
disolventes.
El rendimiento de esencia obtenido de una planta vara de unas cuantas milsimas por
ciento del peso vegetal hasta 1 -3%. La composicin del aceite puede cambiar con la
poca de la recoleccin, el lugar geogrfic o o pequeos cambios genticos. En
gimnospermas y angiospermas es donde aparecen las principales especies que
contienen aceites esenciales, distribuyndose entre unas 60 familias. Son
particularmente ricas en esencias las pinceas, laurceas, mirtceas, l abiceas,
umbelferas, rutceas, y compuestas.


2. Destilacion Por Arrastre Con Vapor De Aceites Esenciales

OBJETIVO
Separar los aceites esenciales de: Comino, clavos de olor. corteza de canela, ans,
eucalipto, etc. y tratar de caracterizar sus const ituyentes, despus de aislarlos por
cromatografa de columna y/o capa fina.

PROCEDIMIENTO
El mas antiguo y sencillo mtodo para obtener aceites esenciales es la destilacin por
arrastre con vapor, a partir de material vegetal, lo ms fresco posible. Usand o matraces
de 1 a 6 litros, en el laboratorio se pueden destilar por arrastre con vapor continuo 100 a
500 g. de planta fresca, con buena recuperacin de la esencia.

Fig. 1. Equipo para extraer aceites esenciales por arrastre con vapor
En el matraz 1 colocar suficiente agua (mas o menos 1 litro por cada Kg de material
vegetal) y unos ncleos de ebullicin; si se cuenta con un equipo generador de vapor,
como una olla a presin la cual a travs del conducto de la vlvula se puede conducir el
vapor hacia el compartimento donde se encuentra el material vegetal. En el
compartimento 2 se ubica la muestra picada en pequeos trozos.

El agua se somete a calentamiento, logrando as la generacin de vapor, que a medida
que asciende y atraviesa el material vegetal v a extrayendo el aceite esencial. En el
embudo de separacin 3, se recoge el destilado; este se puede recoger sobre una
1 11
2
3
4
5 6
7
8
9
1 10
2
3
4
5 6
7
8
9
1 10
1
2
3

solucin saturada de cloruro de sodio, con el fin de disminuir la formacin de la
emulsin aceite en agua. Tambin es de utilidad el ad icionarle un poco de ter etlico o
diclorometano al embudo, con el fin de observar mas fcilmente las dos fases y as
favorecer la separacin.

Nota: la unin entre el embudo de separacin y el condensador, debe permitir la
liberacin de presin, de lo co ntrario el equipo puede romperse por exceso de presin.
Una vez cese la destilacin, separe las dos fases. La fase etrea se seca con sulfato de
sodio anhidro y se concentra a 40 -45C ( no es necesaria la presin reducida). Una vez
el aceite este libre de solvente, pese y calcule el rendimiento con base en el material
vegetal de partida.

2. Extraccin de aceites esenciales con solventes

OBJETIVO
Separar los aceites esenciales con solventes no polares y caracterizar sus
componentes por mtodos espectrofo tomtricos.

PROCEDIMIENTO
Se extraen 30 g. de muestra seca y molida en un dispositivo Sohxlet con un volumen
suficiente de ter de petrleo. Las fases etreas se juntan, se filtran, se secan con
Na
2
SO
4
anhidro, se filtran de nuevo y se evaporan a sequedad con calentamiento
suave. El residuo de evaporacin debe tener el olor caracterstico de la muestra antes
de extraerla. Este es el aceite esencial crudo (AEC) el cual se pesa para calcular su
rendimiento.


ANLISIS CROMATOGRFICO Y AISLAMIENTO DE
COMPONENTES PRINCIPALES

EXTRACCIN.
Se extraen 30 g. de muestra seca y molida en un dispositivo Sohxlet con un volumen
suficiente de ter de petrleo. Las fases etreas se juntan, se filtran, se secan con
Na
2
SO
4
anhidro, se filtran de nuevo y se evaporan a seq uedad con calentamiento
suave. El residuo de evaporacin debe tener el olor caracterstico de la muestra antes
de extraerla. Este es el aceite esencial crudo (AEC) el cual se pesa para calcular su
rendimiento.

ANLISIS POR CROMATOGRAFA EN CAPA FINA.
El AEC se redisuelve en unos ml de ter de petrleo o cloroformo y se analiza por CCF
con slica gel y c/u de los siguientes eluentes:

a) Diclorometano
b) Tolueno: acetato de etilo 93:7

Para revelar cada una de las cromatoplacas se utilizan los siguientes revelad ores:

a) Luz ultravioleta (254 y 375 nm)
b) Olfato
c) Vapores de yodo
d) 2,4- Dinitrofenilhidrazina (0.4 g. en 100 ml HCl 2 N)
e) Vainillina/cido sulfrico

NOTA: De acuerdo con los resultados de este anlisis se escoge el sistema
cromatogrfico en el cual el componente principal del aceite se observe bien separado
de los dems componentes.

FRACCIONAMIENTO POR CROMATOGRAFIA EN CAPA FINA
El AEC se aplica disuelto en un pequeo volumen del eluente escogido y se aplica a
una placa cromatogrfica de slica gel. Se eluye con el eluente escogido. Los
componentes mayoritarios pueden reconocerse por revelado con luz ultravioleta de 254
nm (compuestos con enlaces dobles conjugados), o cortando una tira lateral de la placa
y revelndola con alguno de los revelado res c, d e, citados arriba.

EXTRACCION DE LOS COMPONENTES POR CCF
Los componentes mayoritarios se raspan con la ayuda de la lmpara UV el revelador,
se extraen con una mezcla 1:1 de alcohol:cloroformo. Se filtra y se lleva a sequedad. El
residuo debe ser el componente puro o con algunas impurezas. En el caso que se
observe que el compuesto est muy impuro puede purificrsele por otra CCF
preparativa.


ANALISIS DEL COMPONENTE PURO.
a) Ensayos de coloracin.
Si se obtiene una buena cantidad del compuest o puro se pueden realizar ensayos para
fenoles, aldehdos y cetonas, alcoholes, etc.

b) Anlisis Espectral.
Al componente puro se le determinan los espectros infrarrojo, ultravioleta, etc.


PRACTICA 7.
TECNICAS GENERALES DE EXTRACCIN Y VALORACION DE U NA DROGA

a. Valoracin de alcaloides del tropano

El trmino alcaloide (de lcali), fue propuesto por el farmacutico W. Meissner en 1819,
se aplic a los compuestos de origen vegetal con propiedades alcalinas, este carcter
bsico es debido a la presenci a de nitrgeno amnico en su estructura.

No existe una definicin exacta para el termino alcaloides, pero se pueden considerar
como compuestos orgnicos de origen natural ( vegetal: familias Lauraceae,
Ranunculaceae, Magnoliaceae, Annonaceae, Menispermacea e, Papaveraceae,
Fumariaceae, Rutaceae, Apocynaceaae, Loganiaceae, Solanaceae , Rubiaceae;
animal: ranas de la familia Mantellidae quienes presentan alcaloides txicos en piel ;
bacteriano: la Pseudomona aeruginosa produce la Piocianina, hongos: el Psilocybe
produce Psilocyna y Psilocybina, etc.), nitrogenados, derivados generalmente de
aminocidos, mas o menos bsico, de distribucin restringida, con propiedades
farmacolgicas importantes a dosis bajas (gran variedad de actividad sobre SNC y
SNA) y que presentan gran diversidad estructural .

Figura 1. Algunos ejemplos de variabilidad estructural de los alcaloides

Para su estudio, algunos autores dividen los alcaloides en cuatro clases (figura 2):
1. Alcaloides Verdaderos : los cuales cumplen estrictamente con las caractersticas
de la definicin de alcaloide: tienen siempre un nitrgeno heterocclico, son de
carcter bsico y existen en la naturaleza normalmente en estado de sal,
biolgicamente son formados a partir de aminocidos.
isoquinoleina
N
N N
N
N
pirrolidina piperidina piridina indolicidina quinolicidina
N
N
N
N
tropano
tetrahidro
quinoleina indol
N
N
N
N
N
N
O
O
O
N
imidazol purina
diterpnico
N N
N
N
N
espermidina
esteroidal

2. Protoalcaloides: son aminas simples con nitrgeno extracclico, de carcter bsico
y que son productos del metabolismo de los aminocidos.
3. Pseudoalcaloides: presentan todas las caractersticas de la definicin de alcaloide
pero no son derivados de aminocidos.
4. Alcaloides imperfectos: se derivan de bases pricas y no precipitan con los
reactivos especficos para alcaloides. No son alcaloides los aminocidos, las
betalanas, los pptidos, los amino azcares, las vitaminas nitrogenadas, las
porfirinas, algunas bases c omo la tiamina ampliamente distribuida en los seres vivos
y los alkil aminas de bajo peso molecular.

Los alcaloides se han clasificado en funcin de su estructura (heterocclica y no
heterocclica), actualmente existen varias formas de clasificarlos
1,6
segn sus
propiedades farmacolgicas, distribucin botnica de acuerdo a su origen biosinttico .

figura 2. Aspectos biogenticos para la clasificacin de los alcaloides

EL NITROGENO es necesario para la construccin de amino cidos que posteriormente
se convertirn en protenas, y de nucleotidos que harn parte de los cidos nucleicos,
en las plantas l a funcin de los alcaloides no es aun clara, se ha sugerido que estas
sustancias pueden actuar en los v egetales como:
Acetil CoA Malonil CoA Proteinas

N
2
Aminoacidos
Aminocidos Aminocidos
modificados

Mevalonato Policetidos

Alcaloides
Imperfectos

NH
3
Aminas Protoalcaloides

Isoprenoides Policetidos Alcaloides
Aminados Aminados Verdaderos

Pseudoalcaloides

- CO
2

No
cclicas
Cclicas

Fuente de almacenamiento del nitrgeno sobrante
Productos de desecho del nitrgeno sobrante
Protectores por su sabor amargo evitan el ataque de insectos, los alcaloides
generalmente se localizan en los tejidos perifricos de los rganos de la planta
(recubrimiento de las semillas, corteza del tallo, raz o fruto, epidermis de la hoja) .
Rreguladores del crecimiento se ha demostrado que los alcaloides derivados
de la putrescina se incrementan notablemente en algunas plantas cuando se
encuentran en suelos deficientes de potasio
2,3
,

no obstante la prdida de alcaloides en
el vstago de plantas que normalmente los acumulan en las partes areas, ( Nicotiana y
Daturas) no ha impedido el desarrollo, lo cual sugiere que los alcaloides no son
esenciales para los vegetales.

Los alcaloides se reconocen en el laboratorio por su capacidad de combinarse con el
yodo o los metales pesados (bismuto, mercurio, tunsgteno) cuando se encuentran en
forma de sal en extractos cidos formando precipitados; en la prctica, se utilizan los
siguientes reactivos para su deteccin: yodo-yoduro de potasio (Reactivo de Wagner),
mercurio tetrayoduro de potasio (reactivo de Mayer), tetrayodo bismuto de potasio
(reactivo de Dragendorff), solucin de cido pcrico (reactivo de Hager), cido slico
tngtico (reactivo de Bertrand), p-dimetilamino benzaldehido (reactivo de Ehrlich);
reaccin de Vitali -Morin (para alcaloides en estado base). La extraccin y aislamiento se
fundamentan en la diferencia de solubilidad que presentan los alcaloides segn se
encuentren en forma de sal (sales de cidos orgnicos y combinaciones con otras
sustancias solubles en solvente polares: agua, soluciones cidas e hidroalcoholicas )
de base (solubles en solventes orgnicos no polares: diclorometano, acetato de etilo ),
generalmente son incoloros, pero l as conjugaciones en la molcula producen
coloraciones que van desde el amarillo hasta el rojo , adems la mayora son slidos a
temperatura ambiente, pero hay excepciones (la nicotina que es lquida).

Alcaloide base Alcaloide sal

La extraccin puede realizarse mediante mtodos generales como :

1. Extraccin en medio alcalino : en donde una solucin alcalina desplaza los
alcaloides de sus combinaciones salinas y las bases liberadas son solubilizadas en
un solvente orgnico medianamente polar
2. Extraccin en medio cido: Extraccin de los alcaloides en forma de sales con
agua acidulada, alcohol o solucin hidroalcohlica acidulada, seguido de una
alcalinizacin y extraccin de los alcaloides base con un solvente orgnico no

R
3
N
..
H

X
-
+
R
3
NH X
+ -

miscible (alcaloides y compuestos nitrogenados. Universidad de Antioquia, G. J. Arango
2000)


EXTRACCIN DE ALCALOIDES EN MEDIO ALCALINO (FIGURA 3)

1. Alcalinizacin
2. Extraccin con solvente orgnico apolar
Marco libre de alcaloides
Mayer (-)
extraccin con cido diluido
1. Alcalinizacin
2. Extraccin solvente org. no polar
Fase acuosa alcalina
deshidratacin evaporacin en vaco
Alcaloides Totales (AT)
Fase orgnica
(alcaloides bases)
Solucin cida
(alcaloides sales)
Solucin orgnica
(libre de alcaloides)
Solucin de alcaloides bases (+ impurezas)
DROGA SECA Y DESENGRASADA
MANUAL DE PRCTICAS DE LABORATORIO DE FARMACOGNOSIA Y FITOQUMICA 2008

69
1. Maceracin en alcohol al 70%
2. Concentracin del macerado
1. Alcalinizacin
2. Ext. con solvente organico medianamente apolar
Fase acuosa
(alcalina)
Ext. con sol. cida dil.
1. alcalinizacin
2. extraccin con solvente organico inmisible
Fase acuosa alcalina
(impurezas)
evaporacin
Alcaloides totales
Fase orgnica
(alcaloides bases)
Fase acuosa
(Alcaloides sales)
Fase orgnica
(impurezas)
Fase orgnica
(alcaloides bases)
Solucin acuosa
(alcaloides sales)
DROGA EN POLVO, SECA Y DESENGRASADA

VALORACION DE ALCALOIDES DEL TROPANO
(Flores y hojas de Datura sp.)

La hioscina (escopolamina) y la hiosciamina son los alcaloides principales de las
especies de Datura (Solanaceae), pertenecen al grupo de los alcaloides tropn icos de

70
conocida actividad farmacolgica, estos alcaloides se encuentran en algunos gneros
de la familia Solanceas: Atropa, Datura, Duboisia, Hyoscyamus, Mandragora,
Scopolia, etc. Adems se encuentran en otros gneros de familias como el
Erythroxylum (Erythroxylaceae).

ACITIVIDAD BIOLOGICA
La Atropina ( l(-)-hiosciamina) se encuentra en Atropa belladona, Datura stramonium y
la escopolamina ( l(-)hioscina) en Hyosciamus niger, los ismeros l(-) de ambos
alcaloides son 100 veces mas potente s que los ismeros d (+). Se absorben bien en el
intestino y a travs de la conjuntiva alcanzando el sistema nervioso central en un lapso
de tiempo entre 30 60 minutos, en donde provocan bloqueo competitivo reversible de
las acciones de los colinomimticos (acetilcolina y anlogos) en los receptores
muscarnicos (farmacologa bsica y clnica de B. G. Katzung 1999)

Efecto en los organos
Sistema Nervioso Central: Estimulan o deprimen dependiendo de la dosis empleada,
a dosis t xicas estimulan con ap aricin de irritabilidad inquietud, desorientacin,
alucinaciones y delirio, si la dosis incrementa el esta de intoxicacin pro gresa hacia la
depresin profunda, coma, parlisi s respiratoria depresin cadiovascular y
eventualmente la muerte.
Gastrointesti nales: reducen la secrecin salival .
Cardiovasculares: producen boqueo colinrgico en el ndulo sinusal el cual genera
taquicardia y cuya intensidad depende la dosis .
Efectos oculares: bloquea la accin parasimptic a en las fibras circulares del iris y el
msculo ciliar produciendo midriasis (pupila dilatada) y cicloplej a (desenfoque para
visin lejana e incremento de la presin intraocular) ( Fundamentos de farmacologa en
teraputica C.A. Isaza 1992).


Extraccin de alcaloides por el mtodo cido.
En un erlenmeyer de 250 ml se colocan 10 g de material vegetal seco y molido con
suficiente cantidad de etanol del 95% (v/v) que cubra la muestra (aproximadamente
100 ml), se macera a temperatura ambiente por 24 horas, tambin pu ede realizarse un
N
CH
3
O
O
Ph
OH
N
CH
3
O
O
Ph
OH
O
N
CH
3
O
OH
C
6
H
5
COOMe
L-Hiosciamina: Atropina
Ester del acido trpico
con la tropina

71
reflujo durante 2 horas si no se dispone del tiempo para la maceracin a temperatura
ambiente. El extracto etan lico se filtra, el residuo slido se lava con 3 porciones de
etanol de 10-15 ml y se descarta, la reunin de los filtrados se concentra a un pequeo
volumen o se evapora a sequedad, luego se le adicionan 15 ml de H
2
SO
4
0.5 N y 10 ml
de agua destilada. La fase acuosa cida se extrae con tres porciones de 10 ml de
hexano para desengrasar, la fase orgnica hex nica se descarta y las acuosas cidas
se alcalinizan con NH
4
OH al 25% hasta obtener un pH entre 10 y 11, posteriormente se
extraen con tres porciones de 10 ml de diclorometano. Los extractos dicloromet nicos
reunidos son secados sobre sulfato de sodio anhidro y llevados a sequedad en
rotaevaporador, el residuo alcalo dico se redisuelve en 3 5 gotas de etanol y 5.0 ml
de H
2
SO
4
0.02N (medidos exactamente con pipeta volumtrica), se adicionan 15 ml de
agua destilada y 2 -3 gotas del indicador rojo de metilo (viraje de pH entre 4. 2 - 6.3).
Esta solucin cida (color rosa) es valorada por retroceso, por adicin de una solucin
de NaOH 0.01 N desde una bureta hasta que el color de la solucin cambie a amarillo.


72
DIAGRAMA DE FLUJO
VALORACIN DE ALCALOIDES DEL TROPANO

Base del mtodo: extraccin de alcaloides en medio cido

Nota:

1. Si al agregar el indicador rojo de metilo no se observa cambio de color a rojo y la
solucin permanece de color amarillo, debe agregarse mayor cantidad de cido ya
que los alcaloides de la mues tra han consumido todo el cido agregado, y es
necesario establecer el medio cido para proceder con la retrovaloracin.

2. Segn el libro Farmacognosia de Trease and Evans 13 edicin, Editorial
Interamericana Mc Graw-Hill 1991 pgina 606, el Estramonio pu ede contener entre
0.2 y 0.45% de alcaloides siendo los principales la hiosciamina y la hioscina
(escopolamina), la droga BP contiene no menos de 0.25% de alcaloide.
Extraer ETOH al 95 % (100 ml) por 24 horas a 25 C reflujo de 2h
Filtrar, Lavar con ETOH (porciones de 10 ml)
Concentrar, Adicionar 15 ml H2SO4 0.5 N y 10 ml H2O
Filtrar si es necesario
Extraer con 15 ml Hexano (3 porciones)
DESECHAR
FASE ORGANICA (hexano)
Alcalinizar con NH4OH 25% (pH: 10 -11)
Extraer con 15 ml CH2Cl2 (3 porciones)
DESECHAR
FASE ACUOSA
Retrovaloracin: Sln NaOH 0.01 N
Punto final: cambio a color amarillo
Agregar 15 ml H2O
Agregar 2 - 3 gotas Indicador Rojo de Metilo (pH: 4.2 - 6.3)
Filtrar sobre Na2SO4
LLevar a sequedad en RVP balon pequeo
Redisolver en gotas de ETOH y 5.0 ml H2SO4 0.02 N
FASE ORGANICA (CH2Cl2) inferior
FASE ACUOSA
FILTRADO
DESECHAR
RESIDUO SOLIDO
Material vegetal Seco y Molido (10 g)

73

Clculos
Tener en cuenta que:
1. Asumir el punto final de la titulacin como el punto d e equivalencia para tomar el
volumen de base utilizada en el proceso de neutralizacin.
2. Calcular el volumen de Volumen de H
2
SO
4
0.02N neutralizado por el alcaloide base
3. El H
2
SO
4
es un cido diprtico, entonces por cada meq de cido reaccionan 2
equivalentes de base NaOH.
4. Cada 1 ml. de cido o de base 0.01 N es equivalente a 2.892 mg. del alcaloide
calculado como L- hiosciamina. PM = 289.2 g/n

En el punto de equivalencia:

1 Meq de Acido = 2 Meq de base
N
H2SO4
x V
H2SO4
= 2 (N
NaOH x
V
NaOH
)
V
H2SO4 libre (exceso)
=

2

(N
NaOH x
V
NaOH
)
N
H2SO4

V
H2SO4 que reacciona con el alcaloide base
= 5.0 ml - V
H2SO4 libre (exceso)

% Alcaloides en la muestra
= 2 (5.0 ml - ((V
NaOH
x N
NaOH
)/ N
H2SO4
)) x 2.892 mg/ml x 100
Peso de muestra (mg)

Datos:
N
H2SO4
= 0.02
N
NaOH
= 0.01
V
H2SO4
= 5.0 ml
V
NaOH
= ?

b. Cuantificacin de rutina en flores de saco y en partes areas de pensamiento

Introduccin
La rutina es un glicsido flavonoide que se encuentra ampl iamente distribuido en
plantas y productos fitofarmacuticos. Esta amplia distribucin, junto con la facilidad en
su deteccin a nivel de laboratorio mediante la cromatografa en capa fina (CCF) y la
espectroscopia Ultravioleta (UV), la hacen un indicador adecuado para el

74
reconocimiento y el control de calidad de productos fitofarmacuticos terminados o sus
materias primas vegetales correspondientes.

Procedimiento
Preparar una solucin estndar de rutina en metanol de concentracin 100 ppm
Tomar 1.2 ml de solucin completar a 10 ml y determinar el espectro UV entre
200 y 400 nm.
Seleccionar la longitud de onda de trabajo.
Para obtener la curva de calibracin, tomar alcuotas de la solucin estndar y
llevar a 10 ml segn la tabla siguiente. Leer absorbanc ias de cada solucin a la
longitud de onda de trabajo. Realizar una curva de Absorbancia vs.
Concentracin en ppm.

Alcuota (ml) Volumen final
(ml)
Absorbancia a
360 nm
Concentracin de rutina
(ppm)
0.6 10.0
0.9 10.0
1.2 10.0
1.5 10.0
1.8 10.0

La grfica muestra una curva de calibracin obtenida experimentalmente con alcuotas
tomadas a partir de una solucin estndar de rutina de concentracin aproximada a
100 ppm.
Curva de calibracin de estndar de rutina
y = 0,0352x + 0,037
R
2
= 0,9906
0
0,1
0,2
0,3
0,4
0,5
0,6
0,7
0,8
0,9
0 5 10 15 20 25
Concentracin en metanol (ppm)
A
b
s
o
r
b
a
n
c
i
a

a

3
6
0

n
m


75

2. Extraccin de la droga
1 g de droga seca y en polvo (pesar con balanza de precisin 1 diezmilsima
de gramo), se extrae con 10 ml de metanol, con agitacin, calentamiento en
bao de agua a 60C, durante 10 minutos. Filtrar, lavar el filtrado dos veces con
10 ml de metanol (preferiblemente cali ente), evaporar a sequedad y pesar el
extracto obtenido.

3. Separacin mediante CCF
Redisolver el extracto en 2 ml de metanol caliente y sembrar una banda en una
cromatoplaca de slica gel GF -254 (20x10 cm, 1 mm espesor de capa),
colocando al lado una apl icacin del estndar de rutina disuelto en metanol.
Evaporar a sequedad el resto de extracto y pesar para determinar por diferencia
el peso de extracto sembrado en CCF.
Desarrollar en la mezcla Acetato de etilo/Acido frmico/Acido actico/Agua
100:11:11:2. 7.
La rutina se observa con un rf aproximado de 0.3, de color amarillo.
Retirar la placa luego de desarrollar, dejarla secar en un extractor de vapores y
analizarla con una lmpara UV a 254 nm.
Demarcar la banda correspondiente a la rutina en la muestra, raspar y extraer
con metanol caliente 3 veces (porciones de 5 a 10 ml). Los filtrados se
concentran a sequedad y se redisuelven en 3 ml de metanol, medidos con
exactitud. Ayudarse con una pipeta Pasteur para evitar prdidas.

4. Lectura espectrofotomtri ca y cuantificacin
Leer absorbancia a 360 nm y determinar concentracin mediante interpolacin
con la curva de calibracin.
Determinar el porcentaje de rutina en la muestra y comparar con lo reportado
para muestras autnticas.

c. Cuantificacin de r utina en un jarabe de saco

Introduccin
La rutina es un glicsido flavonoide que se encuentra ampliamente distribuido en
plantas y productos fitofarmacuticos. Esta amplia distribucin, junto con la facilidad en
su deteccin a nivel de laboratorio median te la cromatografa en capa fina (CCF) y la
espectroscopia Ultravioleta (UV), la hacen un indicador adecuado para el
reconocimiento y el control de calidad de productos fitofarmacuticos terminados o sus
materias primas vegetales correspondientes. En este caso se propone un mtodo de
cuantificacin en un jarabe.

76

Procedimiento
Preparar una solucin estndar de rutina en metanol de concentracin 100 ppm
200 y 400 nm.
llevar a 10 ml segn la tabla siguiente. Leer absorbancias de cada solucin a la
longitud de onda de trabajo. Realizar una curva de Absorbancia v s.
Concentracin en ppm.

(ml)
Absorbancia a
360 nm
Concentracin
de rutina (ppm)
0.6 10.0
0.9 10.0
1.2 10.0
1.5 10.0
1.8 10.0

A partir de la informacin dada en la etiqueta por el fab ricante tomar un volumen
equivalente a 1 g de droga seca y en polvo (medir exactamente con material
volumtrico). Evaporar a sequedad con ayuda de vaco y calentando a 60C. El
residuo se extrae con 10 ml de metanol, con agitacin, calentamiento en bao
de agua a 60C, durante 10 minutos. Filtrar, lavar el filtrado dos veces con 10 ml
de metanol (preferiblemente caliente), evaporar a sequedad y pesar el residuo
obtenido.

Redisolver el residuo en 2 ml de metanol caliente y sembrar una banda en una
cromatoplaca de slica gel GF -254 (20x10 cm, 1 mm espesor de capa),
colocando al lado una aplicacin del estndar de rutina disuelto en metanol.
Desarrollar en la mezcla Acetato de etilo/Acido frmico/Acido actico/Agua
100:11:11:2.7.
La rutina se observa con un rf aproximado de 0.3, de color amarillo.
analizarla con una lmpara UV a 254 nm.
Demarcar la banda correspondiente a la rutina en la muestra, raspa r y extraer
con metanol caliente 3 veces (porciones de 5 a 10 ml). Los filtrados se
concentran a sequedad y se redisuelven en 3 ml de metanol, medidos con
exactitud.


77
4. Lectura espectrofotomtrica y cuantificacin

Figura 1. Espectro UV de rutina en metanol

d. Cuantificacin de anetol en semillas de ans e hinojo

Introduccin
El anetol es un fenilpropano que se encuentra distribuido en varia s plantas aromticas.
Esta amplia distribucin, junto con la facilidad en su deteccin a nivel de laboratorio
mediante la cromatografa en capa fina (CCF) y la espectroscopia Ultravioleta (UV), la
hacen un indicador adecuado para el reconocimiento y el con trol de calidad de
productos fitofarmacuticos terminados o sus materias primas vegetales
correspondientes.

Procedimiento
Preparar una solucin estndar de anetol en metanol de concentracin 100 ppm
200 y 400 nm.
llevar a 10 ml segn la tabla siguiente. Leer absorbancias de cada solucin a la
longitud de onda de trabajo. Las absorbancias deben estar en el rango de 0.3 a

78
0.8, si no es as se debern preparar diluciones calculando absorbancias de 0.3,
0.4, 0.5, 0.6 y 0.7. Realizar una curva de Absorbancia vs. Concentracin en
ppm.

(ml)
Absorbancia a
360 nm
Concentracin de rutina
(ppm)
10.0
10.0
10.0
10.0
10.0

1 g de droga seca y en polvo (pesar con balanza de precisin 1 diezmilsima
de gramo), se extrae con 10 ml de diclorometano, con agitacin, durante 15
minutos. Filtrar, lavar el filtrado dos veces con 10 ml de diclorometano, evaporar
a sequedad y pesar el extracto obtenido.

Redisolver el extracto en 1 ml de tolueno y sembrar una banda en una
cromatoplaca de slica gel GF-254 (20x10 cm, 1 mm espesor de capa),
colocando al lado una aplicacin del estndar de anetol disuelto en tolueno
diclorometano. Evaporar a sequedad el resto de extracto no sembrado y pesar.
Por diferencia determinar el peso de ext racto sembrado.
Desarrollar en la mezcla Tolueno/Acetato de etilo 93:7.
analizarla con una lmpara UV a 254 nm. El anetol se observa a un Rf
aproximado de 0.95.
Demarcar la banda correspondiente al anetol en la muestra, raspar y extraer con
diclorometano 3 veces (porciones de 5 a 10 ml). Los filtrados se concentran a
sequedad y se redisuelven en 3 ml de metanol, medidos con exactitud.

4. Lectura espectrofotomtrica y cuanti ficacin
Determinar el porcentaje de anetol en la muestra y comparar con lo reportado
para muestras autnticas.


79

Figura 2. Espectro UV de anetol en metanol


80

Prctica 8
MARCHA FITOQUMICA
OBJETIVO
Efectuar el estudio qumico sistemtico de las plantas con el fin de detectar varias
clases de sustancias vegetales presentes en ellas como son los alcaloides, los
flavonoides, las quinonas, las sapon inas, los taninos, los compuestos fenlicos, los
triterpenoides, los esteroides, los cardiotnicos y las leucoantocianidinas , las que con
mayor frecuencia se ha comprobado estn relacionadas con actividades biolgicas
especficas, o se utilizan como materi as primas para el desarrollo de productos
farmacuticos comerciales .

Para propsitos de la presentacin de los resultados se deben utilizar las siguientes
convenciones:

Resultado Asignacin
Negativo -
Dudoso +/-
Positivo +
Francamente positivo ++
No determinado ND


81
1. Salado ("Salti ng out")
2. Particin con CHCl
3

Alcalinizar, Particin con
CHCl3 CH2Cl2
HCl diluido
H
2
O
MUESTRA SECA Y PULVERIZADA (50 g)
FRACCIN A (AA, CF, TA, FL, TE, QU, CA, AL, LE)
INSOLUBLES (FRACCIN B) SOLUBLES
FASE CHCl
3
(FRACCIN C) FASE ACUOSA BSICA
FASE CHCl
3
(FRACCIN D) FASE ACUOSA (FRACCIN E)
Ensayar FL, LE, CF, AA, TA
Ensayar AL (en
medio cido)
Ensayar CA, TE
Ensayar FL, LE,
CA, TE, AL
Ensayar AL, FL,
CF, TA

82

CONVENCIONES

AA = AMINOACIDOS
CF..= COMPUESTOS FENOLICOS
TA = TANINOS
FL = FLAVONOIDES
TE = TRITERPENOIDES Y/O ESTEROIDES
QU = QUINONAS
CA = CARDIOTONICOS
AL = ALCALOIDES
LE = LEUCOANTOCIANINAS

83
OBTENCIN Y ANLISIS DE LA FACCIN A

Filtrar en fro
10 ml (caliente)
10 ml
FILTRADO ACUOSO
Llevar a
sequedad *
1 ml
1. Macerar con etanol 70%, 24 horas
2. Reflujar 1 hora
3. Filtrar caliente

DROGA O MUESTRA (50 g) SECA Y PULVERIZADA
FILTRADO (FRACCIN A) Residuo, lavarlo con alcohol
Ensayar
AA
Redisolver en 20 ml de agua
caliente y filtrar
FRACCIN A
RESIDUAL
40 ml
RESIDUO
DESECHAR
FILTRADO
RESIDUO
DESECHAR
Ensayar FL y LE
RESIDUO
DESECHAR
FILTRADO ACUOSO
Ensayar CF y TA
* NOTA: Para llevar a sequedad utilice
calentamiento con temp eratura no mayor de 50 C.

84
ANLISIS DE LAS FRACCIONES A RESIDUAL Y B
Llevar a sequedad
FRACCIN A RESIDUAL
Aadir 30 ml de HCl 5%.
Calentar a 60C durante 15 minutos.
Filtrar en caliente.
Lavar con 20 ml de HCl 5% y filtrar
RESIDUO
RESIDUO INSOLUBLE
RESIDUO
DESECHAR
FILTRADO ACUOSO
ACIDO I
FILTRADO
Disolver con 30 ml de cloroformo o diclorometano
Deshidratar con Na
2
SO
4
anhidro y filtrar
FILTRADO (FRACCIN B)
Ensayar TE, CA, QU, FL.

85
OBTENCIN Y ANLISIS DE LA FACCIN C
Resto
FILTRADO ACUOSO ACIDO I
Lavar con 10 ml de H
2
O
FASE orgnica
RESIDUO
DESECHAR
FASE ACUOSA
BSICA
FASE ACUOSA
Deshidratar con Na
2
SO
4
anhidro y filtrar
Alcalinizar con gotas de NH
4
OH conc. (pH 10-11)
FASE orgnica
FILTRADO (FRACCIN C)
Particin con 2x15 ml de cloroformo (o diclorometano)
Llevar a sequedad
Redisolver en 10 ml de HCl 5% con calor y filtrar
Ensayar CA y TE.
FILTRADO
Ensayar AL.
RESIDUO
DESECHAR
5 ml

86
OBTENCIN Y ANLISIS DE LAS FRACCIONES D Y E
FASE ACUOSA BSICA
Lavar con 20 ml de solucin semisaturada de NaCl
FASE orgnica FASE ACUOSA
(FRACCIN E)
FASE ACUOSA
Deshidratar con Na
2
SO
4
anhidro y filtrar

FASE orgnica
FILTRADO (FRACCIN D)
Hacer particin con 2x15 ml de CHCl
3
CH
2
Cl
2

Redisolver D1 en 4 ml de etanol y ensayar FL, CA, LE.

RESIDUO
DESECHAR
Repartir en tres porciones iguales
de 5 ml c/u: D1, D2 y D3. L levar a
sequedad.
Redisolver D2 en 1 ml de CHCl
3
y ensayar TE.
Redisolver D3 en 5 ml de HCl 1% y ensayar AL.
Neutralizar con HCl y ensayar FL, LE,
AL (en medio cido), CF (pH
ligeramente cido) y TA (pH neutro).
FIN

87


88
ENSAYOS SOBRE LAS FRACCIONES A -E

1. ENSAYO DE SHINODA (O DE LA CIANIDINA) PARA FLAVONOIDES Y OTRAS
SUSTANCIAS CON EL NUCLEO -BENZOPIRONA.

Precaucin 1: Antes de realizar el ensayo, si se trata de muestras que contienen
demasiadas clorofilas, estas se deben eliminar precipitndolas co n acetato de plomo
en solucin.

Precaucin 2: Si la muestra est en solucin clorofrmica o diclorometnica, se debe
evaporar para eliminar el solvente y redisolverla en 1 ml de alcohol.

Precaucin 3: Realizar la prueba en la campana de extraccin de gas es y sujetando el
tubo de ensayo con una pinza.

Ensayo: Tomar 1 ml de solucin en un tubo de ensayo limpio. Aadir algunas li maduras
de Mg. sujetar el tubo con una pinza. Aadir cuidadosamente por la pared del tubo,
unas gotas de HCl concentrado (37%).

La aparicin de coloraciones naranja a violeta es prueba positiva para la presencia de
flavonoides.

Para fines de comparacin realizar la prueba con 0.5 ml de una solucin patrn de
morina.

2. ENSAYO DE ROSENHEIM (PARA LEUCOANTOCIANIDINAS):

Ensayo: Tomar 1.0 ml de solucin acuosa en un tubo de ensayo limpio. Aadir 0.5 ml
de HCl concentrado. Mezclar. Calentar durante 10 minutos a 100
0
C y enfriar. Pasar a
un tubo de ensayo de 10 x 75 mm. Aadir 0.4 ml de alcohol amlico y agi tar. Dejar
separar las fases. La prueba se considera positiva si aparece coloracin en la fase
amlica que vaya desde el carmes oscuro al rosado dbil.

3. ENSAYO DEL FeCl
3
(PARA COMPUESTOS CON HIDROXILOS FENOLICOS):

Ensayo: Tomar 1.0 ml de solucin acuosa o alcohlica en un tubo d e ensayo limpio.
Aadir 1 gota de FeCl
3
al 1% acuoso o alcohlico. Mezclar. La aparicin de
coloraciones violeta, verdes, azules u oscuras se considera prueba positiva.
Para fines de comparacin realizar la prueba con 0.5 ml de solucin pa trn de cido
tnico.


89
4. ENSAYO DE LA GELATINA -SAL (PARA TANINOS):

Ensayo: Tomar 1.0 ml de solucin acuosa neutra en un tubo de ensayo limpio. Aa dir
1.0 ml de solucin de gelatina -sal. La formacin de un precipitado se considera prueba
positiva. Centrifugar si es ne cesario para observar el precipitado.

Precaucin: Algunas otras sustancias tambin producen precipitados con este
reactivo, para eliminar tales interferencias, es recomendable uti lizar el procedimiento de
Sanabria, Pg. 73.

5. ENSAYO DE LIEBERMANN-BURCHARD (PARA TRITERPENOIDES Y/O
ESTEROIDES CON GRUPOS DIENO CONJUGADOS REALES O
POTENCIALES):

Precaucin 1: El ensayo se realiza con muestras disueltas en cloroformo
Diclorometano nicamente.

Precaucin 2: Al adicionar el cido sulfrico hacerlo en la ca mpana de extraccin. La
reaccin libera calor, utilizar pinza para tubo de ensayo. Si la solucin el tubo de
ensayo no estn completamente secos puede haber salpicaduras.

Ensayo: Tomar 0.5 ml de solucin clorofrmica anhidra en un tubo de ensayo limpio y
seco. Aadir 0.5 ml de Anhdrido actico. Aadir cuidadosamente por la pared del tubo,
una gota de Acido sulfrico concentrado. Observar y anotar los cambios de coloracin.
Se considera positiva la prue ba cuando aparecen coloraciones violeta, verde o az ul.

6. ENSAYO DE BORNTRANGER (PARA NAFTO - Y ANTRAQUINONAS)

Precaucin: Realizar esta prueba en la campana de extraccin ya que el benceno y el
tolueno son sustancias muy txicas.

Ensayo: Tomar 3 ml de solucin clorofrmica y llevarlos a sequedad. Rediso lver en 5
ml de alcohol: H
2
0 (1:7). Aadir 1 ml de agua oxigenada de 20 vol menes, 1 ml de
cido sulfrico al 50% y calentar la mezcla en un bao de agua hirviendo durante 10 -15
minutos. Dejar enfriar y extraer en un embu do de separacin con 5 ml de benc eno
tolueno.

Retirar 2 ml de la fase orgnica y agitarla en otro tubo con 1.0 ml de solucin de NaOH
al 5% en NH
4
OH al 2%. La prueba se considera positiva cuando aparecen coloraciones
que van del rosado al rojo intenso en la ca pa alcalina.


90

7. ENSAYO DE KEDDE (PARA CARDIOTONICOS)

Precaucin: La formacin del color violceo no dura sino algunos pocos segundos.

Ensayo: Tomar 1 ml de la fase orgnica. Llevar a sequedad. Redisolver en 1 ml de
alcohol. Aadir 0.5 ml de reactivo de Kedde recin prepa rado (Mezcla de partes iguales
de las soluciones A y B). Se considera positiva la prueba si aparece una coloracin
prpura o violcea. Como referencia se puede compa rar con el color producido con 1
ml de KOH al 5% en alcohol.

8. ENSAYOS PARA ALCALOIDES

Precaucin 1: Todos los ensayos deben hacerse siempre con la muestra disuelta o
redisuelta en HCl 5% acuoso.

Precaucin 2: La solucin acuosa cida debe estar libre de turbiedades y precipitados
antes de hacer los ensayos para alcaloides.

Precaucin 3: Luego de realizados los ensayos, se deben desechar las muestras en un
frasco dispuesto para ello en el laboratorio, esto con el fin de no contaminar el
ambiente con metales pesados.

Ensayos: Tomar 0.5 ml de solucin acuosa cida en 4 tubos de ensayo limpios. Aadir
a cada tubo 1 gota de los reactivos de Dragendorff, Mayer, Valser y Reineckato de
amonio. Se considera prueba positiva cuando aparecen preci pitados en por lo menos 3
tubos.

Para fines de comparacin realizar el ensayo con 0.5 ml de una solucin p atrn de
sulfato de quinina.

9. ENSAYO DE NINHIDRINA (PARA AMINOACIDOS).

Ensayo: Colocar 1 gota de solucin, en una tirilla de papel filtro. Secar. Aadir 1 gota
de reactivo de ninhidrina (Solucin al 0.002% en alcohol). Calentar sobre una plancha
de calentamiento a 105
0
C. El desarrollo de coloraciones violeta, azul o rosada se
considera prueba positiva.


91

BIBLIOGRAFA CONSULTADA

1. SANABRIA G. Antonio: Anlisis Fitoqumico Preliminar, Departamen to de
Farmacia, Universidad Nacional, Bogot, 198 3.

2. ARANGO A. Gabriel J. QUIJANO T. Jairo: Marcha Fitoqumica Semicuantitativa,
Facultad de Ciencias Exactas y Naturales, Universidad de Antioquia, Medelln.

3. DOMINGUEZ X.A., Mtodos de Investigacin Fitoqumica, Ed. Limusa, Mxico,
1979.

92

PAUTAS PARA LA ELABORACIN DEL INFORME DE LABORATORIO

El informe de laboratorio incluir el desarrollo y presentacin de cada uno de los
siguientes puntos:

TITULO
El titulo debe describir en forma somera el alcance del expe rimento realizado
procurando que no sea excesivamente largo y detallado como tampoco que sea
muy corto y demasiado general.

Cuando un experimento se trabaje con una determinada especie vegetal o animal,
el titulo debe incluir el nombre cientfico de la misma, de acuerdo con las normas
universales estableci das; adems el nombre vulgar, y la familia a la cual
pertenece la muestra. En este caso, tambin debe incluirse el nombre de la parte
de la especie analizada (por ejemplo: raz, fruto, hojas, partes areas, etc.).
Por otro lado, el titulo debe incluir los nombres de las prin cipales tcnicas de
laboratorio empleadas (ejemplo Purificacin por cromatografa en columna de . .
., ... identificacin por espectroscopia ultravioleta de . . . , etc.) .

Un modelo de ttulo es:

Aislamiento y caracterizacin del componente principal del aceite esencial de
hojas de ajenjo, Artemisia absinthium, Compositae, mediante cromatografa en
capa fina y tcnicas espectrales

En este ttulo se reconocen las siguientes partes:

Los logros alcanzados: Aislamiento y caracterizacin de una sustancia.
La parte de la planta analizada : Las hojas
El nombre comn de la planta : El ajenjo
El nombre cientfico de la planta : Artemisia absinthium ( en itlicas)
La familia vegetal : Compositae (en ingls), Compuestas (en espaol)
La tcnica de aislamiento : Cromatografa en capa fina .
La tcnica de caracterizacin : Mtodos espectrales .

DATOS
En esta parte del informe deben incluirse todas las medicio nes y observaciones
realizadas en el laboratorio y que permiten hacer un anlisis e interpretacin de
los fenmenos observados. Por ejemplo, los dibujos de las cromatoplacas
obtenidas en un anlisis por cromatografa en capa fina con sus manchas y
colores correspondientes ; los valores de absorbancia o transmitancia de un
pigmento carotenoide al analizarlo por espectroscopia ultravioleta, los espectros

93
infrarrojo o ultravioleta determinados; los resultados de reacciones coloreadas
para reconocer algn metabolito secun dario, etc.

ANALISIS DE RESULTADOS
En este tem se incluir la forma como se interpretaron los resultados obtenidos
por comparacin con datos obtenidos con patrones o reportados en la literatura
cientfica, citando como una nota al pi la referencia bibliogrfica
correspondiente.

Al citarse un dato u observacin de los reportados en la li teratura, debe siempre
citarse la correspondiente referencia, la cual debe aparecer en el tem Bibliografa,
y en el texto debe sealarse dicha referencia, por ejemplo:

ANALISIS DE RESULTADOS

La sustancia aislada mostr un mximo de absorcin en su es pectro ultravioleta
en 206 nm, lo cual esta de acuerdo con lo reportado por Silverstein (1978) para
sustancias con enlaces dobles aislados....

.... De acuerdo con este anlisis la sustancia mas pro bable es el Bcaroteno,
ya que se necesitara determinarle por lo menos el correspondiente espectro de
masas para confirmar este hecho....

CONCLUSIONES Y RECOMENDACIONES

En este tem se debe incluir solamente aquellos hechos demos trados en la
observacin experimental de cada prctica, y las sugerencias que se considere
de inters sobre las conclusio nes obtenidas.

Las conclusiones no deben ir reseadas bibliogrficamente, puesto que son
inherentes a la interpretacin que d el es tudiante al experimento realizado.

Por ejemplo unas conclusiones pueden ser:

...el principal componente del aceite de clavo el eugenol.

De acuerdo con los sistemas utilizados en la prctica el mejor sistema eluente
para separar por cromatografa en capa fina los caroteno ides de la zanahoria
(Daucus caraota) es la mezcla diclorometano/ter de petrleo 50:50....

Las conclusiones no deben incluir eventos tales como cortes de energa, falta
de recursos, dao de aparatos, excusas m dicas, etc.


94

BIBLIOGRAFIA

Este tem debe relacionar en el orden alfabtico (por apelli dos del primer autor)
solamente aquellos documentos, libros, revistas, folletos, comunicaciones
personales, etc. que sean inherentes al informe, es decir los que efectivamente
fueron consultados por el es tudiante para la elaboracin del informe.

Por otro lado, si el estudiante encuentra un mismo dato re portado en varias
fuentes bibliogrficas, debe reportar solo aquella que considere ms
conveniente de acuerdo con su criterio. Por ejemplo, si encontr en el libro A
que el fruto del tomate maduro contiene licopeno, y en otro libro B encontr que
el mismo contiene -caroteno (pigmento amarillo) y licopeno (pigmento rojo)
junto con otros pigmentos carotenoides... etc. , debe reportar solo el libro que le
informe ms sobre lo reali zado en la prctica, es decir el B, en este caso. Si no
es posible discernir entre uno y otro, siempre debe reportarse el ms reciente
en su publicacin.

Para propsitos de presentar las referencias bibliogrficas en cada informe s e
deben tomar los siguientes modelos:

Para libros:

Autor(es); Ttulo, volumen, Editor o Editorial, Nmero de edicin,
ciudad, ao, paginas consultadas.

Ejemplo:

HARBORNE J.B.: PHYTOCHEMICAL METHODS, Chapman and
Hall Ltd., New York, 1973, pp 119 120.

Para revistas:

Autor(es); ttulo del artculo (en minsculas), nombre de la revista (en
may
4
sculas), volumen, nmero, paginas consultadas, (ao).

Por ejemplo el siguiente modelo:


95
Garg V.K., Nes W.R.; Codisterol and other
5-
Sterols in the seeds of Cucurbita
maxima PHYTOCHEMISTRY 23 (12), 2925 2929 (1974).

Para documentos publicados en Universidades:

Autor(es), ttulo, Facultad o Departamento, Universi dad, ciudad, ao, pginas
consultadas.

Por ejemplo:

Martnez M. A.; Manual de practi cas para el laboratorio de Fitoqumica,
Facultad de Qumica Farmacutica, Universidad de Antioquia, Medelln, 1988,
pp. 1518.

Para referencias bibliogrficas de Internet:
Se deben citar solamente pginas web de entidades acadmicas y cientficas
reconocidas, acompaadas de la primera pgina impresa con la
correspondiente direccin http y la fecha de consulta.

No se aceptan como referencias bibliogrficas las comunicaciones personales,
excepto las impresas enviadas por correo electrnico.

Nota: Cuando se reporten referencias bibliogrficas incompletas que se
compruebe que no son consistentes con lo escrito en el informe, este se
calificar sobre una base del 70% de la calificacin mxima.

Evaluacin:

Prctica 1: Informe al profesor, 5%
Prctica 2: Informe 7%, quiz 3%
Prctica 3: Informe 7% y quiz 3%
Prctica 6: Informe, 10%
Prctica 7: Informe, 10%
Prctica 8: Informe 7% y quiz 3%
Prctica especial: Anteproyecto 5%, Pster 20%.


96
Bibliografa

1. Domnguez, X. A., Mtodos de Investigacin Fitoqumica, Edit. Limusa, Mexico,
1973.
2. Wagner, H., Bladt, S., Zgainski, E. M., Plant Drug Analysis. A Thin Layer
Chromatography Atlas, Springer -Verlag, Berlin-Heidelberg-New York-Tokyo, 1984.
3. Evans, W. C., Farmacognosia Trease -Evans, 13 edic., Interamericana McGraw -Hill,
Madrid-Auckland-Bogot, 1991.
4. Harborne, J. B., Phytochemical Methods. A Guide to Modern Techniques of Plant
Analysis, Chapman & Hall, London -Weinheim-New York, 1998.
5. Gattuso, M. A., Gattuso, S. J., Manual de Procedimientos para el Anlisis de Drogas
en Polvo, UNR Editora, Cyted, Rosario (Argentina), 1999.
6. Ramrez, S., Fonnegra, R., Plantas Medicinales Aprobadas en Colombia,
Universidad de Antioquia, Medelln, 1999.
7. http://matematicas.udea.edu.co/~carlopez/laboratorio/pagelab.html
8. http://farmacia.udea.edu.co/~ff
9. http://matematicas.udea.edu.co/~carlopez
10. Stahl, E., Thin Layer Chromatography
11. Martnez, A., Farmacognosia y Fitoqumica Experimental, Universidad de Antioquia,
Medelln, 1991.
12. Revistas especializadas: Phytochemistry, Planta Medica, Journal of Natur al
Products, Journal of Food and Agricultural Chemistry, etc.
13. Bases de datos: Napralert
14. Repblica de Colombia, Ministerio de Salud, Decreto ley N 677, Ley del
medicamento de 1994.
15. Quality Control Methods for Medicinal Plant Materials, World Health Org anization,
Geneva, 1998.
16. Sharapin, N., Fundamentos de Tecnologa de Productos Fitoterapeticos, Roberto
Pinzn ed., Programa Iberoamericano de Ciencia y Tecnologa para el Desarrollo,
Cyted, Santaf de Bogot D. C., 2000.
17. CD Farmacognosia y Fitoqumica, versin 2.0, Alejandro Martnez , Universidad de
Antioquia, Medelln, 200 5.

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