INTRODUCCIN

La luz que es un "agente fsico que hace visibles los objetos

1
", es utilizada
frecuentemente para el estudio de sustancias que absorben algunas longitudes
de ondas de este tipo de energa. Esto ocurre ya que la mayora de los
elementos tienen la capacidad de absorber, repeler o emitir energa, ya sea en
forma de luz o calor. ebido a la distinta intensidad de atrapar o repeler la luz, es
posible de identificar a cada elemento o sustancia mediante la luz, ya que se
podr! registrar el nivel de absorbancia o transmitancia de cada objeto, m!s a"n
si es que estos poseen color. #$n espectro de emisi%n, se produce cuando los
!tomos en un estado e&citado emiten fotones caractersticos del elemento a
medida que regresan a sus estados de m!s baja energa. En tanto que, el
espectro de absorci%n se produce cuando los !tomos absorben fotones de
ciertas longitudes de onda y se e&citan desde estados de energa menores hasta
estados de energa mayores
'
(.
)ara poder medir cuantitativamente cuanta luz atraviesa o capta cada
elemento, se utiliza un instrumento que bombardea con fotones a las soluciones,
y mide la energa que es capaz de atravesar. *!sicamente, se encarga de tomar
una se+al producida previa e&citaci%n de una muestra a determinada
concentraci%n mediante la aplicaci%n de distintas longitudes de onda y que, no
suele ser detectable directamente por el ser humano, para convertirla en una
forma que sea perceptible, ya sea, entregando gr!ficas o datos num,ricos
dependiendo de la complejidad del aparato, este instrumento se llama
espectrometr%metro. #-dem!s, de permitir la identificaci%n de una sustancia, un
espectr%metro puede usarse para medir su concentraci%n, porque la
-bsorbancia, la cantidad de luz a una longitud de onda dada absorbida por una
sustancia es proporcional al n"mero de mol,culas
'
(. .ientras mayor sea la
concentraci%n del objeto, menos luz ser! captada por el aparato, por lo tanto
mayor ser! la absorbancia. $na analoga que puede ocupar es cuando se patea
un tiro libre, mientras m!s jugadores se ocupen en la barrera, m!s probable es
que la pelota impacte a alg"n deportista.
os conceptos que se han ocupado varias veces en esta introducci%n son el
de absorbancia y transmitancia. El primero se define como "la cantidad de
intensidad de luz que absorbe la muestra
/
". - mayor cantidad de luz absorbida,
mayor ser! la absorbancia del cuerpo, y menor cantidad de luz ser! transmitida
por dicho cuerpo.
)or otro lado la transmitancia, se refiere a la "cantidad de luz que atraviesa un
cuerpo, en una determinada longitud de onda. 0uando un haz de luz incide
sobre un cuerpo trasl"cido, una parte de esa luz es absorbida por el mismo, y
otra fracci%n de ese haz de luz atravesar! el cuerpo, seg"n su transmitancia
1
". El
valor de la transmitancia de un objeto se puede determinar seg"n la siguiente
e&presi%n2
I es la cantidad de luz transmitida por la muestra e I
0
es la cantidad total de
luz incidente.
.uchas veces encontraremos la transmitancia e&presada en porcentaje,
seg"n la f%rmula2
0omo podemos darnos cuenta, la absorbancia y la concentraci%n de una
sustancia est!n ntimamente relacionados entre s, eso destaca la ley de
Lambert3*eer. Esta ley se basa en tres fen%menos que e&plicaran cuanta luz es
capaz de atravesar un objeto2
La cantidad 4concentraci%n5 de material que absorbe en el medio.
La distancia que la luz tiene que viajar! trav,s de la muestra
)robabilidad de que el fot%n de cierta longitud de onda sea absorbido por el
material 4coeficiente de absorci%n o de e&tinci%n molar del material5.
Estas tres condiciones se integran en una f%rmula que establece esta ley2

c b A =

2 0oeficiente de e&tinci%n molar en L mol

31
cm
31
b2 Longitud de la muestra 4cubeta5 en cm
c2 0oncentraci%n del compuesto en soluci%n en mol L
31
)or "ltimo es importante destacar que esta ley establece dos gr!ficos que
indican comportamientos de la absorbancia y la transmitancia. Los cuales se
llaman curvas de calibraci%n.
Estos gr!ficos indican que la absorbancia directamente proporcional al
camino %ptico, al contrario de la transmitancia que es indirectamente
proporcional al camino que debe atravesar la luz.
6inalmente, es importante conocer la estructura de la 7iboflabina, ya que a
esta vitamina se realizar!n distintos estudios de absorbancia y transmitancia
para obtener los datos que nos permitan obtener todos los datos y as realizar
una curva de calibraci%n, es por esto que a partir de este elemento se realizar!n
distintas disoluciones con concentraciones distintas y as ir observando que
ocurre con la luz en cada una de las situaciones.
"La vitamina *' es una vitamina hidrosoluble de color amarillo, constituida
por un anillo de isoalo&azina dimetilado al que se une el ribitol, un alcohol
derivado de la ribosa. Los tres anillos forman la isoalo&acina y el ribitol es la
cadena de 8 carbonos en la parte superior.
Esta vitamina es sensible a la luz solar y a ciertos tratamientos como la
pasteurizaci%n, proceso que hace perder el '9: de su contenido. )or ejemplo,
la e&posici%n a la luz solar de un vaso de leche durante dos horas hace perder el
89: del contenido de vitamina *'. -lgunas fuentes de vitamina *' son2 leche,
queso, vegetales de hoja verde, hgado y legumbres
;
".
OBJETIVOS
Estudiar y ejecutar los pasos b!sicos que se utilizan en la t,cnica de
espectrofotometra.
0onstruir una curva de calibraci%n para la 7iboflavina seg"n la longitud de
onda de m!&ima absorci%n que se haya determinado e&perimentalmente.
eterminar la concentraci%n de una soluci%n problema a trav,s del
comportamiento de la luz.
0omprobar de manera pr!ctica los sustentos en los que se basan la ley de
Lambert3*eer.
eterminar el comportamiento de la luz en la 7iboflavina 4vitamina5 y
posteriormente realizar una curva de calibraci%n.
ETODOS
ateriales
<oluci%n patr%n de 7iboflavina 1 & 1931 .
8 =ubos de ensayo > ' cubeta 8ml
-gua bidestilada
Espectrofot%metro
.ircropipetas
!rocedimientos
E"periencia n# $% RE&'I(&CIN DE UN ES!ECTRO)R&&
$. <e enciende y deja estabilizar el instrumento 418 min5.
*. Enseguida se efect"a lecturas entre //9 y 8;9 m. 40ada 19 m5. En todas
las lecturas se usa agua destilada como blanco.
+. En las zonas de m!&ima absorci%n, se vuelve a leer en intervalos m!s
peque+os 4cada 8 m5 para definir adecuadamente la curva en estas regiones.
,. <e anota la naturaleza de la soluci%n, su concentraci%n original, coeficiente de
e&tinci%n molar, la concentraci%n calculada y el espesor de la cubeta.
-. <e anota en forma tabulada la longitud de onda, el : de transmitancia 4:=5 y
la absorbancia correspondiente.
.. <e grafica en papel milimetrado el espectrograma, colocando - en la
ordenada y ?0@ en la abscisa.
/. )osteriormente se calcula el coeficiente de e&tinci%n e&perimental a la
longitud de onda de trabajo y an%telo. 6inalmente se compara el valor obtenido
e&perimentalmente con el de la literatura.
!reparaci0n de la soluci0n coloreada.
- partir de una soluci%n patr%n de 7iboflavina 1 & 1931 ., mediante el coeficiente
de e&tinci%n, se calcula concentraci%n de 7iboflavina requerida para que el
espectrograma resultante. )osteriormente se prepara 8 ml de la soluci%n.
E"periencia n#*% CURV& DE C&'IBR&CIN
!reparaci0n de soluciones.
a1 <e prepara una serie de tubos que contengan2 9,1, 9,', 9,/, 9,1 y 9,8 moles
de 7iboflavina por tubo, y se lleva a todos los tubos a un volumen final de 19 ml
con agua bidestilada. Enseguida se realizan los c!lculos necesarios.
21 <e utiliza el espectrofot%metro, se mide la absorbancia de cada muestra, a la
longitud de onda e&perimental de mayor absorbancia para la 7iboflavina.
c1 <e grafica en papel milimetrado & 4eje y5 versus Amoles de 7iboflavina en la
muestra 4eje &5.
d1 <e mide la absorbancia de una muestra problema que le ser! proporcionada
en el laboratorio. <e utiliza la misma longitud de onda del paso 4b5.
RESU'T&DOS
E"periencia n#$% RE&'I(&CIN DE UN ES!ECTRO)R&&
Calculo de concentracin de Riboflavina requerida para el
espectrograma.
3 V$ " C$ 3 V* " C*
3 V$ " $"$4
5,
3 6 " $4
5-
" -ml
V$ 3 76 " $4
5-
8 $"$4
5,
1 " -ml
V$ 3 ,ml
<e necesitan 8m de soluci%n, por lo tanto se a+aden en un tubo, 1 ml de
7ivoflavina B 1ml de agua destilada.
Ta2la n#$% Lectura de absorbancia a diferentes longitudes de onda
'on9itud de onda 7m1 ++4 +,4 +-4
&2sor2ancia 9,/18 9,11C 9,89/
+.4 +/4 +64 +:4 ,44 ,$4 ,*4
9,;1D 9,;19 9,88' 9,89; 9,1E1 9,8'1 9,;99
,+4 ,,4 ,-4 ,.4 ,/4 ,64 ,:4
9,;E1 9,E1E 9,E99 9,;'1 9,8/8 9,/C1 9,''1
-44 -$4 -*4 -+4 -,4 --4 -.4
9,9CD 9,9/D 9,91C 9,911 9,99C 9,991 9,991
3 El valor de absorbancia m!s alto se observ% a 119 m, lo que significa
Longitud de onda 4nm5
-bsorbancia
que est! en el rango de los 118 m, por lo tanto la 7iboflavina posee un
coeficiente de e&tinci%n molar de 1'.899. <eg"n los siguientes datos2
;m<" = 75$ cm5$ 1
';; /1.D99 /E/ 19.199
118 1'.899
Calculo de concentracin de Riboflavina
& 3 =>c>2 por lo tanto c 3 &8 =2
E"periencia n#*% CURV& DE C&'IBR&CIN
=ubo Fmoles 7iboflavina 1&19
31
. Gol. 7iboflavina 1&19
31
. Gol. de H
'
9
1 4*lanco5 9 Fmol 9 mL 8 mL
' 9,1 Fmoles 1 mL 1 mL
/ 9,' Fmoles ' mL / mL
1 9,/ Fmoles / mL ' mL
8 9,1 Fmoles 1 mL 1 mL
; 9,8 Fmoles 8 mL 9 mL
Tabla n 2: ol!menes de cada tubo
Tabla n": Calculo de vol!menes de cada tubo
Tu2o $ Tu2o *
1&19
31
moles de 7iboflavina 1999 mL
9&19
3;
moles de 7iboflavina I mL
?3 4 m' de Ri2o@laAina
1&19
31
moles de 7iboflavina 1999 mL
9,1 &19
3;
moles de 7iboflavina I mL
?3 4B$ m' de Ri2o@laAina
Tu2o + Tu2o ,
1&19
31
moles de 7iboflavina 1999 mL
9,' &19
3;
moles de 7iboflavina I mL
?3 4B* m' de Ri2o@laAina
1&19
31
moles de 7iboflavina 1999 mL
9,/&19
3;
moles de 7iboflavina I mL
?3 4B+ m' de Ri2o@laAina
Tu2o - Tu2o .
-J 9,E1E
K J 1'.899 .
31
cm
31
b J 1 cm
0 J 9,E1E > 1'.899 .
31
cm
31
& 1 cm
0 J 9,E1E > 1'.899 .
31
0 J 8,E/;&19
38
. 8E,/; u.
1&19
31
moles de 7iboflavina 1999 mL
9,1 &19
3;
moles de 7iboflavina I mL
?3 4B, m' de Ri2o@laAina
1&19
31
moles de 7iboflavina 1999 mL
9,8 &19
3;
moles de 7iboflavina I mL
?3 4B- m' de Ri2o@laAina
Tabla n#: $bsorbancia de las soluciones
In@ormaci0n 2<sica2 Espectrofotometra realizada a 119 m
Tu2o 1
4blanco5
' / 1 8 ;
Concentraci0n 9 umol 9,1umol 9,' umol 9,/ umol 9,1 umol 9,8 umol
&2sor2ancia 9,9 9,19C 9,'18 9,/'9 9,1'/ 9,8'C
%uestra problema
In@ormaci0n 2<sica% <e determin% la absorbancia de la muestra problema y
posteriormente se interpol% en la curva de calibraci%n realizada.
$bsorbancia muestra problema
In@ormaci0n 2<sica2 Espectrofotometra realizada a 119 m
-bsorbancia 9,1/D
0oncentraci%n 4umol5
-bsorbancia
Interpolar absorbancia de muestra problema en curva de calibracin
C&lculo ecuacin lineal:
3 ' ( )*0+#,- . 0*002"
3 0*)", ( )*0+#,- . 0*002"
3 )*0+#,- ( 0*)", / 0*002"
3 )*0+#,- ( 0*)"+0
3 - ( 0*)"+0 1 )*0+#,
3 - ( 0*)2,2#33,)
0oncentraci%n 4umol5
-bsorbancia
0oncentraci%n de 7iboflavina con
una absorbancia de 9,1/D es de
0*)2,2#33,) umoles
4I5C65I78
E"periencia n#$% ES!ECTRO)R&&
En la realizaci%n del espectrograma podemos decir, que la 7iboflavina
#constituida por un anillo de isoalo&azina dimetilado al que se une el ribitol, un
alcohol derivado de la ribosa. Los tres anillos forman la isoalo&acina y el ribitol es
la cadena de 8 carbonos en la parte superior(
;
, debido a esto la 7iboflavina
absorbe mucha luz al momento de realizar un procedimiento de absorciometra,
obteniendo como picL de absorci%n 119 nm, que est! en el rango te%rico que
son 118 nm, esta variaci%n se produjo porque e&iste una #e&actitud fotom,trica,
que es el grado de concordancia entre la absorbancia real y la absorbancia
medida(
E
. )or ende, las variaciones obtenidas se producen por #el error cometido
al leer una absorbancia respecto de una referencia se denomina entonces
#ine&actitud fotom,trica(
E
.
E"periencia n#*% CURV& DE C&'IBR&CIN
En la realizaci%n de la curva de calibraci%n podemos decir que nuestra curva
fue casi perfecta, donde todos los puntos se acercan mucho a la lnea de
tendencia trazada, al ser un gr!fico lineal haciendo que e&ista una relaci%n
directa entre la absorbancia y la concentraci%n de las soluciones, haciendo que
estos resultados sean estadsticamente significativos y confiables para poder
interpolar cualquier soluci%n problema. Esta confecci%n de la curva se pudo
realizar de la mejor manera gracias a los c!lculos realizados que fueron los
precisos, a la preparaci%n de los tubos con diferentes concentraciones y a la
medici%n en el espectrofot%metro de estas soluciones.
En el caso de la muestra problema podemos decir que no hubo problemas
en la obtenci%n de la absorbancia en esta se pudo interpolar de manera perfecta
en la curva de calibraci%n, obteniendo as su concentraci%n a trav,s de esta
curva que presenta datos significativos y confiables.
C78CL65I78
En sntesis, podemos decir que los m,todos de absorciometra, en este caso la
espectrofotometra son m,todos b!sicos y no complejos para conocer la
cantidad de alguna sustancia que se requiera, muy "tiles para e&!menes
m,dicos. Este m,todo se pudo lograr con bastante satisfacci%n en nuestro grupo
de trabajo, en especial todo lo que es manejo de realizar las disoluciones.
)or otro lado, en realizaci%n de la curva de calibraci%n, podemos decir que
efectivamente se cumple la ley de Lambert y beer, la cual nos dice que e&iste
una relaci%n directa entre la absorbancia y la concentraci%n, puesto que, la
absorciometra aprovecha la propiedad de ciertos compuestos de absorber
radiaci%n electromagn,tica, una herramienta "til que mide cuantitativamente
esta propiedad de los compuestos que absorben radiaci%n es el
espectrofot%metro que calcula la capacidad de absorbencia y transmitancia a
distintas longitudes de onda y concentraci%n de una soluci%n en particular. )or lo
tanto, a mayor concentraci%n de una soluci%n, mayor es la absorbancia.
Logramos comprender que hay compuestos que absorben luz a distintas
longitudes de onda debido a su estructura, en este caso, la riboflavina al
presentar anillos arom!ticos en su estructura presentaba poda absorber gran
cantidad de luz a 119 nm.
)or "ltimo, el espectrofot%metro como instrumento cuantitativo, entrega datos de
car!cter precisos, pues, e&iste una concordancia o cercana entre valores al
repetir las mediciones.
9I9LI7:R$;<$
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