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Ensayos fitoqumicos, cromatogrficos y actividad

antibacteriana del extracto etanlico de Bauhinia


variegata.
Laura Camila Orozco Ardila
1
, Angie Lizeth Silva Martnez
1
.
1. Estudiante de Ingeniera Qumica, Falcultad de Ingeniera, Universidad de la Sabana, Cha
Cundinamarca, Colombia.
Resumen.
Se realiz el ensayo de arrastre por vapor con hojas y tallos de la planta Bauhinia variegata para
reconocer la presencia de aceite esencial, obteniendo un resultado negativo, ya que el aceite se
encuentra en semillas y frutos. Se aplicaron pruebas fitoqumicas al extracto etanlico y de acetato
de etilo, de hojas y tallos de la planta para reconocer los metabolitos secundarios contenidos en los
mismos, obteniendo positivo para flavonoides, azcares reductores, quinonas, cumarinas,
glucsidos cardiacos y sesquiterpenlactonas. A partir de estos resultados, se decidi realizar la
separacin de compuestos flavnicos por medio de cromatografa en columna, la fase mvil y el
extracto se eligi a base de ensayos en cromatografa en capa fina, escogiendo Tolueno-Metanol
(8:2) y Metanol como fase mvil; y el extracto etanlico como muestra analizar; se obtuvo 13
fracciones que fueron reconocidas por cromatografa en capa fina, revelndolas por medio de la
cmara UV y con sulfato crico amnico, observando presencia de flavonoides en las fracciones 7
y 8. La actividad antibacteriana se desarroll para las fracciones y el extracto etanlico con dos
bacterias: Escherichia Coli como gramnegativo y Staphylococcus Aureus como grampositivo,
encontrando que la planta tiene propiedades inhibitorias.
Abstract.
It was performed the drag test by vapor with leaves and stems of the plant Bauhinia variegata to
recognize the presence of essential oil, getting a negative result, due to the oil is found in seeds and
fruits. Phytochemical tests were applied to the ethanol extract and the ethyl acetate, of leaves and
stems of the plant, to recognize secondary metabolities contained therein, obtaining positive for
flavonoids, reducing sugars; quinones, coumarins, cardiac glycosides and sesquiterpene lactone .
From these results, it was decided to make the separation of flavone compounds by column
chromatography, the mobile phase and the extract was chosen, based on tests in thin layer
chromatography, choosing Toluene-Methanol (8:2) and methanol as mobile phase; and the ethanol
extract as sample to analize ; 13 fractions that were recognized by thin layer chromatography were
obtained, revealing them through the UV chamber and with ceric ammonium sulphate, observing
the presence of flavonoids in the fractions 7 and 8. Antibacterial activity was developed for the
fractions and the ethanol extract with two bacteria: Escherichia Coli and Staphylococcus Aureus as
gram-positive, finding that the plant has inhibitory properties.
Palabras clave.
Bauhinia variegata, flavonoides, fitoqumica, cromatografa, S. Aureus, E. Coli, actividad
antibacteriana.

1. INTRODUCCIN.

El estudio de partes vegetales, extractos o
sustancias puras, resulta importante hoy en da,
para los estudios acerca de las propiedades
medicinales que poseen las plantas, por lo cual
se llev acabo el anlisis de la Bauhinia.
La Bauhinia variegata pertenece a la familia de
leguminosas-cosalpiniceas con ms de 400
especies, se encuentra distribuida en zonas
tropicales a nivel mundial como Asa, frica,
Amrica central y del sur. Tambin conocida
como casco de vaca, falsa caoba o pie de Buey.
Son rboles pequeos de mximo 10m, notables
por sus hojas, divididas por la mitad en dos
lbulos, con flores grandes y vistosas. (1)
As mismo, los estudios qumicos indican la
presencia de metabolitos esteroles, flavonas,
flavanonas y flavonoides, por otra parte los
estudios biolgicos de -sitosterol como
tratamiento por su accin inhibitoria indican la
absorcin de colesterol, junto con las
caractersticas antipirticas y antiinflamatorias.
(2)
Muchas de estas plantas son utilizadas en la
etnofarmacologa en casos de disentera, diarrea,
inflamaciones, infecciones de la piel y
afecciones del hgado. Igualmente, las
investigaciones se enmarcan ms hacia la
accin antidiabtica. Por ello, a partir de la
Bauhinia variegata, se realizaron diferentes
extractos que permitieran establecer los
componentes de los mismos, separando el
compuesto a ensayar por medio de mtodos
cromatogrficos, para que a partir de las
fracciones obtenidas se lograra demostrar la
capacidad antibacteriana de los constituyentes,
en este caso compuestos flavnicos, en el
intento de relacionar su aplicacin
etnofarmacolgica del vegetal con los resultados
obtenidos.

2. MATERIALES Y MTODOS.

2.1 Material vegetal. Las hojas y tallos de
Bauhinia variegata se recolectaron en el
municipio de Villeta, Cundinamarca, Colombia.
En el laboratorio se escogi el material de
agrado y con este se realizaron las siguientes
pruebas.
2.2 Destilacin por arrastre con vapor. Se
realiz esta prueba con el fin de encontrar aceite
esencial en la planta. Se trituraron hojas y tallos
en un baln con agua destilada; el ensayo realiz
en un aparato de destilacin industrial. El
tiempo del proceso de destilacin fue de 2 horas.
2.3 Extractos. Las muestras se pesaron y
trituraron con el fin de obtener los extractos por
los mtodos de Soxhelt y maceracin, en etanol
y acetato de etilo respectivamente. Para realizar
el extracto etanlico se utilizaron 9,3271g; y
para el extracto de acetato de etilo 30,0561g,
dejndolo reposar 4 das en dicho solvente.
2.4 Pruebas fitoqumica. A partir de los
extractos se realizaron pruebas fitoqumicas con
el fin de identificar los compuestos orgnicos
que contiene la planta. Las pruebas consistan en
la coloracin o precipitacin del compuesto a
identificar, si alguna de estos dos resultados no
se obtena, significaba que el extracto de la
planta no contena este compuesto, o que la
concentracin era muy baja como para poder
reconocerlo.
2.5 Cromatografa en capa fina para
extractos. Para reconocer la mejor fase mvil
correspondiente al solvente que tena mejores
propiedades para separar los compuestos de la
planta, es decir, de cada uno de los extractos, se
utiliz el mtodo de cromatografa en capa fina,
realizando la prueba con tres solventes: Tolueno,
Etanol y ter de Petrleo, mezclndolos a
diferentes concentraciones, las cuales son: ter
de Petrleo, ter de Petrleo-Tolueno (8:2), ter
de Petrleo-Tolueno (1:1), ter de Petrleo-
Tolueno (2:8), Tolueno, Tolueno-Metanol (8:2),
Tolueno-Metanol (1:1) y Metanol. La fase
estacionaria que se utiliz fue slica gel. La
prueba se realiz con los dos extractos, etanlico
y de acetato de etilo, con el fin de escoger el que
contenga las mejores cualidades para que sea
utilizado en las siguientes pruebas. El mtodo
que se us para el revelado de los compuestos
incoloros, es decir, que poseen una longitud de
onda invisible al ojo humano, fue la cmara de
rayos UV a 254nm y 366nm.
2.6 Cromatografa en columna. A partir de la
prueba de cromatografa en capa fina, la fase
mvil que se eligi fue Tolueno- Metanol (8:2)
y el extracto fue el etanlico, ya que este
demostr contener una gran cantidad de
compuestos orgnicos, adems, contiene el
mayor porcentaje de flavonoides, que es el
compuesto orgnico al cual se le quiere aplicar
las pruebas de citotoxicidad y actividad
antibacteriana. La fase estacionaria utilizada fue
slica gel.
2.7 Cromatografa en capa fina para
fracciones. Para reconocer los compuestos
orgnicos contenidos en las fracciones, se
realiz la prueba en cromatografa en capa
delgada, utilizando como fase mvil Tolueno-
Metanol (8:2) y fase estacionaria slica gel. Al
igual que en cromatografa en capa fina, los
compuestos incoloros se revelaron con la
cmara de rayos UV y con sulfato crico
amnico.
2.8 Bacterias. De donde se obtuvieron Las
bacterias que se utilizaron fueron Escherichia
Coli (E. Coli) como gramnegativo y
Staphylococcus Aureus (S. Aureus) como
grampositivo. Ests se encontraban previamente
preparadas en el laboratorio.
2.9 Actividad antibacteriana. Se us el
Meller-Hinton agar previamente preparado, ya
que este ha sido recomendado universalmente
para la prueba de sensibilidad a los
antimicrobianos.
http://www.britanialab.com.ar/esp/productos/b0
2/muellerhintonagar.htm
El ensayo se realiz por el mtodo de
antibiograma por difusin y se efectu sobre dos
de las fracciones diluidas en ter de petrleo, y
el extracto etanlico. Se sembraron 300l de
bacterias sobre el agar previamente preparado
que se encontraba en la caja de Petri, la cual se
encuentra dividida en 4 partes, seguidamente se
remojaron los sensidiscos sobre los extractos y
fracciones respectivamente. Las bacterias se
incubaron a 37C durante 22 horas.

3. RESULTADOS

3.1 Destilacin por arrastre con vapor. Segn
la bibliografa la bauhinia variegata tiene un
aceite esencial compuesto por sesquiterpenos en
semillas y frutos, razn por la cual al realizar la
prueba en el laboratorio, no se encontr
presencia de aceite esencial, ya que la prueba se
realiz solo con hojas y tallos.
http://www.latiendanaturista.com/vademecum/c
ascodevaca.htm
3.2 Fitoqumica. Los resultados de las pruebas
fitoqumicas se presentan en la Tabla No. 1,
demostrando que la planta contiene ms
compuestos polares o medianamente polares ya
que se dieron ms pruebas positivas para el
extracto etanlico. En los extracto se
encontraron compuestos como flavonoides,
azcares reductores, quinonas, cumarinas y
glucsidos cardiacos y sesquiterpenlactonas.

Compuesto orgnicos Prueba Extractos
Acetato de etilo Etanol
Alcaloides
Ensayo 1: Reactivo Dragendorff - -
Ensayo 2: Reactivo Sonneschain - -
Ensayo 3: Reactivo de Mayer - -
Ensayo 4: Reactivo de Wagner - -
Flavonoides
Ensayo 1: Limaduras de Mg, HCl concentrado (37%) - -
Ensayo 2: HCl, Virutas de Mg, alcohol amlico + +
Ensayo 3: cido clorhdrico - -
Cloruro frrico - +
Ensayo 4: Reaccin de hidrxido de sodio al 10%. - +
Glicsidos Cianogenados
Ensayo 1: cido clorhdrico al 10%, cloroformo
- -
Azucares reductores
Ensayo 1: Reaccin de Fehling. - +
Ensayo 2: Reaccin de Benedict - +
Saponinas
Ensayo 1: Reaccin de Lieberman Bouchard + +/-
Ensayo 2: Reaccin de Rosenthaler. +/- +/-
Taninos
Ensayo 1: Reaccin de Cloruro frrico + +/-
Ensayo 2: ferrocianuro de potasio al 1% - +/-
Quinonas
Ensayo 1: Reaccin de hidrxido de amonio. - +
Ensayo 2: Reaccin con cido sulfrico - -
Ensayo 3: Reaccin de Brntraguer - -
Cumarinas
Ensayo 1: Reaccin con hidrxido de amonio. - +
Glucsidos cardiacos
Ensayo 1: Reaccin de Legal +/- +
Sesquiterpenlactonas
Ensayo 1: Reaccin con Hidroximato frrico
+ -
Tabla No. 1. Resultados pruebas fitoqumicas. (Positivo (+), Negativo (-), Dudoso (+/-))

3.3 Cromatografa en capa fina para
extractos. Como se seal en prrafos
anteriores, el fin de esta prueba era determinar la
mejor fase mvil y el mejor extracto para
realizar la prueba de cromatografa en columna,
obteniendo como resultado que la mejor era
Tolueno-Metanol (8:2), ya que permiti que se
observara una mejor separacin de los
compuestos, a lo largo de la placa. El mejor
extracto fue el etanlico.
En la imagen No. 1 se puede observar a la
izquierda la placa con Metanol y a la derecha
con Tolueno-Metanol (8:2), la dos sustancias a
la izquierda de la primera placa son del extracto
etanlico y a la izquierda el del extracto de
acetato de etilo. Las sustancias visibles son las
que se encuentran encerradas en un valo, las
visibles a 254nm son las que tienen un
parntesis a la izquierda y a 366nm las que
tienen un parntesis a la derecha.

Imagen No. 1. Placas cromatogrficas para Metanol
y Tolueno-Metanol (8:2)
3.4 Cromatografa en columna. Se obtuvieron
13 fracciones, recordando que las primeras
contienen los compuestos ms apolares y as
mismo, las ltimas los ms polares. Las
fracciones se encuentran distribuidas como se
observa en la Imagen No. 2.

Imagen No. 2. Fracciones obtenidas en
cromatografa en columna.
3.5 Cromatografa en capa fina para
fracciones. Luego de realizar la cromatografa
en columna, para identificar las fracciones se
us el mtodo de capa delgada. Al revelar dicha
placa, se obtuvo que en las fracciones 7 y 8
(color caf en la Imagen No. 3) se encontraba la
mayor concentracin de flavonoides, por lo que
ests dos se ubicaron en un solo recipiente; no se
realiz otra prueba de revelado por lo que no se
pudo conocer que otros tipos de compuestos se
encontraban en las fracciones. Las fracciones
reveladas se encuentran ordenadas de la
siguiente manera. 1,5, 6, 7,8, 10 y 11. Las
convenciones de las lneas son las mismas que
se utilizaron en capa fina para extractos.

Imagen No. 3. Revelado de la placa cromtagrfica
para las fracciones, con sulfato crico amnico.
3.6 Actividad antibacteriana. Pasadas las 22
horas, se realiz la lectura de los resultados que
se encuentran en la Tabla No. 2, en la cual se
puede observar que el halo de inhibicin de la
fraccin es mayor para S. Aureus y menor para
E. Coli, y as mismo en el extracto ocurre de
manera contraria. En las imgenes No. 4 y 5, el
compuesto 1 es el extracto y el 2 la fraccin.

Sustancia a
ensayar
Halo de
inhibicin
E. Coli
Halo de
inhibicin
S. Aureus
Extracto 0,5cm 0,5cm
Fraccin 0,6cm 0,4cm
Tabla No. 2. Resultados actividad antibacteriana.



Imagen No. 4. Halos de Imagen No. 5. Halos de
inhibicin para la inhibicin para la
bacteria S. Aureus. bacteria E. Coli.

4. DISCUSIN.

La literatura y los estudios acerca de la planta
Bauhinia variegata, afirman que esta sirve como
analgsico, antidiabtico y antiinflamatorio.
Rica en flavonoides, saponinas, glucsidos
cardiacos entre otros compuestos orgnicos,
analizados por procesos fitoqumicos y
cromatogrficos. Por otro lado en la literatura no
se encuentran muchos estudios antibacterianos
acerca de la planta, lo que nos indujo a llevar
acabo el ensayo de actividad antibacteriana.
El extracto produjo un halo de inhibicin ms
grande para la bacteria S. aureus que para la E.
coli, (Imagen No. 4) esto se debe a que la
primera es grampositiva, es decir, que no posee
una membrana externa, lo que permite que los
compuestos puedan atacarla e inhibir su
crecimiento; lo contrario ocurre para la segunda
bacteria la cual es gramnegativa, ya que tiene
una membrana citoplasmtica externa que la
hace ms resistente. El mecanismo que se lleva a
cabo en el proceso de inhibicin depende del
compuesto que se vaya a ensayar, ya que este
acta sobre la bacteria impidiendo que complete
su proceso de crecimiento de diferentes
maneras.
Por otra parte, en el proceso de extraccin de
flavonoides, al momento de revelar la placa se
realiz solo para compuestos flavnicos,
despreciando los otros constituyentes que
podran haberse encontrado en las fracciones
utilizadas para el ensayo, por lo que no se puede
asegurar que la actividad antibacteriana obtenida
para la fraccin se deba nicamente al
compuesto flavnico. As mismo, se esperara
resultados favorables para la prueba realizada,
ya que este compuesto presenta cualidades
antibacterianas mediamente eficaces,
observndose a partir del ensayo realizado que
el halo de inhibicin no fue lo suficientemente
grande. En el mismo, se obtuvo una mejor
inhibicin del crecimiento para la bacteria E.
coli en comparacin con la S. aureus, (Imagen
No. 5), esto puede ocurrir debido a que el
mecanismo de accin del compuesto acta de
mejor manera para bacterias gramnegativas que
para las grampositivas.
En cuanto a la bacteria E. coli, comparando la
capacidad inhibitoria de crecimiento de la
fraccin con el extracto, fue mejor para la
primera, ya que contienen mayor concentracin
de compuestos con capacidades antibacterianas
permitiendo que la accin de los mismos fuese
ms exitosa.

5. CONCLUSIONES

Los resultados de las pruebas fitoqumicas
permiten concluir que el extracto etanlico de
las hojas y tallos de Bauhinia variegata
contienen metabolitos secundarios tales como:
flavonoides, quinonas, taninos, cumarinas,
glucsidos cardacos, sesquiterpenlactonas y
azcares reductores; que permitieron escoger el
compuesto a separar, en este caso flavonoides.
As mismo, se llevaron a cabo los diferentes
tipos de cromatografa, que permitieron aislar el
constituyente mencionado anteriormente; en la
prueba se obtuvieron 13 fracciones las cuales
fueron reveladas, encontrando que en la sptima
y octava la mayor concentracin de compuestos
flavnicos. Continuamente, se llev a cabo el
ensayo antibacteriano mediante el cual se logr
determinar que la planta tiene este tipo de
propiedades, demostrando que no es la mejor
cualidad de la planta, ya que el halo de
inhibicin no es tan grande como se esperara en
una sustancia que si tiene este tipo de atributos.


6. BIBLIOGRAFA
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