variegata. Laura Camila Orozco Ardila 1 , Angie Lizeth Silva Martnez 1 . 1. Estudiante de Ingeniera Qumica, Falcultad de Ingeniera, Universidad de la Sabana, Cha Cundinamarca, Colombia. Resumen. Se realiz el ensayo de arrastre por vapor con hojas y tallos de la planta Bauhinia variegata para reconocer la presencia de aceite esencial, obteniendo un resultado negativo, ya que el aceite se encuentra en semillas y frutos. Se aplicaron pruebas fitoqumicas al extracto etanlico y de acetato de etilo, de hojas y tallos de la planta para reconocer los metabolitos secundarios contenidos en los mismos, obteniendo positivo para flavonoides, azcares reductores, quinonas, cumarinas, glucsidos cardiacos y sesquiterpenlactonas. A partir de estos resultados, se decidi realizar la separacin de compuestos flavnicos por medio de cromatografa en columna, la fase mvil y el extracto se eligi a base de ensayos en cromatografa en capa fina, escogiendo Tolueno-Metanol (8:2) y Metanol como fase mvil; y el extracto etanlico como muestra analizar; se obtuvo 13 fracciones que fueron reconocidas por cromatografa en capa fina, revelndolas por medio de la cmara UV y con sulfato crico amnico, observando presencia de flavonoides en las fracciones 7 y 8. La actividad antibacteriana se desarroll para las fracciones y el extracto etanlico con dos bacterias: Escherichia Coli como gramnegativo y Staphylococcus Aureus como grampositivo, encontrando que la planta tiene propiedades inhibitorias. Abstract. It was performed the drag test by vapor with leaves and stems of the plant Bauhinia variegata to recognize the presence of essential oil, getting a negative result, due to the oil is found in seeds and fruits. Phytochemical tests were applied to the ethanol extract and the ethyl acetate, of leaves and stems of the plant, to recognize secondary metabolities contained therein, obtaining positive for flavonoids, reducing sugars; quinones, coumarins, cardiac glycosides and sesquiterpene lactone . From these results, it was decided to make the separation of flavone compounds by column chromatography, the mobile phase and the extract was chosen, based on tests in thin layer chromatography, choosing Toluene-Methanol (8:2) and methanol as mobile phase; and the ethanol extract as sample to analize ; 13 fractions that were recognized by thin layer chromatography were obtained, revealing them through the UV chamber and with ceric ammonium sulphate, observing the presence of flavonoids in the fractions 7 and 8. Antibacterial activity was developed for the fractions and the ethanol extract with two bacteria: Escherichia Coli and Staphylococcus Aureus as gram-positive, finding that the plant has inhibitory properties. Palabras clave. Bauhinia variegata, flavonoides, fitoqumica, cromatografa, S. Aureus, E. Coli, actividad antibacteriana.
1. INTRODUCCIN.
El estudio de partes vegetales, extractos o sustancias puras, resulta importante hoy en da, para los estudios acerca de las propiedades medicinales que poseen las plantas, por lo cual se llev acabo el anlisis de la Bauhinia. La Bauhinia variegata pertenece a la familia de leguminosas-cosalpiniceas con ms de 400 especies, se encuentra distribuida en zonas tropicales a nivel mundial como Asa, frica, Amrica central y del sur. Tambin conocida como casco de vaca, falsa caoba o pie de Buey. Son rboles pequeos de mximo 10m, notables por sus hojas, divididas por la mitad en dos lbulos, con flores grandes y vistosas. (1) As mismo, los estudios qumicos indican la presencia de metabolitos esteroles, flavonas, flavanonas y flavonoides, por otra parte los estudios biolgicos de -sitosterol como tratamiento por su accin inhibitoria indican la absorcin de colesterol, junto con las caractersticas antipirticas y antiinflamatorias. (2) Muchas de estas plantas son utilizadas en la etnofarmacologa en casos de disentera, diarrea, inflamaciones, infecciones de la piel y afecciones del hgado. Igualmente, las investigaciones se enmarcan ms hacia la accin antidiabtica. Por ello, a partir de la Bauhinia variegata, se realizaron diferentes extractos que permitieran establecer los componentes de los mismos, separando el compuesto a ensayar por medio de mtodos cromatogrficos, para que a partir de las fracciones obtenidas se lograra demostrar la capacidad antibacteriana de los constituyentes, en este caso compuestos flavnicos, en el intento de relacionar su aplicacin etnofarmacolgica del vegetal con los resultados obtenidos.
2. MATERIALES Y MTODOS.
2.1 Material vegetal. Las hojas y tallos de Bauhinia variegata se recolectaron en el municipio de Villeta, Cundinamarca, Colombia. En el laboratorio se escogi el material de agrado y con este se realizaron las siguientes pruebas. 2.2 Destilacin por arrastre con vapor. Se realiz esta prueba con el fin de encontrar aceite esencial en la planta. Se trituraron hojas y tallos en un baln con agua destilada; el ensayo realiz en un aparato de destilacin industrial. El tiempo del proceso de destilacin fue de 2 horas. 2.3 Extractos. Las muestras se pesaron y trituraron con el fin de obtener los extractos por los mtodos de Soxhelt y maceracin, en etanol y acetato de etilo respectivamente. Para realizar el extracto etanlico se utilizaron 9,3271g; y para el extracto de acetato de etilo 30,0561g, dejndolo reposar 4 das en dicho solvente. 2.4 Pruebas fitoqumica. A partir de los extractos se realizaron pruebas fitoqumicas con el fin de identificar los compuestos orgnicos que contiene la planta. Las pruebas consistan en la coloracin o precipitacin del compuesto a identificar, si alguna de estos dos resultados no se obtena, significaba que el extracto de la planta no contena este compuesto, o que la concentracin era muy baja como para poder reconocerlo. 2.5 Cromatografa en capa fina para extractos. Para reconocer la mejor fase mvil correspondiente al solvente que tena mejores propiedades para separar los compuestos de la planta, es decir, de cada uno de los extractos, se utiliz el mtodo de cromatografa en capa fina, realizando la prueba con tres solventes: Tolueno, Etanol y ter de Petrleo, mezclndolos a diferentes concentraciones, las cuales son: ter de Petrleo, ter de Petrleo-Tolueno (8:2), ter de Petrleo-Tolueno (1:1), ter de Petrleo- Tolueno (2:8), Tolueno, Tolueno-Metanol (8:2), Tolueno-Metanol (1:1) y Metanol. La fase estacionaria que se utiliz fue slica gel. La prueba se realiz con los dos extractos, etanlico y de acetato de etilo, con el fin de escoger el que contenga las mejores cualidades para que sea utilizado en las siguientes pruebas. El mtodo que se us para el revelado de los compuestos incoloros, es decir, que poseen una longitud de onda invisible al ojo humano, fue la cmara de rayos UV a 254nm y 366nm. 2.6 Cromatografa en columna. A partir de la prueba de cromatografa en capa fina, la fase mvil que se eligi fue Tolueno- Metanol (8:2) y el extracto fue el etanlico, ya que este demostr contener una gran cantidad de compuestos orgnicos, adems, contiene el mayor porcentaje de flavonoides, que es el compuesto orgnico al cual se le quiere aplicar las pruebas de citotoxicidad y actividad antibacteriana. La fase estacionaria utilizada fue slica gel. 2.7 Cromatografa en capa fina para fracciones. Para reconocer los compuestos orgnicos contenidos en las fracciones, se realiz la prueba en cromatografa en capa delgada, utilizando como fase mvil Tolueno- Metanol (8:2) y fase estacionaria slica gel. Al igual que en cromatografa en capa fina, los compuestos incoloros se revelaron con la cmara de rayos UV y con sulfato crico amnico. 2.8 Bacterias. De donde se obtuvieron Las bacterias que se utilizaron fueron Escherichia Coli (E. Coli) como gramnegativo y Staphylococcus Aureus (S. Aureus) como grampositivo. Ests se encontraban previamente preparadas en el laboratorio. 2.9 Actividad antibacteriana. Se us el Meller-Hinton agar previamente preparado, ya que este ha sido recomendado universalmente para la prueba de sensibilidad a los antimicrobianos. http://www.britanialab.com.ar/esp/productos/b0 2/muellerhintonagar.htm El ensayo se realiz por el mtodo de antibiograma por difusin y se efectu sobre dos de las fracciones diluidas en ter de petrleo, y el extracto etanlico. Se sembraron 300l de bacterias sobre el agar previamente preparado que se encontraba en la caja de Petri, la cual se encuentra dividida en 4 partes, seguidamente se remojaron los sensidiscos sobre los extractos y fracciones respectivamente. Las bacterias se incubaron a 37C durante 22 horas.
3. RESULTADOS
3.1 Destilacin por arrastre con vapor. Segn la bibliografa la bauhinia variegata tiene un aceite esencial compuesto por sesquiterpenos en semillas y frutos, razn por la cual al realizar la prueba en el laboratorio, no se encontr presencia de aceite esencial, ya que la prueba se realiz solo con hojas y tallos. http://www.latiendanaturista.com/vademecum/c ascodevaca.htm 3.2 Fitoqumica. Los resultados de las pruebas fitoqumicas se presentan en la Tabla No. 1, demostrando que la planta contiene ms compuestos polares o medianamente polares ya que se dieron ms pruebas positivas para el extracto etanlico. En los extracto se encontraron compuestos como flavonoides, azcares reductores, quinonas, cumarinas y glucsidos cardiacos y sesquiterpenlactonas.
Compuesto orgnicos Prueba Extractos Acetato de etilo Etanol Alcaloides Ensayo 1: Reactivo Dragendorff - - Ensayo 2: Reactivo Sonneschain - - Ensayo 3: Reactivo de Mayer - - Ensayo 4: Reactivo de Wagner - - Flavonoides Ensayo 1: Limaduras de Mg, HCl concentrado (37%) - - Ensayo 2: HCl, Virutas de Mg, alcohol amlico + + Ensayo 3: cido clorhdrico - - Cloruro frrico - + Ensayo 4: Reaccin de hidrxido de sodio al 10%. - + Glicsidos Cianogenados Ensayo 1: cido clorhdrico al 10%, cloroformo - - Azucares reductores Ensayo 1: Reaccin de Fehling. - + Ensayo 2: Reaccin de Benedict - + Saponinas Ensayo 1: Reaccin de Lieberman Bouchard + +/- Ensayo 2: Reaccin de Rosenthaler. +/- +/- Taninos Ensayo 1: Reaccin de Cloruro frrico + +/- Ensayo 2: ferrocianuro de potasio al 1% - +/- Quinonas Ensayo 1: Reaccin de hidrxido de amonio. - + Ensayo 2: Reaccin con cido sulfrico - - Ensayo 3: Reaccin de Brntraguer - - Cumarinas Ensayo 1: Reaccin con hidrxido de amonio. - + Glucsidos cardiacos Ensayo 1: Reaccin de Legal +/- + Sesquiterpenlactonas Ensayo 1: Reaccin con Hidroximato frrico + - Tabla No. 1. Resultados pruebas fitoqumicas. (Positivo (+), Negativo (-), Dudoso (+/-))
3.3 Cromatografa en capa fina para extractos. Como se seal en prrafos anteriores, el fin de esta prueba era determinar la mejor fase mvil y el mejor extracto para realizar la prueba de cromatografa en columna, obteniendo como resultado que la mejor era Tolueno-Metanol (8:2), ya que permiti que se observara una mejor separacin de los compuestos, a lo largo de la placa. El mejor extracto fue el etanlico. En la imagen No. 1 se puede observar a la izquierda la placa con Metanol y a la derecha con Tolueno-Metanol (8:2), la dos sustancias a la izquierda de la primera placa son del extracto etanlico y a la izquierda el del extracto de acetato de etilo. Las sustancias visibles son las que se encuentran encerradas en un valo, las visibles a 254nm son las que tienen un parntesis a la izquierda y a 366nm las que tienen un parntesis a la derecha.
Imagen No. 1. Placas cromatogrficas para Metanol y Tolueno-Metanol (8:2) 3.4 Cromatografa en columna. Se obtuvieron 13 fracciones, recordando que las primeras contienen los compuestos ms apolares y as mismo, las ltimas los ms polares. Las fracciones se encuentran distribuidas como se observa en la Imagen No. 2.
Imagen No. 2. Fracciones obtenidas en cromatografa en columna. 3.5 Cromatografa en capa fina para fracciones. Luego de realizar la cromatografa en columna, para identificar las fracciones se us el mtodo de capa delgada. Al revelar dicha placa, se obtuvo que en las fracciones 7 y 8 (color caf en la Imagen No. 3) se encontraba la mayor concentracin de flavonoides, por lo que ests dos se ubicaron en un solo recipiente; no se realiz otra prueba de revelado por lo que no se pudo conocer que otros tipos de compuestos se encontraban en las fracciones. Las fracciones reveladas se encuentran ordenadas de la siguiente manera. 1,5, 6, 7,8, 10 y 11. Las convenciones de las lneas son las mismas que se utilizaron en capa fina para extractos.
Imagen No. 3. Revelado de la placa cromtagrfica para las fracciones, con sulfato crico amnico. 3.6 Actividad antibacteriana. Pasadas las 22 horas, se realiz la lectura de los resultados que se encuentran en la Tabla No. 2, en la cual se puede observar que el halo de inhibicin de la fraccin es mayor para S. Aureus y menor para E. Coli, y as mismo en el extracto ocurre de manera contraria. En las imgenes No. 4 y 5, el compuesto 1 es el extracto y el 2 la fraccin.
Sustancia a ensayar Halo de inhibicin E. Coli Halo de inhibicin S. Aureus Extracto 0,5cm 0,5cm Fraccin 0,6cm 0,4cm Tabla No. 2. Resultados actividad antibacteriana.
Imagen No. 4. Halos de Imagen No. 5. Halos de inhibicin para la inhibicin para la bacteria S. Aureus. bacteria E. Coli.
4. DISCUSIN.
La literatura y los estudios acerca de la planta Bauhinia variegata, afirman que esta sirve como analgsico, antidiabtico y antiinflamatorio. Rica en flavonoides, saponinas, glucsidos cardiacos entre otros compuestos orgnicos, analizados por procesos fitoqumicos y cromatogrficos. Por otro lado en la literatura no se encuentran muchos estudios antibacterianos acerca de la planta, lo que nos indujo a llevar acabo el ensayo de actividad antibacteriana. El extracto produjo un halo de inhibicin ms grande para la bacteria S. aureus que para la E. coli, (Imagen No. 4) esto se debe a que la primera es grampositiva, es decir, que no posee una membrana externa, lo que permite que los compuestos puedan atacarla e inhibir su crecimiento; lo contrario ocurre para la segunda bacteria la cual es gramnegativa, ya que tiene una membrana citoplasmtica externa que la hace ms resistente. El mecanismo que se lleva a cabo en el proceso de inhibicin depende del compuesto que se vaya a ensayar, ya que este acta sobre la bacteria impidiendo que complete su proceso de crecimiento de diferentes maneras. Por otra parte, en el proceso de extraccin de flavonoides, al momento de revelar la placa se realiz solo para compuestos flavnicos, despreciando los otros constituyentes que podran haberse encontrado en las fracciones utilizadas para el ensayo, por lo que no se puede asegurar que la actividad antibacteriana obtenida para la fraccin se deba nicamente al compuesto flavnico. As mismo, se esperara resultados favorables para la prueba realizada, ya que este compuesto presenta cualidades antibacterianas mediamente eficaces, observndose a partir del ensayo realizado que el halo de inhibicin no fue lo suficientemente grande. En el mismo, se obtuvo una mejor inhibicin del crecimiento para la bacteria E. coli en comparacin con la S. aureus, (Imagen No. 5), esto puede ocurrir debido a que el mecanismo de accin del compuesto acta de mejor manera para bacterias gramnegativas que para las grampositivas. En cuanto a la bacteria E. coli, comparando la capacidad inhibitoria de crecimiento de la fraccin con el extracto, fue mejor para la primera, ya que contienen mayor concentracin de compuestos con capacidades antibacterianas permitiendo que la accin de los mismos fuese ms exitosa.
5. CONCLUSIONES
Los resultados de las pruebas fitoqumicas permiten concluir que el extracto etanlico de las hojas y tallos de Bauhinia variegata contienen metabolitos secundarios tales como: flavonoides, quinonas, taninos, cumarinas, glucsidos cardacos, sesquiterpenlactonas y azcares reductores; que permitieron escoger el compuesto a separar, en este caso flavonoides. As mismo, se llevaron a cabo los diferentes tipos de cromatografa, que permitieron aislar el constituyente mencionado anteriormente; en la prueba se obtuvieron 13 fracciones las cuales fueron reveladas, encontrando que en la sptima y octava la mayor concentracin de compuestos flavnicos. Continuamente, se llev a cabo el ensayo antibacteriano mediante el cual se logr determinar que la planta tiene este tipo de propiedades, demostrando que no es la mejor cualidad de la planta, ya que el halo de inhibicin no es tan grande como se esperara en una sustancia que si tiene este tipo de atributos.
6. BIBLIOGRAFA 6. BIBLIOGRAFA 1. Frans Geilfus, Pascual Bailn. La pata de vaca. El rbol al servicio del agricultor. Turialba : Enda caribe, 1994, pg. 511. 2. Orlando Muoz,Marco Montes,Tatiana Wilkomirsky. Bauhinia. [aut. libro] Marco Montes,Tatiana Wilkomirsky Orlando Muoz. plantas medicinales de uso en chile. Santiago de Chile : Universitaria, 1999, pgs. 58-59. 3. Actividad antibacteriana y citotoxicidad in vivo de extractos etanlicos de Bauhinia variegata L. . MSc. Maby M. Martnez, MSc. Diana M. Ocampo, BSc. Jhon H. Galvis, Andrea Valencia. 2011, Cubana. 4. Frans Geilfus,Pascual Bailn. La pata de vaca. Turrialba : Enda-caribe, 1994. 5. Orlando Muoz,Marco Montes,Tatiana Wilkomirsky. Bauhinia. Santiago de chile : Universitaria, 119. 6. Elbert Luther Little,Frank Howard Wadsworth,Jos Marrero. Bauhinia. San juan : universidad de puerto rico, 2001. 7. Federico Collado Otero,Collado Otero F. Estafilococus. Madrid : Norma. 8. Estafilococus. Chans, Gerardo R. 9. Arroyo, Gladys Arias. Determinacin quimico bromatologica y actividad antimicrobiana. Ciencia e investigacin vol III. 2000, pg. 59. 10. Pierce, Benjamin A. Organismo gentico modelo. Gentica. Madrid : Panamericana, 2009, pg. 216.
Principios teóricos cumarinas (38)Este título resume de manera concisa el contenido del documento sobre los principios teóricos de las cumarinas y tiene menos de como se solicitó