SNTESIS, SEMIPURIFICACIN E IDENTIFICACIN DE

FRUCTOSA 1,6 BIS FOSFATO

INTRODUCCIN

Se conoce por gliclisis a la degradacin anaerbica de la glucosa que produce cido lctico, siendo una de las
diversas rutas catablicas conocidas como fermentaciones anaerbicas, que son los mecanismos biolgicos ms
primitivos destinados a la obtencin de energa. Sin embargo, la mayor parte de los organismos superiores han
conservado la capacidad de efectuar la degradacin anaerbica de la glucosa que se ha convertido as en una
etapa de preparacin del catabolismo aerbico de este azcar.

El objetivo de esta practica, es proceder al aislamiento, semipurificacin e identificacin de uno de los
metabolitos intermediarios de la va glucoltica, la fructosa 1,6 bisfosfato, mediante el bloqueo de la aldolasa,
enzima responsable de la escisin de este metabolito.
En la practica se utiliza la sacarosa como fuente de carbono y la levadura nos proporcionar las enzimas y
cofactores necesarios para que la sntesis tenga lugar, para lo cual sern previamente lisadas las clulas con ter
etlico, adems se utilizar una fuente de fosfatos y el bicarbonato ayudara al mantenimiento del pH del medio.
El ion magnesio, es necesario en la accin de la hexoquinasa y fosfofructoquinasa.

La aldolasa de levadura (aldolasa clase II) contiene un ion metlico divalente especfico, generalmente Zn
2+
, por
lo que la adicin de un agente quelante (EDTA), que elimina los cationes divalentes, provocar el bloqueo de la
enzima y como consecuencia, se acumulara la fructosa 1,6 bisfosfato en la solucin, facilitndose su aislamiento.
Como dicho producto es soluble, se precipitara con la formacin de sus sales clcicas (que son insolubles al
aumentar la temperatura).

Luego de determinada la cantidad en peso de fructosa, sal clcica obtenida, se proceder a precipitar el Ca2+
con cido sulfrico diluido, se tomara una alcuota para determinar carbohidratos totales y otra ser neutralizada
con NH4OH, para formar la sal amnica (de mayor movilidad relativa) para la identificacin cromatrogrfica.
El papel cromatogrfico debe lavarse previamente con cido oxlico para eliminar los iones Ca2+ y Mg2+, los
cuales producen interferencias con los steres de fosfato. El tratamiento con cido oxlico reduce la absorcin
irreversible de los azucares fosforilados.

EQUIPOS, MATERIALES Y REACTIVOS:

Reactivos
Levadura de panadera
Sacarosa
Na2HPO4
NaHCO3
Solucion de EDTA 0,1 M. Disuelva 41.62 g de EDTA disdico en 800 ml de agua destilada y luego enrase a 1
L.
Solucin de MgCl2 1 M.
NH4OH al 25 %
Solucin patrn de fructosa 1,6 bis (P). Disuelva 1 mg en 1 ml de H
2
SO
4
0,5 M.
Solucin de cido actico 2 M.
Glucosa al 0,01%
Etanol al 95%
H2SO4 0,5 mol / L
cido oxlico al 1%
ter etlico
Antrona en Acido sulfrico concentrado al 0,2%
CaCl2 (cloruro de calcio) 55%
cido clorhdrico 6 M.
cido perclrico al 60%.
Papel cromatogrfico lavado con cido oxlico
Papel indicador de fenoftalena
Solvente cromatogrfico: metanol-cido frmico-H2O (80:15:5)
Solucin reveladora de perclrico-molibdato. Disuelva 4 g de molibdato de amonio en 100 ml de agua destilada.
Mezcle 25 ml de sta solucin con 10 ml de cido clorhdrico 6 M. y 5 ml de cido perclrico al 60% y 60 ml de
agua destilada.

Materiales
Espectrofotmetro
Bomba de vaci
Embudos Buchner
Cubetas cromatogrficas
Erlenmeyer de 500 mL
Balanzas analtica y tcnica
Lmpara de luz ultravioleta
Probeta
Micropipetas
Pipetas
Tubos de ensayo
Vaso de precipitado


PROCEDIMIENTO:

A. Sntesis
1. Coloque 60 mL de H
2
O destilada en un erlenmeyer (500 mL)
2. Disuelva 20 g de sacarosa; 4,2 g de Na
2
HPO
4
; 1,1 g de NaHCO
3
; EDTA y MgCl
2
para una concentracin
final de 0,01mol / L, respectivamente.
3. Complete hasta 100 mL con H
2
O destilada.
4. Aada 2.5 de levadura y agite.
5. Aada 15 mL de ter etlico u otro agente plasmoltico, mezcle e incube a 37 C por 48 h o a temperatura
ambiente durante 5 das.

B. Obtencin y semipurificacin
1. Al terminar la sntesis, caliente el recipiente en bao de mara durante 5 min, teniendo cuidado de que no
ocurra la caramelizacin del azcar.
2. Enfri y centrifugue durante 15 min. a 5 000 r / min., guarde el sobrenadante.
3. Neutralice el sobrenadante con una solucin de NaOH 4 mol / L hasta pH 8. Utilice papel indicador o
reaccin neutra con la fenoftaleina.
4. Aada 15 mL de CaCl
2
al 55% y caliente en un bao de maria hasta que se forme un abundante precipitado.
5. Filtre al vaco y lave el precipitado varias veces con agua caliente. (En este paso la filtracin al vaco puede
ser sustituida por una centrifugacin durante 15 min. a 5 000 r / min.)
6. Para purificar el producto, disulvalo en 25 mL de cido actico 2M.
7. Aada 15 mL de H
2
O y filtre al vaci para eliminar impurezas.
8. Neutralice de nuevo el filtrado hasta pH 8 y caliente de nuevo para precipitar la sal clcica de la fructosa 1,6
bisfosfato.
9. Filtre nuevamente al vaco y lave el precipitado con agua caliente, luego etanol y finalmente ter etlico.
10. Determine el peso hmedo del producto obtenido (pese previamente el papel por donde va a filtrar).




C. Cuantificacin e identificacin de la fructuosa 1,6 bis (P).
1. Disuelva 400 mg del producto obtenido en 5 mL de H
2
SO
4
0,5 mol / L y agite durante 5 min.
2. Filtre y tome 1 mL del filtrado y neutralice con NH
4
OH, filtre nuevamente.
3. Mediante un capilar aplique la sal amnica de la fructosa obtenida y la muestra del patrn, en un papel
cromatogrfico tratado con cido oxlico.
4. Desarrolle el cromatograma hasta una altura de 10 cm. Saque el papel, marque el frente del solvente.
5. Revele el cromatograma con el reactivo perclrico molibdato.
6. Caliente a 100 C por 5 min. Observe bajo una lmpara ultravioleta. Mientras corre el cromatograma tome
dos alcuotas de 0,1 y 0,5 mL de la fructosa obtenida disueltas en H
2
SO
4
y determine con ella el contenido de
fructosa aadindole agua destilada hasta 1 mL y 4 mL del reactivo de antrona.
7. Prepare un blanco con 1 mL de agua y 4 del reactivo de antrona.
8. Caliente los tubos en un bao de agua hirviente por 10 min, para que desarrolle el color.
9. Deje enfriar los tubos y lea la Absorbancia de luz a 620 nm.
10. Prepare una curva de calibracin con las alcuotas siguientes de una solucin de fructosa 1,6 bisfostato 0,01
%: Tome en varios tubos de ensayo 0,1; 0,2; 0,3; 0,5; 0,7 y 1 mL de la solucin anterior. Complete a 1 mL
con agua destilada y aada 4 mL del reactivo de antrona al 0,2%, proceda de la misma forma que con las
muestras.

PRESENTACIN DE LOS RESULTADOS:

1. Haga un resumen de los principales pasos de obtencin.
2. Calcule el Rf de la muestra y el patrn, comprndolos.
3. Trace la curva de reaccin para el reactivo de antrona
4. Determine los g de fructosa 1,6 bisfosfato obtenidos en la prctica.
5. Calcule el porcentaje de fructosa obtenido, teniendo en cuenta de que se parte de 20 g de sacarosa en 100 mL
de solucin.