Manual de Virología

1
MANUAL DE LABORATORIO DE VIROLOGIA

AUTORES:
M. en C. JUAN CARLOS BENTEZ SERRANO.
M. en C. GLORIA LEN TELLO.
D. en C. ANA MARTA DE LOS NGELES LOBO SNCHEZ.
M. en C. LAURA MARTNEZ PREZ.
M. en C. NIDIA GARY PAZOS SALAZAR.
M.S.P. CLAUDY LORENA VILLAGRN PADILLA.
2013
BENMERITA UNIVERSIDAD AUTNOMA DE PUEBLA
FACULTAD DE CIENCIAS QUIMICAS
DEPARTAMENTO DE MICROBIOLOGA
LICENCIATURA: QUIMICO FARMACOBILOGO

2
NDICE

NMERO DE LA
PRCTICA
TTULO DE LA PRCTICA PGINA

Prctica 1

Seminario: Pruebas de hemaglutinacin (HA) e
inhibicin de la hemglutinacin (IHA).
Fundamentos y aplicaciones.
4
Prctica 2

Pruebas de hemaglutinacin (HA) para el
diagnstico preliminar del virus de la enfermedad
de Newcastle.
9
Prctica 3

Prueba de inhibicin de la hemaglutinacin (IHA)
para el diagnstico definitivo del virus de la
enfermedad del Newcastle.
12
Prctica 4

Seminario: Modelos biolgicos para el cultivo e
identificacin de virus. Huevo frtil de pollo,
animales de laboratorio y cultivos celulares.
15
Prctica 5 Ensayos de las vas de inoculacin en huevo frtil
de pollo.
21

Prctica 6 Replicacin del virus de la enfermedad de
Newcastle en huevo frtil de pollo.
25
Prctica 7

Titulacin (DI
50
) del virus de la enfermedad de
Newcastle en huevo frtil de pollo.
28
Prctica 8

Preparacin de un medio mnimo para el cultivo y
propagacin de clulas.
31
Prctica 9

Taller demostrativo de proliferacin de cultivos
celulares mediante subcultivo o pase 1:2.
35
Prctica 10 Seminario: Pruebas para el diagnstico clnico de
virus (ELISA, Inmunofluorescencia y Western
blot). Fundamentos, aplicaciones y limitaciones.

38
3
Prctica 12 Replicacin de bacterifagos lticos en 50
Escherichia coli.
Prctica 13 Seminario de pruebas moleculares para el anlisis. 54
PCR y sus variantes; retrotranscripcin, mltiple,
anidada, tiempo real, RFLP, Souther blot,
Northern blot.
Prctica 14 Taller demostrativo para el diagnstico molecular 60
de virus: PCR, electroforesis, restriccin enzimtica.
Bibliografa 72

Prctica 11

Ensayos inmunoenzimticos para el diagnstico de
virus de la inmunodeficiencia humana (VIH)
antgeno de superficie del virus de la hepatitis B
(Ag HBs).

45

4

Practica No. 1
Seminario: pruebas de hemaglutinacin (HA) e inhibicin de la
hemaglutinacin (IHA) fundamentos y aplicaciones

Introduccin
Desde el descubrimiento de los virus se estableci que, de acuerdo con sus propiedades
moleculares, estos agentes infecciosos requieren del empleo de sistemas biolgicos para su
reproduccin; esta condicin hace particularmente difcil emplear sistemas adecuados tales como
los animales de laboratorio o cultivos celulares. De esta manera se tuvieron que buscar
alternativas para el estudio de virus en el laboratorio que eliminasen la necesidad de emplear
clulas vivas.
Prueba de Hemaglutinacin (HA)
Inicialmente, la HA se aplic para el anlisis del virus Influenza, sin embargo, se puede
aplicar para otros viriones que posean protenas estructurales con capacidad hemaglutinante. El
nombre de hemaglutinacin se debe al hallazgo de que los virus Influenza podan aglutinar
eritrocitos; posteriormente se determin que el origen de esta propiedad se deba a la existencia
de una glicoprotena presente en la envoltura viral a la cual se le denomin hemaglutinina. Esta
protena acta como el ligando viral que reconoce a su receptor en clulas blanco. En trminos
generales, este receptor corresponde a molculas de cido silico presentes sobre la superficie de
diversos tipos celulares, organizadas en diferentes enlaces qumicos con otros carbohidratos.
La funcin de la hemaglutinina viral no es simplemente aglutinar eritrocitos, sino mediar
la adsorcin en la replicacin viral, pero sus propiedades son empleadas para desarrollar pruebas
de seleccin tal como la hemaglutinacin. Esta prueba de presenta algunas ventajas, pero
tambin limitaciones que se enlistan a continuacin:

BENEMRITA UNIVERSIDAD AUTNOMA DE PUEBLA
FACULTAD DE CIENCIAS QUMICAS
LICENCIATURA: QUMICO FARMACOBILOGO
5

Fig. 1 Ilustracin del virus Influenza

Ventajas:
Desarrollo sencillo.
No requiere de una infraestructura elaborada.
Econmica.
Ideal cuando se emplean muestras con alta concentracin de viriones.
Aplicacin en ensayos que orientan sobre la naturaleza qumica de receptores celulares.
Limitaciones:
Empleada slo como diagnstico presuntivo.
Especificidad limitada por agentes no virales que pueden hemaglutinar
Poca sensibilidad.
Riesgo de obtencin de resultados falsos negativos.

El fundamento de esta prueba consiste en poner de manifiesto la presencia de viriones con
protenas hemaglutinantes que reconocen receptores celulares. De esta manera, los virus se
unirn a los eritrocitos de diferentes especies siempre que posean en su superficie molculas de
cido silico (fig.2).

6

Fig. 2. Representacin de la reaccin de HA

Esta prueba requiere contar con muestras que contengan un nmero elevado de viriones,
tales como suspensiones virales provenientes de lotes vacunales, cosechas virales obtenidas de
clulas en cultivo, o bien, muestras clnicas tomadas durante la fase aguda de la enfermedad.
Para procesar las muestras se preparan diluciones seriadas al doble, desde una dilucin
1:10 hasta 1:1280 empleando como diluyente solucin reguladora de fosfatos. Posteriormente a
cada dilucin se le adiciona la misma cantidad de una suspensin de eritrocitos preparada al 1%,
incluyendo un control de reaccin que solo contendr solucin reguladora de fosfatos y
eritrocitos.
El soporte para llevar a cabo este ensayo son microplacas de 96 pozos con fondo en U, de
tal manera que los eritrocitos aglutinados forman una red o malla en el fondo del pozo,
mientras que los no aglutinados sedimentan por gravedad formando un botn homogneo (fig.
3).

Fig. 3. Sedimentos en la prueba de HA

7

Una prueba de HA positiva sugiere la presencia de un virus con capacidad hemaglutinante
en la muestra, sin embargo la identificacin final del virus debe establecerse con un ensayo
complementario.
Prueba de Inhibicin de la Hemaglutinacin (IHA)
Para realizar un diagnstico viral definitivo debe llevarse a cabo una prueba que
demuestre un tipo de respuesta especfica del husped hacia un virus en particular, tal como la
produccin de anticuerpos que se pone de manifiesto en pruebas del tipo de la Inhibicin de la
Hemaglutinacin (IHA).
Este ensayo se basa inicialmente en la unin de anticuerpos especficos con la
hemaglutinina viral, tal que se impida en una reaccin posterior, la formacin de puentes entre los
ligandos virales y los receptores presentes sobre la superficie de los eritrocitos que daran lugar a
una reaccin de hemaglutinacin.
La prueba de IHA, puede representarse esquemticamente de la siguiente manera:

Primera etapa: Reconocimiento Ag viral Ac

Viriones con
protenas
hemaglutinantes
Anticuerpos anti-HA Neutralizacin
de protenas
hemaglutinantes
8
No se lleva a cabo
la interaccin
virus-eritrocito
Segunda etapa: Reaccin de complejos Ag-Ac con eritrocitos

La presencia de anticuerpos que puedan reconocer aislamientos virales, permite realizar
un diagnstico especfico, tomando como base un principio fundamental en inmunologa el cual
establece que la presencia de anticuerpos en un hospedero, es la consecuencia de una exposicin
previa al antgeno que origin su produccin.
En esta prueba se realizan diluciones seriadas al doble de un suero que contenga
anticuerpos contra un virus hemaglutinante, iniciando con una dilucin 1:2 y hasta alcanzar
1:256. A cada dilucin del suero se le agregan 4 unidades hemaglutinantes (concentracin que se
conoce a travs de un ensayo preliminar de hemaglutinacin) de un virus determinado, incubando
durante 10 minutos para permitir el reconocimiento Ag-Ac. Finalmente se adiciona una
suspensin de eritrocitos al 1%. Al igual que en la prueba de hemaglutinacin, se incluye un
control de reaccin que solo contendr solucin reguladora de fosfatos y eritrocitos. Si el ensayo
se realiza en microplacas de 96 pozos con fondo en U, los resultados esperados sern los
siguientes:

Fig.4. Sedimentos correspondientes a las pruebas de IHA+ e IHA

9

Practica No. 2
Pruebas de hemaglutinacin (HA) para el diagnstico preliminar del virus de
la enfermedad de Newcastle
Introduccin
Muchos virones animales posen en su envoltura protenas codificadas por el genoma viral
capaces de unirse con eritrocitos. Tales virus pueden por tanto formar puentes entre los glbulos
para constituir una red. Este fenmeno conocido como Hemaglutinacin fue primeramente
descrito para el anlisis del virus Influenza. En este caso la protena hemaglutinante
(Hemaglutinina) en la superficie del virin es una glicoprotena que en adicin de la
Neuraminidasa se proyecta en la envoltura viral. El virin se unir a cualquier eritrocito de la
especie que sea siempre que lleve los receptores complementarios que en este caso son molculas
de Acido N-Acetil-Neuramnico.
El virus de la enfermedad del Newcastle es un miembro de la familia Paramyxoviridae; es
un patgeno primario de aves en quienes produce infecciones respiratorias y digestivas con
trastornos ocasionales en el S.N.C. que conducen a parlisis y muerte; en el humano puede
ocasionalmente producir conjuntivitis autolimitada.
Se requieren aproximadamente 10
7
viriones de Newcastle para causar aglutinacin, por lo
que la Hemaglutinacin no es un indicador sensible de la presencia de pequeas cantidades de
viriones pero por su simplicidad constituye un ensayo conveniente si se dispone de grandes
cantidades de viriones.
Objetivos
1. El alumno dominar el manejo de la tcnica de la reaccin de Hemaglutinacin (HA).
2. El estudiante determinar la concentracin de viriones presentes en una suspensin, la
cual expresar en Unidades Hemaglutinantes (UHA).

10
Material
Solucin reguladora de fosfatos (SRF) de Dulbecco con pH = 7.2
Microplacas de poliestrireno con fondo en U.
Micropipetas de volmen variable de 20- 200 L.
Puntillas para micropipeta.
Vacuna viral (viriones atenuados, cepa La Sota)
Suspensin de glbulos rojos de pollo al 1% en solucin reguladora de fosfatos con pH =
7.2.
Pipetas de vidrio de 1 y 5 mL.
Solucin de Hipoclorito de Sodio 1:10 en agua destilada.
Algodn alcohol al 70%.
Recipiente para recolectar desechos.
Metodologa
1. Empleando solucin reguladora de fosfatos con pH = 7.2, realizar una serie de diluciones
seriadas al doble de la vacuna viral, desde 1:10 hasta 1:1280 (Esquema No. 1); es muy
importante incluir un pozo control que no contendr virus.
a. En un frasco con tapn de rosca preparar una dilucin 1:10 de la vacuna viral. Agregar al
pozo A1 de la microplaca 200 L de la dilucin anterior.
b. Agregar 100 L de solucin reguladora de fosfatos con pH = 7.2 de los pozos A2 hasta el
A9.
c. Transferir 100 L de la dilucin 1:10 al pozo A2, homogenizar por pipeteo suave.
d. Nuevamente transferir 100 l de sta dilucin (1:20) al pozo A3 mezclando en forma
homogenea como en el paso c; de esta manera se obtendr ahora una dilucin 1:40.
e. Repetir este procedimiento hasta el pozo A8 que corresponder a una dilucin 1:1280.
f. Desechar 100 L de la suspensin viral del pozo A8, tranfirindolos al pozo A12 y
teniendo cuidado en no agregar dilucin viral al pozo A9 que sirve como control de la
reaccin.

11
Esquema No. 1

2. Agregar a todos los pozos 100 L de una suspensin al 1% de glbulos rojos de pollo.
3. Rotar la microplaca sobre la mesa de trabajo e incubar a temperatura ambiente hasta que
los eritrocitos del pozo A9 hayan sedimentado.
4. Identificar la ltima dilucin en que se presente una reaccin positiva de hemaglutinacin,
la cual corresponder a 1 unidad hemaglutinante (1 UHA), es decir, la concentracin
mnima de viriones que es capaz de aglutinar una suspensin de referencia de eritrocitos
de pollo al 1% en solucin reguladora de fosfatos con pH = 7.2.
5. Reconocer la dilucin del virus vacunal que contenga 4 UHA.
Cuestionario
1. Mencione tres ejemplos de virus que puedan ser analizados mediante la prueba de HA.
2. Anote dos razones por las que se puedan obtener resultados falsos negativos en la prueba
de HA.
3. De qu otra especie animal se pueden emplear eritrocitos para la prueba de HA?
4. Porque la prueba de HA no se considera confirmatoria?
5. Cul sera la muestra clnica para diagnosticar infeccin por virus del Newcastle
aplicando la prueba de HA.?

12

Practica No. 3
Prueba de inhibicin de la hemaglutinacin (IHA) para el diagnstico
definitivo del virus de la enfermedad del Newcastle
Introduccin
La prueba de Hemaglutinacin es un diagnstico preliminar de enfermedad por virus Newcastle,
de manera que si resulta positiva, no permite concluir que este virus sea el agente causal del
cuadro clnico en el ave con enferma.
Con base en lo anterior, para realizar un diagnstico definitivo se debe demostrar una
respuesta especfica del husped hacia este virus, determinando la presencia de anticuerpos por
medio de la reaccin de Inhibicin de la Hemaglutinacin (IHA).
Esta prueba se basa en la unin de un anticuerpo especfico hacia la hemaglutinina del
virin que impida la formacin de puentes entre el ligando viral y el receptor celular. Este hecho
permite identificar completamente a virus hemaglutinantes y se conoce tambin como
neutralizacin vrica.
Objetivos
1. El estudiante desarrollar la tcnica de Inhibicin de la Hemaglutinacin para determinar
el ttulo de un suero problema.
2. El alumno ser capaz de interpretar los resultados obtenidos al realizar esta prueba de
identificacin viral.
Material
Solucin reguladora de fosfatos (SRF) de Dulbecco con pH = 7.2.
Microplaca de poliestireno de 96 pozos con fondo en U.
Micropipetas de volmen variable de 20- 200 L.
Puntillas para micropipeta.
Vacuna viral (viriones atenuados, cepa La Sota).
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Suspensin de glbulos rojos de pollo al 1%.
Suero problema.
Pipetas de vidrio de 1 y 5 mL.
Solucin de Hipoclorito de Sodio 1:10 en agua destilada.
Algodn y alcohol al 70%.
Recipiente para recolectar desechos.
Metodologa
Con base en los resultados de la prctica anterior, preparar en un frasco con tapn de
rosca una dilucin del virus de la enfermedad de Newcastle que contenga 4 UHA, empleando
solucin reguladora de fosfatos; considerar un volumen suficiente para realizar la prueba de IHA.
De esta manera, si el resultado de la prctica de HA hubiese sido:
Dilucin 1:40 de la vacuna viral = 1 UHA, Por lo tanto:
Dilucin 1:10 de la vacuna viral = 4 UHA
Volmen suficiente para realizar la prueba de IHA = 2 ml. Entonces:
Vacuna viral concentrada 200 l
+
SRF 1800 l
_________
Volmen final 2000 ml de una dilucin viral con 4 UHA
1. Hacer diluciones seriadas al doble del suero problema, desde 1:2 hasta 1:256 de acuerdo
al esquema No. 2; incluir un pozo control que no contendr antisuero ni suspensin viral:
a) Agregar 100 L de una dilucin 1:2 del suero problema al pozo A1.
b) Adicionar 50 L de SRF de los pozos A2 al A8; en el pozo A9 colocar 100 l de la
misma solucin.
c) Transferir 50 L del pozo A1 al pozo A2, homogenizar por pipeteo suave para obtener
una dilucin del suero problema de 1:4.
d) Nuevamente transferir 50 l ahora del pozo A2 al A3 (para obtener una dilucin 1:8),
homogenizar y repetir el procedimiento hasta el pozo A8 que corresponder a una
dilucin 1:256.
e) Desechar 50 L del pozo A8 colocndolos en el pozo A12, teniendo cuidado en no
agregar ninguna dilucin del suero al pozo A9 ya que sirve como control de la reaccin.
14
Esquema No. 2

2. Agregar a cada uno de los 8 pozos con suero problema, 4 UHA del virus vacunal en un
volumen de 50 L.
3. Rotar la microplaca sobre la mesa de trabajo para que haya reaccin antgeno-anticuerpo e
incubar a temperatura ambiente durante 10 min.
4. Agregar 100 L de la suspensin de glbulos rojos al 1% a todos los pozos, desde A1
hasta A9; nuevamente rotar la microplaca e incubar a temperatura ambiente hasta que los
glbulos rojos del pozo A9 que sirven como control hayan sedimentado.
5. Determinar el ttulo del suero problema identificando la ltima dilucin en que se observe
inhibicin de la hemaglutinacin.
Cuestionario
1. Cul es la interpretacin que debe darse a un resultado negativo en la prueba de IHA?
2. Qu interpretacin diagnstica debe sealarse para un resultado positivo en la prueba de
IHA?
3. Combinando los resultados de las pruebas de HA e IHA, cul es la interpretacin
diagnstica en los siguientes casos: a) HA: positiva, IHA: negativa; b) HA: negativa,
IHA: positiva; c) HA: positiva, IHA: positiva

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Practica No. 4
Seminario: modelos biolgicos para el cultivo e identificacin de virus. Huevo
frtil de pollo, animales de laboratorio y cultivos celulares.
Introduccin
Gran parte de nuestro conocimiento sobre la herencia, el desarrollo, la fisiologa y los
procesos celulares y moleculares subyacentes se derivan de los estudios de un modelo u
organismos de referencia; a pesar de la gran diversidad de formas de vida y su alto grado de
complejidad, algunas caractersticas compartidas entre los seres vivos ha permitido la bsqueda
de respuestas ante las interrogantes planteadas por los investigadores.
Se cree que Gregor Mendel fue el primero que eligi cuidadosamente un organismo para
responder experimentalmente preguntas universales relacionadas con la herencia. Mendel fue
muy cuidadoso con las caractersticas filogenticas y la susceptibilidad a la investigacin
experimental que deba tener un organismo modelo para evitar obtener resultados dudosos; estas
caractersticas siguen siendo actualmente la base para la seleccin de un modelo biolgico.
Los modelos biolgicos representan slo una nfima fraccin de la biodiversidad que
existe en el planeta por lo que podra ser una muestra sesgada de los seres vivos, por lo que se
asume que el conocimiento de estos organismos permite extrapolar la informacin obtenida al
resto de organismos considerando un origen comn de las especies. Sin embargo, queda la
interrogante de si el corto ciclo vital de la mayora de los modelos biolgicos y la facilidad de
manipulacin, son representativos de todos los seres vivos o si sus caracteres excepcionales
permiten hacer generalizaciones del mundo vivo (figura 1).

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Fig. 5 rbol de la vida, mostrando una seleccin de varios organismos. Los organismos
utilizados con mayor frecuencia en la investigacin como modelos biolgicos se indican en color
rojo (Ciccarelli et al., 2006; Letunic et al., 2007)

Criterios de seleccin
En la actualidad los criterios utilizados para seleccionar un modelo biolgico para
experimentacin es su posicin filogentica, ya que cualquier organismo seleccionado para un
estudio es un modelo si es tomado como representante de algunas caractersticas de un grupo
mayor (gnero, familia, orden o phylum) o de un taxn inaccesible y la disponibilidad
experimental, pues estos organismos son seleccionados de acuerdo a caractersticas muy
especficas de la investigacin que se realiza, siendo importante controlar su pureza y evitar su
contaminacin bitica, por lo que se requiere que su produccin sea estandarizada, que tengan
caractersticas genticas y sanitarias definidas, que sean criados o cultivados en ambientes
17
controlados, que respeten los requerimientos de la especie y que se cumplan los principios ticos
para su bienestar.
Ejemplos de algunas especies utilizadas como modelos biolgicos en virologa
Drosophila
Fue adoptada como animal de experimentacin gentica por Thomas Morgan a principios
del siglo XX. Tambin llamada mosca del vinagre o mosca de la fruta, es una especie de dptero
braqucero de la familia Drosophilidae. Recibe su nombre debido a
que se alimenta de frutas en proceso de fermentacin. Es una especie
utilizada frecuentemente en experimentacin gentica, dado que
posee un reducido nmero de cromosomas (4 pares), breve ciclo de
vida (15-21 das) y aproximadamente el 61% de los genes de
enfermedades humanas que se conocen tienen una contrapartida identificable en el genoma de las
moscas de la fruta y el 50% de las secuencias protenicas de la mosca tiene anlogos en los
mamferos. Para propsitos de investigacin, fcilmente pueden reemplazar a los humanos.
Actualmente se utiliza como modelo para estudiar numerosos procesos biolgicos incluyendo la
respuesta inmunolgica a ms de 20 virus de RNA diferentes como el VIH, virus del dengue,
Fiebre amarilla, etc.
Neurospora
Es un gnero de hongos Ascomyceto. La especie ms conocida de este gnero es
Neurospora crassa. The National Institute of Health lo reconoci
como uno de los 12 organismos eucariotes modelo para la
investigacin en Gentica y Biologa Molecular, debido a que es fcil
de cultivar y tiene un ciclo de vida haploide que simplifica el anlisis
gentico ya que los rasgos recesivos se mostrarn en la descendencia;
el anlisis de la recombinacin gentica es facilitado por el arreglo ordenado de los productos de
la meiosis. Este hongo es utilizado para expresar los genes de herpes virus thymidine-kinase,
permitiendo el estudio de drogas anticancergenas y antivirales.
Bacteria
Entre los organismos modelo ms utilizados se encuentra la bacteria Escherichia coli, una
bacteria Gramnegativa, anaerobia facultativa y no esporulada, con un genoma de
aproximadamente 4'6 kb. Algunas cepas de esta bacteria son enormemente verstiles en
18
laboratorio, tolerando muy bien la manipulacin gentica e incluso
perdiendo su capacidad patognica. Se ha observado que gran parte de
sus estructuras y funciones son extrapolables en cierta medida a un
gran nmero de microorganismos, incluida la clula eucariota.
Tambin se utiliza como almacn de material gentico, fbrica de
virus, vector de plsmidos, etc.
Bacteriofagos
Los fagos o virus que infectan bacterias, se establecieron como modelos biolgicos por la
iniciativa de Max Delbrck. Los fagos cumplen un papel de gran
importancia en la Biologa Molecular al ser utilizados como vectores
de clonacin para insertar ADN dentro de las bacterias y obtener como
resultado bibliotecas genmicas. Los fagos ms utilizados con este fin
son el Fago y el Fago T
4
. Algunos estudios realizados en los
bacterifagos son: Protenas involucradas en la sntesis de ADN, ARN y protenas Regulacin
gnica; Cncer y control de la proliferacin celular, Transporte de protenas y organelos dentro de
las clulas; Infeccin e inmunidad; Posible va de acceso para terapia gnica. En la actualidad
estn siendo utilizados como modelos biolgicos para inducir la respuesta inmunolgica.
Caenorhabditis elegans
Es un nemtodo con una longitud aproximada de 1 mm, estructura bilateral simtrica y
ciertos precursores de rganos superiores, a saber, boca (estoma),
faringe, intestino y gnadas principalmente. Es un nemtodo
transparente por lo que permite diferenciar visualmente todas sus
estructuras, es hermafrodita, facilitando la transmisin de mutaciones.
Su genoma de 97 Mb est estructurado en 5 pares de cromosomas ms
dos cromosomas X en hermafroditas y un slo X en machos (un
0'05% del total de una descendencia). Si juntamos las caractersticas anteriores con su ciclo vital
de dos o tres semanas en laboratorio y la implicacin de larvas en el desarrollo se consigue un
organismo modelo con nuevas perspectivas en investigacin. El estudio de este organismo aporta
gran cantidad de informacin sobre diferenciacin celular y apoptosis, especialmente til en la
rama conocida como biologa del desarrollo. Los investigadores de la Universidad de California
en Riverside (UCR), han desarrollado de C. elegans como modelo para estudiar la reproduccin
19
de virus altamente peligrosos como el virus del Ebola, VIH, Hepatitis C, Fiebre del Nilo, etc.;
permitiendo trazar un mapa de la delicada interaccin entre virus y anfitrin; demostrado que la
copia del virus en el gusano provoca una respuesta antiviral conocida como ARN silenciador o
ARN interferencia (ARNi) que destruye el ARN viral.
Ratn
El ratn comn (Mus musculus), es una especie de roedor miomorfo de la familia
Muridae. Es la especie ms frecuente de ratn. Se cree que es la segunda especie de mamferos
con mayor nmero de individuos, despus del Homo sapiens. Habita
siempre cerca a los humanos, con los que mantiene una relacin de
comensalismo. Es tambin el mamfero ms utilizado en experimentos
de laboratorio y existen multitud de variantes transgnicas que simulan
enfermedades genticas humanas. Los principales estudios realizados en
el ratn comn son: desarrollo de tejidos corporales, funcin del sistema inmune de los
mamferos, formacin y funcin del cerebro y del sistema nervioso, modelos de cnceres y de
otras enfermedades humanas, regulacin gnica y herencia, enfermedades infecciosas virales y la
respuesta inmunolgica.
Huevo Frtil de Ave
El huevo frtil de ave es una fuente de tejido vivo empleado como un sistema sensible
para el cultivo, titulacin e identificacin de virus. En
comparacin con los animales de laboratorio empleados para
otros ensayos virales, el modelo de huevo frtil ofrece
diversas ventajas tales como: desarrollo en condiciones de
esterilidad; no poseen funciones inmunolgicas desarrolladas;
bajo costo; manipulacin relativamente sencilla; no requieren
de una infraestructura compleja. El huevo frtil empleado
para el cultivo de virus, debe obtenerse de aves libres de patgenos especficos (ALPES), para
evitar la presencia de virus que comnmente afectan a las aves, en especial Adenovirus,
Coronavirus, Bronquitis Infecciosa Aviar, etc., o bien, bacterias de los gneros Salmonella,
Pseudomonas, Pasteurella, etc. Para el cultivo y titulacin de virus, es indispensable determinar
la viabilidad del embrin, as como tener destreza en el dominio de las tcnicas de inoculacin,
20
todo ello debido a la especificidad que presentan algunos viriones por determinadas clulas o
tejidos.
Cultivos Celulares
En 1949 John Enders, Thomas Weller y Frederick Robbins describieron las condiciones
bajo las cuales Poliovirus poda cultivarse en clulas eucariticas de origen no neuronal, lo que
les permiti ganar aos ms tarde el premio Nobel en Fisiologa y
Medicina. A partir de entonces, los cultivos de clulas reemplazaron a
los animales de laboratorio como modelo de reproduccin de virus y en
nuestros das son utilizados en muchos campos del rea biomdica.
Este modelo biolgico est conformado por conjuntos de clulas con
caractersticas definidas que se mantienen en condiciones de laboratorio sobre soportes inertes (in
vitro), pero mantienen capacidad de proliferar a travs de divisiones mitticas requiriendo de
medios de cultivo con una composicin compleja que les provea de los nutrientes necesarios para
su preservacin y desarrollo. Las clulas se obtienen inicialmente de tejidos sanos o tumorales y
se disocian mediante diferentes mtodos hasta obtener fragmentos ms pequeos que pueden ser
disgregados con enzimas proteolticas para formar suspensiones celulares.

Cuestionario
1. Cules son las limitantes del uso de huevo frtil para la propagacin de virus?
2. Mencione las ventajas y desventajas del empleo de animales de laboratorio para el anlisis
de virus.
3. Qu virus se propagan nicamente en animales de laboratorio?
4. Cite las desventajas del modelo de cultivos celulares.
5. Mencione ejemplos de bacterias, diferentes de Escherichia coli, en las que se pueden
propagar bacterifagos y cite ejemplos de stos.

21

Practica No. 5
Ensayos de las vas de inoculacin en huevo frtil de pollo
Introduccin
El huevo frtil de ave es una fuente de tejido vivo empleado como un sistema sensible para el
cultivo, titulacin e identificacin de virus. En comparacin con los animales de laboratorio
empleados en los ensayos virales, el modelo de huevo frtil ofrece diversas ventajas tales como:
Son estriles.
No tienen funciones inmunolgicas desarrolladas.
No son costosos.
Son accesibles y no requieren para su manejo de tanta destreza tcnica en
comparacin con otros sistemas biolgicos, tales como el mantenimiento y
reproduccin de cultivos celulares.

El huevo frtil empleado para el cultivo de virus, debe obtenerse de aves sanas ALPES,
aves libres de patgenos especficos o SPF por sus siglas en ingls, para de esta manera eliminar
la presencia de virus que comnmente afectan a las aves como Adenovirus o Bronquitis
Infecciosa Aviar, etc.

Para la propagacin, cultivo y titulacin de virus, es indispensable determinar la
viabilidad del embrin, as como dominar las tcnicas para las diferentes vas de inoculacin
debido a la especificidad que presentan algunos viriones por determinadas clulas o tejidos. En la
figura 3 se presenta en esquema de las diferentes zonas que conforman a un huevo frtil.

Una vez realizado el ensayo de la inoculacin, deber observarse el conjunto del huevo
frtil para reconocer las cavidades y fluidos que constituyen al sistema biolgico empleado.
22

Fig. 6. Compartimentos del huevo frtil de ave.
Objetivos:
Al finalizar la sesin, el alumno:
1. Determinar al ovoscopio la viabilidad del embrin.
2. Dominar las tcnicas comnmente utilizadas para la inoculacin de huevos frtiles de
ave.
3. Diferenciara las estructuras embrionarias observando la organizacin de los tejidos fuera
de su cutcula.
Material:
Huevos frtiles de ave de 10 das de inoculacin (+/- 1 da), calidad ALPES.
Ovoscopio y pinzas de diseccin
Recipiente para recibir desechos
Charola porta embriones
Perforadores, bulbos y lpiz.
Jeringas de insulina
Agujas de 20 x 38 mm.
Colorantes
Guantes.

1
2
3
4
5
1 Cavidad Alantoidea

2 Saco de Aire

3 Saco Amnitico

4 Saco Vitelino

5 Membrana Corioalantoidea
23
Desarrollo:
I.- Confirmacin de la viabilidad del embrin
Transluminar cada embrin colocando el extremo romo en la ventana del ovoscopio. Un embrin
no viable puede reconocerse a travs de:
Desprendimiento de la membrana corioalantoidea de la parte interna de la cutcula.
Falta de irrigacin.
Falta de movimiento.
Cualquier coloracin de verde a negra que indica por lo general contaminacin bacteriana.
II.- Tcnicas de inoculacin
A Cavidad alantoidea
a Transluminar el huevo frtil con ayuda del ovoscopio.
b Marcar un punto o cruz de 2 a 3 mm. por arriba del lmite de la cmara de aire del lado
contrario al embrin y en una zona escasamente irrigada.
c Perforar la marca sealada.
d Con una jeringa que porte aguja de insulina o tuberculina, inocular en ngulo de 45
grados con respecto al huevo frtil de ave.
B Saco vitelino
a Localizar la parte ms alta del embrin sobre la cmara de aire y marcar con un punto o
cruz.
b Marcar otro punto o gua que indicara la localizacin del embrin.
c Perforar la marca sealada
d Introducir una aguja de 20 x 38mm recta con ligera inclinacin opuesta a la localizacin
del embrin
C Membrana corioalantoidea
a Localizar la parte ms alta de la cmara de aire y marcar un punto o cruz (*).
b Marcar otro punto en la parte media opuesta a la localizacin del embrin en un rea con
la menor irrigacin posible.
c Perforar ambas marcas.
d Succionar con un bulbo de goma a travs del punto marcado en la primera posicin (*),
creando as una cmara de aire falsa en la parte media del embrin.
24
e Inocular empleando jeringas con aguja de insulina o tuberculina en el lugar que se
desarroll la cmara de aire falsa.

En estos ensayos, se emplearan colorantes para las diferentes inoculaciones con el
objetivo de facilitar la visualizacin del sitio donde se pretendi depositar un volumen
determinado de colorante. Una vez realizada la tcnica, se abrirn los huevos frtiles de ave para
analizar si la va elegida fue efectivamente inoculada, vertiendo el contenido del embrin sobre
cajas de Petri.

Cuestionario
1. De acuerdo con lo observado despus de abrir los embriones de pollo y segn la va de
inoculacin empleada; esquematice para cada va, cuales zonas deben quedar teidas y
cules no, si la inoculacin se realiz correctamente.
2. Cite ejemplos de virus que puedan ser inoculados por va saco vitelino, mencionando las
lesiones que causan.
3. Cite ejemplos de virus que puedan ser inoculados por va membrana corioalantoidea
mencionando las lesiones que causan.
4. Cite ejemplos de virus que puedan ser inoculados por va cavidad alantoidea,
mencionando las lesiones que causan.
5. Qu otras aplicaciones tiene el huevo frtil adems de la propagacin de virus?

25

Prctica No. 6
Replicacin del virus de la enfermedad de newcastle en huevo frtil de pollo

Introduccin
Existen diversos agentes infecciosos que provocan en el humano y otros mamferos daos
severos e incluso la muerte. En el mejor de los casos lo deseable es que esta interaccin induzca
una proteccin inmunolgica al individuo como consecuencia del reconocimiento de antgenos
especficos tanto en forma natural como artificial. En el caso de medidas profilcticas, con el
empleo de vacunas se procura inducir una Inmunidad Adquirida Artificial.

Para obtener resultados satisfactorios, es indispensable evaluar la calidad de la vacuna.
Para las vacunas elaboradas con virus atenuados, la valoracin se puede efectuar en sistemas
biolgicos tales como huevos frtiles de ave que pueden responder a la infeccin viral dando
lesiones caractersticas del virin inoculado que afecte directamente al embrin y le produce
signos tales como msculos distrficos, enanismo o muerte, o bien, afectan estructuras y lquidos
extraembrionarios donde se pueden observar hemorragias, formacin de placas o pstulas as
como determinar la presencia de hemaglutininas virales.

Los virus vacunales o de campo pueden titularse en huevos frtiles de ave cuando
producen su muerte calculando entonces una Dosis Letal al 50% (DLEP
50
) o en el caso de virus
hemaglutinantes calculando Dosis Infectivas al 50% (DIEP
50
) empleando la reaccin de
Hemaglutinacin de los fluidos cosechados.

26
Objetivos
1. El alumno desarrollara la tcnica para propagar una cepa vacunal de virus. atenuados de la
enfermedad de newcastle
2. El alumno determinar la DIEP
50
para la vacuna del Virus de laenfermedad de newcastle ,
calculando sus concentracin por unidad de volumen.

Material
Huevo frtil de ave de 10 dias de incubacin (+/- 1 dia) calidad ALPES.
Vacuna con viriones atenuados de la enfermedad de newcastle
Solucion reguladora de fosfatos (srf) de dulbecco con ph 7.2 o solucion salina
Suspensin de eritrocitos de pollo al 1%
Lpiz, pegamento blanco y perforadores
Hisopos estriles, tintura de yodo.
Estufa a 37C.
Ovoscopio.
Jeringas para aplicacion de insulina.
Mechero.
Recipiente para desechos.
Desarrollo:
1. Realizar con solucion salina de Dulbecco diluciones seriadas de la vacuna viral desde 10
-1

hasta 10
-8
a partir de una suspensin concentrada.
2. Trasluminar el huevo frtil de ave y seguir la tcnica de inoculacin para cavidad
alantoidea
3. Desinfectar el sitio marcado con el punto o cruz de inoculacin con tintura de yodo antes
y despus de perforar
4. Inocular 0.1 mLde las cuatro ultimas diluciones en cada uno de 5 embriones de 9 a 11
das de incubacin (20 embriones en total), va cavidad alantoidea.
5. Desinfectar nuevamente y sellar la perforacin con una gota de pegamento blanco
6. Marcar con lpiz sobre cada embrin la dilucin y vacuna inoculada
27
7. Incubar a 37C durante 7 dias, revisando diariamente la viabilidad de los embriones al
ovoscopio, sealando en el primer dia los embriones que resulten muertos por
traumatismo

Cuestionario
1. Que es una vacuna?
2. Qu parametros deben tomarse en cuenta para evaluar la calidad de una vacuna?
3. Para que es importante tener una vacuna de calidad?
4. Mencione al menos cinco vacunas que en la actualidad sean producidas en huevo frtil de
ave
5. Mencione vacunas elaboradas con virus atenuados de uso humano.

28

Prctica No. 7
Titulacin (DI
50
) del virus de la enfermedad de newcastle en huevo frtil de
pollo

Introduccin
Uno de los procedimientos importantes en virologa es medir la concentracin de un virus en
una muestra, o el ttulo viral.
Las tcnicas de titulacin viral son en muchos casos un paso previo y necesario para
desarrollar otros tipos de estudios tales como: ensayos de neutralizacin, determinacin de actividad
antiviral de un extracto dado, ensayos de identificacin viral como en el caso de virus influenza
(ensayo de inhibicin de la hemaglutinacin), etc.
La cantidad de virus presente en una muestra se calcula por diversos mtodos entre los
cuales se encuentra la dosis infectante al 50% (DI
50
). Para llevar a cabo este ensayo, diluciones
seriadas de virus son inoculadas en cultivos celulares, huevos embrionados o animales. Los
resultados son observados despus de dejar el tiempo apropiado para que la infeccin y replicacin
viral se lleve a cabo.
El ttulo viral es definido como aquella dilucin de virus que infecta (o mata) el 50% de la
poblacin inoculada.
En stos anlisis para determinar el ttulo viral, se utiliza el mtodo de Reed y Muench, el
cual es relativamente simple. Se basa en la suposicin de que el nmero de unidades de prueba
afectadas vara proporcionalmente al log10 de la dilucin, es decir que a diluciones menores (mayor
concentracin de virus) el porcentaje de efecto ser mayor que a diluciones mayores (menor
concentracin de virus). Adems, considera que en la zona cercana al 50% de efecto ste vara
linealmente con la dosis. Es muy importante no omitir ninguna dilucin intermedia.

29
Objetivo
1. El alumno titular la vacuna del Virus de la enfermedad de newcastle, determinando la
DLEP
50
calculando sus concentracin por unidad de volumen.
Desarrollo:
1. Al termino de la incubacin, de los embriones de la prctica anterior, cosechar un poco de
fluido alantoideo de cada uno de los 20 huevos inoculados, para efectuar
hemaglutinaciones.
2. Anotar los resultados obtenidos y realizar los clculos para determinar la DIEP
50
/ 0.1 ml
empleando el metodo de Reed & Muench, con base en el siguiente ejemplo
Resultados de las pruebas de hemaglutinacion
DILUCION EMBRIONES
INOCULADOS
HA+ HA-
10
-3
5 4 1
10
-4
5 3 2
10
-5
5 2 3
10
-6
5 1 4

Calculos
1) ACUMULADOS
POSITIVOS
2) ACUMULADOS
NEGATIVOS
3) RADIO DE
POSITIVIDAD
4) PORCENTAJE
10 1 10 / 11 90.9
6 3 6 / 9 66.6
3 6 3 / 9 33.3
1 10 1 / 11 9.09

Para una mejor explicacin, se desgloza a continuacin la realizacin de los clculos para cada
columna:
Columna 1: Realizar la suma acumulada de pruebas HA+, desde la dilucin mas alta hasta la mas
baja.
Columna 2: Realizar la suma acumulada de pruebas HA- desde la dilucin mas baja a la mas alta.
30
Columna 3: Para cada dilucin anotar el cociente dado por los acumulados con HA+ sobre la
suma de acumulados con HA+ y HA-.
Columna 4: Expresar el cociente anterior como porcentaje
Calcular el valor de interpolacin (VI.) con la siguiente frmula:

% Positividad 50% - 50% 66.6 50.0 16.6
V.I. = =
% Positividad 50% - % Positividad 50% 66.6 33.3 33.3

V.I. = 0.49
Multiplicar el logaritmo negativo del factor de dilucin por el valor de interpretacin para as
calcular el valor de interpolacin corregido.
Para este caso:
V.I.C.= log Neg de 10 X V.I. = -1 x 0.49

Localizar las diluciones entre las que se encuentra el 50% de positividad
En el ejemplo: 10
-6
y 10
-7

Estimar la DIEP
50
sumando el V.I.C. al exponente de la dilucin que presente mayor del 50% de
positividad, en este ejemplo.
DIEP
50
= 10
-6 + (-0.49)
= 10
-6.49

El titulo se obtiene con el inverso del valor de la DIEP
50
.
Finalmente el resultado sera:
Titulo = 10
6.49
/0.1ml , que es la concentracin de viriones presentes en 100 microlitros de
la vacuna original
Cuestionario
1. Adems de la titulacin viral, que otras pruebas se deben realizar a un lote vacunal antes
de salir al mercado?
2. Mencione otras dosis al 50% que se pueden calcular para titular una muestra viral.
3. En esta prctica que nos indica una HA+
4. Porque emplear el metodo de Reed & Muench.?
5. Qu otros mtodos se utilizan para titular una muestra viral?

31

Prctica No. 8
Preparacin de un medio mnimo para el cultivo Y propagacin de clulas

Introduccin
En el organismo, las clulas y los tejidos constantemente son alimentados con fluidos
circulantes en el cuerpo, los cuales proveen nutrientes y oxgeno adems remueven los productos
de desecho del metabolismo celular. De la misma forma cuando las clulas son cultivadas in
vitro, dependen completamente de fluidos de cultivo para sus requerimientos nutricionales. Las
primeras soluciones utilizadas para cultivos celulares consistan en suero sanguneo, coagulos de
plasma y linfa. Durante la dcada de los 30, se establecieron los requerimientos nutricionales
para el crecimiento de clulas en cultivo y de ah se desarrollaron los nuevos medios sintticos.
En 1950 Morgan formul el Medio 199, que permite el crecimiento de clulas primarias de
embrin de pollo. Este medio contiene 61 nutrientes sintticos adems de 5-10% suero bovino
fetal (SBF). En 1955, Eagle realiza la primera investigacin sistemtica de los requerimientos
nutritivos de las clulas en cultivo e identifiva 28 sustencias esenciales para el crecimiento celular
y la necesidad de soluciones corporales complejas en el medio de cultivo como el suero,
desarrollando el Medio Basal de Eagle (MBE) que incluye glucosa como fuente de energa, 13
aminocidos como precursores de protenas, 8 vitaminas como cofactores y seis sales que
proveen cofactores metablicos que controlan el pH y regulan el balance electroltico. Eagle
desarroll posteriormente el Medio Esencial Mnimo de Eagle (MEME) el cual contiene
concentraciones mayores de aminocidos y vitaminas; este es el medio ms comn en los
laboratorios y su mayor ventaja es que permite mantener los cultivos por ms tiempo sin
necesidad frecuente de cambio de medio.
32
En 1965, Ham introduce el primer medio definido, libre de suero y capaz de mantener
indefinidamente algunas clulas de mamfero en cultivo. Basicamente, un medio de cultivo
celular debe de contener:
Iones como Na, K, Ca, Mg, Cl y P
Elementos trazas como Fe, Zn y Se
Fuentes de energa como glucosa
Aminocidos que son 13 aminocidos esenciales en los cultivos celulares
Vitaminas
Protenas, pptidos, lpidos
Antibiticos y antimicticos
Suero como soporte para el crecimiento de la mayora de las clulas

Los medios para cultivo celular se pueden clasificar como medios de mantenimiento o
crecimiento, medios de congelacin (que contienen hasta el 20% de SFB como crioprotector),
medios selectivos que favorecen el crecimiento de cierto tipo de clulas y los medios definidos
donde se conocen todos y cada uno de los componentes y sus concentraciones exactas.
Para la eleccin de un medio de cultivo se debe tener en cuenta el tipo de celula que se va
a cultivar y los requerimientos esenciales que la clula necesita para su desarrollo. Actualmente
se comercializan un gran nmero de medios de cultivo, siendo la unica diferencia la cantidad de
los componentes nutritivos en ellos ya que la composicion no varia. Algunos ejemplos de los
medios utilizados con mayor frecuencia son:
Medio Basal de Eagle (BME). Medio elemental con slo los aminocidos esenciales. Se
necesita siempre la suplementacin con suero bovino fetal al 10 %. Crecimiento de
fibroblastos de ratn y clulas HeLa.
Medio Mnimo Esencial de Eagle (MEM). Es el medio de uso ms comn, contiene ms
aminocidos y en mayor concentracin que el BME. Se usa para cada casi todo tipo de
cultivos y requiere la adicin de suero (10%).
RPMI 1640. Medio diseado para el crecimiento de linfoblastos y lneas celulares
leucmicas en suspensin. Tiene un amplio rango de aplicaciones con suplementos
adecuados.
33
Medio MEM modificado por Dulbeco (DMEM). Contiene cuatro veces la concentracin
de aminocidos y vitaminas que el BME. Se usa para la seleccin de hibridomas.
Modificacin de Iscove del medio DMEM (IMDM). Es un medio muy completo que
incluye en su formulacin albmina bovina, transferrina, selenito, etc. Es muy til para el
cultivo de linfocitos en medio libre de suero. Tambin sirve para otros tipos celulares,
pero en ese caso requiere suero a bajas concentraciones.
McCoy 5A. Medio diseado para el crecimiento de lneas celulares diploides tanto de rata
como humanas.
Medio F-10 de Ham. Para el crecimiento de lneas celulares humanas, debe ser
suplementado con protenas y hormonas. Contiene metales como Fe, Cu, Zn. Es til para
el cultivo de clulas amniticas.
Medio F-12 de Ham. til para el crecimiento de lneas celulares con suplementos
protenicos. Combinado con IMDM es un medio que se usa como libre de suero.
Medio 199. Muy usado para el cultivo de clulas no diferenciadas y estudio de
cromosomopatas

Objetivos
1. Establecer los fundamentos tericos para la preparacin de medios de cultivo.
2. Preparar un medio de cultivo que permita propagar clulas.

Material y reactivos
2 frascos de vidrio de 1 L.
1 probeta de 1000 mL.
1 balanza analtica.
1 parilla con agitacin
Gabinete de seguridad biolgica
1 pH-metro
1 vaso de precipitados de 50 mL.
2 filtro con membrana con un poro de (0.22m de dimetro).
2 jeringas de 50 mL
1 sobre de Medio Esencial Mnimo de Eagle (MEM)
34
2.2 g de NaHC0
3

Solucin de HC1 1 N
1000 mL de agua inyectable.
Suero fetal de bovino
Penicilina G y estreptomicina
Desarrollo
a) Disolver el contenido del sobre de medio MEM de una presentacin comercial con agua
inyectable en aproximadamente el 80% del volumen final a preparar.
b) Aadir 2.2 g de NaHC0
3
(se observa un cambio de color de un naranja a un rojo
intenso).
c) Adicionar el antimicrobiano 100UI/ml de penicilina G y 100 g/ml de estreptomicina
d) Utilizando un pH- metro calibrado, y manteniendo el medio en agitacin, adicionar poco
a poco HC1 1 N al medio, de manera que se ajuste el pH a 7.1.
e) Aforar al volumen final con agua inyectable.
f) El medio se esteriliza por filtracin atravs de membrana con dimetro de poro de
0.22m, utilizando una jeringa de 50 mL para hacer pasar la solucion.
g) Para verificar la esterilidad del medio, se incuba un da a 37C y luego se almacena a
4C.
h) Complementar el medio con 5 % de suero fetal bovino.
i) Someter nuevamente a prueba de esterilidad y almacenar a 4C hasta su uso.

Cuestionario
1. Cul es el indicador utilizado en la formulacin y cul es su importancia?
2. Por qu es necesario esterilizar por filtracion?
3. Que funcin tiene el suero de ternera adicionado al medio de cultivo para clulas?
4. Por qu es necesario agregar NaHC0
3
?
5. Qu otros antibiticos se pueden adicionar a un medio para cultivar clulas y cul es su
espectro de accin?

35

Prctica No. 9
Taller demostrativo de proliferacin de cultivos celulares mediante subcultivo
o pase 1:2

Introduccin
Los cultivos celulares son el modelo biolgico que ms se utiliza para el aislamiento y
propagacin de virus. Permite realizar ensayos de infeccin en condiciones controladas por lo
que representan el mtodo de referencia en el estudio de virus.
Estos ensayos pueden servir para la propagacin de un virus como es el caso de la
produccin de vacunas, o bien para analizar si el efecto de un virus en un determinado tipo
celular se presenta de forma reproducible, lo cual requiere adems incluir monocapas de
controles positivos y negativos. En cualquier caso es necesario contar con una cantidad
suficiente de clulas. La manera de aumentar las clulas disponibles es por la propagacin de un
cultivo inicial mediante un subcultivo o pase.
El subcultivo se realiza a partir de una monocapa confluente que se disgrega mediante la
accin enzimtica de una proteasa preparada en solucin con un agente quelante, una vez
disgregadas, las clulas se resuspenden en el medio de cultivo correspondiente hasta lograr una
suspensin homognea. El volumen de dicha suspensin se divide partes que se depositan en
recipientes adecuados para que las clulas se adhieran. Cuando la suspensin se divide en partes
iguales, se denomina como subcultivo o pase 1:2. Cada parte proliferar hasta formar
nuevamente una monocapa confluente, que puede propagarse bajo el mismo procedimiento. Los
subcultivos se realizan subsecuentemente hasta satisfacer las necesidades de trabajo.

36
Objetivo
Realizar un subcultivo de clulas eucariticas en relacin 1:2 para promover su proliferacin y
obtener monoestratos celulares.
Material y equipo
Gabinete de bioseguridad
Incubadora con fuente de CO
2

Pipeteador automtico
Etanol al 70%
Cultivo celular confluente.
Recipientes para cultivo celular
Medio de cultivo complementado con 5% de Suero fetal bovino (SFB) adecuado para el
tipo celular de trabajo.
Solucin de tripsina en regulador de pH.
Solucin reguladora de fosfatos (SRF)
Pipetas graduadas de 1, 5 y 10 mL
Frasco de desecho
Desarrollo
a) Desinfectar el rea de trabajo en el interior del gabinete de bioseguridad con etanol al
70%.
b) Introducir todo el material y equipo que se empleara en el proceso previamente
limpiado con etanol al 70% y encender la luz ultravioleta por espacio de 15 minutos,
evitando observar en forma directa la fuente de radiacin.
c) Apagar la luz ultravioleta y encender la iluminacin convencional del gabinete de
bioseguridad.
d) Observar la confluencia del cultivo original
e) Decantar el medio del frasco que contiene clulas.
f) Lavar suavemente las clulas con 5 ml de (SRF)
g) Agregar 1.0 ml de solucin de tripsina y dejar interaccionar con las clulas durante 1
min; retirar el exceso de la solucin de tripsina.
h) Incubar a 37 C durante 5 a 10 minutos; observar al microscopio que las clulas se
hayan redondeado (disgregacin celular).
37
i) Agregar al frasco de cultivo, 14 ml de medio complementado con SFB y homogenizar
por pipeteo hasta formar una suspensin celular homognea. Evite la formacin de
espuma.
j) Dispensar 7 ml de la suspensin celular obtenida a cada uno de dos recipientes
estriles para cultivo celular.
k) Incubar a 37 C en la incubadora con una concentracin de 5% de CO
2
, durante 24 a
48 horas.
l) Observar al microscopio que en ambos frascos de cultivo se tenga una confluencia del
100% (monoestrato celular).
m) Cambiar el medio de cultivo celular, por un medio de mantenimiento que solo
contenga 0.5 % de SFB, hasta el momento de emplear el cultivo para la reproduccin
de virus.

Cuestionario
1. Qu significa confluencia?
2. Qu funcin tiene el SFB adicionado al medio de cultivo para clulas?
3. Explique el efecto que produce la adicin de tripsina a la monocapa celular?
4. De qu materiales estn hechos los recipientes para el cultivo de celulas?
5. Mencione 5 tipos de cultivos celulares y los medios de cultivo adecuados para su
propagacin.

38

Prctica No. 10
Seminario: pruebas para el diagnstico clnico de virus (ELISA,
inmunofluorescencia y Western Blot). Fundamentos aplicaciones y
limitaciones
Introduccin
El diagnstico viral es uno de los retos importantes a los que se enfrenta la medicina
actual, ya que durante las ltimas dcadas, el desarrollo progresivo de nuevas y mejores
herramientas hace posible que estos agentes infecciosos se puedan estudiar no slo a nivel de
laboratorios especializados, sino tambin en los de anlisis clnicos.
Idealmente se busca identificar plenamente al virus asociado con una enfermedad en corto
tiempo y a travs de una sola prueba, pero en forma prctica, en la mayora de ocasiones no se
realiza diagnstico diferencial, no hay comunicacin entre el diagnstico clnico y el de
laboratorio, as como difcilmente los pacientes aceptan realizarse estudios con muestras de suero
sanguneo pareadas, es decir, recolectadas tanto en la fase aguda de la enfermedad como en la
fase convaleciente.
Diagnosticar si una infeccin es de etiologa viral es muy importante porque determina las
acciones teraputicas del paciente y elimina los tratamientos inadecuados, adems de ayudar al
pronstico y seguimiento de la enfermedad.
Esto tiene repercusiones sociales y econmicas, puesto que la administracin oportuna de
un tratamiento correcto puede reducir el tiempo y costo de atencin hospitalaria.
En general, el contacto con virus puede ser analizado de forma directa o indirecta. Las
pruebas directas son las que evidencian al virus o alguno de sus antgenos presentes en clulas o
tejidos humanos. Las pruebas indirectas son las que se utilizan con mayor frecuencia y
bsicamente demuestran un contacto del husped con el agente viral mediante la determinacin
de anticuerpos especficos hacia un virus en particular.

39
En estos ensayos se aprovechan las caractersticas fisicoqumicas de los virus o los
anticuerpos producidos hacia ellos para tener especificidad en las reacciones. Dentro de las
principales utilidades diagnsticas pueden mencionarse:
Deteccin de antgenos virales.
Determinacin de anticuerpos antivirales.
Obtencin de datos epidemiolgicos y pronstico de enfermedades efectuando anlisis de
sueros pares; en muestras tomadas con una separacin de al menos 2 semanas, un
incremento en 4 veces o ms en el ttulo de la segunda muestra con respecto a la primera,
es considerado significativo para una enfermedad viral en convalecencia o en el peor de
los escenarios activa.
Diferenciacin entre infecciones primarias, persistentes o crnicas. La presencia de IgM
especfica se puede detectar en los primeros das del inicio de la enfermedad.

Las pruebas serolgicas con mayor aplicacin en el diagnstico viral son:
1. Ensayos inmunoenzimticos (ELISA)
a) Directo (deteccin de antgenos)
b) Indirecto (deteccin de anticuerpos de respuesta inmunolgica)
2. Inmunofluorescencia
a) Directa (deteccin de antgenos virales)
b) Indirecta (deteccin de anticuerpos de respuesta)
3. Western-blot

ELISA (enzyme linked inmuno sorbent assay).
Se basa en el uso de antgenos o anticuerpos marcados con una enzima, de forma que los
conjugados resultantes tengan actividad tanto inmunolgica como enzimtica.
Al estar uno de los componentes (antgeno o anticuerpo) marcado con una enzima e
insolubilizado sobre un soporte (inmunoadsorbente) la reaccin antgeno-anticuerpo quedar
inmovilizada y, por tanto, ser fcilmente revelada mediante la adicin de un substrato
especifico que al actuar la enzima producir un color observable a simple vista o
cuantificable mediante el uso de un espectrofotmetro o un colormetro.
Pasos generales de un ELISA.
40
1. Tapizado del pocillo con el antgeno o anticuerpo.
2. Adicin de la muestra problema con la mezcla de antgenos o anticuerpos.
3. Unin del antgeno o anticuerpo especfico al anticuerpo o antgeno tapizado en el
pocillo
4. Lavado del pocillo para eliminar el exceso de antgeno o anticuerpo no unido
5. Adicin del anticuerpo secundario marcado con la enzima
6. Unin del anticuerpo secundario al antgeno o anticuerpo
7. Lavado del pocillo para eliminar el exceso de enzima no unida
8. Adicin del substrato
9. Unin del substrato a la enzima
10. Desarrollo del color.

Tipos de ELISA
ELISA directo (ensayo ELI SA simple de dos capas). Las placas ELISA se preparan recubriendo
los pocillos con las soluciones en las que se sospecha se encuentra el antgeno. Se incuban con
anticuerpos marcados.
ELISA 'sandwich'. (Ensayo de captura de antgeno y deteccin mediante inmunocomplejos). Se
trata de un ensayo muy empleado en el que se recubre el pocillo con un primer anticuerpo anti-
antgeno. Despus de lavar el exceso de anticuerpo se aplica la muestra problema en la que se
encuentra el antgeno, que ser retenido en el pocillo al ser reconocido por el primer anticuerpo.
Despus de un segundo lavado que elimina el material no retenido se aplica una solucin con un
segundo anticuerpo anti-antgeno marcado. As pues cada molcula de antgeno estar unida a un
anticuerpo en la base que lo retiene y un segundo anticuerpo, al menos, que lo marca. Este ensayo
tiene una gran especificidad y sensibilidad debido a la amplificacin de seal que permite el
segundo anticuerpo.
ELISA con anticuerpo de captura (sndwich) para el diagnstico de virus:
Es una prueba en fase slida donde se fijan anticuerpos especficos (monoclonales o policlonales
obtenidos en ratn) para un virus determinado sobre una superficie inerte como las microplacas
de poliestireno; sobre estos de adiciona el suero o muestra que contiene el antgeno que se quiere
demostrar y una vez que ocurre la reaccin antgeno-anticuerpo, se hace una serie de lavados para
eliminar todo lo que no haya reaccionado. Finalmente, se agrega un segundo anticuerpo que
41
tambin reconoce al antgeno viral pero obtenido en un husped distinto (por ejemplo cabra)
conjugado a una enzima.
Pueden ser utilizadas enzimas como la fosfatasa alcalina (FA) o la peroxidasa de rbano
picante (PR) y para el revelado final de la reaccin, se coloca el sustrato especfico para la
enzima, el cual es hidrolizado por sta para producir un complejo coloreado. En el caso de la FA
el sustrato es paranitrofenilfosfato y para PR es ortofenilendiamina (OPD) en solucin de
perxido de hidrgeno, los cuales permiten visualizar la reaccin.
Para cuantificar el color producido, se mide la absorbancia en un espectrofotmetro, cuya
lectura ser directamente proporcional a la concentracin de antgeno presente en la muestra.
Esta tcnica se utiliza ampliamente para el diagnstico de antgenos de la Hepatitis A, B y C,
Rotavirus, VIH, agente Norwalk, virus Parainfluenza e Influenza A y B. Para la hepatitis B la
demostracin del antgeno de superficie (HBsAg) diagnstica la infeccin activa as como el
estado de portador; el diagnstico de rotavirus con este mtodo ayuda a obtener un resultado
rpido en nios menores de dos aos con cuadros diarreicos, donde este virus es el principal
agente causal.
Por otra parte, para VIH la demostracin del antgeno p24 es til en el diagnstico de la
infeccin en nios y en pacientes que se encuentran en periodo de ventana inmunolgica; es
adems de gran utilidad en el pronstico y la progresin de la infeccin as como en el control de
la terapia antirretroviral.
ELISA Indirecto para el diagnstico de virus:
Esta tcnica serolgica determina la presencia de anticuerpos contra agentes infecciosos
como los viriones, considerando que la exposicin a ellos produce una respuesta por parte del
sistema inmune, entre otros mecanismos, a travs de la produccin de anticuerpos especficos.
La prueba de ELISA indirecto tiene un principio semejante al de ELISA directo, pero en
este caso, un antgeno viral especfico est unido a la fase slida, a la cual se aade el suero del
paciente que presumiblemente posee anticuerpos antivirales y despus se adiciona un conjugado
constituido por anti-anticuerpos IgG o IgM unidos a una enzima. Finalmente se adiciona un
sustrato especfico, que desarrollara un color cuya intensidad es proporcional a la concentracin
de anticuerpos presentes en el suero del paciente.
Este mtodo se utiliza comnmente en laboratorios clnicos y si se automatiza puede
efectuarse en un tiempo menor a 2 horas. Su utilidad en virologa est dirigida hacia la
42
determinacin de anticuerpos contra antgenos especficos de virus Dengue, Herpesvirus, VIH,
Citomegalovirus, Rubola, Hepatitis A, B y C, as como en infecciones por Virus Epstein-Bar
para demostrar marcadores serolgicos tempranos de la enfermedad
La especificidad de las pruebas de ELISA depende en buena medida de la calidad de los
reactivos adsorbidos en la fase slida, lo cual ha permitido la generacin de diferentes ensayos a
travs del tiempo, cada vez con mejores propiedades:
a) De primera generacin
Pruebas donde inicialmente se utilizaron antgenos crudos sin mayores procesos de
purificacin, tales como el virin completo inactivado (caso de las primeras tcnicas de ELISA
para VIH), sin embargo, estos ensayos presentaban reacciones inespecficas (falsos positivos), en
particular se obtenan reacciones cruzadas con virus Herpes.
b) De segunda generacin
En este caso los antgenos son protenas recombinantes, que se producen mediante
ingeniera gentica en bacterias y son sometidas a procesos de purificacin, lo cual confiere
mayor especificidad a la prueba, pues se identifican anticuerpos particulares contra las protenas
consideradas ms inmunognicas.
c) De tercera generacin
Son las ms utilizadas actualmente, ya que presentan una alta especificidad. En ellas se
emplean pptidos sintticos (fabricados siguiendo un diseo especfico en el laboratorio) con
secuencias particulares para cada virus, como es el caso de las pruebas diseadas para determinar
anticuerpos contra VIH 1 y VIH 2.
En adicin, los mtodos ms recientes de ELISA emplean en su proceso final el sistema
de anticuerpos-biotinilados / estreptavidina-enzima, que amplifica la lectura en unidades de
densidad ptica para ganar sensibilidad en los casos en que la concentracin de anticuerpos
antivirales est muy reducida.
Inmunofluorescencia (IF)
La fluorescencia es la propiedad de una sustancia de emitir luz cuando es expuesta a
radiaciones de baja longitud de onda y alta energa (UV-Rx). Las radiaciones absorbidas
(invisibles al ojo), son transformadas en luz visible, o sea de una longitud de onda mayor a la
incidente.
43
La absorcin de luz por parte de la molcula de fluorocromo la eleva a un estado de
excitacin en el cual contiene mayor energa. La molcula permanece en el estado de excitacin
por un perodo de tiempo muy corto. El retorno a un nivel de energa menor es acompaado por
emisin de luz (fluorescencia)
La IF es una tcnica que emplea anticuerpos conjugados a fluorocromos (como
isotiocianato de fluorescena).
La visualizacin de la cantidad de Ag-Ac formado se hace con la ayuda de un
microscopio de fluorescencia
Inmunofluorescencia Directa
Esta tcnica utiliza muestras clnicas recolectadas apropiadamente que deben ser colocadas sobre
portaobjetos donde se dejan secar y fijar. Luego se agregan anticuerpos especficos marcados
con isotiocianato de fluorescena que difunden a travs de la membrana celular y se combinan
con los antgenos vricos en el interior de las clulas. La reaccin antgeno anticuerpo se
visualiza con el microscopio de fluorescencia, por la aparicin de fluorescencia de color verde
manzana.
Esta tcnica es til para la identificacin de virus como: Herpes Simple, Virus
Respiratorio Sincitial (VRS), Rabia, Influenza A, entre otros.
Inmunofluorescencia Indirecta
Es una tcnica de doble capa en donde se aplica el anticuerpo sin marcar directamente sobre el
sustrato de tejido y se visualiza por tratamiento con un suero anti-inmunoglobulina conjugado
con fluorocromo (anti-anticuerpo marcado).
El proceso consta de dos etapas:
Primera etapa: se fijan sobre un portaobjetos los antgenos que constituyen el substrato
conocido especfico (clulas que contiene virus.) sobre l se coloca el suero de quien se sospecha
la presencia de anticuerpos especficos, si la reaccin es positiva se dar formacin de complejo
antgeno-anticuerpo no visible ya que el anticuerpo no estaba marcado.
Segunda etapa: se agrega una anti-inmunoglobulina humana marcada, que reaccionar
con el anticuerpo del complejo producido en la primera etapa.
Western blot
El trmino blotting hace referencia a la transferencia de macromolculas biolgicas
desde un gel hasta una membrana y su posterior deteccin en la superficie de la misma. Este
44
proceso es necesario ya que todas estas macromolculas estn embebidas dentro de la matriz que
forma el gel, lo que imposibilita realizar su deteccin, mientras que en la membrana, se
encuentran accesibles al estar adheridas sobre la superficie de la misma.
El mtodo para protenas ms potente es el denominado Western blot en el que las
protenas son separadas en primer lugar mediante electroforesis en geles de poliacrilamida en
condiciones desnaturalizantes (SDS-PAGE) y posteriormente se transfieren a una membrana,
mediante la aplicacin de un campo elctrico perpendicular al gel (electroblotting). Una vez
completada esta operacin la protenas de inters son reveladas por el agregado de un anticuerpo
especfico.
La especificidad de la unin antgeno-anticuerpo permite la deteccin de una nica
protena dentro de una mezcla compleja de otras protenas. En la actualidad se utiliza como
criterio de identificacin positivo de una protena especifica en una mezcla compleja y para
obtener datos cualitativos y semicuantitativos sobre la misma.
El primer paso de todo Western Blot es la separacin de las macromolculas mediante
geles de electroforesis; despus de la misma, las macromolculas ya separadas en funcin de su
diferente peso molecular se transfieren a una segunda matriz, generalmente una membrana de
nitrocelulosa o PVDF. Posteriormente, se bloquea la membrana para evitar la unin inespecfica a
su superficie de los anticuerpos que se van a utilizar para la deteccin de la protena de inters.
En el siguiente paso, se une a dicha protena transferida un anticuerpo especfico marcado con
una enzima y, finalmente, se aade un sustrato apropiado para dicha enzima con lo que se
produce un producto detectable como, por ejemplo, un precipitado cromognico o fluorognico
en la membrana. Actulmente, los mtodos ms sensibles emplean sustratos quimioluminiscentes
que cuando se combinan con la enzima correspondiente, producen luz como producto final, que
puede detectarse mediante una pelcula o una cmara CCD. En todos los casos y sea cual sea el
sustrato que se utilice, la intensidad de la seal se correlaciona con la cantidad del antgeno en la
superficie de la membrana.

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Prctica No. 11
Ensayos inmunoenzimticos para el diagnstico de virus de la
inmunodeficiencia humana (VIH) y antgeno de superficie del virus de la
hepatitis B (Ag HBS).
Introduccin
Virus de inmunodeficiencia humana (HIV por sus siglas en ingls)
Es un retrovirus, identificado en 1983 como el agente etiolgico del Sndrome de
Inmunodeficiencia Adquirida (SIDA). Aunque se trata de un sndrome, es decir, un conjunto de
signos y sntomas y no de una sola enfermedad, por ser valido y ms sencillo de aqu en adelante
nos referimos al SIDA como enfermedad. No existe vacuna contra el virus, por lo que una vez
que se desarrolla, casi inexorablemente lleva a la muerte en un tiempo muy corto.
En nuestro pas, el informe, descripcin y anlisis de esta singular enfermedad, ha sido
objeto de mltiples actividades acadmicas, clnicas, e incluso culturales. A partir de abril de
1987, el SIDA se convirti en una enfermedad sujeta a vigilancia epidemiolgica; la notificacin
de los casos tiene carcter de obligatoria e inmediata.
Hasta ahora se conocen dos variables genticas del virus, en funcin del antgeno de
superficie que los clasifica en VIH-1 y VIH-2. Para el VIH-1 la glicoprotena externa es la gp120
y la de transmembrana es la gp41; para el VIH-2 la gp externa es la 140 y la de transmembrana es
la gp36.
Desde que se reconocieron los primeros casos de SIDA, una de las primeras lneas de
investigacin ha sido lo referente a la transmisin del virus; conocindose hasta el momento las
siguientes vas:
1. Sexual: homosexual, heterosexual.
2. Sangunea: transfusin de sangre y/o hemoderivados.
3. Perinatal: durante el embarazo, en el parto, despus del parto (leche materna).

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Para el diagnostico de VIH se cuenta con:
Mtodos directos (determinan estructuras de los virus), como:
Aislamiento del virus en cultivos celulares
Deteccin de antgenos virales con anticuerpos monoclonales
Reaccin en cadena de la polimerasa
Hibridizacin con sonda de DNA marcadas
Mtodos indirectos (donde se valoran anticuerpos contra el virus), como:
Pruebas de Inmunoenzayo enzimatico (ELISA)
Aglutinacin pasiva con partculas de ltex
Inmunoelectrotransferencia (Western-Blot)

Hepatitis viral.
Es una enfermedad generalizada que afecta principalmente al hgado. Es causada por los
siguientes agentes:
1. Virus de la Hepatitis A (agente causal de la hepatitis infecciosa)
2. Virus de la Hepatitis B (asociado a la hepatitis srica)
3. Virus de la Hepatitis C (causa de muchos casos de hepatitis postranfucional)
4. Virus de la Hepatitis D requiere de la presencia de del VHB. Asimismo, se ha identificado el
agente causal de otra de las formadas de la antes llamada hepatitis no A-no B
5. Virus de la Hepatitis E
Otros virus que tambien pueden ser agentes causales de la hepatitis se encuentran: virus
Epstein Bar, rubola, citomegalovirus, coxsakie, varicela zoster entre otros.
El virus de la Hepatitis B pertenece al grupo hepadnavirus y su transmisin es va parenteral
(sangre y derivados, fomites contaminados por el virus). Al virus se le conoce como partcula
DANE, presente diversos antigenos que estimulas anticuerpos, lo cual se utiliza en el diagnostico
de la enfermedad, este puede detectarse de manera completa (virin completo) o en partes del
mismo, la cubierta protenica determina el antgeno de superficie de la hepatitis B (HBsAg) y la
partcula interna antgeno core (o central) de la hepatitis B (HBcAg). Resiste la temperatura a
37C por 1 h, 60C por 10 h, 25C por una semana, 100C 1 min y 20C por 5 aos. El
hipoclorito de sodio al 0.5 % lo inactiva en 3 min.
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La infeccin tiene un periodo de incubacin de 60 a 180 das; su comienzo es insidioso, con
poca o ninguna fiebre. Pudiendo presentarse a cualquier edad.

Objetivo
1. El alumno aprender el manejo de la tcnica de Ensayo inmunoenzimtico de fase slida
(EIA), empleado para el diagnostico de HIV y Antgeno de superficie de Hepatitis B (HBsAg).

Material y reactivos:
Equipo Inmuno Comb HIV 1+2 PBS-Orgenics
Equipo Inmuno Comb II para AgHBs
Micropipetas con puntillas para 25, 50 y 100 L
Tijeras
Perforador
Reloj
Papel desechable
Sueros problema
Sueros control positivo y negativo
Solucin de hipoclorito de Sodio

Metodologa
o Realizar un plan de distribucin que identifique plenamente la localizacin de los sueros
problema, control positivo y negativo tanto para HIV y HBsAg
o Deposito de muestra. Compartimiento A.
Para HIV deposite por separado 50 L de los sueros problema, control positivo y negativo
dentro de cada pozo del compartimiento A perforando la cubierta de papel aluminio y
descargando la muestra en el fondo del pozo. Mezcle los sueros con el diluyente
contenido en el compartimiento A mediante carga y descarga de la solucin con la pipeta
en varias ocasiones. Utilice una puntilla por cada muestra y deschela
Para Hepatitis B, deposite 75 L de los sueros ( problema, control positivo y negativo)
dentro de cada pozo del compartimiento A y continue el procedimiento antes mencionado.

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Desarrollo de la prueba
o Reaccin antgeno-anticuerpo.
Inserte el peine dentro de los pozos del compartimiento A con la cara impresa apuntando
hacia usted. Reinserte el peine varias veces para mover las burbujas de aire. Incube
durante 10 min a temperatura ambiente en el caso de HIV y para HBsAg se incubar 30
min a 37C
Al final de la incubacin extraiga el peine del compartimiento y seque el lquido
sobrenadante tocando con la orilla del peine el papel desechable y perfore con las pinzas
el papel que cubre los pozos del siguiente compartimiento.
NOTA: Este ltimo procedimiento se repetir siempre antes de pasar de un
compartimiento a otro.
Lavado. Compartimiento B
Inserte el peine en el compartimiento B, para lograr un lavado adecuado mueva el peine
hacia atrs y adelante durante un periodo 2 min.
o Conjugado. Compartimiento C.
Inserte el peine en el compartimiento C. Reinserte el peine varias veces. Para HIV Incube
durante 10 min a temperatura ambiente; para HBsAg incubar por 20 min a 37C
Para el caso de HIV se continua de la siguiente manera:
o Lavado. Compartimiento D.
Realice el mismo procedimiento que para el compartimiento B.
o Lavado. Compartimiento E.
Realice el mismo procedimiento que para el compartimiento B.
o Reaccin de color. Compartimiento F
Inserte el peine dentro del compartimiento F; Reinserte el peine varias veces durante 10
min. a temperatura ambiente.
o Deteccin de la reaccin. Compartimiento E.
Vuelva a insertar el peine en el compartimiento E, despus de 1 min. retire el peine y
squelo al aire completamente.

Para HBsAg del compartimiento D en adelante se procede de la manera siguiente :
Reaccin con fosfatasa alcalina. Compartimiento D.
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Inserte el peine en el compartimiento D. Reinserte el peine varias veces para remover las
burbujas de aire. Incube durante 20 min a 37C.
Lavado. Compartimiento E.
Inserte el peine en el compartimiento E y agite vigorosamente por 2 min, moviendo el
peine hacia atrs y adelante.
Reaccin de color. Compartimiento F.
Inserte el peine en el compartimiento F. Reinserte varias veces igual que en A, e incube
durante 10 min a 37C.
Deteccin de la reaccin. Compartimiento E
Vuelva a insertar el peine en el compartimiento E. Despus de un minuto retire el peine y
squelo al aire completamente.

Cuestionario
1. Cul es el fundamento de la prueba de ELISA
2. Cundo se dice que el paciente es seropositivo a VIH?
3. Cul es la diferencia entre un paciente seropositivo y uno con SIDA?
4. Cmo se puede prevenir el SIDA?
5. Cmo se trata la enfermedad del VIH?
6. Cul es la diferencia entre los tipos de hepatitis?
7. Cules son las formas de transmisin de los diferentes tipos de hepatitis y cules seran los
mecanismos de prevencin?
8. Describa otros mtodos para diagnosticar hepatitis, diferente a la hepatitis B.

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Prctica No. 12
Replicacin de bacterifagos lticos en Escherichia coli

Introduccin
Las bacterias son huspedes de un grupo particular de virus denominados bacterifagos o
simplemente fagos. Los fagos constituyen modelos ideales para estudios sobre la infeccin a
nivel celular, la relacin husped parsito, la multiplicacin viral y estudios de ingeniera
gentica. Por otro lado, tambin son muy tiles en la tipificacin de cepas bacterianas.
En los bacterifagos lisognicos, tambin denominados temperados, el genoma del fago
se replica sincrnicamente con el genforo bacteriano, pasando a la progenie cada vez que la
bacteria se divide por fisin binaria. En este estado lisgenico, los fagos integrados al genforo
bacteriano adquieren genes de la bacteria durante su separacin. Estos genes permiten a la
bacteria lisgenica expresar nuevas actividades y producir diferentes protenas.
El genoma del fago lisgenico puede modificar la estructura del polisacrido bacteriano y
su antigenicidad, as como codificar para la produccin de toxinas bacterianas que causan
enfermedades tales como difteria, clera, botulismo y sndrome urmico hemoltico.
Por otra parte, los bacterifagos lticos o virulentos se replican dentro de la bacteria
husped y causan su muerte por lisis, liberando nuevos fagos. Los fagos lticos ms
extensamente estudiados son los de Escherichia coli, mismos que se designan con la letra T y
diferentes nmeros (bacterifagos de la serie T). Los fagos virulentos al destruir a las bacterias
producen placas de lisis o calvas que se tornan evidentes en cultivos sobre placas de agar.

Objetivo
El alumno aprender a cultivar bacterifagos en el laboratorio y conocer su importancia en la
Microbiologa.


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Material y equipo
Incubadora bacteriolgica
Centrifuga
Tubos para centrifuga
2 filtros de nitrocelulosa de 0.45m de espesor (adaptable a jeringa)
1 jeringa de 20 a 40 mL
Hisopos estriles o varilla de vidrio.
1 asa bacteriolgica
Mecheros
2 tubo de 5mL de caldo nutritivo o soya tripticasena
Cepa aislada de Escherichia coli
2 frascos o tubos estriles de al menos 5mL
1 pipeta pasteur o 1 micropipeta.
Placas de agar nutritivo o STC (Soya Tripticasena)
1 muestra de aguas residuales o estancadas (aguas negras)
Alcohol etlico al 70%
Sanitas y/o algodn
1 maskingtape o diurex
1 marcador permanente de punto fino

Desarrollo
a. Tomar una colonia de la cepa de E. coli y sembrarla en un tubo con caldo nutritivo o soya
tripticasena e incubar a 37C por 24 h en agitacin a 200 rpm (un da antes de la
prctica).
b. En un frasco limpio colectar aproximadamente 10 mL de agua residual o estancada.
Tomar 5mL de esta agua y centrifugar a 3000 rpm durante 10 min y colectar el
sobrenadante con una jeringa estril. Adaptar el filtro de nitrocelulosa de 0.45m a la
jeringa y colectar el eludo en un tubo o frasco estril en el cual se contendr la muestra
presuntiva de fagos (cuidando de no romper el filtro con la presin que se ejerce con el
mbolo de la jeringa).
52
c. En condiciones de esterilidad, tomar una alcuota del cultivo en caldo de E. coli
(aproximadamente 100L) y colocarlo en la placa con agar nutritivo. Extender la alcuota
sobre el agar mediante la tcnica de arrastre con varilla de vidrio (extensin en
superficie), o si se prefiere sustituir sta tcnica mediante el uso de hisopos estriles para
hacer un sembrado masivo hasta que se absorba el cultivo.
d. Una vez absorbida la alcuota en el agar, se hace un goteo del filtrado con una pipeta
Pasteur o una micropipeta sobre la superficie del agar y nuevamente se deja secar.
e. Voltear la placa y una vez rotulada, dejar incubar 37C durante 24 48h.
f. Leer las placas a contra luz para observar las placas de lisis (unidades formadoras de
placa, UFP).

Nota: En muchos casos es recomendable hacer una previa propagacin de los fagos,
como a continuacin se describe:
Para la propagacin de los fagos se requiere un caldo nutritivo o soya de tripticasena
previamente crecido de E. coli a 37C por 24 h en agitacin a 200 rpm.
A este caldo colocarle un volumen igual (1:1) del filtrado del agua residual descrita
anteriormente y dejarlo incubar por 24 o 48 h ms a 37C, sin agitacin.
Pasado el tiempo de incubacin centrifugar el cultivo a 3000 rpm 10 min. Y recuperar el
sobrenadante con una jeringa estril y posteriormente adaptar el filtro de nitrocelulosa de 0.45m
y colectar el eluido en un tubo o frasco estril en el cual se contendr la muestra concentrada de
fagos.
La muestra es viable aproximadamente por 3 meses si se mantiene en refrigeracin (aunque
pueden llegar a formarse cristales).

Observacin
En las placas se deben observar zonas translcidas (llamadas calvas de lisis) como se muestra en
la siguiente figura:
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Fig. 7. Placas de replicacin de bacterifagos lticos. Placa de la izquierda: ausencia de calvas.
Placa de la derecha: presencia de calvas de lisis.

Resultados e interpretacin
La presencia de calvas de lisis indica la actividad replicativa del bacterifago con la consecuente
muerte del modelo bacteriano usado. As mismo, su ausencia indica que no hay actividad de
bacterifagos lticos.
Cuestionario
1. Anote usted un ejemplo de bacterifago temperado.
2. En qu mecanismo de recombinacin gentica entre bacterias se involucra la participacin
de bacterifagos?
3. Realice un esquema en donde se representen los principales componentes estructurales de los
bacterifagos de la serie T.
4. Investigar por qu ciertas cepas de E. coli son capaces de producir colitis hemorrgica?
5. Escriba otros ejemplos de gneros bacterianos susceptibles a bacterifagos e indique el
nombre del bacterifago.

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Prctica No.13
Seminario de pruebas moleculares para el anlisis. PCR y sus variantes;
retrotranscripcin, mltiple, anidada, tiempo real, RFLP, Southern-Blot,
Northern-Blot.

Introduccin.
La incorporacin de tcnicas antes reservadas a la investigacin bsica es, probablemente,
una de las caractersticas ms sobresalientes en la medicina actual. Una de ellas es la reaccin en
cadena de la polimerasa (PCR), que permite copiar de forma exponencial una zona concreta de
un genoma y que de todas las tcnicas disponibles para la amplificacin de cidos nucleicos es la
ms utilizada.
La amplificacin de cidos nucleicos mediante la reaccin en cadena de la polimerasa
(PCR), es otra tcnica alternativa a los cultivos. Primero se realiza la amplificacin de los
fragmentos de ADN a hibridar, con la reaccin en cadena de la polimerasa que aumenta
notablemente la sensibilidad de las tcnicas de deteccin de ADN.
La Reaccin en Cadena de la Polimerasa (PCR) permite obtener ms de 10 millones de
copias de una cadena de ADN de inters a partir de pocas molculas de sta. La sensibilidad de
esta tcnica requiere de cuidados para que la muestra no est contaminada previamente con otras
cadenas de ADN que pudieran generar amplificados.
Existen numerosas tcnicas que emplean la PCR (RAPD, RFLP, RTPCR) con diferentes
aplicaciones en campos de diagnstico, criminologa, e investigacin.
La PCR fue desarrollada por Kary Mullis para aumentar el nmero de molculas de ADN
blanco en las muestras. Tiene una sensibilidad tan alta que puede amplificar una nica molcula
de ADN y una sola copia de genes puede ser extrada de mezclas complejas de secuencias
genmicas y visualizada como bandas diferentes en geles de agarosa. El proceso se lleva a cabo
de forma cclica en un termociclador. Esta tcnica consiste, en una amplificacin de secuencias
especficas del ADN. Se basa en el uso de secuencias cortas de nucletidos sintticos llamados

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primers o cebadores, que se hibridan especficamente con cada una de las cadenas de ADN
previamente desnaturalizadas, llamadas moldes o templados. Para que la reaccin se produzca se
usa una enzima llamada Taq pol (ADN polimerasa termoestable obtenida de la bacteria Thermus
aquaticus) y desoxinucletidos trifosfatos. La funcin natural de la ADN polimerasa consiste en
reparar y replicar el ADN. Los desoxinucletidos trifosfatos se necesitan como ladrillos para la
construccin. El nucletido al cual se une la polimerasa ser complementario al de la base en la
posicin correspondiente de la cadena templado. Se sintetiza as una cadena simple de ADN,
complementaria y alineada a cada cebador.
Se realiza una serie repetida de ciclos, cada uno compuesto por tres pasos bsicos:
desnaturalizacin a altas temperaturas (95C) del ADN de doble cadena; alineamiento de los
cebadores, la temperatura se desciende a 55 72C y elongacin del cebador, aqu se eleva la
temperatura a 72C permitiendo la incorporacin de los desoxinucletidos. Mientras tanto se van
seleccionando los cebadores y los desoxinucletidos y se van sintetizando nuevas cadenas de
ADN. Al final se consiguen miles de copias de ADN del fragmento de ADN limitado por los
cebadores. Los fragmentos de ADN obtenidos se pueden identificar por varias tcnicas:
visualizacin en geles de agarosa o poliacrilamida con tincin con bromuro de etidio y examen
con luz ultravioleta o hibridacin con una sonda marcada. La combinacin de la PCR y las
sondas de cidos nucleicos marcadas promete ser el mtodo ms sensible para la deteccin e
identificacin de los virus.
Variantes de la reaccin en cadena de la polimerasa
Desde 1983, cuando se llev a cabo por vez primera la reaccin en cadena de la
polimerasa, hasta hoy se han desarrollado diversas variantes de dicha tcnica para aumentar el
potencial de sta. En la PCR multiplex se coamplifican en un mismo ensayo distintas zonas del
ADN diana o distintos ADN diana con los mismos o con distintos cebadores, de tal manera que
se obtienen varios productos de la reaccin. En la PCR nested (PCR anidada) se lleva a cabo una
amplificacin doble debido a que se utiliza como ADN molde de una segunda PCR el producto
de una PCR inicial, en la que se ha amplificado una secuencia dada. Esto aumenta la sensibilidad
y la especificidad de la PCR, pero su principal problema es la fcil contaminacin de la muestra
en el proceso. Finalmente, en la PCR reversa el cido nucleico diana es un molde de ARN del
que por medio de una transcriptasa reversa se sintetiza una copia de ADN complementario que se
amplifica mediante una PCR estndar, esta reaccin se conoce comnmente como RT-PCR
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(Retrotranscripcin acoplada PCR). Adems de amplificar el cido nucleico de diversos
retrovirus, como el virus de la inmunodeficiencia humana o el virus de la hepatitis C, permite
tambin distinguir una infeccin activa de una latente debido a que se amplifica una copia en
ADN de un ARN mensajero, responsable de la expresin activa de protenas por parte de un
patgeno.
Frente a las limitaciones que presentan mtodos diagnsticos convencionales como el
cultivo, la serologa o el estudio histopatolgico de las muestras, la amplificacin de cidos
nucleicos por medio de la PCR aporta grandes ventajas, como son una gran sensibilidad
diagnstica, as como una elevada especificidad. Asimismo, uno de sus puntos fuertes es la
rapidez diagnstica, dado que permite obtener en minutos u horas lo que antes precisaba das e
incluso semanas. No obstante, no est exenta de inconvenientes que no conviene olvidar a la
hora de interpretar los resultados.
Uno de ellos es su elevada sensibilidad, que es tambin su mayor debilidad, dado que al
igual que amplifica exponencialmente el genoma diana tambin lo hace con cualquier genoma
producto de una contaminacin de la muestra. Adems, dada su capacidad para amplificar
cantidades insignificantes de cidos nucleicos, no siempre es posible distinguir un resultado
clnicamente significativo de aquel que no lo es, y tampoco distingue aquellos casos de infeccin
activa de una latente. Por ello, previo a la interpretacin de la PCR, es preciso establecer la cifra
a partir de la cual un resultado es relevante desde el punto de vista prctico.
Por otro lado, cierto tipo de muestras como orina, medios de hemocultivo, secreciones
vaginales, etc., contienen diversas sustancias que degradan la polimerasa con lo que inhiben la
PCR, dando lugar a falsos negativos. Otro inconveniente de la PCR es su alto costo, no slo a
causa de la tcnica en s y del carsimo equipamiento que exige, sino tambin debido a la
necesidad de una gran disponibilidad de espacio en el laboratorio, porque para prevenir la
contaminacin de la muestra es preciso que las distintas fases del proceso tengan lugar en lugares
fsicamente separados entre s.
Actualmente hay disponible un amplio nmero de protocolos de PCR para la
identificacin de diversos patgenos, pero slo parte de ellos estn disponibles comercialmente
como la PCR frente a virus del grupo herpes, papovavirus, flavivirus y retrovirus.
La PCR ha ayudado a establecer el pronstico de distintas infecciones por medio de la
determinacin cuali/cuantitativa del virus de la hepatitis C o por medio de la determinacin de la
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viremia plasmtica en la infeccin por el virus de la inmunodeficiencia humana, en la que est
reconocida la importancia de la determinacin de la carga vrica en sangre en el pronstico de la
infeccin y tambin en la evaluacin del tratamiento.
Para elegir un mtodo de diagnstico, adems de la sensibilidad y la especificidad, hay
que considerar aspectos operativos de las tcnicas a usar tales como el costo, la complejidad
tcnica del ensayo, el volumen necesario y preparacin de la muestra, el tiempo que requiere el
proceso y la disponibilidad comercial de los reactivos de calidad reconocida. Adems, se debe
considerar el nivel de complejidad del laboratorio y la disponibilidad tecnolgica y de recursos
que requiere cada tcnica.
RFLP (Polimorfismo en la longitud de los fragmentos de restriccin)
Esta tcnica permite diferenciar distintos microorganismos mediante el anlisis de
patrones de bandas, derivados de la rotura de su respectivo DNA, fue una de las primeras tcnicas
que se us ampliamente para detectar variaciones a nivel de la secuencia del ADN. Esta
tecnologa se basa en el principio de que es posible comparar patrones de bandas generados a
partir de molculas de ADN de diferentes virus que han sido sometidas a digestin con enzimas
de restriccin. Las diversas mutaciones que afectan a las molculas de ADN de muchas maneras
producen fragmentos de longitud variable. Estas diferencias de longitud de los fragmentos
pueden observarse una vez realizadas la electroforesis, la hibridacin y la visualizacin.
El aislamiento del ADN es el primer paso en las tecnologas moleculares. El ADN extrado es
digerido con enzimas de restriccin especficos, cuidadosamente elegidos. Cada enzima de
restriccin, en condiciones apropiadas, reconocer el ADN y lo cortar de manera predecible,
dando lugar a un conjunto reproducible de fragmentos de ADN (fragmentos de restriccin') de
diferentes longitudes.
Las enzimas de restriccin son endonucleasas que reconocen una secuencia de ADN entre 4-8
bp. El sitio de reconocimiento se llama sitio de restriccin, y la enzima rompe un enlace
fosfodiester en la hebra de arriba (sentido) y otro enlace fosfodiester en la hebra complementaria
(antisentido). Las endonucleasas de restriccin se denominan con tres o cuatro letras que
proceden del nombre de la bacteria en la que se han aislado (p. ej., la enzima Eco procede de
Escherichia coli) y adems se le aade un nmero romano (Eco RI, Eco RII), debido a que se
pueden encontrar varias enzimas de restriccin diferentes, que reconocen distintas secuencias
nucleotdicas en la misma bacteria.
58
Existen diferentes tipos de enzimas de restriccin, para los ensayos de tipificacin
gentica se emplean las de Tipo II, puesto que permiten romper el ADN en sitios especficos. Se
han identificado ms de 2300 endonucleasas de restriccin de tipo II. Se denominan
Isoschizomeros a aquellas enzimas que han sido obtenidas de diferentes especies de bacterias,
pero que reconocen la misma secuencia de DNA.
Los millones de fragmentos de restriccin as obtenidos son separados comnmente mediante
electroforesis en geles de agarosa. Dado que los fragmentos se veran como un rastro continuo si
el gel se tiera con bromuro de etidio, la sola tincin no puede detectar los polimorfismos. Por
consiguiente, debe recurrirse a tcnicas de hibridacin como Southern-blot o Northern-Blot para
detectar fragmentos especficos.
Southern-blot
La transferencia del ADN se realiza por el mtodo Southern, nombre tomado de E.M.
Southern (1975), quin invent la tcnica. En este mtodo, primero se desnaturaliza el gel en una
solucin bsica y se pone en una bandeja. Se coloca sobre el gel una membrana porosa de nylon o
de nitrocelulosa y al conjunto se le superpone un peso. Todos los fragmentos de restriccin de
ADN que estaban en el gel se transfieren, como cadenas simples a la membrana por accin
capilar. Todos los fragmentos conservan en la membrana el mismo patrn que tenan en el gel.
La membrana con el ADN patrn se incuba con la sonda de ADN. Las condiciones de
incubacin son tales que si las cadenas de ADN de la membrana son complementarias a las de la
sonda, se dar la hibridacin y se formarn duplos marcados. En condiciones muy rigurosas, no
ocurrir la hibridacin con un ADN que no sea homlogo o no emparentado. De este modo, la
sonda reconoce las secuencias complementarias e idealmente homlogas entre los miles o
millones de fragmentos no detectados que migran a travs del gel.
Los fragmentos deseados se pueden detectar despus de que haya una exposicin simultnea
de la membrana hibridada y una pelcula fotogrfica.
Para detectar el subconjunto de fragmentos de ADN que interesan, de entre todos los
fragmentos generados por la digestin con restriccin, se necesita una sonda, que es una molcula
de cadena simple, se marca convenientemente usando cualquier mtodo estndar (por ejemplo un
radioistopo o digoxigenina), y se hibrida con el ADN patrn que est adherido a la membrana.
Northern blot
El northern blot es el mtodo ms usado para el estudio de la expresin gnica. Para
59
realizar un northern blot, una vez extrado el RNA, debe ser fraccionado en funcin de sus
tamaos en gel desnaturalizante de agarosa, transferido a un filtro de nitrocelulosa y sondado.
El gel de agarosa/formaldehdo es un sistema sencillo de electroforesis desnaturalizante
que permite, con buena resolucin, la separacin por tamaos del RNA de cadena simple. Para
proteger las muestras de las RNAsas debemos mantener el material para su realizacin en agua
con DEPC al 1 % durante unas horas; esto incluye el aparato de electroforesis horizontal, peines
y material auxiliar.
Se cargan entre 5 y 20 g de RNA por pocillo, a los que previamente se les ha aadido el
tampn de carga con formamida, formaldehdo, bromuro de etidio, colorante para seguir la
electroforesis y glicerol o sacarosa que aumente la viscosidad de la muestra y evite su difusin en
el tampn de electroforesis. Antes de cargar la muestra debe ser calentada (hervida un minuto,
por ejemplo) para separar las distintas hebras de RNA que aleatoriamente pudieran haber
hibridado parcialmente entre s. El gel se corre a bajo voltaje (unos 40-50 voltios) durante las
horas que sea necesario y que, obviamente, dependen del tamao del gel. Un procedimiento
alternativo usa concentraciones ms bajas de formaldehdo y la electroforesis se lleva a cabo en
menos de 2 h.
Una vez obtenido el gel, se enjuaga, para eliminar el formaldehdo, y a continuacin se
realiza la transferencia en condiciones de humedad y se lleva a cabo por capilaridad.
Posteriormente se incuba con la sonda marcada radiactivamente por cualquiera de los mtodos
conocidos no habiendo diferencias esenciales entre los procedimientos de hibridacin de
Northern y Southern.
Con el northern blot podemos saber si un gen se expresa o no, cuntos mensajes tiene
(especies de mRNA), qu tamao tiene cada especie y con qu intensidad se expresa (abundancia
de mRNA).

60

Prctica No. 14
Taller demostrativo para el diagnstico molecular de virus: PCR,
electroforesis, restriccin enzimtica

Introduccin
La dependencia que los virus tienen de una clula para su replicacin dificulta su manejo
en las condiciones de cultivo que convencionalmente se emplean en el caso de otros agentes de
importancia infecciosa como bacterias, parsitos y hongos. Las tcnicas moleculares ofrecen una
alternativa til que se han aplicado para el anlisis viral en diferentes reas como la
epidemiolgica, de investigacin, taxonmica, desarrollo de vacunas, diagnstico clnico, slo
por mencionar algunas.
Podemos encontrar una amplia gama de tcnicas, y los avances tecnolgicos hacen que la
lista de opciones crezca velozmente cada da. Para incursionar en este terreno, vale la pena
conocer algunas de las tcnicas que iniciaron el despliegue que la biotecnologa ha alcanzado en
la actualidad. El taller considera tres tcnicas, Reaccin en Cadena de la Polimerasa (PCR por
sus siglas en ingls) de punto final, Electroforesis en gel de agarosa (EGA) y Restriccin
enzimtica.
PCR de punto final
La PCR simula algunas de las condiciones que ocurren en la replicacin natural del
DNA. El principio se basa en la amplificacin enzimtica de fragmentos de DNA limitados por
dos secuencias iniciadoras de oligonucletidos o primers que por complementacin, hibridizan
con hebras opuestas de la secuencia blanco. La PCR se constituye de varios ciclos, cada ciclo se
forma de tres etapas; inicialmente una desnaturalizacin trmica del DNA original, seguida de
un alineamiento de los iniciadores que encuentran su secuencia blanco por complementariedad
entre bases nitrogenadas y finalmente la extensin, que se da por la accin de una DNA
polimerasa termoestable que incorpora bases nitrogenadas complementarias a la hebra en la que
se ha alineado el iniciador a partir del extremo 3 de ste. El ciclo se debe repetir en forma

61
continua durante unas 30 ocasiones, para amplificar un segmento de DNA con un tamao
definido por la distancia entre los extremos 5 de las secuencias iniciadoras. El funcionamiento
de la enzima depende de Mg
+2
como cofactor y requiere de un ambiente amortiguador de pH. El
producto generado se denomina amplicn, en la PCR de punto final el amplicn se observa
mediante la electroforesis en gel de agarosa y se compara contra un patrn de bandas de ADN de
tamao conocido.
Restriccin enzimtica
Uno de los avances ms importante en los inicios de la biologa molecular, fue el descubrimiento
de las endonucleasas de restriccin, es decir de enzimas que pueden cortar el ADN y que tienen
la ventaja de que lo cortan en sitios concretos. Fueron descubiertas en bacterias, y son enzimas
que estas bacterias usan para destruir ADN que ingresa a ellas, por ejemplo ADN de virus
bacterifagos (fago lambda), DNA plasmdico y genmico. Con las enzimas, la bacteria puede
degradar este ADN forneo sin degradar su propio ADN.
La ventaja de estas enzimas es que reconocen secuencias de DNA cortos, especficos y a
menudo palindromicos, un sitio para cortar, puede ser de 4, 6 u 8 pares de bases, pero tienen que
estar organizadas con una secuencia exacta y no otra. Por ejemplo, la enzima que se llama EcoR1
(porque se aisl de la bacteria Escherichia coli, que reside normalmente en el intestino), solo
corta si encuentra la secuencia GAATTC. Si hay una base que est cambiada ya no corta.
Estas enzimas de restriccin, entonces permiten cortar el ADN en sitios especficos.
Algunas de ellas cortan dejando extremos cohesivos que se pueden pegar nada ms por
complementariedad de bases. Esto quiere decir que un extremo que gener una enzima y otro que
gener la misma enzima aunque provengan de molculas de ADN diferentes, se pueden unir y
generar lo que se llam inicialmente un ADN recombinante. Este hito de los aos 70 de poder
recombinar, es decir hacer construcciones genticas, hacer ingeniera en gentica fue la base de
una enormidad de otros avances.
Cada enzima de restriccin tiene requerimientos especficos para su actividad ptima.
Condiciones tales como temperatura, pH, cofactores enzimticos, composicin de sales y fuerza
ioniza afectan la estabilidad y actividad de la enzima
Electroforesis en gel de agarosa (EGA).
La electroforesis es una tcnica de separacin de macromolculas (protenas o cidos
nuclecos: ADN y ARN) la cual utiliza una un campo elctrico para separar las molculas
62
cargadas elctricamente. La velocidad de separacin de una molcula dada depende tanto de la
carga como de su tamao. La electroforesis puede llevarse a cabo utilizando una amplia variedad
de medios de soportes porosos, tales como papel, acetato de celulosa, almidn, poliacrilamida o
agarosa (un polisacrido obtenido de las algas marinas). De todos estos medios, los geles de
poliacrilamida y los de agarosa son los ms utilizados debido a que proporcionan mejor
resolucin y son empleados habitualmente en las electroforesis para la separacin de cidos
nucleicos.
La electroforesis de cidos nucleicos es mucho ms simple que la separacin de
protenas debido a que estas molculas (ADN o/y ARN) estn cargadas negativamente debido a
los grupos fosfatos que conforman su estructura. Los fragmentos ms pequeos normalmente se
separan en geles de poliacrilamida, mientras que los fragmentos ms grandes se separan en geles
ms porosos como los de agarosa.
Las muestras a separar son colocadas en un extremo del gel de agarosa en compartimentos
separados llamados pocillos. El gel debe estar sumergido en una solucin buffer contenida en
una cmara de electroforesis. Los buffers permiten que se conduzca la corriente elctrica
emitida por la cmara al mismo tiempo que ayudan a mantener la integridad de los cidos
nucleicos (los buffers ms utilizados con este fin son TAE (TRIS base + cido Actico Glacial
+ EDTA) y TBE (TRIS base + cido Brico + EDTA)). Posteriormente, y con el nodo situado
en el extremo opuesto de donde se encuentras las muestras, se aplica el potencial elctrico.
Debido a la carga negativa de los cidos nucleicos estos migraran hacia el nodo. Los fragmentos
ms pequeos (es decir aquellos con el peso molecular ms bajo) se movern en el gel con
relativa facilidad y por tanto migraran rpidamente, mientras que los fragmentos ms grande se
movern ms lentamente.
El resultado final son una serie de fragmentos de cidos nucleicos que se han separado
basndose en su diferencia de tamao. Los fragmentos separados se visualizan o se tien
sumergiendo el gel en un colorante llamado bromuro de etidio, que se une al cido nucleico y
fluorece en naranja cuando se expone a la luz ultravioleta revelando as un conjunto de
fragmentos fluorescentes llamados bandas.

63

Fig.8. Esquema representativo de la electroforesis en gel de agarosa EGA

Objetivo
Que el alumno conozca los requerimientos necesarios para realizar las tcnicas de PCR,
EGA y Restriccin enzimtica y que participe en el montaje de estas tcnicas en el laboratorio de
virologa.

Tcnica de PCR
Material
Tubos para Reaccin de PCR.
Puntillas estriles para micropipetas.
Micropipetas de volmenes variables.
Bao de hielo.
Gradilla para tubos de PCR.
Guantes de ltex.
Microcentrfuga.
Termociclador.
Cmara de electroforesis horizontal.
64
Transiluminador.
Marcadores de pares de bases.
Buffer de corrida.
Buffer de muestra.
Agarosa al 1% con bromuro de etidio.
MgCl
2
50 Mm.
Buffer para PCR 10X.
dNTPs.
Iniciadores (primers).
ADN plantilla.
Enzima Taq DNA polimerasa.
Agua inyectable.
Desarrollo
1. Limpiar con alcohol al 70% el rea de trabajo.
2. Colocarse los guantes de latex.
3. Marcar los tubos para PCR con un patrn que permita identificar las muestra problema y
controles.
4. Sacar los reactivos del congelador; mantenerlos en el bao de hielo durante todo el proceso.
5. Realizar la mezcla de reaccin de PCR por separado para cada prueba de acuerdo a al
siguiente tabla, teniendo cuidado de respetar el orden de colocacin de los reactivos. Se puede
guiar en el esquema para realizar una PCR individual.

Reactivo Volmen (l)
1. MgCl
2
50 Mm 0.5
2. Buffer Taq 10X 2.5
3. dNTPs 10 mM 0.5
4. Iniciador 1 (50 pmol/l) 0.4
5. Iniciador 2 (50 pmol/l) 0.4
6. Taq polimerasa 5U/l 0.2
65
7. ADN plantilla* 5.0
8. Agua inyectable 15.5

Volmen final 25.0
*El ADN plantilla es diferente para controles y muestra.
La prueba se puede agilizar, preparando una mezcla maestra que contenga todos los
reactivos, excepto el ADN plantilla, considerando una reaccin extra del nmero de reacciones a
realizar. Por ejemplo si se tienen dos controles y una muestra problema, se calcula el volmen
total de cada reactivo para cuatro reacciones. Basndose en la tabla anterior, la mezcla maestra se
preparara como sigue:

Reactivo Vol. (l)
Por
reaccin
Reacciones a
preparar
4
Vol. total (l)
1. MgCl
2
50 Mm 0.5 X 4 2.0
2. Buffer Taq 10X 2.5 X 4 10.0
3. dNTPs 10 mM 0.5 X 4 2.0
4. Iniciador 1 (50
pmol/L)
0.4 X 4 1.6
5. Iniciador 2 (50
pmol/L)
0.4 X 4 1.6
6. Taq polimerasa
5U/L
0.2 X 4 0.8
7. Agua inyectable 15.5 X 4 62.0

Vol. total/
Reaccin
20
Vol. total de la
mezcla
80
66

Esquema para la realizacin de una reaccin de PCR individual

Descongelar todos los reactivos, dar un spin en la microcentrfuga y
mantenerlos en bao de hielo
Mgcl2
Buffer Taq 10X
dNTPs
Iniciador 2
Iniciador 1
Taq Polimerasa
ADN plantilla
Agua inyectable
Mezclar en vortex, dar un spin en la microcentrfuga, colocar en el termociclador y aplicar el
programa para los productos deseados
67
De la mezcla maestra se toma el volumen por reaccin individual y se transfiere a cada
uno de los tubos para PCR. Para este caso sera un volumen de 20.0 l que contiene todos los
reactivos, excepto ADN plantilla. Posteriormente se prepara la mezcla de reaccin de PCR para
cada prueba:
Mezcla maestra 20.0 l
ADN 5.0 l

25.0 l

Esquema 2. Realizacin de PCR preparando una mezcla maestra

Calcular las cantidades de cada reactivo (excepto el ADN plantilla) en un volumen suficiente
para el nmero de reacciones a realizar, considerando una reaccin ms de las necesarias
Descongelar todos los reactivos, dar un spin en la microcentrfuga y
mantenerlos en bao de hielo

Pasar al vortex y dar un spin
de la mezcla maestra en la
microcentrfuga
Distribuir en cada tubo el
volumen de una reaccin
individual
Adicionar el ADN plantilla a cada tubo, mezclar en vortex, dar un spin en la microcentrfuga,
colocar en el termociclador y aplicar el programa para los productos deseados

68
Guardar los reactivos en congelacin una vez hecha la mezcla.
6. Tapar los tubos de reactivos perfectamente y dar un spin en la microcentrfuga.
7. Colocar los tubos de PCR en el termociclador en el programa necesario para obtener los
productos.
8. Correr 5 l de cada producto mediante EGA al 1% con bromuro de etidio en condiciones
de corrimiento adecuadas para el amplicn. Terminado el tiempo de corrida el gel se
coloca en el transiluminador y los productos de PCR se identifican por comparacin con
los marcadores de pares de bases.
Tcnica de Restriccin enzimtica
Material, reactivos y equipo
Tubos para Reaccin de 0.5 ml (eppendorf)
Bao de hielo.
Gradilla para tubos de 0.5 ml
Guantes de ltex.
Microcentrfuga.
Buffer 10X/enzimas de restriccin
ADN

Desarrollo
1. Limpiar con alcohol al 70% el rea de trabajo.
2. Colocarse los guantes de ltex.
3. Marcar los tubos con un patrn que permita identificar la muestra problema.
4. Sacar los reactivos del congelador; mantenerlos en el bao de hielo durante todo el
proceso.
5. Realizar la mezcla de reaccin por separado de acuerdo a la siguiente tabla, teniendo
cuidado de respetar el orden de colocacin de los reactivos.

69
Reactivo Volmen (l)
Agua esteril desionizada 16.3
Buffer 10X 2.0
BSA acetilada , 10 g/l 0.2
DNA, 1g/l 1.0
Mezclar perfectamente bien y
agregar:

Enzima de restriccin 0.5
_______
Volumen final 20.0

6. Mezclar suavemente por pipeteo, cerrar el tubo y centrifugar por pocos segundos en una
microcentrfuga
7. Incubar entre 1 a 4 h a 37C
8. Adicionar el buffer a una concentracin final 1X y proceder a un anlisis en gel de
agarosa de los fragmentos obtenidos.
Tcnica de EGA.
Material, reactivos y equipo
Cmara de electroforesis horizontal.
Transiluminador de luz UV.
Marcadores de peso molecular para cidos nucleicos.
Buffer de carga para la muestra.
Buffer de corrida TAE o TBE.
Agarosa
Bromuro de etidio.
Microondas o parilla de calentamiento.
Matraz Erlenmeyer de 100mL

70
Desarrollo
1. En un matraz Erlenmeyer pesar 0.3g de agarosa e hidratarla con 30 ml de buffer TAE o TBE
(esto para geles al 1%).
2. Disolver por calentamiento la agarosa hasta que esta quede traslucida (sin presencia de
ningn cristal).
3. Dejar enfriar unos minutos la agarosa (hasta que no haya emisin de vapores); agregar 1.2L
de bromuro de etidio y agitar para mezclar.
4. Verter en el soporte para geles colocando el peine a utilizar (este depende de la cantidad y
volumen de muestras a trabajar).
5. Dejar enfriar hasta gelificar.
6. Una vez gelificado retirar cuidadosamente el peine y colocar el gel (con todo y soporte) en la
cmara de electroforesis y agregar buffer de corrida (esto depender, entre otras cosas, del
buffer con que se haya hidratado el gel) hasta cubrir completamente el gel.
7. Con la ayuda de la micropipeta mezcle 1L de buffer de carga por cada 5L de muestra y
depostelos en un pocillo.
8. Repita la operacin con cada una de las muestras (teniendo cuidado de no colocar las
muestras en el mismo pocillo). Es recomendable colocar en un pocillo de los extremos
marcador de peso molecular (para ADN o ARN segn sea el caso) como referencia.
9. Cierre la cmara de electroforesis y conecte a la fuente de poder para que inicie el potencial
elctrico (el voltaje, el amperaje y el tiempo de corrida dependen del tipo de muestras que se
est analizando).
10. Transcurrido el tiempo de corrimiento elctrico retire el gel (cuidando de no romperlo) y
colquelo en el transiluminador para su visualizacin.
11. Analizar.

Observacin
Con la exposicin del gel a una fuente de luz ultravioleta lograran distinguirse bandas
de color naranja en los diferentes carriles del gel donde se haya depositado muestra, como se
muestra en la figura siguiente:
71

Fig. 9. Gel de agarosa expuesto a luz UV. Las bandas naranjas emitidas indican ADN o
ARN unido a bromuro de etidio.
Interpretacin y resultados
La visualizacin de bandas en el gen debe ser comparadas con el marcador de peso
molecular que convenga. La interpretacin est en funcin de la muestra a analizar.
Cuestionario
1. Definir una enzima de restriccin
2. Qu hace una enzima de restriccin?
3. A partir de cuales organismos se aslan enzimas de restriccin
4. Definir una unidad para las enzimas de restriccin
5. Qu significa Eco RI?
6. Qu ventaja y/o desventajas tiene usar buffer TAE sobre TBE?
7. Cmo se ve afectada la porosidad del gel por su concentracin?

72
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