Fundamentos Cromatografia Liquida HPLC

QUANTAR ; Laboratorio de Anlisis Qumico Especializado
1. Estudios Profesionales :
Profesional en Qumica Pura y Aplicada de la Universidad del Valle

2. Diplomados :
Ingeniera Farmacutica; Colegio Nacional de Qumicos Farmacuticos de Colombia
y Terra Farma, S.A. de C.V. Mxico. Santiago de Cali, 24 Diciembre de 2007.

Aseguramiento de la Calidad en Laboratorios de Pruebas y Ensayos (Buenas Prcticas
de Laboratorio (BPL) y Norma ISO 17025); Fundacin General de Apoyo a la
Universidad del Valle. Santiago de Cali, Diciembre 10 de 2008

3. Experiencia como profesional :
INSTITUTO DE INMUNOLOGA DE LA UNIVERSIDAD DEL VALLE
Qumico de Investigacin (1995 hasta Enero 1997)

Validacin de mtodos analticos por Cromatografa Lquida (HPLC), Sntesis y anlisis
de Pptidos; Estudios de investigacin : Implementacin de metodologa analtica para
determinacin de aminocidos libres en plasma sanguineo en estudio colaborativo para
evaluar efectos de dieta a base de proteinas de albmina y Caseina; Desarrollo de
metodologa por HPLC para estudio clnico colaborativo, para determinacin de nivel
de prostaglandinas en plasma humano en tratamiento para estudios de preeclampsia.
Carlos Humberto Lpez valencia
LABORATORIOS BAXTER S.A.
Analista Qumico Aseguramiento de Calidad Enero 1997 hasta Diciembre
2004
Coordinador de Validacin de Mtodos Analticos Enero 2004 hasta Enero-
2009.

Anlisis de materia prima y producto terminado por las tcnicas de : IR, NIR,
HPLC, CG, Absorcin Atmica, Fotometra de llama, UV-VIS, Potenciometra
Automtica; Implementacin programa 5Ss; auditoras internas y a
proveedores; desarrollo de estudios de estabilidad; investigacin y desarrollo
de nuevos productos; soporte tcnico y cientfico para la compaa en mbitos
internacionales; Qumico de validaciones (mas de 120 metodologas analticas
validadas); Coordinador de validacin de mtodos de anlisis; compra de
equipos para el laboratorio; Coordinador lder de proyectos para laboratorio
qumico. Implementacin del programa de validaciones, calificaciones y
mantenimientos del rea de laboratorio qumico. Implementacin de
herramienta de mejoramiento continuo Mantenimiento Productivo Total
(TPM) en laboratorio qumico.
QUANTAR S.A.S., Laboratorio de Anlisis Qumico Instrumental
Especializado
Gerente. Enero 2009 hasta la fecha

Socio Gestor y fundador de la empresa; Direccin general; elaboracin del
manual de calidad, definicin de polticas, misin y visin de la empresa;
Implementacin del sistema de calidad y del sistema documental del
laboratorio; elaboracin de planeacin estratgica; contratacin de personal;
negociaciones y alianzas estratgicas; elaboracin de proyectos para desarrollo
de nuevos productos y nuevos servicios (Proyecto : Cursos y capacitacin
continua QUANTAR Educativa.)
La Cromatografa Lquida de Alta Eficiencia es la tcnica con mayor mercado
en el mundo instrumental analtico gracias a su versatilidad, excelente
capacidad para el anlisis de trazas, rapidez y adaptabilidad.
Principales limitaciones del HPLC --> Falta de operadores experimentados.
Razones :

-Escaso entrenamiento en las universidades (costos de equipos y escasa
experiencia de la mayora de los profesores).

- Pocas personas interesadas en aprender cromatografa.

- Poca oportunidad practica de contacto con la tcnica.
La Cromatografa es un mtodo utilizado principalmente para separar los
componentes de una muestra, donde estos componentes se distribuyen
entre dos fases, una estacionaria y otra mvil.
Fase mvil
Fase
estacionaria
BOMBA
INYECTOR
CMARA DE
MEZCLA
PRE-COLUMNA
DETECTOR
COLUMNA
PC
Equipos
Integrados
Equipos
Modulares
1. Generalmente vidrio polmero
resistente. Transparente o mbar.

2. Ubicado siempre por encima de las
bombas.

3. Tapado apropiadamente para evitar el
ingreso de partculas.

4. Contiene el buzo que se utiliza como
filtro y como peso de la tubera
plstica.
Deben ser inertes y de acuerdo a su
ubicacin en el sistema, ser resistentes a
altas presiones. Los dimetros pueden
variar segn su ubicacin.
PEEK
Tefln
Acero 316
1. Deben ser inertes a fases
mviles y muestras.

2. Deben cerrar hermticamente.

3. No deben contribuir con
volmenes muertos.
La bomba impulsa la fase mvil desde el reservorio de solventes hacia el
inyector, desde ste hacia la columna y luego hacia el detector.
Tipos de Bombas :
Bomba de Desplazamiento Continuo (Bomba Jeringa)
- Flujo constante
- No genera pulsaciones
- Independiente de la viscosidad
- No permite elucin con gradiente
Bomba Reciprocante de Pistn nico
- Bomba de pistn.
- Problema de pulsaciones (amortiguar).
- Genera presiones sobre 10.000 PSI.
- Flujo constante, relativamente independientes de la viscosidad de la FM.
Pistones
Caractersticas :
Presin constante con pequeas variaciones de flujo y un mnimo de
pulsaciones.
Bomba Reciprocante de Doble Pistn
El inyector es el dispositivo que permite introducir la muestra en solucin al
sistema sin interrumpir el caudal del solvente.
Caractersticas importantes del inyector :
- Debe ser fcil de operar.
- Debe ser inerte al ataque qumico y soportar altas presiones.
- Debe ser muy preciso en cuanto a la cantidad de muestra introducida al
sistema.
- No debe provocar diluciones importantes de la solucin inyectada.
- En ocasiones especiales puede requerirse que opera a altas temperaturas ( Ej. :
anlisis de polietilenos por SEC ) para lo cual requiere componentes fabricados
en Titanio o PTFE.
Sistema de inyeccin
de muestra
El Detector es la parte del cromatgrafo que permite ver y ubicar en tiempo
y espacio la posicin de cada componente de la muestra a la salida de la
columna.
Caractersticas importantes del detector :
- Tener un amplio rango dinmico de respuesta . Rango de concentraciones en
la que un cambio en la concentracin produce un cambio en la seal.
- Poseer una respuesta lineal. La seal producida debe incrementar linealmente
al incrementar la concentracin.
- No contribuir al ensanchamiento de banda extracolumnar. Prdida de
eficiencia no adjudicable a la columna.
- Tener la sensibilidad apropiada. Habitualmente esta propiedad se contrapone
con la universalidad de deteccin.
- No afectarse por cambios de temperatura. Los cambios de temperatura no
deben modificar la seal emitida por los detectores (no as para el detector de
IR).
- Responder a todos los solutos. No siempre es posible en HPLC debido a las
relativas limitaciones para medir propiedades diferenciales entre un lquido
(fase mvil) y un slido (analito disuelto).
- Poseer una buena relacin seal / ruido.
- Tener una constante de tiempo baja. Velocidad con que el detector responde a
un cambio instantneo de la concentracin del analito
- No destruir la muestra. Propiedad que cumplen casi todos los detectores de
HPLC y que es muy importante cuando se desean recolectar los componentes
aislados.
Dectores Universales. Miden el cambio de alguna propiedad fsica que presenta
la fase mvil pura con respecto a la de la fase mvil con el analito.
Ej.: Dectector de Indice de Refraccin y el de Conductividad.
Clasificacin de los Detectores :
Dectores Selectivos. Miden una propiedad caracterstica del soluto.
Ej. : Dectector Ultravioleta-Visible (UV), de Fluorescencia, Electroqumico
El resultado del ensayo cromatogrfico genera una grfica a partir de la seal
que se denomina Cromatograma, de cuya interpretacin pueden
extraerse conclusiones cualitativas y cuantitivas.
El sistema de toma y procesamiento de datos comprende :
Registrador grfico. Que convierte la seal en un grfico del tipo X-Y
Integrador. Que permite procesar el grfico (cromatograma) para su
tratamiento matemtico y el clculo de concentraciones.
Computador. Que a travs de un software permite el registro, integracin,
manipulacin, generacin de reportes y almacenamiento de datos entre
otras caractersticas.
Interacciones Hidrofbicas, Puentes de hidrgeno, Interacciones dipolares y
electrostticas y entropa principalmente.
Fase Ligada
(C4, C8, C18, Phe, CN)
Partculas
Slica
Polimrica
Fase Estacionaria Fase Mvil (Eluente) Analito
Interacciones Hidrofbicas, Puentes de hidrgeno, Interacciones dipolares y
electrostticas y entropa principalmente.
Fase Estacionaria Fase Mvil (Eluente) Analito
Tiempo de retencin. Tiempo que
transcurre desde la inyeccin de la
muestra hasta que el soluto alcanza el
detector( tambin Ve, Te Tr)
Tiempo muerto. Tiempo necesario
para que una especie que no se
retiene en la fase estacionaria
alcance el detector (tambin Vm).
CROMATOGRAMA
Lnea base. Seal de la fase mvil
Ancho del pico en la base.
Medida del tiempo en
donde se inicia la salida de
la seal hasta donde
termina sta.
Longitud
de la
columna
Altura equivalente del plato (HEPT) H = L
N
Es el sitio de interaccin donde se consigue un equilibrio transitorio del
eluato entre la fase estacionaria y la fase mvil.
29
As10% =b/a
Ideal = 1
Aceptable = 0.8 a 1.3
10% Altura
k = Nmero de moles de soluto en la fase estacionaria
Nmero de moles de soluto en la fase mvil
La fase mvil cumple un papel fundamental en HPLC, ya que permite
modificar la selectividad de la separacin cromatogrfica. Esta es la
principal diferencia con respecto a la CG.
Un solvente apropiado para HPLC debe cumplir con algunos requisitos
entre los cuales cabe destacar :
1. Alto poder solubilizante de las muestras. Compatibilidad entre el
soluto, el diluente de la muestra y la fase mvil. Mientras sea posible la
fase mvil debe preferirse como el diluente de la muestra. Con este se
pretende prevenir :

- Precipitacin de la muestra o componentes de la misma.
- Aparicin de picos extraos en el cromatograma (frente de solvente o
impurezas retenidas en la columna)
2. Baja reactividad. No deben reaccionar con la muestra, la columna o los
componentes del equipo. Ej. solventes con alta reactividad :Olefinas,
nitrocompuestos, aldehidos, cetonas, cidos fuertes, bses fuertes.
Ejemplo : Solvente con c a 254nm no debe utilizarse a 230 nm pero si a
280nm.
-Solventes no adecuados para HPLC : Tolueno (c 285 nm) , acetona (c
330nm).
- Solventes adecuados para HPLC : Acetonitrilo (c 190 nm), Metanol (c
205 nm)
3. Compatibilidad con el detector utilizado. Transparencia a la longitud de
onda de corte del solvente.
4. Puntos de ebullicin. Se prefieren los solventes con puntos de ebullicin
intermedio.

- Bajo punto de ebullicin = Alta volatilidad y variacin de la fase mvil
durante el anlisis; generacin de burbujas e irregularidad del caudal.

- Alto punto de ebullicin = Alta viscosidad que incrementa la presin del
sistema. Recomendables en baja proporcin.
5. Viscosidad. Se relaciona con altas presiones del sistema. Disminucin de
la eficiencia debido a que se reduce el coeficiente de difusin de la
muestra.
6. Seguridad. En particular inflamabilidad y toxicidad.
7. Pureza. Importante para evitar modificaciones en la selectividad de la
fase mvil y la presencia de seales extraas.
8. Propiedades qumicas. Las propiedades qumicas de la fase mvil son las
que establecen el tipo y la fuerza de interaccin entre el solvente y la
muestra. Estas pueden definirse como :
Indice de polaridad. Resultante de
todas las propiedades qumicas y mide
cuantitativamente la fuerza de
interaccin de los solventes frente a
solutos polares.
Fuerzas dispersivas. Indica la facilidad a
polarizarse que tiene una molcula,
aumenta con el nmero de electrones
de la misma y con la distancia de stos
al nucleo.
6. Seguridad. En particular inflamabilidad y toxicidad.
7. Pureza. Importante para evitar modificaciones en la selectividad de la
fase mvil y la presencia de seales extraas.
8. Propiedades qumicas. Las propiedades qumicas de la fase mvil son las
que establecen el tipo y la fuerza de interaccin entre el solvente y la
muestra. Estas pueden definirse como :
Capacidad aceptora / donadora de
protonoes. Capacidad de las molculas
de aceptar o donar protones (cidos y
bases de Lewis)
Momento dipolar. Capacidad de las
molculas para formar dipolos
permanentes. Estrechamente
relacionado con la constante dielctrica.
Fase mvil de fase reversa
Mezclas de solventes polares
(generalmente Agua) + Modificador
orgnico (Metanol, Acetonitrilo, THF)
=
Es el solvente ms utilizado en HPLC.
Agua Destilada
Agua Desionizada
Carbn
activado
Resina
catinica
Resina
aninica
Filtro
0,2um
-Modificador orgnico mas utilizado en fase reversa.
-Alta capacidad disolvente de sales y reactivos de apareamiento inico.
-Preferible frente al Acetonitrilo en IPC cuando se van a utilizar altas
concentraciones de sales.
-Poco txico, fcil de purificar y ms barato que los dems solventes grado
HPLC.
-Desventajas : genera mayores presiones que el Acetonitrilo; mayor
afinidad por el oxgeno.
-Selectividad muy diferente a la del Metanol lo que lo convierte en la
primer alternativa cuando se quiere modificar la selectividad de la fase
mvil.
-Se debe almacenar protegido de la luz y ambiente ya que es muy
higroscpico.
-Su baja longitud de onda de corte (190 nm) lo convierte en el solvente de
eleccin cuando se debe trabajar a longitudes de onda cortas.
-Es costoso por los procedimientos requeridos para su purificacin.
Muy tiles para la implementacin de numerosos mtodos
cromatogrficos, generalmente para la regulacin del pH y de la fuerza
inica.
Fosfatos. Presentes como sales de sodio
o de potasio en preparacin de buffers.
tiles debido a su baja absorcin en el
UV a cortas.
Acetato y Citrato. Buffers utilizados en
menor grado. El Acetato presenta alta
absorcin al UV y el Citrato acompleja la
slice de las columnas.
Formiato. Buffers til para eluir el
analito pero puede atacar el acero
inoxidable al igual que las sales de
haluros y sus cidos.
Aminas. tiles para disminuir el Tailing
de compuestos bsicos.
cidos. Normalmente Actico y
Fosfrico. Muy utilizados para control
de pH en supresin inica. Preferible el
Fosfrico por su baja absorcin en el UV.
Aditivos PIC. Empleados para el anlisis
de sustancias orgnicas inizables.
Sales de tetralaquilamonio para solutos
cidos y alquilsulfonatos para solutas
bsicos.
Es un tratamiento preventivo para cuidar el adecuado funcionamiento del
equipo y prevenir desgaste acelerado del mismo.
Membranas de filtracin. De
0,22 ; 0,45 0,50 m de
dimetro de poro. Se eliminan
tanto partculas como bacterias.
Recomendaciones.
- Uso de guardacolumnas.
-Compatibilidad de membrana
con solventes.
- Descartar primeros mililitros.
Es un paso complementario de la filtracin.
Importancia :

- Eliminar burbujas en el cabezal de la bomba.

- Formacin de burbujas en la celda del detector.

- Interferencias del oxgeno en detectores de fluorescencia y
electroqumicos.

- Oxidacin de analitos.

- Aumento de linea base en Detectores UV.
- Reflujo: Ebullicin a reflujo de la F.M. con agitacin por 15
minutos. No til para mezcla de solventes.
- Burbujeo con gas inerte: Se utiliza Helio como gas de arrastre de
los gases existentes. Puede desplazar el solvente mas voltil de la
fase mvil. Gas costoso.
- Ultrasonido: Onda electromagntica producida por choque
mecnico de cristales piezoelectricos. No reduce la solubilidad de
los gases, slo los expulsa si la solucin esta sobresaturada.
- Vaco: Es el mtodo mas utilizado, se aplica junto con el proceso
de filtracin.
Caractersticas del material de relleno de una columna :
Morfologa y Tamao: Partculas irregulares esfricas entre 3 y 10 m de
dimetro para C. analtica y entre 100 y 200 m para C. preparativa.
10 m
10 m
Partculas esfricas.
-Mayor eficiencia.

- Mayor resistencia
mecnica.

- Mayor permeabilidad al
paso de la F.M. resultando
en menores presiones y
con ello menor desgaste
del equipo.
Caractersticas del material de relleno de una columna :
Porosidad y rea Superficial:

La porosidad es responsable de los fenmenos de exclusin y de la velocidad
de transferencia de masa del soluto entre la fase mvil y la fase estacionaria.
El rea superficial determina la capacidad de retencin de la fase
estacionaria. La componen el rea externa de la partcula y las paredes
internas de los poros.
En general, mucho menos del 1%
del rea superficial est localizada
en la superficie de la partcula y slo
las molculas que penetran en los
poros participarn de los procesos
separativos. En consecuencia

a menor dimetro de poro mayor
rea superficial y mayor retencin.
Estructura Qumica:
En cromatografa de fase normal, la fase ligada son partculas de slica gel,
conformando una intrincada estructura en la cual su parte interna est
formada por grupos siloxano (Si-O-Si) y su parte externa por grupos
silanoles (Si-OH).
CFN = Fase Estacionaria Polar y Fase Mvil Apolar
Estructura Qumica:
En cromatografa de fase reversa, a la base de slica gel ( copolmero de
estireno y divinilbenceno), se une qumicamente un grupo funcional por
unin covalente del tipo siloxano (Si-O-R).
CFR = Fase Estacionaria Apolar y Fase Mvil Polar
CFN Si - OH CFR Si - OR
Silanizacin
R = C4, C8, C18, Phe, CN
Variacin de la selectividad por el tipo de fase ligada C18, CN, Phe :
Bondapak CN
Bondapak Phe
Bondapak C18
Variacin de la selectividad por la marca de la columna :
61
62
Elucin isocrtica vs elucin con gradiente
Elucin isocrtica: solvente de composicin constante.
B=acetonitrilo
Elucin en gradiente: solventes de distinta polaridad. Se vara
la composicin de la FM en forma continua o escalonada.
Elucin isocrtica vs elucin con gradiente
Tubos de acero inoxidable. Ocasionalmente de vidrio
resistente
Rectas (10 - 30 cm de longitud) y 4-10 mm d.i.
Tamao partculas de relleno: 310 mm
40.000-100.000 platos/metro
Columnas termostatizadas: en general se trabaja a T
ambiente. La T constante mejora el cromatograma
Columna
66
67

GRACIAS POR TU ATENCION
Y BUENA DISPOSICION !!


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