Filtracin en gel

Principios y Mtodos
Las biomolculas son purificados utilizando tcnicas de cromatografa que los separan de
acuerdo con diferencias en sus propiedades especficas, como se muestra

La figura. 1. Principios de separacin en la purificacin cromatogrfica.

Durante ms de cuarenta aos desde la introduccin de Sephadex , filtracin en gel ha
desempeado un papel clave en la purificacin de enzimas, polisacridos, cidos nucleicos,
protenas y otras macromolculas biolgicas. La filtracin en gel es el ms simple y ms suave
de todas las tcnicas de la cromatografa y separa las molculas sobre la base de diferencias en
el tamao. Esta tcnica se puede aplicar de dos maneras distintas:

1 separaciones Grupo:. Los componentes de una muestra se separan en dos grupos principales
segn el rango de tamao. Un grupo de separacin se puede utilizar para eliminar los
contaminantes de alto peso molecular o bajo (como el rojo fenol a partir de fluidos de cultivo)
o para desalar y tampones de cambio.

2 de alta resolucin de fraccionamiento de las biomolculas:. Los componentes de una
muestra se separan de acuerdo a las diferencias en su tamao molecular. Alta resolucin de
fraccionamiento se puede utilizar para aislar uno o ms componentes, para separar
monmeros de agregados, para determinar el peso molecular o para llevar a cabo un anlisis
de la distribucin de peso molecular.

La filtracin en gel tambin se puede utilizar para facilitar el replegamiento de protenas
desnaturalizadas por el control cuidadoso de las condiciones cambiantes de amortiguamiento.

La filtracin en gel es una tcnica robusta que se adapta bien a la manipulacin de
biomolculas que son sensibles a cambios en el pH, concentracin de iones metlicos o co-
factores y condiciones ambientales duras. Las separaciones se pueden realizar en la presencia
de iones esenciales o cofactores, detergentes, urea, hidrocloruro de guanidina, en fuerza
inica alta o baja, a 37 C o en la sala de fro de acuerdo con los requisitos del experimento.

Este manual describe el uso de la filtracin en gel para la purificacin y separacin de
biomolculas, con un enfoque en la informacin prctica para la obtencin de los mejores
resultados. Los medios de comunicacin disponibles, se incluyen los criterios de seleccin y los
ejemplos con instrucciones detalladas para las aplicaciones ms comunes, as como los
principios tericos detrs de la tcnica. El primer paso hacia una separacin exitosa es
seleccionar el medio correcto y este manual se centra en los medios de comunicacin ms
arriba-hasta la fecha de filtracin en gel y columnas preenvasados.

La biocompatibilidad, estabilidad y utilidad de los medios de filtracin en gel de Amersham
Biosciences han hecho que estos productos en la opcin estndar en casi todos los
laboratorios mediante la tcnica. Una amplia variedad de columnas preenvasados y listo para
usar los medios de comunicacin disponible.

La ilustracin de la cubierta interior muestra la gama de manuales de Amersham Biosciences
que han sido producidos para asegurar que la cromatografa y otras tcnicas de separacin son
utilizados con facilidad y eficacia a cualquier escala, en cualquier laboratorio y para cualquier
aplicacin.


Smbolos

este smbolo indica consejos generales que pueden mejorar los procedimientos o proporcionar
recomendaciones para la accin en situaciones especficas.

Este smbolo indica consejos que debe considerarse como obligatorio y da una advertencia
cuando se debe tomar especial cuidado.

este smbolo resalta consejos de solucin de problemas para ayudar a analizar y resolver las
dificultades que puedan ocurrir.

productos qumicos, tampones y equipos.

protocolo experimental.

Las abreviaturas comunes

En la cromatografa de
GF: filtracin en gel (a veces referido como SEC: cromatografa de exclusin por tamao) IEX:
cromatografa de intercambio inico (tambin visto como IEC)
AC: cromatografa de afinidad
Cromatografa en fase reversa: RPC
HIC: cromatografa de interaccin hidrofbica
CIPP: Captura, Intermedio Purificacin y Pulido
MPa: megapascales
PSI: libras por pulgada cuadrada SDS: dodecil sulfato CIP: limpieza in situ
A280 nm, A214nm: absorbancia UV a la longitud de onda especificada
Mr: peso molecular relativo
N: eficiencia de la columna expresada como platos tericos por metro
Ve: volumen de elucin se mide a partir del cromatograma y se relaciona con el tamao
molecular de la molcula.
Vo: volumen vaco es el volumen de elucin de las molculas que estn excluidos del medio de
filtracin en gel, ya que son ms grandes que los poros ms grandes de la matriz y pasar
directamente a travs del lecho empaquetado
Vt: volumen total de la columna es equivalente al volumen del lecho empaquetado (tambin
conocida como CV) Rs: resolucin, el grado de separacin entre los picos
Kav y logMr: coeficiente de particin y registrar el peso molecular, los trminos utilizados en la
definicin de
la selectividad de un medio de filtracin en gel

En los nombres de productos
APM: alto peso molecular BPM: bajo peso molecular HR: alta resolucin
pg: prep grado
PC: Columna de la precisin
SR: resistente a los disolventes

Captulo 1
La filtracin en gel en la prctica

Introduccin

La filtracin en gel separa las molculas de acuerdo a las diferencias en tamao a medida que
pasan a travs de un medio de filtracin de gel empaquetado en una columna. A diferencia de
intercambio inico o cromatografa de afinidad, las molculas no se unen al medio de
cromatografa de modo composicin del tampn no afecta directamente a la resolucin (el
grado de separacin entre los picos). En consecuencia, una ventaja significativa de filtracin en
gel es que las condiciones pueden variarse para adaptarse al tipo de muestra o de los
requisitos para la purificacin adicional, anlisis o almacenamiento sin alterar la separacin.

La filtracin en gel es muy adecuado para biomolculas que pueden ser sensibles a los cambios
en el pH, concentracin de iones metlicos o co-factores y condiciones ambientales duras. Las
separaciones se pueden realizar en la presencia de iones esenciales o cofactores, detergentes,
urea, hidrocloruro de guanidina, en fuerza inica alta o baja, a 37 C o en la sala de fro de
acuerdo con los requisitos del experimento. Las protenas purificadas se pueden recoger en
cualquier tampn elegido.

Este captulo proporciona pautas generales aplicables a cualquier separacin de filtracin en
gel. Un paso clave hacia la separacin exitosa es seleccionar el medio adecuado, por lo que las
guas de seleccin de los ms estn incluidos hasta al da los medios de filtracin en gel y
columnas preenvasados. Otros ejemplos de aplicacin y la informacin especfica del producto
se encuentran en el Captulo 2.

La separacin por filtracin en gel

Para llevar a cabo una separacin, medio de filtracin en gel se envasa en una columna para
formar un lecho compacto. El medio es una matriz porosa en forma de partculas esfricas que
han sido seleccionados por su estabilidad qumica y fsica, y la inercia (falta de reactividad y
propiedades de adsorcin). El lecho de relleno se equilibra con tampn que llena los poros de
la matriz y el espacio entre las partculas. El lquido en el interior de los poros se refiere a veces
como la fase estacionaria y este lquido se encuentra en equilibrio con el lquido fuera de las
partculas, conocida como la fase mvil. Cabe sealar que las muestras se eluyeron
isocrticamente, es decir, no hay necesidad de utilizar diferentes tampones durante la
separacin. Sin embargo, una etapa de lavado utilizando el tampn de ejecucin se incluye
generalmente en el extremo de una separacin para facilitar la eliminacin de cualesquiera
molculas que pueden haber sido retenidos en la columna y para preparar la columna para
una nueva ejecucin. La figura 2 muestra los trminos ms comunes que se utilizan para
describir la separacin y
La Figura 3 ilustra el proceso de separacin de filtracin en gel.

La figura. 2. Los trminos comunes de filtracin en gel
. Las partculas esfricas de medio de filtracin en gel se empaquetan en una columna.


2. Muestra se aplica a la columna.

3. Buffer (fase mvil) y la muestra se mueven a travs de la columna. Las molculas se
difunden dentro y fuera de los poros de la matriz (tambin descrita como la particin de la
muestra entre la fase mvil y la fase estacionaria). Molculas ms pequeas se mueven ms
lejos en la matriz y as permanecer ms tiempo en la columna.

4. Como tampn pasa continuamente a travs de la columna, las molculas que son ms
grandes que los poros de la matriz no son capaces de difundirse en los poros y pasar a travs
de la columna. Molculas ms pequeas se difunden en los poros y se retrasan en su paso por
la columna.

Difusin
Buffer
La difusin en los poros
Buffer
La difusin de los poros
Absorbancia
5. Las molculas grandes salen de la columna primero seguido de molculas ms pequeas en
orden de su tamao. El proceso de separacin se lleva a cabo la totalidad como un volumen
total de la columna (equivalente al volumen del lecho empaquetado) de tampn pasa a travs
del medio de filtracin de gel.
Vo Vt
Ve
Vt - Vo


La figura. 3. Proceso de filtracin en gel.

Separacin de grupo
La filtracin en gel se utiliza en el modo de separacin de grupo para eliminar las pequeas
molculas de un grupo de molculas ms grandes y como una solucin rpida, simple para el
intercambio de tampn. Las molculas pequeas, tales como el exceso de sal (desalado) o
etiquetas libres se separan fcilmente. Las muestras se pueden preparar para su
almacenamiento o para otras tcnicas de cromatografa y ensayos. La filtracin en gel en el
modo de separacin de grupo de
se utiliza a menudo en esquemas de purificacin de protenas para la desalacin y el
intercambio de tampn. Para ms detalles, consulte el Captulo 2, pgina 57 y el Manual de
purificacin de protenas a partir de Amersham Biosciences.

Sephadex G-10, G-25 y G-50 se utilizan para separaciones del grupo. Los grandes volmenes de
muestreo de hasta 30% del volumen total de la columna (lecho de relleno) se pueden aplicar a
altas velocidades de flujo usando columnas anchas y cortas. La Figura 4 muestra el perfil de
elucin (cromatograma) de un grupo tpico de separacin. Las molculas grandes se eluyen en
o justo despus del volumen de huecos, Vo ya que
pasar a travs de la columna a la misma velocidad que el flujo de tampn. Para una columna
bien embalado
el volumen vaco es equivalente a aproximadamente el 30% del volumen total de la columna.
Las molculas pequeas tales como sales que tienen pleno acceso a los poros se mueven hacia
abajo la columna, pero no se separan el uno del otro. Estas molculas se eluyen normalmente
justo antes de un volumen total de la columna, Vt, de tampn ha pasado a travs de la
columna. En este caso, las protenas se detectan mediante el control de su absorbancia UV,
por lo general a A280 nm, y las sales se detectan mediante el control de la conductividad del
tampn.
La figura. 4. Cromatograma tpico de un grupo de separacin. La UV (protena) y la
conductividad (sal) rastros permiten la puesta en comn de las fracciones desaladas y facilitar
la optimizacin de la separacin.

Consulte el Captulo 2, pgina 57 para obtener informacin detallada sobre la separacin del
grupo de sustancias de alto y bajo peso molecular, es decir, la desalinizacin, intercambio de
tampn y limpieza de la muestra utilizando Sephadex.

Consulte el Captulo 3 para obtener informacin detallada sobre la teora de la filtracin en gel.
Resolucin en filtracin en gel
Muchos factores influyen en la resolucin final (el grado de separacin entre los picos de una
separacin de filtracin en gel): volumen de la muestra, la relacin de volumen de muestra a
volumen de la columna, dimensiones de la columna, tamao de partcula, distribucin de
tamao de partcula, densidad de empaquetamiento, tamao de poro de las partculas , tasa, y
la viscosidad de la muestra y el tampn de flujo. El intervalo de peso molecular sobre la que un
medio de filtracin en gel puede separar molculas se conoce como la selectividad del medio
(ver gua de seleccin para los medios de comunicacin giltration de gel en la pgina 18). La
resolucin es una funcin de la selectividad del medio y la eficacia de ese medio para producir
picos estrechos (ampliar pico mnima), como se ilustra en la Figura 6. El xito de filtracin en
gel depende principalmente de la eleccin de las condiciones que dan suficiente selectividad y
contrarrestan ensanchamiento de los picos efectos durante la separacin.
La altura del lecho de relleno afecta tanto a la resolucin y el tiempo necesario para la elucin.
La resolucin en la filtracin en gel aumenta como la raz cuadrada de la altura de la cama. La
duplicacin de la altura del lecho da un aumento en la resolucin equivalente a E2 = 1,4 (40%).
Para alta resolucin fraccionamiento columnas largas se dan los mejores resultados y una
altura de la cama entre 30-60 cm debera ser satisfactoria. Altura de la cama suficiente, junto
con un bajo caudal permite tiempo para todas las molculas "intermedios" que se difunden
dentro y fuera de los poros de la matriz y dan suficiente resolucin.

Si una columna muy largo se juzga que es necesario, la altura del lecho efectiva se puede
aumentar mediante el uso de columnas, que contiene los mismos medios, acoplados en serie.

Consulte el Captulo 3 para obtener informacin detallada sobre la teora de la filtracin en gel.

Seleccin de los medios

Medios de cromatografa de filtracin en gel se realiz a partir de matrices porosas elegidos
por su inercia y estabilidad qumica y fsica. El tamao de los poros dentro de una partcula y la
distribucin del tamao de partcula se controlan cuidadosamente para producir una variedad
de medios de comunicacin con diferentes selectividades. Medios de filtracin de gel de hoy
cubren un intervalo de peso molecular de 100 a
80 000 000, a partir de pptidos a muy grandes protenas y complejos de protenas.

La selectividad de un medio de filtracin en gel depende nicamente de su distribucin de
tamao de poro y se describe mediante una curva de selectividad. Medios de filtracin en gel
se suministran con informacin sobre su selectividad, como se muestra para Superdex en la
Figura 9. La curva se ha obtenido por el trazado de un coeficiente de particin de Kav frente al
logaritmo del peso molecular para un conjunto de protenas estndar (vase el captulo 3 de
filtracin en gel en teora para el clculo de Kav).

Buffer composicin y preparacin

La composicin del tampn no influye directamente en la resolucin obtenida en la filtracin
en gel ya que la separacin debe depender slo de los tamaos de las diferentes molculas. La
consideracin ms importante es el efecto de la composicin del tampn en la forma o la
actividad biolgica de las molculas de inters. Por ejemplo, el pH y la fuerza inica del
tampn y la presencia
de los agentes o detergentes desnaturalizantes puede causar cambios conformacionales,
disociacin de protenas en subunidades, la disociacin de enzimas y cofactores, o la
disociacin de las hormonas y protenas portadoras.

Seleccionar un tampn y pH que son compatibles con la estabilidad y la actividad de la
protena y en la que el producto de inters debera recogerse. Utilice una concentracin de
tampn que es suficiente para

mantener la capacidad de tamponamiento y el pH constante. Utilice un mximo de 0,15 M
NaCl para evitar interacciones inicas no especficas con la matriz (que se muestra por las
demoras en el pico de elucin). Tenga en cuenta que algunas protenas pueden precipitar en
soluciones de baja fuerza inica. Use tampones voltiles tales como acetato de amonio,
bicarbonato de amonio o acetato de etilendiamina si el producto separado es a
liofilizar.

Use agua de alta calidad y productos qumicos. Las soluciones deben ser filtrados a travs de
0,45 micras o
0,22 m filtros. Es esencial para desgasificar tampones antes de cualquier separacin de
filtracin en gel como burbujas de aire puede afectar significativamente el rendimiento. Los
tampones se deben desgasificar si se filtran al vaco.

Cuando se trabaja con una nueva muestra de tratar estas enfermedades primero: 0,05 M de
fosfato de sodio,
NaCl 0,15 M, pH 7,0 o seleccione el tampn en el que el producto debe ser eluido para el
siguiente paso, tales como purificacin adicional, anlisis o almacenamiento.

Evite los cambios extremos de pH o de otras condiciones que pueden causar la inactivacin o
la precipitacin. Si la muestra se precipita en una columna de filtracin en gel, la columna se
bloquear, posiblemente irreversible, y la muestra se puede perder.

La desnaturalizacin (caotrpicas) agentes y detergentes
Agentes desnaturalizantes, tales como clorhidrato de guanidina o urea se pueden utilizar para
inicial de solu-cin de una muestra y en tampones de filtracin en gel con el fin de mantener la
solubilidad de la muestra. Sin embargo, debido a que se desnaturalizar la protena, que debe
evitarse a menos se requiere desnaturalizacin.

Los medios de comunicacin modernos, como Superdex, Sephacryl y Superose son en general
ms adecuado que los medios clsicos como Sepharose o Sephadex para trabajar bajo
disociar o dena-Turing condiciones o con valores de pH extremos.
Los detergentes son tiles como agentes solubilizantes para las protenas con baja solubilidad
acuosa, tales como componentes de la membrana y no afectarn a la separacin.

Si los agentes desnaturalizantes o detergentes son necesarios para mantener la solubilidad de
la muestra, deben estar presentes tanto en el funcionamiento de amortiguacin y el tampn
de muestra. Tenga en cuenta que las altas concentraciones de detergente se aumentan la
viscosidad de la memoria intermedia de manera que las tasas de flujo ms bajas pueden ser
necesarias para evitar el exceso de presin sobre el relleno de la columna.
Si no se observan las protenas que han sido solubilizados en un desnaturalizante o detergente
para precipitar, eluir despus de lo esperado o ser mal resuelto durante la filtracin en gel,
aadir una concentracin adecuada del agente desnaturalizante o detergente para el
funcionamiento de amortiguacin.

La urea o hidrocloruro de guanidina son muy tiles para la determinacin del peso molecular.
La presencia de estos agentes desnaturalizantes en el tampn de ejecucin mantiene
protenas y polipptidos en una configuracin extendida. Para la determinacin precisa del
peso molecular de los estndares de calibracin tambin se deben ejecutar en el mismo
tampn.

Tenga en cuenta que las curvas de selectividad se determinan generalmente utilizando
protenas globulares para que no reflejan el comportamiento de las muestras
desnaturalizadas.

La filtracin en gel se puede utilizar para intercambiar una protena solubilizada inicialmente
en, por ejemplo SDS, en un detergente ms suave tal como Triton X-100 sin perder
solubilidad.

Preparacin de la columna y los medios de comunicacin

Para llevar a cabo una separacin, medio de filtracin en gel se envasa en una columna de 30-
60 cm de altura para alta resolucin fraccionamiento y hasta 10 cm de altura para las
separaciones de grupo. El volumen del lecho de relleno se determina por los volmenes de
muestra que se aplicarn.

Relleno de la columna eficiente es esencial, sobre todo para alta resolucin fraccionamiento.
La eficiencia de una columna de relleno define su capacidad de producir picos simtricos
estrechas durante la elucin. Eficiencia de la columna es particularmente importante en la
filtracin en gel en el que la separacin se lleva a cabo como un solo volumen de columna de
tampn pasa a travs de la columna. La uniformidad del lecho de relleno y las partculas
influye en la uniformidad del flujo a travs de la columna y por lo tanto afecta a la forma y
anchura de pico eventual. Medios de filtracin en gel con alta uniformidad (distribucin del
tamao de partcula inferior) facilitan la elucin de las molculas en picos estrechos. Remitir
Captulo 3 La filtracin en gel en la teora y en el Apndice 1 para ms informacin sobre la
eficiencia de la columna y el relleno de la columna.
La eficiencia puede ser mejorada al disminuir el tamao de partcula de un medio. Sin
embargo, el uso de un tamao de partcula ms pequeo puede aumentar de nuevo la presin
de modo que el caudal es necesario reducir, alargar el tiempo de ejecucin.

El uso de columnas preenvasados es muy recomendable para garantizar el mejor rendimiento
y resultados reproducibles. Una columna empaquetada de manera uniforme asegura que,
como la muestra pasa por la columna, los picos de los componentes no se amplan
innecesariamente. Embalaje desigual provoca ensanchamiento de los picos y los resultados de
alta resolucin hacen imposibles.

Permitir tampones, medios de comunicacin o columnas preenvasados para llegar a la misma
temperatura antes de comenzar la preparacin. Los cambios rpidos de temperatura, por
ejemplo, la eliminacin de columnas de relleno de una habitacin fra y aplicar tampn a
temperatura ambiente, pueden causar burbujas de aire en el embalaje y afectar a la
separacin.

Las soluciones de almacenamiento y conservantes deben ser lavados antes de utilizar
cualquier medio de filtracin en gel. Equilibrar la columna con 1-2 volmenes de columna de
tampn antes de iniciar una separacin.

Ejemplo de aplicacin

La eleccin del mtodo de aplicacin de la muestra depende en gran medida el volumen a ser
aplicado y del equipo disponible. Asegrese de que la muestra no se diluye en el camino a la
columna y que la parte superior del lecho de la columna no se altera durante la aplicacin de la
muestra. Las muestras se pueden aplicar de forma automtica o manualmente.

Aplicar las muestras directamente a la columna a travs de un sistema de cromatografa, una
bomba peristltica o una jeringa. La eleccin del equipo depende en gran medida del tamao
de la columna, el tipo de medio de filtracin en gel y el volumen de la muestra. Por ejemplo, se
requiere un sistema de cromatografa para una columna de Superdex, mientras que una
jeringa se puede utilizar con pequeas columnas preenvasados tales como HiTrap La
desalacin. Tenga en cuenta que las muestras se aplicaron por gravedad a las columnas
preenvasados como PD-10 La desalacin.

Las tasas de elucin y de flujo

Las muestras se eluyeron isocrticamente en una columna de filtracin en gel, utilizando un
nico sistema tampn. Despus de la aplicacin de la muestra toda la separacin se lleva a
cabo como un volumen de columna de tampn (equivalente al volumen del lecho
empaquetado) pasa a travs de la columna.

Utilice velocidades de flujo que permiten tiempo para las molculas se difundan dentro y fuera
de la matriz (reparto entre la fase mvil y la fase estacionaria) a fin de lograr una separacin.

El objetivo de cualquier separacin es lograr la mayor resolucin posible en el menor tiempo
posible. Las figuras 14a, 14b y 14c muestran que la resolucin se reduce a medida que
aumenta el caudal y cada separacin deben ser optimizados para proporcionar el mejor
equilibrio entre estos dos parmetros. En pocas palabras, la resolucin mxima se obtiene con
una larga columna y una tasa de flujo baja mientras que la carrera ms rpida se obtiene con
una columna corta y una velocidad de flujo alta. Caudales adecuados para alta resolucin
fraccionamiento o separacin del grupo por lo general se suministran con cada producto.

La ventaja de una velocidad de flujo ms alto (y por lo tanto una separacin ms rpida) puede
pesar ms que la prdida de resolucin en la separacin....
BioProcess Medios para la produccin a gran escala

BioProcess Specific Media han sido diseados para cada etapa de cromatografa en un
proceso de captura de Pulido. Produccin de gran capacidad integrado con ordenamiento
claro y rutinas de entrega asegurar que BioProcess
los medios de comunicacin estn disponibles en la cantidad adecuada, en el lugar correcto y
en el momento adecuado. Amersham Biosciences puede asegurar el suministro futuro de
BioProcess Media, por lo que una inversin segura para la produccin a largo plazo. Los
medios de comunicacin se producen siguiendo mtodos validados y probados bajo un
estricto control para cumplir con las especificaciones de alto rendimiento. Un certificado de
anlisis est disponible con cada pedido.

Archivos de soporte normativo (RSF) contienen detalles de rendimiento, estabilidad,
compuestos extrables y los mtodos analticos. La informacin esencial de estos archivos le da
un punto de partida de gran valor para la validacin del proceso, as como la prestacin de
apoyo para la presenta-ciones a las autoridades reguladoras. Usando BioProcess Medios para
cada etapa da lugar a un proceso fcilmente validado. Caudal alto y de alta capacidad y alta
recuperacin contribuyen a la economa global de un proceso industrial.
Todo BioProcess Medios tiene estabilidad qumica para permitir que los procedimientos de
limpieza y desinfeccin eficaz. Mtodos de embalaje se establecen para una amplia gama de
escalas y columnas de gran escala compatibles y materiales disponibles.


Solucin de problemas

Esta seccin se centra en los problemas prcticos que pueden ocurrir cuando se ejecuta una
columna de cromatografa. Los diagramas indican cmo un cromatograma puede desviarse del
comportamiento ideal durante una separacin de filtracin en gel. Las siguientes pginas
contienen sugerencias de posibles causas y sus remedios.

Sustancias altamente cidas o bsicas en fuerza inica baja o materiales aromticos pueden
comportarse de manera diferente durante la filtracin en gel, la interaccin con la matriz. Para
algunas aplicaciones esto puede ser una ventaja. Por ejemplo pptidos aromticos y otras
sustancias que difieren slo ligeramente en el peso molecular se pueden separar en Sephadex.
Sin embargo esto no es una verdadera separacin de filtracin en gel.
Captulo 2
Medios de filtracin en gel

Componentes de medios de filtracin en gel

El desarrollo de los medios de filtracin en gel ha sido impulsado por la necesidad de alcanzar
las velocidades de flujo ms altas, manteniendo la ms alta resolucin. Como muestra pasa a
travs de una columna de filtracin en gel de la separacin o resolucin de los diferentes
componentes se ve afectada por varios parmetros: tasa de flujo, tamao de partcula,
distribucin de tamao de partcula, densidad de empaquetamiento, la porosidad de la
partcula y la viscosidad de la fase mvil. Los intentos para optimizar cada parmetro ha
llevado al desarrollo de una serie de medios de filtracin de gel.

Las primeras matrices de filtracin en gel fueron formadas por polmeros de reticulacin para
formar una red tridimensional, por ejemplo Sephadex est formado por dextrano reticulado.
Controlar el grado de reticulacin y tamao de partcula hizo posible la produccin de una
amplia gama de medios de comunicacin, cada una de ellas con una alta selectividad sobre un
rango estrecho de valores de peso molecular.

Sin embargo, para aumentar la velocidad de una separacin del medio debe resistir tasas de
flujo ms altas y polmeros as alternativos tales como agarosa fueron investigados. Esto dio
lugar a los medios de filtracin de gel sobre la base de Sepharose y, ms tarde, el Superose
ms altamente reticulado. Las matrices basadas en agarosa son, en general, ms poroso que
los basados en dextrano de manera que, aunque la velocidad de una separacin podra
aumentarse haba menos selectividad en comparacin con Sephadex. La porosidad de
Sepharose hace que sea muy adecuado para tcnicas de unin tales
como cromatografa de afinidad donde la alta porosidad facilita una alta capacidad de unin.

Un avance importante en la tecnologa de filtracin en gel se produjo cuando geles
compuestos podran ser preparados mediante el injerto de un segundo polmero en una matriz
preformada, por ejemplo Sephacryl (reticulacin alil dextrano con N, N'-metileno) y la ms
reciente, Superdex . En el caso de Superdex, con las cadenas de dextrano unido
covalentemente a una matriz de agarosa reticulada altamente, ha sido posible crear una gama
de medios de comunicacin con la misma alta selectividad como Sephadex, pero con la
resistencia mecnica de un reticulado altamente matriz de agarosa-basado. Las curvas de
selectividad y las curvas de relacin de presin-flujo mostrados para Superose, Sephacryl y
Superdex en las secciones siguientes muestran cmo el rendimiento de gel de medios de
filtracin ha desarrollado. La figura 16 ilustra claramente el aumento significativo en la
velocidad sin prdida de rendimiento que se ha logrado con el desarrollo de Superdex. Para
Superose y Superdex, la manipulacin del tamao de partcula (Superose calidad preparativa o
Superdex calidad preparativa) tambin se utiliza para permitir que las tasas de flujo ms altas
cuando se ejecuta columnas ms grandes.