INSTITUTO TECNOLOGICO DE

ZACATEPEC

Practica 1:
PARAMETRO CINETICO DE LA INVERTAZA
Materia: BIORREACTORES

Alumnos:
Castillo Serrano Samantha
Gonzlez Mondragn Elizabeth G.
Ocampo Caldern Ana Cecilia
Palacios Talavera Aurelio Alejandro
Palomares Torres Silvia Guadalupe
Salgado Acosta Itzel

Grupo: WA

Ing. Bioqumica

Profesor: Dr. Francisco J. Hernndez Campos

11 de abril del 2014
INTRODUCCION:
Los azcares reductores poseen un grupo carbonilo libre formando un grupo
hemiacetal que le confiere la caracterstica de poder reaccionar con otros
compuestos. La determinacin de estos azcares se realiz con el objeto de
obtener una curva de calibracin aplicando la tcnica de Miller o DNS (cido
dinitrosaliclico), reactivo que tiene la capacidad de oxidar a los azcares
reductores dando resultados colorimtricos que se pueden medir con una longitud
de onda de 575nm.
Los azucares que reaccionan se llaman azucares reductores, que pueden unirse
de forma inespecfica a otras molculas; los que no lo hacen, azucares no
reductores. El mtodo DNS es una tcnica colorimtrica que emplea 3,5-cido
dinitrosaliclico para la hidrlisis de polisacridos presentes en una muestra,
seguido de la determinacin espectrofotomtrica a 540nm de los azcares
reductores. Esta tcnica sirve para cuantificar los azucares reductores producidos
durante una fermentacin o para cuantificar los productos de una reaccin
enzimtica. Las pruebas de Fehling y de Benedict, por ejemplo, se basan en la
capacidad de los azucares reductores de reducir los iones cpricos (Cu2+).
Este mtodo prueba la presencia de un grupo carbonilo libre (C=O) el cual es
llamado azcar reductor. Esto implica la oxidacin del grupo funcional aldehdico
presente, por ejemplo la glucosa y el grupo funcional cetonico en la fructosa.
Simultneamente el acido 3,5 Dinitrosalicilico (DNS) es reducido a acido 3-
amino,5- nitrosalicilico, bajo condiciones alcalinas.
Oxidacin:
Grupo Aldehdo ------ Grupo Carboxilo
Reduccin:
Acido 3,5 Dinitrosalicilico ------ Acido 3- amino, 5-nitrosalicilico.

MARCO TEORICO:
La capacidad enzimtica es en realidad la funcin de la enzima, es decir, la
capacidad que presenta sta para acelera una reaccin qumica, la cual se puede
determinar midiendo la cantidad de sustrato que desaparece o la cantidad de
producto formado por unidad de tiempo, lo cual nos lleva a conocer la velocidad de
reaccin. Inicialmente, las reacciones transcurren linealmente, pudindose tomar
la pendiente de esta recta como velocidad inicial. A tiempos ms largos, el
progreso de la reaccin se aparta de la linealidad. Esta cada de la velocidad de
reaccin se debe a la disminucin significativa de la concentracin de sustrato.
Todas las reacciones qumicas son afectadas por diversos factores como el
aumento de concentracin del producto, cambios de pH, inactivacin del enzima,
fuerza inica y temperatura.

Efecto de las concentraciones de sustrato sobre la actividad enzimtica: La
velocidad de una reaccin enzimtica depende de la concentracin del sustrato
mientras la enzima no se encuentre saturada. A mayor concentracin del sustrato,
a una concentracin fija de la enzima se obtiene la velocidad mxima. Despus de
que se alcanza esta velocidad, un aumento en la concentracin del sustrato no
tiene efecto en la velocidad de la reaccin.

La actividad cataltica de un enzima se determina midiendo la velocidad inicial de
reaccin, que es la pendiente de la curva de progreso (curva de producto formado
sustrato transformado frente al tiempo) en el tiempo cero. Inicialmente, las
reacciones transcurren linealmente, pudindose tomar la pendiente de esta recta
como velocidad inicial. A tiempos ms largos, el progreso de la reaccin se aparta
de la linealidad. Esta cada de la velocidad de reaccin se debe a la disminucin
significativa de la concentracin de sustrato, aunque tambin pueden influir otros
factores como el aumento de la concentracin de producto, cambios de pH,
inactivacin del enzima, etc. La mxima fiabilidad en la determinacin de la
actividad de un enzima la suministra el valor de velocidad inicial o velocidad
durante el tramo inicial de progreso lineal de la reaccin.









EFECTO DE LA CONCENTRACIN DE ENZIMA SOBRE LA ACTIVIDAD ENZIMTICA
De forma general, la velocidad de una reaccin catalizada enzimticamente es
proporcional a la cantidad de enzima en la mezcla de ensayo, segn:

v = Vmax[S] / (Km + [S]) = k'[E0] Vmax = kcat [E0]


Efecto del pH sobre la actividad enzimtica

La actividad de un enzima se ve afectada por el pH al cual se lleva a cabo la
reaccin. La curva actividad-pH puede ser diferente para cada tipo de enzima (Fig.
2). En el caso ms general la curva tiene forma de campana. El valor de pH al cual
la actividad es mxima se denomina pH ptimo; dicho pH no tiene porqu coincidir
con el pH intracelular. La relacin entre el pH y la actividad depende del
comportamiento cido-base del enzima y del propio sustrato. Sustrato y enzima
(centro activo) pueden contener grupos funcionales cidos y bsicos, siendo su
grado de disociacin dependiente del pH, lo que determinar, entre otros
aspectos, la conformacin de la protena, la capacidad de unin del sustrato al
centro activo del enzima (Km) y la capacidad de transformacin del sustrato (kcat).
Los estudios cinticos a diferentes valores de pH nos proporcionan informacin
sobre el mecanismo cataltico de los enzimas y la naturaleza de los aminocidos
ms directamente implicados en la catlisis.







Efecto de la temperatura sobre la actividad enzimtica
La velocidad de una reaccin enzimtica vara al aumentar la temperatura de
acuerdo a lo indicado en la Fig. 3, donde se representa una tpica curva de
actividad enzimtica/temperatura. Tal dependencia refleja un doble efecto de la
temperatura: positivo a bajos valores, debido al incremento general que
experimenta la velocidad de cualquier reaccin qumica al hacerlo la temperatura,
y negativo a valores altos, debido a la desnaturalizacin trmica del enzima. Esto
es, la velocidad de una reaccin enzimtica se incrementa al aumentar la
temperatura dentro de un determinado rango, alcanzando un valor mximo a la
denominada temperatura ptima. A valores superiores la actividad disminuye
debido a que el enzima, como cualquier otra protena, sufre procesos de
desnaturalizacin y, por lo tanto, de inactivacin. Durante la fase de incremento
dela velocidad, la relacin entre sta y la temperatura viene determinada por la
ecuacin de Arrhenius:

v = k e -Ea/RT
ln v = ln k - Ea/RT

Ea es la energa de activacin, R la constante de los gases (1,9872 cal K-1 mol-1;
8,3145 J K-1 mol-1) y T la temperatura absoluta (K). El valor de Ea se puede
calcular a partir de la representacin de Arrhenius (Fig. 4).
Otro parmetro que se utiliza para cuantificar el efecto de la temperatura es el
coeficiente de temperatura (Q10), que se define, para una temperatura dada (p. ej.
25 C), como el factor de incremento de la velocidad de reaccin cuando la
temperatura se incrementa 10 oC.
(Q10)t = vt+10/vt

Efecto de la concentracin de sustrato sobre la actividad enzimtica
En la Fig. 4 se representa el efecto de la concentracin de sustrato sobre la
velocidad de una reaccin catalizada enzimticamente. Este comportamiento
cintico, conocido como curva de saturacin hiperblica por el sustrato, constituye
la norma seguida por la mayora de los enzimas, los denominados enzimas
michaelianos. Como principal desviacin, algunos enzimas muestran curvas
sigmoideas, en vez de hiperblicas, de saturacin por el sustrato (caso de algunos
enzimas cooperativos o alostricos).


El anterior modelo cintico se ajusta a la ecuacin:

v = Vmax [S] / (Km + [S])

Donde Km es la constante de Michaelis e indica la afinidad del enzima por su
sustrato, y Vmax es la velocidad mxima e indica la capacidad cataltica.

La determinacin de los anteriores parmetros cinticos (Vmax y Km) se puede
realizar utilizando las representaciones de Lineweaver-Burk (1/v : 1/[S]) y de
Eadie-Hofstee (v : v/[S]), (Fig. 5).











Ecuacin de Linewever-Burk: 1/v = 1/Vmax + Km/Vmax 1/[S]

Ecuacin de Eadie-Hofstee: v= Vmax Km v/[S]











OBJETIVOS:
Determinar que parmetro cintico es adecuado para la actividad de la
invertasa.

Elaborar una curva de calibrado y calcular el coeficiente de extincin molar
para la determinacin de azucares reductores por el mtodo de DNS.



METODOLOGIA:


MATERIAL

* Matraz Volumtrico 250 ml
* Tubos de ensayo con rosca (6)
* Pipeta, 5.0 ml
* Termmetro 0 - 100 C
* Bao Mara
* Espectrofotmetro
* Gradilla
* Agitador Magntico
* Vasos de precipitados 50, 100 y 250 ml
* Parrilla Elctrica


REACTIVOS
* Enzima (invertasa 0.0375 g/l)
* Solucin de sacarosa (10 g / l)
* Buffer de Fosfatos pH 7
* Tartrato de sodio y potasio (2 gr)
* Solucin DNS (para el anlisis de azcares reductores)




PREPARACIN DE REACTIVOS:

DNS
Se pesan 10 g de DNS, 0.5 g de bisulfito de sodio y 10 g de Hidrxido de sodio.
En un vaso de precipitado con cierto volumen de agua destilada (100 ml) agregar
los 10 g de hidrxido de sodio y agitar con un agitador magntico. Una vez
disuelto por completo el hidrxido en el agua ir agregando gradualmente el DNS
con agitacin constante para evitar la formacin de grumos, en caso de ser
necesario agregar ms volumen de agua para disolver el DNS por completo, una
ves logrado esto agregar el bisulfito de sodio y esperar a que este tambin se
disuelva. Disueltos por completo todo los slidos pasar esta solucin a un matraz
volumtrico de 1000 ml, enjuagar el vaso de precipitado con agua destilada y
verter en el matraz volumtrico para arrastrar los restos de solucin de DNS que
se quedo en las paredes del vaso, aforar la solucin hasta un volumen total de
1000 ml. Repetir todo el procedimiento nuevamente, una ves preparados los 2 L
de solucin de DNS verter en un frasco mbar, etiquetar de manera correcta y
colocar en refrigeracin.








Buffer Fosfatos pH 7.
Para la preparacin de 250 ml de una solucin 0.05 M de Fosfato de potasio
monobsico se pesaron 3.42 g del reactivo, se diluyen en cierta cantidad de agua
destilada en un vaso de precipitado por separado, una ves disuelto por completo
pasar a un matraz volumtrico de 250 ml, se enjuaga el vaso con agua destilada
para retirar lo adherido al vaso, aforar el matraz con agua destilada hasta obtener
un volumen total de 250 ml.
FIG 6: Preparacin
de DNS.
Para la preparacin de 1000 ml de una solucin 0.05 M de fosfato de potasio
bsico se pesaron 8.709 g del reactivo, disolver en cierta cantidad de agua en un
vaso de precipitado por separado, una ves disuelto por completo, verter en un
matraz volumtrico de 1 L, enjuagar el vaso para recuperar lo que queda en las
paredes del vaso y aforar hasta obtener un volumen de 1000 ml.
Medir el pH del fosfato de potasio monobsico con un potencimetro e ir
agregando poco a poco el fosfato de potasio dibasico hasta ajustar una solucin
con un pH de 7.

Ivertasa (solucin madre).
Para la preparacin de una solucin madre de invertasa (250 ml) con una
concentracin de 0.4 g/L se pesaron 0.0375 g de invertasa y se diluyo en un vaso
de precipitado utilizando el buffer de pH 7, verter en un matraz volumtrico de 250
ml y aforar con el buffer de pH 7 hasta tener el volumen deseado.
* Solucin de la enzima de Trabajo.:
Preparar una solucin de la invertasa de trabajo (0,15 g / l) por dilucin de la
solucin madre (0,4 g / L) con 0,05 M de buffer a pH 7.
C1V1=C2V2 V1=C2V2 V1= (0.15g/L)(0.05L) = 0.01897 L = 18.97 ml
C1 (0.4g/L)
Medir 18.75 ml de la solucin madre de invertasa y aforar a 50 mL con el buffer pH
7.
* Efecto de la concentracin de la enzima en la velocidad de reaccin:
De acuerdo a la Tabla 1, se preparan diferentes tubos de ensayo







FIG 7: Preparacin
de invertasa.
Tabla 1.- Efecto de la concentracin de enzima sobre la velocidad de
reaccin.
TUBOS
DE
ENSAYO
SOLUCION DE
INVERTASA (0.15
g/L)
SOLUCION
BUFFER (PH 7
Y 0.05 M)
SOLUCION DE
SACAROSA (10 g/ L)
A 2 ml 0 2 ml
B 2 ml 0.8 2 ml
C 2 ml 0.6 2 ml
D 2 ml 0.4 2 ml
E 2 ml 0.2 2 ml
F 2 ml 1 2 ml

1.-Preincubar los tubos de la A a la F a 55 C durante 5 minutos con la
invertasa y la sacarosa. Cada una deber contener 2 ml tanto de sacarosa e
invertasa y mezclar.






2.-Despus de que termin el tiempo de pre-incubacin, aadir 1 ml de solucin
de buffer de fosfatos pH 7. (Debido a que la tasa inicial se est midiendo, la
longitud de reaccin debe ser controlada con la mayor precisin posible).

3.-Al final del perodo de incubacin, agregar 4 ml de reactivo DNS se aaden a
cada uno de los tubos de ensayo en el mismo orden (condiciones alcalinas de
solucin DNS deben detener la reaccin de hidrlisis de sacarosa).

4.-Una vez detenido la reaccin de hidrlisis, todos los tubos de ensayo se deben
sumergir en un bao de agua a 95 C durante 10 minutos. Medir la absorbancia
despus del enfriamiento.
FIG 8: Forma de llenar
los tubos.
ANALISIS Y RESULTADOS:





DISCUSIN:
Uno de los factores que afecto a la velocidad de la reaccin fue el tiempo, ya que
al no tener todos nuestros tubos al mismo tiempo de incubacin, puede provocar
variaciones alta y no tener resultados seguros.


CONCLUCION:
De acuerdo a nuestros resultados obtenidos podemos concluir que la
concentracin de sustrato se ajusto al parmetro cintico de lagmuir. Adems que
en una reaccin enzimtica interviene de manera significativa diferentes factores
como: pH, temperatura, tiempo y la concentracin de sustrato.


BIBLIOGRAFIA:
http://www.uco.es/dptos/bioquimicabiolmol/pdfs/32%20INVERTASA%20CIN%C3
%89TICA.pdf
http://www.eng.umd.edu/~nsw/ench485/lab14.htm
http://www.slideshare.net/nataliavvg/cinetica-25666624













Formula
t= ks ln (cs0/cs) + cs0-cs / max

Se toma el tiempo de 5, 10, 15, 20, 25 cada 5 minutos
Tiempo de 5 min
t= 14.4133 ln (20/ 18.97) + 20-18.97 / 0.3614 =4.4550

Tiempo de 10 min
t= 14.4133 ln (20/ 22.15) + 20-22.15/ 0.3614 =10.02

Tiempo de 15 min
t= 14.4133 ln (20/ 23.26) + 20-23.26 / 0.3614 =15.04

Tiempo de 20 min

t= 14.4133 ln (20/ 24.38) + 20-24.38 / 0.3614 =20.01

Tiempo de 25 min
t= 14.4133 ln (20/ 25.53) + 20-25.53 / 0.3614 =25.03








LANWEVER

cs r Ycs Ya
0 0 0 0
4.1667 0.0372 0.2399 11.4678
8.333 0.1204 0.1200 8.3056
12.5 0.1713 0.08 5.8207
16.667 0.2165 0.0599 4.6189

b=ks / r max a= 2.9693 ks= 42.3521
ks= b (r max) b=36.6860 r max=0.3367
r max =Ya

LAGMUIR
Cs Cs / r
0 0
4.1667 47.2832
8.3333 69.2134
12.5 72.9713
16.667 76.9838

Ks= a (max)
max = Yb
a=39.882
b=2.7664
r
2
=0.7908
max= 0.3614
ks=14.4133

EDDIE HOFFTIER

a= 0.3473 = ks
b= -12.8299 = r max
r
2
= 0.6856

Teorico
[sac] 0 [sac]
0 0
4.1667 3.73043
8.3333 7.7309
12.5 11.6407
16.667 15.5845
20.833 20.0143
25 24.8310

FORMULA: r= cso-cs / c
r= 0-0 /5 =0
r= 4.1667-3.7304 /5 =0.0872
r= 8.3333-7.7309 /5 =0.1204
r= 12.5-11.6407 /5 =0.1713
r= 16.667-15.5845/5 =0.2165
r= 20.833-20.0143 /5 =0.1637
r= 25-24.8310 /5 =0.0337
r/Cs r
0 0
0.0209 0.0872
0.0144 0.1204
0.0137 0.1713
0.0129 0.2165











y = 4.2879x + 0.1638
R = 0.7985
0
0.2
0.4
0.6
0.8
1
1.2
0 0.05 0.1 0.15 0.2 0.25
CONC / VALORES ABS
CONC / VALORES ABS
Linear (CONC /
VALORES ABS)
[C] ABS. 1 ABS. 2 PROMEDIO ABS.
0 0-000 0.000 0
0.2 0.031 0.035 0.036
0.4 0.051 0.050 0.050
0.6 0.071 0.071 0.071
0.8 0.088 0.089 0.0885
1 0.119 0.106 0.225