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QUMICA NOVA, 22(6) (1999) 863

O EMPREGO DE LIPASES COMO AGENTES DE RESOLUO CINTICA DE ENANTIMEROS EM SNTESE


ORGNICA: ASPECTOS GERAIS SOBRE A INFLUNCIA DO SOLVENTE
Valentim Emilio Uberti Costa* e Hermes Lus Neubauer de Amorim
Instituto de Qumica - Universidade Federal do Rio Grande do Sul - Av. Bento Gonalves, 9500 - 91501-970 - Campus do Vale -
Porto Alegre - RS
Recebido em 16/7/98; aceito em 6/1/99
THE USE OF LIPASES AS AGENTS OF KINETIC RESOLUTION OF ENANTIOMERS IN
ORGANIC SYNTHESIS: GENERAL ASPECTS OF SOLVENT'S INFLUENCE. In organic
synthesis, lipases are the most frequently used biocatalysts. They are efficient stereoselective
catalysts in the kinetic resolution of a wide variety of chiral compounds. The discovery that enzymes
possess catalytic activity in organic solvents has made it possible to address the question of reaction
medium influence on enzymatic specificity. Perhaps the most exciting and significant development
in this emerging area is the discovery that enzyme specificity, in particular enantioselectivity, can
be affected by changing from one organic solvent to another. This article discusses the scope and
possible mechanistic models of this phenomenon in hydrolases, specially lipases, as well as
directions of future research in the area.
Keywords: lipase enantioselectivity; solvent; mechanistic models.
DIVULGAO
INTRODUO
A utilizao de enzimas isoladas na transformao de com-
postos orgnicos conhecida a mais de 100 anos
1
. Entretanto,
foi somente a partir da segunda metade da ltima dcada que o
verdadeiro potencial que estes biocatalisadores representam em
sntese orgnica comeou a ser explorado. Durante este perodo,
um grande nmero de reaes catalisadas por enzimas foram
desenvolvidas e tornaram-se familiares aos qumicos orgnicos.
Uma das principais contribuies deste tipo de metodologia
biossinttica tem sido na obteno de compostos enantiomerica-
mente puros ou enriquecidos, geralmente intermedirios ou pro-
dutos finais de rotas sintticas estereocontroladas
2
.
Apesar da generalizao que este tema vem sofrendo, pro-
porcionalmente pouco se sabe e se tem estudado sobre os fato-
res que determinam a especificidade da enzima durante uma
determinada reao. A necessidade deste tipo de investigao
est relacionada a dois fatores. O primeiro diz respeito ao fato
de que se amplia rapidamente o espectro de estruturas de
substratos com os quais se espera que as enzimas sintetica-
mente teis sejam capazes de trabalhar. O segundo, est rela-
cionado com a necessidade de se otimizar aquelas reaes onde
no so obtidos resultados satisfatrios.
Para o entendimento e otimizao dos processos enzimticos
aqui salientados, h dois tipos de abordagens, que podem ser
realizadas de forma independente ou integrada. Uma delas de
natureza terica. Por exemplo, caso seja nossa inteno inves-
tigar se um determinado enantimero de uma mistura racmica
vai ser reconhecido preferencialmente por uma enzima, h dois
mtodos, que envolvem estudo da dinmica molecular (DM)
3
e
estudo de perturbao da energia livre de Gibbs (PEL)
4
do
sistema. Em um tipo de metodologia, mais simples, possvel
colocar um dos enantimeros no stio ativo da enzima e fazer
uma simulao da dinmica molecular do sistema. Em outra
simulao, o segundo enantimero colocado no stio. Posteri-
ormente, feita a anlise das interaes (por exemplo, nmero
de pontes de hidrognio) dos enantimeros nas diferentes simu-
laes. Outro tipo de estudo terico, consiste em colocar um dos
enantimeros no stio ativo e, aps, lentamente transform-lo no
outro enantimero. Durante esta transformao, a perturbao
na energia livre do sistema avaliada. Em geral, estas formas de
abordagem terica esto limitadas ao conhecimento prvio da es-
trutura tridimensional da enzima estudada.
Outra abordagem est baseada no estudo metodolgico de
uma determinada enzima ou sistema. Este tipo de avaliao
emprica til para a obteno de informaes e, alm disso,
pode ser empregada diretamente na otimizao do processo in-
vestigado. Nos ltimos anos, diferentes tcnicas foram aperfei-
oadas ou desenvolvidas para o estudo e otimizao de bio-
transformaes, como, por exemplo, imobilizao
5a
, modifica-
o enzimtica por engenharia gentica
5b
ou via interao no-
covalente (imprinting)
5c
, reincubao do produto ou do
substrato
5d
, inibio enantiosseletiva
5e
, modificao do
substrato
5f
, mapeamento do stio ativo
5g
, estudo da variao do
solvente (solvent engineering)
5h
e estudo da variao dos doa-
dores acila em reaes de transesterificao
5i
. Destas, a tcnica
que utiliza o estudo da variao do solvente a que apresenta
menor custo, maior flexibilidade e velocidade na execuo.
A influncia do solvente tem sido principalmente observada
nas transformaes enantiosseletivas
6-16
. A origem deste efeito
pode ser assim resumida: em se tratando resoluo cintica de
enantimeros, por exemplo, a discriminao deve ser feita pela
enzima entre dois substratos que diferem somente no arranjo
espacial de seus tomos. Exceto naqueles casos onde um dos
enantimeros simplesmente no reconhecido pela enzima, a
eficincia enantiosseletiva desta, para uma determinada reao,
depender essencialmente do arranjo estrutural do stio ativo,
de forma que este reconhea preferencialmente um dos
enantimeros. Em uma aproximao simples, como a estrutura
tridimensional de uma enzima depende das interaes das ca-
deias laterais da protena entre si e com o ambiente, nestes
casos possvel esperar que a influncia do meio (solvente)
seja um dos fatores determinantes da enantiosseletividade des-
ta. Neste caso, a principal pergunta , como precisamente o
solvente determina o perfil enantiosseletivo das reaes catali-
sadas por enzimas? Ou seja, de um modo prtico, o emprego
de um solvente especfico ir aumentar, diminuir ou no influ-
enciar a enantiosseletividade de determinada reao
enzimtica? Em decorrncia de que, necessariamente, as
(bio)transformaes devem ser conduzidas em algum meio
864 QUMICA NOVA, 22(6) (1999)
(ambiente), surgiram na literatura, nos ltimos, anos vrios tra-
balhos tentando elucidar as questes impostas por este tema.
Neste artigo, so revisados e discutidos os principais aspectos
que esto relacionados com a influncia do solvente sobre a
enantiosseletividade de hidrolases, principalmente lipases.
LIPASES
As lipases (E.C. 3.1.1.3) so enzimas hidrolticas presentes
em diversos organismos, incluindo animais, plantas, fungos e
bactrias. Em seu ambiente natural, estas enzimas possuem a
funo de catalisar a hidrlise de triacilgliceris aos cidos
graxos correspondentes e glicerol. Alm das funes metabli-
cas, as lipases possuem um papel importante em biotecnologia,
principalmente na indstria do leo e dos alimentos
17
, e em
sntese orgnica, na preparao de compostos enantiomerica-
mente enriquecidos
2b,c
.
As lipases representam um grupo de biocatalisadores aces-
sveis e de baixo preo que, em geral, so flexveis quanto a
sua especificidade. A diferena mais importante entre as ver-
dadeiras lipases e outras hidrolases, como as esterases, so as
interaes fsico-qumicas com seus substratos. Em contraste
com as esterases, que apresentam atividade de Michaelis-
Menten normal, ou seja, a atividade da esterase aumenta con-
forme a concentrao do substrato [S] aumenta, at um limite
por saturao, as lipases no apresentam atividade enquanto
seus substratos esto presentes na soluo em estado monom-
rico. Contudo, quando a concentrao do substrato est prxi-
ma ou ultrapassa o seu limite de solubilidade, ocorre um rpi-
do aumento na atividade da lipase. A razo pela qual uma lipase
no hidroliza substratos que estejam abaixo de uma concentra-
o mnima (a concentrao micelar crtica, CMC), porm so-
mente em concentrao acima desta, chamada de ativao
interfacial. O mecanismo de ativao interfacial est associado
a mudanas conformacionais na enzima.
Existem duas metodologias biossintticas que podem ser em-
pregadas na resoluo de compostos racmicos atravs de lipases
e outras hidrolases. Por exemplo, conforme o esquema apresenta-
do na Figura 1, o lcool ROH* e o acetato ROAc* opticamente
enriquecidos podem ser obtidos atravs de transesterificao
enzimtica entre ROH racmico e acetato de vinila, seguida de
hidrlise qumica ou, alternativamente, atravs de esterificao
qumica seguida de hidrlise enzimtica. Em ambos os casos, a
resoluo enantiomrica realizada na etapa biocataltica. Depen-
dendo da enzima, substrato e condies experimentais utilizadas,
podem ser obtidos diferentes enantimeros de ROH* e ROAc*
atravs do emprego das duas tcnicas.
envolvidos no rearranjo de ligaes que ocorre durante o pro-
cesso cataltico. O primeiro estado de transio (I) gerado
durante a transformao do complexo de Michaelis-Menten en-
tre a enzima e o doador acila (ster vinlico) em uma espcie
intermediria denominada enzima acilada. Normalmente, so
empregados steres vinlicos como doadores acila. Nestes casos,
o enol formado aps a acilao do resduo reativo da trade
cataltica rapidamente transformado em seu tautmero
(acetaldedo), que mais estvel, e voltil. Esta estratgia des-
loca o equilbrio da reao na direo dos produtos por impedir
uma possvel competio nucleoflica entre o lcool formado
nesta etapa e o substrato. Reaes de transesterificao realiza-
das com excesso de doador acila (ster vinlico) e em solventes
orgnicos anidros so irreversveis. O segundo estado de transi-
o (II) ocorre quando a espcie intermediria enzima-acilada
clivada pelo lcool R
2
OH, formando um ster como produto.
Nos estados de transio I e II, a carga negativa gerada sobre o
oxignio aps o ataque nucleoflico, estabilizada atravs de
ligaes de hidrognio pelos resduos Ser83 e Leu147, que for-
mam o bolso do oxinion na lipase de Humicula lanuginosa
18
.
As lipases so especialmente estveis em solventes orgni-
cos
20,21
. A facilidade com que estas enzimas aceitam uma va-
riedade de substratos no-naturais e de tamanhos diversos, su-
gere que a espinha dorsal polipeptdica flexvel e pode adotar
diferentes conformaes. Como conseqncia, a baixa barreira
de energia que necessria para que ocorram mudanas con-
formacionais dificulta a modelagem e a previso das intera-
es estereoqumicas para este grupo de biocatalisadores
22
.
Outra caracterstica das lipases de que as esterificaes por
elas catalisadas em solventes orgnicos so freqentemente
mais enantiosseletivas que as reaes hidrolticas correspon-
dentes em gua
23
.
O fato de que muitas enzimas mantm atividade cataltica
em solventes orgnicos no possui explicao simples. A hip-
tese correntemente aceita de que, quando a enzima coloca-
da em um solvente orgnico anidro, esta cineticamente con-
gelada no estado nativo. Isto ocorre em parte devido a baixa
constante dieltrica do meio, que produz uma maior efetividade
nas foras eletrostticas responsveis pela manuteno da es-
trutura enzimtica
12,21
.
Figura 1. Alternativas biossintticas que podem ser empregadas na
resoluo enantiomrica ou esterificao direta de um lcool atravs
de hidrolases.
Na Figura 2 mostrado o mecanismo geral para reao de
transesterificao de um lcool catalisada por uma lipase de
Humicula lanuginosa. Dois estados de transio diferentes esto
Figura 2. Representao esquemtica do mecanismo de uma reao
de transestrificao entre um lcool em um ster vinlico catalisada
por uma lipase de Humicula lanuginosa. Baseado em Holquist et al.
19
.
QUMICA NOVA, 22(6) (1999) 865
Uma maior compreenso sobre os mecanismos de ao de
lipases foi obtida a partir da resoluo da estrutura cristalina
de vrias destas enzimas. At o momento, foram caracterizadas
as estruturas tridimensionais das lipases pancretica humana
24
,
do cavalo
25
, e do porco
26
, alm de lipases fngicas de
Rhizomucor miehei
27
, Geotrichum candidum
28
, Humicula
lanuginosa
29
, Penicillium camerbertii
29
, Rhizopus delemar
29
,
Candida rugosa
30
(preliminarmente conhecida como Candida
cylindracea), Candida antarctica
31
e de lipases bacterianas de
Pseudomonas glumae
32
, Chromobacterium viscosum
33
e
Pseudomonas cepacea
34
.
ASPECTOS FSICO-QUMICOS SOBRE
A INFLUNCIA DO SOLVENTE
NA ENANTIOSSELETIVIDADE
DE UMA BIOTRANSFORMAO
Em uma biotransformao, os substratos e os estados de
transio gerados durante o processo cataltico devero ser li-
gados por interaes mltiplas no-covalentes com a superfcie
da enzima. Como conseqncia, a fora de todas estas intera-
es ser fortemente dependente da distncia e dos ngulos de
interao da enzima com o substrato, resultando na formao
de um stio de ligao altamente seletivo. A discriminao entre
dois enantimeros realizada pela enzima atravs de um stio
cataltico, contendo trs pontos de ligao com o substrato,
onde ser gerado um intermedirio tetradrico, como, por exem-
plo, na Figura 3. Qualquer impedimento estrico devido a ar-
quitetura ou conformao da estrutura enzimtica poder auxi-
liar a enzima a diferenciar estruturas semelhantes durante o
processo de interao com o substrato.
insolvel, obedece um modelo de catlise interfacial, mostrado
na Figura 5
38a,22
. Este modelo representa a ao da enzima
sobre dois enantimeros competidores S e S e assume que a
etapa cataltica irreversvel. Desde que as propriedades ativas
de superfcie dos dois enantimeros so idnticas, a razo k
s
/k
d
constante e independe das concentraes relativas dos
enantimeros na interface. Como conseqncia, a etapa onde a
enzima penetra na interface adquirindo uma nova conformao
Enz* no participa do processo de discriminao do
biocatalisador pelo enantimero. Assim, a enantiosseletividade
de uma bioconverso irreversvel em solventes orgnicos
anidros obedecer um processo homocompetitivo clssico, des-
crito pela equao 1.
Figura 3. Representao esquemtica de um possvel complexo
tetradrico enzima-substrato para uma reao de hidrlise de um ster
ou transesterificao de um lcool catalisada por uma lipase de
Candida rugosa. Baseado em Cygler, M. et al.
35
.
A resoluo cintica de um lcool ou ster catalisada por
lipase envolve a formao e colapso de diferentes pares de
intermedirios diastereoisomricos enzima-substrato, relaciona-
dos aos dois enantimeros. Assim, o estado de transio que
determinar a enantiosseletividade de uma enzima ocorre du-
rante a formao ou colapso do primeiro intermedirio forma-
do na etapa lenta. Para os casos onde a condio de
irreversibilidade obedecida, a enantiosseletividade da bio-
transformao depender somente da diferena de energia
(G

) entre os estados de transio dos complexos ativados


Enz-S e Enz-S
36
, conforme a relao de energia livre
estabelecida na Figura 4.
Em seu ambiente natural as lipases so ativadas por uma
interface lipdio-gua onde a fase apolar formada pelos pr-
prios substratos
37
. Em geral, o aumento da atividade de uma
lipase est associado ao aumento da rea da interface (ou con-
centrao do substrato na interface)
38
. O mecanismo de catlise
enzimtica em solventes orgnicos, onde a enzima permanece
Figura 4. Diagrama de energia livre para um processo hipottico
enantiosseletivo
36
.
Figura 5. Modelo de mecanismo para catlise interfacial enzimtica.
ln /
ln /
/
/
S S
S S
E
k K s
k K s
cat m
cat m
[ ] [ ] ( )
[ ]
[ ] ( )
=
( )
( )

0
0
(1)
Na equao 1, k
cat
/K
m
representa a constante de velocidade
aparente de segunda ordem para a reao entre uma enzima e
um substrato em uma concentrao infinitamente pequena; k
cat
a constante cataltica, K
m
a constante de Michaelis e E a
razo enantiomrica
5d
, um parmetro quantitativo e qualitativo
da enantiosseletividade do sistema. Embora a qualidade do pro-
duto da resoluo de um racemato seja caracterizada pelo ex-
cesso enantiomrico, a razo enantiomrica (E) significa um
parmetro muito importante. Um valor elevado de E para um
dado par enzima-substrato essencial para o sucesso de uma
resoluo cintica, j que isto assegura no apenas um excesso
enantiomrico elevado, mas tambm um rendimento proporci-
onalmente alto
1,5d
. Para propsitos prticos, um valor de E abai-
xo de 10 para qualquer biotransformao torna-a invivel como
um processo enantiosseletivo. Por outro lado, este pode ser
considerado bom se estiver situado entre aproximadamente 10
e 30 e, acima disto, excelente. Os valores de E > 200 no
podem ser precisamente atribudos como conseqncia das in-
certezas intrnsecas aos mtodos analticos de determinao do
866 QUMICA NOVA, 22(6) (1999)
excesso enantiomrico (por exemplo, RMN, HPLC ou CG).
Acima deste patamar, uma pequena variao no excesso
enantiomrico do produto ou substrato provoca um significativo
aumento no valor numrico de E. Dependendo do tipo de estudo
realizado, a enantiosseletividade de biocatalisadores tm sido
tambm expressa atravs da razo entre as velocidades iniciais,
n
S
/n
S
, ou razo entre as constantes de especificidade, (k
cat
/K
m
)
S
/
(k
cat
/K
m
)
S
, para os dois enantimeros competidores. A relao
entre os termos cintico, termodinmico e a enantiosseletividade
(E) de uma biotransformao dada pela equao 2.
E
k K s
k K s
cat m
cat m
=
( )
( )
=

/
/ "
e
G
RT

(2)
Para a energia de ligao enzima-substrato (Enz-S e Enz-S,
na Figura 3) h a contribuio de vrios componentes. No caso
de reaes enantiosseletivas irreversveis, a magnitude de
G

, que ser a medida da discriminao da enzima pelos


enantimeros, deve possuir um componente espacial e outro
eletrnico, relacionados exclusivamente a enzima, j que du-
rante o estado de transio o substrato removido do solvente.
Portanto, as enzimas que possuem barreiras energticas baixas
para transies conformacionais, isto , enzimas que possuem
um comportamento do tipo encaixe induzido (induced-fit)
39
,
como as lipases, devem sofrer alteraes no seu perfil
enantiosseletivo em solventes com caractersticas fsico-qumi-
cas diferentes, j que a capacidade de mobilidade conformaci-
onal e a conformao desta devero experimentar variaes.
As enzimas que possuem conformaes mais rgidas (isto ,
barreiras de energia elevadas para a quebra das ligaes no-
covalentes), no devem passar por grandes transformaes con-
formacionais ao adotarem a conformao cataltica ativa. Estas
enzimas, que no seguem um modelo do tipo encaixe induzido
(non induced fit), devem sofrer um grau menor de influncia
do solvente no seu potencial enantiosseletivo.
COMO O SOLVENTE INFLUENCIA A
ENANTIOSSELETIVIDADE DE LIPASES?
A magnitude do efeito do solvente sobre a enantiosseleti-
vidade das lipases pode ser ilustrada a partir de em um recen-
te trabalho, realizado por Kaminska
15
e colaboradores. Foi re-
alizado um estudo sobre o efeito do solvente na enantiossele-
tividade da reao de transesterificao entre 1-(2-furil)-etanol
(1) e acetato de vinila, catalisada pela lipase do pncreas do
porco (PPL) e pela lipozima IM (uma lipase de Rizhomucor
miehei imobilizada) (Equao 3). Os resultados obtidos po-
dem ser observados na Tabela 1. Nas reaes em que foi
empregada a PPL como biocatalisador, dentre os 8 solventes
utilizados, a enantiosseletividade (E) para a reao variou en-
tre 5, quando a reao foi conduzida em cicloexano, a 266,
para a reao que foi conduzida em THF. Quando a mesma
reao foi catalisada pela lipozima IM, dentre os 10 solventes
utilizados, a enantiosseletividade (E) variou entre 50, quando
a reao foi conduzida em tolueno, a 106, para a reao que
foi conduzida em clorofrmio. Estes resultados mostram que
houve uma forte dependncia da enantiosseletividade das
enzimas em funo do solvente empregado. Alm disso, pode-
se tambm observar que as lipases apresentaram comporta-
mento distinto, sendo que a PPL foi consideravelmente mais
influenciada pela variao do solvente.
(3)
O efeito do solvente sobre a enantiosseletividade de lipases
vem sendo objeto de estudo de vrios grupos de pesquisa
6-16
.
Embora seja conhecido que o solvente afeta a especificidade
das lipases em biotransformaes enantiosseletivas, a raciona-
lizao dos mecanismos destes efeitos e o estabelecimento de
modelos que permitam antecipar o comportamento de um de-
terminado sistema ainda incipiente. Como conseqncia, os
mtodos de otimizao que empregam a tcnica de variao do
solvente ainda so empricos, em geral baseados no conheci-
mento de sistemas semelhantes ou na escolha arbitrria de um
determinado solvente. As principais abordagens que tm sido
propostas para a elucidao dos mecanismos de influncia do
solvente no comportamento enantiosseletivo de biotransforma-
es so apresentadas a seguir.
Variao conformacional induzida por solvente
Embora hajam estudos anteriores
6,40-42
, o primeiro modelo
dinmico de stio ativo, elaborado com a finalidade de raciona-
lizar o efeito das caractersticas fsico-qumicas do solvente e
da estrutura do substrato sobre a enantiosseletividade de rea-
es catalisadas por lipases em solventes no aquosos, foi pro-
posto em 1991, por Fitzpatrick e Klibanov
43
. Estes autores pro-
curaram estabelecer um modelo que permitisse prever a enan-
tiosseletividade da subtilisina (uma serino-proteinase de
Bacillus licheniformis) em funo do solvente na reao de
transesterificao entre o lcool 1-fenil-etanol (3) e butirato de
vinila (Equao 4). Neste estudo, foi observada uma correla-
o entre o aumento da enantiosseletividade da subtilisina e a
diminuio do momento de dipolo e da constante dieltrica dos
solventes empregados (Tabela 2). Este resultado foi interpreta-
do com base no efeito do solvente sobre a mobilidade confor-
macional da protena, segundo o modelo de stio ativo apresen-
tado na Figura 6. Neste, o enantimero S do substrato ligado
enzima segundo uma geometria denominada Modo Produti-
vo, onde o grupo fenila, mais volumoso, ocupa a cavidade
maior e o grupo metila a cavidade pequena. J o enantimero
R necessita, para reagir, ocupar o stio de ligao conforme um
Modo No-Produtivo, isto , com o grupo fenila ocupando a
cavidade menor e o grupo metila ocupando a cavidade maior,
sendo que, para que esta aproximao ocorra, este dever en-
contrar um impedimento estrico maior do que o encontrado
pelo enantimero S. A eficincia enantiosseletiva deste proces-
so depende da rigidez do stio ativo. Quando a flexibilidade da
protena aumenta (devido ao aumento da constante dieltrica
do solvente), o impedimento estrico exerce menor influncia,
permitindo um aumento na reatividade do enantimero R, o
que, como conseqncia, diminui a enantiosseletividade da
enzima. Foi observado que a enantiosseletividade da subtilisina
Tabela 1. Influncia do solvente na enantiosseletividade da
reao de transesterificao entre 1 e acetato de vinila
catalisada pela lipase do pncreas do porco (PPL) e pela
lipozima IM
15
.
Lipozima IM PPL
E [%]ee [%]ee Solvente [%]ee [%]ee E
1-S 2-R 1-S 2-R
83 46 96 THF 30 >99 266
82 59 96 hexano 8 70 86
57 79 92 cicloexano 6 66 5
50 71 92 tolueno 18 94 39
94 22 97 CH
2
Cl
2
8 >99 214
106 48 97 CHCl
3
12 >99 225
64 >99 87 CCl
4
14 >99 227
70 92 90 benzeno - - -
83 35 97 dioxano 26 >99 258
69 71 94 iso-octano - - -
QUMICA NOVA, 22(6) (1999) 867
Hidrofobicidade do solvente
Em geral, o efeito da hidrofobicidade do solvente sobre a
enantiosseletividade de biotransformaes tem sido analisado em
termos de partio, ou das molculas de gua presentes nas ca-
vidades do stio ativo
40
, ou dos grupos funcionais do substrato
45
.
Sakurai et al.
40
observaram uma correlao linear entre a dife-
rena de energia livre de ativao (G

) para a reao de tran-


sesterificao entre o ster N-acetil-2-cloroetil-alanina (6) e
propanol, catalisada pela subtilisina em 13 solventes orgnicos,
e o logaritmo do coeficiente de partio em gua-octanol destes
(log P). Para este sistema, foi verificada uma relao inversa
entre o valor de G

, e conseqentemente da enantiosseletivi-
dade, e a hidrofobicidade dos solventes empregados, expressa
em valores de log P. Esta dependncia foi interpretada como
sendo derivada da maior dificuldade encontrada no deslocamen-
to de molculas de gua, presentes na cavidade hidrfoba do
stio de ligao da enzima, em solventes hidrfobos durante o
processo de ligao enzima-substrato. A fora condutora deste
processo surge do deslocamento das molculas de gua que
esto presentes dentro da cavidade hidrfoba do stio de liga-
o da enzima, sendo que, como conseqncia, em solventes
hidrfobos ele termodinamicamente menos favorecido do que
em solventes hidroflicos. Se enantimero lento (menos reativo)
precisa, para reagir, estar ligado ao stio ativo de uma forma
incorreta, conseqentemente ele dever deslocar algumas mo-
lculas de gua a menos que o enantimero rpido (mais
reativo). Neste caso, em solventes hidrfobos o enantimero
rpido sofre, proporcionalmente, uma maior diminuio na sua
reatividade do que o enantimero lento. O efeito disto a di-
minuio da enantiosseletividade da reao.
(5)
Dependendo das caractersticas estruturais e dos grupos fun-
cionais ligados ao carbono quiral, este tipo de fenmeno pode
estar associado aos efeitos de partio dos grupos funcionais
do prprio substrato
45
. Por exemplo, na reao de transesteri-
ficao entre N-acetil-2-cloroetil-fenilalanina (8) e propanol,
catalisada por Aspergillus oryzae (Esquema 1), Tawaki e
Klibanov
45
observaram uma reverso completa da enantiosse-
letividade da enzima, induzida a partir da mudana do solvente.
Conforme pode ser observado na Tabela 3, enquanto que em
solventes hidroflicos, como acetonitrila e DMF, o enantimero
S de 8 mais reativo que o enantimero R, foi observada uma
inverso na ordem de reatividade destes em solventes
hidrfobos, como tolueno e tetraclorometano.
Tabela 2. Enantiosseletividade da subtilisina na reao de tran-
sesterificao de 3 em vrios solventes orgnicos. Valores de
momento de dipolo e constante dieltrica no foram apresenta-
dos no artigo
43
.
a
Enantimero R;
b
enantimero S.
k
cat
/K
M
, M
-1
min
-1
Enantiosseletividade
Solvente S
a
R
b
(k
cat
/K
M
)
S
/(k
cat
/K
M
)
R
1,4-dioxano 170 2,8 61
benzeno 13 0,24 54
trietilamina 330 6,9 48
THF 230 5,8 40
piridina 43 1,4 31
DMF 1,4 0,16 9
nitrometano 16 3,3 5
N-metil-acetamida 1,3 0,38 3
acetonitrila 48 16 3
Figura 6. Representao esquemtica para os modos de ligao dos
enantimeros R e S do lcool sec-feniletanol (3) e o stio da subtilisina
acilado
43
.
obedeceu, na srie de solventes empregados, uma correlao
inversa e linear conforme o aumento do momento de dipolo e
da constante dieltrica dos solventes empregados. Por outro
lado, no foi encontrada nenhuma correlao entre a enantios-
seletividade e a hidrofobicidade dos mesmos solventes. O modo
suposto de ligao de 3 no stio ativo da subtilisina foi poste-
riormente comprovado por estudos de modelagem molecular
44
.
(4)
Esquema 1
Este efeito foi racionalizado segundo um modelo de afini-
dade entre os grupos do substrato e solvente (Figura 7). Nes-
te, o Modo Produtivo de ligao (que favorece a converso
do substrato) representa a situao onde o grupo hidroxila do
resduo serina (Ser) da trade cataltica est em posio ade-
quada para o ataque nucleoflico sobre o carbono carbonlico
de 8. Conforme aumenta a hidrofobicidade do solvente, a
parte hidrfoba (grupo benzila) de 8 sofre partio para fora
do stio ativo. Este modo favorece a reatividade do
enantimero R. Em solventes hidroflicos, o grupo benzila
trocado por um grupo menos lipoflico, sendo que a geome-
tria que a molcula deve adotar neste caso favorece a
reatividade do enantimero S.
868 QUMICA NOVA, 22(6) (1999)
Estrutura do solvente
Nakamura
46
e colaboradores, em trabalho sobre a influncia
da estrutura do solvente na reao entre 1-nitro-propanol (10)
e acetato de vinila catalisada por Pseudomonas sp. (Equao
6), estabeleceram um princpio emprico para a escolha ade-
quada de solventes em reaes catalisadas por lipases, segundo
o qual solventes cclicos so mais adequados para que sejam
alcanadas maiores enantiosseletividades.
(6)
Recentemente, o grupo de Nakamura
47
estudou o efeito da
estrutura da molcula do solvente na reao de esterificao
entre o sulcatol (12) e acetato de vinila, catalisada pela lipase
de Pseudomonas sp. (Equao 7). Foi observado que o empre-
go de alcanos e teres lineares como solventes conduziu a bi-
otransformao a enantiosseletividades maiores do que quando
foram empregados os solventes correspondentes ramificados.
Da mesma forma, foi constatado que, em uma srie homloga
de cicloalcanos, a enantiosseletividade do sistema diminuiu
conforme o aumento do nmero de carbonos. Estas duas lti-
mas tendncias foram explicadas em funo da maior facilida-
de de incorporao das molculas lineares, quando comparadas
com os derivados ramificados, ou com menor nmero de car-
bonos, no caso de solventes cclicos, na cavidade menor do
stio ativo da lipase. Conforme o modelo apresentado na Figu-
ra 8, aqueles solventes que tm suas molculas mais facilmen-
te incorporadas nas cavidades do stio ativo tendem a retardar
mais a velocidade de ligao efetiva do enantimero lento, que
precisa ligar-se segundo um modo no produtivo.
(7)
Tabela 3. Enantiosseletividade da subtilisina da Calrsberg na
reao de transesterificao de 8 em vrios solventes orgni-
cos. Valores de log P no foram apresentados no artigo
45
.
a
Enantimero R;
b
enantimero S.
Velocidade inicial
Mh
-1
enantiossele-
(mg de protena)
-1
tividade
Solvente S
a
R
b

S
/
R
acetonitrila 0,85 0,12 7,1
DMF 0,017 0,003 5,7
piridina 0,65 0,15 4,3
terc-butanol 1,4 0,83 1,7
dioxano 0,70 0,55 1,3
acetona 0,54 0,41 1,3
THF 1,2 0,93 1,3
cicloexanona 0,46 0,41 1,1
diclorometano 0,29 0,33 0,88
3-octanona 0,16 0,22 0,73
nitrobenzeno 0,57 0,95 0,60
acetato de terc-butila 1,4 3,2 0,44
trietilamina 2,7 8,0 0,34
MTBE 2,2 6,4 0,34
cicloexano 3,2 12 0,27
tolueno 0,82 3,2 0,26
octano 2,9 12 0,24
tetraclorometano 1,4 8,9 0,19
Figura 7. Representao esquemtica dos modos de ligao dos
enantimeros R e S de 8 ao stio ativo de Aspergillus oryzae. A cavi-
dade maior representa o stio hidrofbico. O grupo hidroxila do res-
duo serina est propriamente alinhado para o ataque sobre a carbonila
do ster somente nos modos produtivos de interao. Solventes
hidroflicos favorecem o enantimero R enquanto que solventes
hidrfobos favorecem enantimero S de 8
45
.
Figura 8. Mecanismo de inibio enantiosseletiva para a reao de
transesterificao entre sulcatol (12) e acetato de vinila catalisada
pela lipase PS. As molculas que so incorporadas nas cavidades do
stio ativo diminuem a velocidade de reao do enantimero lento (S)
de 12, aumentando a enantiosseletividade da lipase PS
47
.
Adio de gua
Reaes de condensao em sistemas bifsicos so reaes
reversveis
23a
. Diferentemente dos processos irreversveis, a pureza
ptica do substrato e do produto em reaes reversveis depen-
dente de, alm da converso c e da razo enantiomrica E, de uma
parmetro adicional, a constante de equilbrio K. No caso de bio-
transformaes reversveis, o excesso enantiomrico obtido para o
produto ou substrato ser inversamente proporcional a magnitude
de K, e ter um timo quando o equilbrio do enantimero rpido
for alcanado. O efeito da adio gua em reaes de catlise
enzimtica foi estudado por Kitaguchi
42
e colaboradoes na reao
de esterificao entre o cido -bromo-propinico (14) e butanol,
catalisada por lipase de Candida rugosa (CRL), em hexano (Equa-
o 8). Para este sistema, como pode ser observado na Tabela 4, o
valor de E variou entre 17, para a reao catalisada em hexano, a
81, quando a reao foi conduzida em hexano/H
2
O 0,125% (v/v).
Mustranta
48
, por outro lado, verificou que a adio de gua provo-
cou um decrscimo na enantiossseletividade da CRL na reao de
transesterificao entre ibuprofen racmico (16) e pentanol, realiza-
da em n-hexano (Equao 9). Os resultados obtidos por Mustranta
48
(Tabela 5) mostram que a CRL apresentou comportamento distinto
daquele observado por Kitaguchi
42
e colaboradores (Tabela 4).
QUMICA NOVA, 22(6) (1999) 869
(8)
(9)
Fitzpatrick e Klibanov
43
, verificaram que, na reao de
esterificao do lcool 3 por butirato de vinila em dioxano
(Equao 4), a enantiosseletividade da subtilisina diminuiu sig-
nificativamente pela adio de gua, como pode ser observado
na Tabela 6. Quando a mesma reao foi realizada em
acetonitrila, a adio de 0,4% (v/v) de gua produziu efeito
contrrio, elevando a enantiosseletividade.
conseqncia de fortes interaes de natureza eletroesttica
51
.
De acordo com a lei de Coulomb, a fora destas interaes
inversamente proporcional a constante dieltrica, que particu-
larmente alta para gua em relao aos solventes orgnicos. No
caso de enzimas ativas em solventes orgnicos, a gua pode
atuar como lubrificante, fazendo ligaes com os grupos funci-
onais da protena, assim atenuando a rigidez e, como conseq-
ncia, a capacidade de discriminao, do stio ativo. Esta pode
ser uma explicao para os casos em que h queda na enantios-
seletividade por adio de gua
43,48
. Outra possibilidade, surge
do fato que, dependendo da concentrao, a gua presente pode
atuar de forma a aumentar significativamente a velocidade da
reao reversa. Nesta situao, a enantiosseletividade da reao
cai abruptamente aps o enantimero rpido ter alcanado o
equilbrio
23a
. Em trabalho sobre a irreversibilidade de reaes de
transesterificao em solventes orgnicos na presena de exces-
so de steres vinlicos, Hgberg e colaboradores
52
observaram
que a presena de gua pode promover uma segunda reao de
acilao do stio ativo, a partir do acetato formado pelo
enantimero mais reativo. Este fenmeno causa uma diminuio
no valor de E apenas para a reao do substrato. O mecanismo
pelo qual a reversibilidade se processa no foi esclarecido.
Nos casos em que h o aumento da enantiosseletividade da
enzima devido a adio de gua, no foram encontrados mode-
los na literatura consultada que estabeleam um mecanismo
especfico ou geral para tal propriedade. A diferena de com-
portamento encontrada para a CRL pode ser indicativo da exis-
tncia de mais de uma forma de ligao do substrato com a
superfcie da lipase. Esta possibilidade est de acordo com tra-
balho recente de modelagem molecular, que indicou a existn-
cia de dois modos possveis de ligao para cidos carboxlicos
substitudos na posio 2, no stio ativo da CRL53.
Adio de solventes orgnicos em reaes de hidrlise
Em trabalho recente, Kinoshita e Ohno
54
estudaram o efeito
da adio de solventes orgnicos na reao de hidrlise de 2-
acetxi-6-metil-5-hepteno (acetato do sulcatol; 13) catalisada
pela lipase PPS, uma lipase de Pseudomonas cepacea (Equao
10). Conforme pode ser observado na Tabela 7, os solventes
adicionados alteram o perfil enantiosseletivo da reao atravs
de diferentes formas. Por exemplo, a adio de hexano, embora
tenha aumentado a enantiosseletividade devido ao efeito de ini-
bio sobre enantimero S, diminuiu a reatividade de ambos os
enantimeros. Por outro lado, 2,2-dimetilbutano, um solvente
com caracterstica semelhante a do hexano, foi ativador dos dois
enantimeros, sem alterar a enantiosseletividade. A adio de
Tabela 4. Efeito da adio de gua sobre a enantiosseletividade da reao de transesterificao entre 14 e butanol catalisada por
uma lipase de Candida rugosa (CRL)
42
.
Quantidade de gua Velocidade inicial e.e.
adicionada(%) mol.h
-1
.(mg)
-1
Converso(%) de 15-R (%) E
0,00 0,69 44,5 80 17
0,05 1,3 47,5 85 29
0,075 4,0 43 90 39
0,125 6,1 42 95 81
Tabela 5. Efeito da adio de gua sobre a enantiosseletividade da reao de transesterificao entre 16 e pentanol catalisada por
uma lipase de Candida rugosa (CRL)
47
.
Quantidade de e.e.
gua adicionada (mmol) converso(%) de 17-S (%) E
0,0 42 99 >100 (429)
1,0 24 98 >100 (133)
2,5 17 90 23
5,0 13 88 17
Tabela 6. Efeito da adio de gua sobre a enantiosseletivida-
de da reao de transesterificao entre 3 e butirato de vinila
catalisada pela subtilisina da Carlsberg
43
.
Quantidade de Enantiosseletividade
gua adicionada (%) Solvente
R
/
S
0,0 dioxano 50
0,2 dioxano 18
0,4 dioxano 14
0,0 acetonitrila 3,6
0,4 acetonitrila 5,4
Nas enzimas, h uma pequena camada de hidratao que
atua como componente primrio do microambiente enzimtico,
servindo de tampo entre a superfcie da enzima e o ambiente.
Em reaes conduzidas em ambientes no aquosos, a interao
entre os solventes orgnicos e as molculas de gua ligadas
enzima controla a atividade enzimtica
21
. Sabe-se que solventes
que sejam capazes de subtrair esta gua estrutural provocam a
inativao da enzima
49
. Uma caracterstica preponderante das
lipases em meio anidro a rigidez conformacional adquirida
50
,
870 QUMICA NOVA, 22(6) (1999)
ciclopentano aumentou a enantiosseletividade da lipase PPS ele-
vando a reatividade do enantimero R e diminuindo a reatividade
do enantimero S enquanto que, a adio de cicloexano, apesar
da pequena diferena de tamanho no anel, provocou efeito in-
verso no comportamento da enzima. Embora o mecanismo no
esteja claro, estes resultados so indicativo de que a principal
forma de influncia do solvente no comportamento
enantiosseletivo da enzima decorreu de interaes moleculares
entre stios particulares da lipase e molculas do solvente.
Evidncia recente de que isto pode ocorrer, foi obtida aps a
resoluo da estrutura cristalina da lipase do pncreas do porco
(PPL), a partir do complexo lipase-colipase-(ter monooctil-
tetraetileno-gliclico, EMTG)2
6
. Foi observado que, no cristal
do complexo, uma molcula de EMTG, um detergente no
inico, foi incorporada ao stio ativo da enzima durante a cris-
talizao. A presena do detergente foi responsvel pela altera-
o da orientao de um dos resduos da trade cataltica,
His264. A importncia desta observao est relacionada a re-
sultados obtidos em outro trabalho
35
: a anlise de estruturas
tridimensionais de anlogos de estado de transio enzima-
inibidor para a hidrlise de steres metnicos, demonstrou que
a enantiosseletividade da CRL para estes substratos decorre da
destruio de uma ponte de hidrognio entre o anel himidaz-
lico da histidina da trade cataltica e o enantimero lento do
substrato. Pode-se concluir que, em certos casos, a forma de
influncia mais importante do solvente sobre a enantiosseleti-
vidade de lipases, decorre da atuao deste como molcula
individual, e no como ambiente de soluo.
(10)
Influncia da tampa das lipases nos processos seletivos
As lipases existem dentro de um amplo espectro de tama-
nhos e pesos moleculares. Em geral, as semelhanas entre as
suas seqncias de amino-cidos esto limitadas a curtas ex-
tenses localizadas em torno ao stio ativo. Todas lipases, com
exceo das lipases pancreticas, possuem um nico domnio.
Estas enzimas compartilham um padro conformacional co-
mum, denominado conformao / de hidrolase, onde est
situada a trade cataltica (Ser-His-Asp/Glu)
55,56
. Este arranjo,
existente tambm nas esterases e outras enzimas relacionadas,
consiste de estruturas paralelas, flanqueadas em ambos os
lados por hlices . Uma das caractersticas mais conservadas
nas lipases o cotovelo nucleoflico, uma aguda curvatura g
contendo o resduo nucleoflico serina, posicionado entre uma
estrutura e uma hlice .
Os aspectos bsicos sobre os mecanismos de catlise das
lipases, incluindo o processo de ativao interfacial, foram
elucidados a partir da resoluo das estruturas tridimensionais
de vrias destas enzimas, na forma nativa e/ou na forma de
complexo enzima-inibidor. Estudos realizados demonstraram a
existncia de duas conformaes principais, denominas forma
fechada (inativa)
24,27
e forma aberta (ativa)
57,58
. Na conforma-
o fechada, o stio ativo est totalmente oculto sob um curto
segmento helicide, formado por um ou mais loops, denomina-
do tampa (lid) ou aba (flap). Na conformao aberta, a tampa
deslocada para fora do stio ativo, deixando-o totalmente
acessvel ao solvente e substrato. Neste movimento, o lado
hidrfobo da tampa fica totalmente exposto, expandindo consi-
deravelmente a superfcie no polar do stio ativo. Na lipase de
Rhizomucor miehei, por exemplo, durante o processo de ativa-
o, a espinha dorsal da tampa deslocada um pouco mais que
7 , expandindo em aproximadamente 750
2
a rea hidrfoba
da superfcie da enzima
59
. A ativao da lipase decorre da es-
tabilizao da superfcie no polar do stio ativo, gerada pelo
movimento da tampa, atravs do contato deste com um ambi-
ente apolar (interface lipdica)
57
. Alm da desobstruo espaci-
al e da formao da superfcie hidrfoba, o movimento da tam-
pa fundamental para que um dos resduos responsveis pela
formao do oxinion (Ser82) adquira uma conformao favo-
rvel para estabilizao do intermedirio tetradrico
57
. O me-
canismo verificado para este processo sugere que, durante a
ativao, ocorre um movimento rgido do corpo da tampa na
lipase de Rhizomucor miehei. Neste tipo de movimento, a
maioria das cadeias principais e laterais voltam a posio ori-
ginal aps o rearranjo conformacional
57
. Conforme foi demons-
trado para a lipase pancretica humana (HPL)
58
, os arranjos
estruturais que ocorrem durante a reorganizao da tampa so
muito diferentes daqueles que ocorrem na lipase de Rhizomucor
miehei. Na HPL, assim como nas lipases de Candida rugosa
30
e Pseudomonas cepacea
34
, durante este processo h modifica-
o na estrutura secundria destas enzimas. Nestes casos, no
ocorre um movimento de corpo rgido.
Nas lipases, a localizao topolgica, comprimento e com-
plexidade envolvida no movimento da tampa, depende da fa-
mlia e tamanho da enzima
60
. Em muitos casos, os rearranjos
envolvidos esto diretamente relacionados com a criao de
uma geometria adequada para formao do bolso do oxinion
e/ou gerao de uma superfcie prpria para contatos especfi-
cos com o substrato. Estes dois processos esto intimamente
envolvidos na capacidade de discriminao da enzima por mo-
lculas diferentes, ou seja, seletividade. A despeito do progres-
so alcanado na elucidao dos mecanismos de ativao
interfacial de diferentes lipases
60
, baseado principalmente em
estudos de raio-X, ainda existem lacunas na correlao entre
atividade enzimtica e as propriedades da interface. Os dados
de difrao de raio-X fornecem informao importante, mas
predominantemente esttica, sobre as estruturas das protenas.
Em soluo, o movimento da enzima pode ser bastante com-
plexo. Em particular, a forma com que a enzima aproxima-se
do substrato e as interaes da enzima com a interface tem
papel importante no processo de ativao e reconhecimento.
interessante notar que, embora tenha sido demonstrado que o
solvente pode alterar a especificidade
61
, quimiosseletividade
62
,
Tabela 7. Efeito do solvente orgnico adicionado na reao de hidrlise de 13 catalisada pela lipase PPS de Pseudomonas cepacea.
a
Solventes adicionados a uma concentrao de 16mg/ml (concentrao limite para manter o sistema como uma disperso)
54
.
Solvente Adicionado
a
10
2
k
R
(h
-1
) 10
2
k
S
(h
-1
) E
nenhum 2,570,12 2,050,12 12,50,4
hexano 1,890,05 0,830,01 22,80,6
2,2-dimetil-butano 3,520,15 2,670,22 12,90,6
ciclopentano 2,910,09 1,160,08 24,81,4
cicloexano 2,010,09 2,220,11 09,00,2
benzeno 0,670,05 0,210,03 31,13,3
diisopropil ter 2,920,08 1,470,07 19,70,6
QUMICA NOVA, 22(6) (1999) 871
regiosseletividade
5h
, seletividade proquiral
63
, esterosseletivida-
de
44
e estereoespecificidade
64
das lipases e outras hidrolases,
existem vrios dados que indicam a independncia do meca-
nismo de ao e estrutura enzimticas do solvente
12
. Por exem-
plo: (a) o emprego do mtodo de Hammet na anlise da
clivagem de vrios fenil-acetatos para-substitudos, catalisada
pela subtilisina em gua e em diferentes solventes orgnicos,
revelou que a estrutura do estado de transio para a acilao
da enzima independente do solvente; (b) estudos cinticos de
efeitos isotpicos indicaram que o estado de transio para a
desacilao da subtilisina acilada no muda com o solvente;
(c) estudos de RMN em estado slido revelaram que a nica
rede de ligaes de hidrognio existente na trade cataltica da
proteinase a-lise, mantida intacta tanto em octano como em
acetona; (d) foram observadas estruturas indnticas para cris-
tais da subtilisina obtidos em gua e em acetonitrila.
Em vista destes fatos, no estudo das lipases, torna-se im-
portante o exame do movimento dinmico da tampa durante
a interao da enzima com o substrato. Infelizmente, os mo-
vimentos dos loops peptdicos ocorrem em escalas de tempo
que no permitem, at o presente momento, o emprego de
mtodos padres de dinmica molecular no estudo de mode-
los atmicos completos de protenas
65
. Neste campo, mto-
dos alternativos, como dinmica browniana (DB) e dinmi-
ca essencial (DE), foram recentemente utilizados na investi-
gao da dinmica da tampa
65
e da lipase de Rhizomucor
miehei
66
, em diferentes solventes. Estes estudos indicaram
que a enzima ativada conforme diminui a constante
dieltrica do solvente e a tampa movida para fora do stio
ativo, atravs da estabilizao da interao entre os resduos
Arg86 e Asp91
65
. Na simulao realizada em hexanoato de
metila, foi observado que uma molcula do ster penetrou
na regio de encaixe do stio ativo
66
. Este movimento foi
orientado atravs de interaes hidrfobas entre o substrato
e os resduos Pro100 e Pro101. Foi observado que a cadeia
alquila da molcula do hexanoato de metila moveu-se para
abaixo do resduo Phe94, empurrando-o para cima. Possi-
velmente, este movimento foi responsvel pela ativao da
lipase, alm de ter mudado significativamente a dinmica da
tampa. Estes resultados esto de acordo com trabalho preli-
minar realizado por Norin e colaboradores
50
.
CONCLUSES
O solvente pode alterar a especificidade, quimiosseletivi-
dade, regiosseletividade, seletividade proquiral e enantiosse-
letividade das lipases e outras hidrolases. Vrios modelos
foram propostos para explicar a mudana da seletividade des-
tas enzimas em funo do solvente. Estes, foram baseados na
alterao da flexibilidade conformacional do sitio ativo, na
partio de grupos funcionais do substrato ou de molculas
de solvente para fora ou para dentro das cavidades do sitio
ativo, e na estrutura do solvente. Dependendo do substrato,
foram observados comportamentos diferentes para a mesma
enzima. Nestes casos, foi sugerida a existncia de mais de
uma possibilidade de ligao do substrato com a superfcie
da enzima.
O evento primrio da atividade cataltica das lipases a
ativao interfacial. Existem vrias indicaes de que a com-
petncia cataltica destas enzimas governada principalmente
pela interao entre a tampa do stio ativo e o meio. Foi obser-
vado que os arranjos conformacionais que ocorrem durante a
reorganizao da tampa causam mudanas estruturais em seto-
res da protena responsveis pela ligao do substrato e estabi-
lizao dos estados de transio dos intermedirios de reao.
Estes indicativos sugerem h forte influncia da tampa na ca-
pacidade de discriminao da enzima por diferentes substratos.
A dinmica destas interaes ainda no foi esclarecida. O fato
de que o tipo de reorganizao molecular, que ocorre devido
ao movimento da tampa, varia conforme a lipase, sugestivo de
que o solvente afeta estas enzimas segundo um mecanismo parti-
cular para cada uma delas.
Em resumo, a forma com que o solvente afeta a enantiosse-
letividade de lipases e outras hidrolases parece envolver a com-
posio de uma srie de fatores, interdependentes ou no, rela-
cionados com a estrutura do substrato e com os diferentes n-
veis de interao entre a enzima e o microambiente ou ambi-
ente de soluo que a envolvem.
O ESTADO DA ARTE
Nos ltimos anos, grande ateno tem sido voltada para os
mecanismos que controlam o acessibilidade do substrato ao s-
tio ativo das enzimas. O grande nmero de estruturas tridimen-
sionais de lipases nativas e de complexos enzima-inibidor foi
responsvel pelo melhor entendimento de como funcionam
estes biocatalisadores a nvel molecular. Contudo, muito pouco
conhecido sobre a dinmica das interaes destas enzimas,
com a interface e com o substrato, sob a influncia de um
determinado solvente. A importncia do emprego de mtodos
tericos reside no fato de que possvel, atravs da observa-
o de trajetrias de microssegundos, ver a dinmica da re-
gio do stio ativo em diferentes solventes. Por outro lado,
muitos outros dados experimentais e estruturais ainda so ne-
cessrios para a melhoria do entendimento sobre a
especificidade das lipases.
A capacidade atual da cincia em fornecer respostas para as
perguntas que esto sendo feitas em torno do tema aqui discu-
tido, pode ser ilustrada a partir de dois trabalhos recentes. Foi
observado que, durante a reao de transesterificao do
sulcatol, realizada em diclorometano, houve o aumento da enan-
tiosseletividade da lipase de Pseudomonas cepacea em funo
da converso do substrato
67
. Atravs das investigaes experi-
mentais realizadas e modelos tericos analisados, os autores
no obtiveram explicao para este fenmeno nico. Em estu-
dos realizados por nosso grupo, foi observado uma correlao
entre o aumento da enantiosseletividade da lipase do pncreas
do porco (PPL), em reaes de transesterificao, e o aumento
da constante dieltrica e hidrofobicidade dos solventes empre-
gados
68
. Os resultados do estudo realizado foram indicativos
de que a PPL possui comportamento enantiosseletivo diferente
da maioria das lipases, sendo que no foi possvel esclarecer a
razo pela qual este fenmeno ocorre. Independente da aborda-
gem utilizada, muitos detalhes moleculares da ao das lipases
devem ser ainda determinados. Em particular, o entendimento
dos mecanismos moleculares que determinam a seletividade
enzimtica em solventes orgnicos.
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68. Artigo submetido para publicao.

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