REPROGRAMACION

NUCLEAR Y CELULAR
Dra. Lilia Cruz de Montbrun
Miembro Correspondiente Nacional, puesto nmero 6.
Novedades Cientficas, ANM. ao 1, nmero 5. 21/5/2009
Comisin de Ciencias Bsicas
RESUMEN:
La posibilidad de usar clulas sanas para reemplazar las que estn enfermas (terapia celular) en el
tratamiento de numerosas enfermedades degenerativas y genticas ha estimulado intensos esfuerzos de
investigacin en todo el mundo con el fin de desarrollar mtodos que permitan obtener la gran variedad de
clulas necesarias, que sean seguras y eficaces para los pacientes y aceptables desde el punto de vista tico.
Avances en esa direccin se han logrado recientemente con la introduccin de nuevas tcnicas de
reprogramacin nuclear y celular: cambios provocados en la expresin gentica de un tipo de clula permiten
que sta se convierta en un tipo diferente. As, por ejemplo, una clula cutnea se convierte en una neurona o
una de pncreas exocrino en una clula beta productora de insulina (1).
En este trabajo nos referimos a la reprogramacin de clulas diferenciadas a un estado pluripotencial para
generar las llamadas clulas madre pluripotentes inducidas, CMPi, (en ingls iPSC), similares en
morfologa y funcin a las clulas madre embrionarias:
1.- Reprogramacin por genes de factores de trasncripcin introducidos a las clulas por vectores
virales.
Genes de Oct4, Sox2, c- Myc y Klf4 y retrovirus fueron utilizados con xito por primera vez en la literatura
para reprogramar fibroblastos de ratn (2). Con diversas combinaciones de factores de transcripcin y
vectores, en varios tipos celulares y especies, incluyendo humana, y con amplias variaciones en eficiencia y
rapidez se ha obtenido CMPi (3,4,5). Destaca la alta eficiencia y rapidez de reprogramacin a CMPih de
queratinocitos primarios provenientes de biopsias de piel y de un solo pelo arrancado de la cabeza de un
adulto, fuentes potencialmente muy favorables (4). Es muy interesante que la reprogramacin de clulas
madre neurales del adulto a CMPi puede lograrse con el solo factor OCT4, puesto que expresan en forma
endgena Sox2, c-Myc y Klf4 (5).
Existe riesgo de que los factores genticos extraos insertados en el genoma de la clula blanco ocasionen
mutaciones y otros cambios. c-Myc and Klf4 son oncognicos. Estos riesgos se pueden reducir con el uso de
vectores que no se integran al genoma y que se eliminan espontneamente de las clulas despus de varios
pasos en el cultivo (6)
2.- Reprogramacin por protenas recombinantes
H. Zhou y col. (7) utilizaron, en vez de material gentico, los factores de trasncripcin Oct4, Sox2, c- Myc
y Klf4, que son protenas, combinadas por su extremo carboxlico con el pptido poliarginina (11R)
capaces de atravesar las membranas celular y nuclear, para obtener clulas madre pluripotentes inducidas a
partir de fibroblastos murinos, sin los riesgos antes mencionados.
Sera muy recomendable utilizar las protenas recombinantes en los queratinocitos primarios, los cuales,
segn Assen y col (4) son mucho ms fciles de reprogramar que los fibroblastos o en clulas madre neurales,
las cuales requieren un solo factor (5).
Perspectiva: Los avances logrados en reprogramacin celular son de alta significacin para la investigacin
bsica y clnica y hacen cada vez ms factibles las tan esperadas terapias celulares con clulas especficas
para pacientes especficos.
Reprogramacin Nuclear
Definicin:
Cambio en la expresin gentica que permite que un
tipo de clula se transforme en un tipo distinto
Ejemplos:
Fibroblastos se convierten en clulas madre
pluripotenciales (CMP) similares a las clulas
embrionarias
Clulas hepticas se convierten en clulas que
producen insulina
Importancia de las investigaciones sobre
reprogramacin nuclear y celular
Conocer los factores que determinan que las clulas se
mantengan estables en su estado fisiolgico, sea diferenciado
o indiferenciado y los mecanismos de cambio de un estado a
otro
Posibilidad de obtener clulas sanas para terapia de
reemplazo celular autlogo evitando el uso de
inmunosupresin
Cultivo de lneas celulares patolgicas para estudiar in vitro la
naturaleza de la enfermedad y probar drogas y otras opciones
teraputicas
Reprogramacin del ncleo de una clula
somtica por transferencia a un vulo
enucleado
Clulas madre
embrionarias
(pluripotentes)
FETO
(pluripotentes)
Adulto frtil
(clonado)
Totipotentes
Modificado de la fuente: J. B. Gurdon y col, Science 322, 1811 -1815 (2008)
1996: Primer mamfero clonado: la oveja Dolly (I. Wilmut
y K. Campbell)
1962: Primer anfibio obtenido por clonacin (J.B.Gurdon)
2007: Primer primate obtenido por transferencia
nuclear (J. A. Byrne)
Es muy probable que el vulo humano
enucleado tambin contenga los componentes
necesarios para la reprogramacin del ncleo,
pero la clonacin humana reproductiva est
prohibida por la mayora de las legislaciones
Transferencia de mltiples ncleos de
clulas somticas a un oocito de anfibio
Todos los ncleos se reprograman a estado
embrionario pero la clula no se divide
Reprogramacin nuclear
por fusin celular
El ncleo de la clula A es
reprogramado:
Su actividad gentica se
comporta como la de la
clula B, dominante
Los experimentos de transferencia nuclear
demostraron que la diferenciacin celular es
reversible y se produce por factores epigenticos,
sin modificar la secuencia del ADN de los
cromosomas.
La necesidad de obtener clulas madre
pluripotentes sin utilizar embriones ni ovocitos
(difciles de conseguir y ticamente cuestionables)
estimula investigaciones sobre los factores
reguladores y reprogramadores
Modificado de la fuente: J. B. Gurdon y col, Science 322, 1811 -1815 (2008)
Intercambio de protenas nucleares en una clula
somtica y despus de la transferencia del ncleo
a un vulo enucleado
Ncleo transferido
y reprogramado
por protenas
Ncleo diferenciado
Factores de transcripcin
Son protenas que participan en la regulacin de la
transcripcin del ADN, activando o reprimiendo
la expresin de diversos genes
Pueden actuar unindose a secuencias concretas
de ADN, a otros factores o directamente a la ARN
polimerasa.
En clulas humanas existen aprox 2500
Reprogramacin nuclear y celular
para inducir la formacin de clulas
madre pluripotentes
1.- Por genes de factores de transcripcin
unidos a vectores virales
2.- Por protenas recombinantes:
Factores de transcripcin unidos
a poliarginina
Shinya Yamanaka,
M.D., Ph.D.
Institute for Frontier
Medical Sciences
Universidad de Kyoto,
Japn
S. Yamanaka concibe la idea de
reprogramar el ncleo de clulas
somticas a un estado pluripotente,
con factores reguladores de la
transcripcin gentica.
Comienza a trabajar con una
lista de 24 candidatos. Logra
obtener resultados efectivos al
insertar en el ncleo celular
con vectores retrovirales, los
genes que codifican slo 4
factores de transcripcin :
OCT4, SOX2,
KLF4, c-MYC
Reprogramacin por genes de factores de
transcripcin unidos a vectores retrovirales
Producen lneas de clulas madre pluripotentes que
se comportan morfolgica y funcionalmente como
las clulas madre embrionarias
Las denominan
Induced Pluripotent Stem Cells (iPSC)
que traducimos como
Clulas Madre Pluripotentes inducidas
(CMPi)
Takahashi K, Yamanaka S. Induction of
pluripotent stem cells from mouse embryonic
and adult fibroblast cultures by defined
factors. Cell. 2006; 126(4):663-676.
El trabajo fue publicado en el ao 2006
OCT4, SOX2,
KLF4, c-MYC
J. Yu y col, Induced Pluripotent Stem Cell Lines
Derived from Human Somatic Cells.
Science 2007; 318(5858) 1917 1920
Las clulas madre pluripotenciales inducidas
tienen las propiedades caractersticas de las
clulas madre embrionarias
Clulas somticas humanas
son reprogramadas a CMPi
por genes exgenos de los factores
OCT4, SOX2, NANOG, LIN28
introducidos con lentivirus
James A. Thomson
Universidad de
Wisconsin
De los cuatro factores utilizados para la
reprogramacin nuclear y celular
OCT4, SOX2, NANOG, LIN28:
OCT4 y SOX2: indispensables
NANOG aument hasta 200 veces la eficacia
LIN28 mejora la recuperacin de colonias, pero se
puede prescindir de l
JA Thomas y col. Reprogramaron fibroblastos fetales humanos (lnea
bien caracterizada IMR90) y una lnea de fibroblastos postnatales
humanos de piel de la frente.
Equipo de Investigadores del Centro de Medicina Regenerativa de
Barcelona, Espaa, dirigidos por Juan Carlos Izpisa,
Obtuvieron clulas madre pluripotentes humanas a
partir de queratinocitos primarios reprogramados
Aasen, T y col. Efficient and rapid generation of induced
pluripotent stem cells from human keratinocytes
Nature Biotch. 2008; 26(11):1276-1284
Induccin de clulas madre pluripotentes humanas
(CMPhi) a partir de queratinocitos primarios
Transduccin retroviral de factores de transcripcin:
Cuatro: OCT4, SOX2, KLF4, c-MYC
Tres: OCT4, SOX2, KLF
Mtodo de reprogramacin:
Rapidez : en 10 das de cultivo a partir de la fecha
de la infeccin se obtienen las colonias de CMPhi.
Eficiencia 1 % (En comparacin con fibroblastos:
2 veces mas rpido y 100 veces mas eficaz)
Fuentes fcilmente accesibles para la
produccin de clulas en el laboratorio
y eventualmente para la terapia clnica:
Basta un solo pelo de un adulto o una
biopsia de epidermis
Q F
Pelo humano en cultivo
Clulas madre pluripotentes humanas inducidas
(CMPhi) a partir de queratinocitos primarios
OCT4, SSEA3
OCT4, CX43
TRA1-60,
NANOG, DAPI
TRA1-81, SOX2
DAPI
OCT4, IGF1R,
DAPI
Expresin de marcadores de las clulas embrionarias presentes en las CAMPhI
Antigenos de superficie SSEA3, TRA-1-60, TRA-1-81 y receptor IGF1
Factores de transcripcion nuclear OCT4, SOX2, NANOG
Conexina 43, protena de la unin intercelular (gap)
Inmunofluorescencia
Aasen, T y col. Efficient and rapid generation of induced pluripotent
stem cells from human keratinocytes
Nature Biotch. 2008; 26(11):1276-1284
Clulas diferenciadas a partir de Clulas Madre Pluripotentes
Humanas inducidas por reprogramacin de queratinocitos
Neuronas dopaminrgicas
Endodermo
Mesodermo Cardiomiocitos
Neuronas
Aasen, T y col. Efficient and rapid generation of induced pluripotent stem cells
from human keratinocytes Nature Biotch. 2008; 26(11):1276-1284
Combinaciones efectivas:
4 genes: OCT4, SOX2, KLF4, c-MYC
3 genes: OCT4, SOX2, KLF4
2 genes: OCT4, KLF4
1 gene: OCT4
4 genes: OCT4, SOX2, NANOG, LIN28
Generacin de clulas madre pluripotentes
por genes de factores de trasncripcin
unidos a vectores virales
Ratn:
A partir de derivados de las 3 capas germinales:
Mesodermo: fibroblastos
Endodermo: clulas epiteliales (hepatocitos y estmago
Ectodermo: queratinocitos
clulas madre neurales adultas (OCT4)
Humano:
Fibroblastos de la dermis (OCT4, SOX2, KLF4)
Queratinocitos primarios de biopsia de piel juvenil y
pelo del adulto (mtodo de alta eficiencia y rapidez)
Clulas Madre Pluripotentes inducidas
por Genes de Factores de Transcripcin
Fuentes de clulas somticas
1. Reprogramacin global transcripcional y
epigentica
2. Capacidad de auto-renovacin adquirida
3. Pluripotencialidad
4. Silenciacin de los transgenes retrovirales
5. Expresin endgena de factores de
transcripcin
Caractersticas de las clulas madre
pluripotenciales inducidas por
transgenes retrovirales
Aplicacin clnica es limitada
por el riesgo que implica la
presencia continua de material
gentico extrao en las clulas
con la posibilidad de generar
mutaciones en el sitio de
insercin viral en el genoma
y tumores.
Limitaciones de la reprogramacin celular por
genes de factores de transcripcin insertados
con vectores virales
Los trabajos de S Yamanaka, JA Thomson y otros autores son muy
importantes porque han demostrado que la reprogramacin in vitro
de clulas somticas al estado embrionario puede lograrse con muy
pocos factores de transcripcin.
GENES
Yu J , Hu K, Smuga-Otto K, Tian S, Stewart R, SlukvinII, Thomson J A. Human
Induced Pluripotent Stem Cells Free of Vector and Transgene Sequences.
Science. Mayo 2009; 324: 797-801
Eficiencia baja: 3 a 5 colonias de CMPhi por
milln de clulas somticas iniciales
Una sola transfeccin de vectores episomales basados en
oriP/EBNA1 (antgeno nuclear 1 del virus Epstein-Barr)
combinados con OCT4, SOX2, NANOG, LIN28, c-Myc,
KLF4 y SV40LT seguida por prdida espontanea de dichos vectores,
ocurrida con sucesivos ciclos de divisin celular
Continuaban replicndose normalmente en cultivo despus de 7 meses de la transfeccin
viral y conservando sus caractersticas similares a las de las clulas embrionarias
Clulas madre pluripotenciales humanas
inducidas (CMPhi) libres de secuencias de vector
y transgenes a partir de fibroblastos de piel neonatal
fueron obtenidas por:
Sheng Ding,
PhD en Qumica,
The Scripps Research
Institute,
La Jolla, California
Zhou H, Wu S, Joo JY, Zhu S, D W Han,T Lin, S Trauger, G Bien, S Yao,Y
Zhu, G Siuzdak, H R Schler, L Duan y Sheng Ding Generation of Induced
Pluripotent Stem Cells Using Recombinant Proteins. Cell Stem Cell. 2009;
4 (5):381-384
AVANCE MUY IMPORTANTE
(Abril de 2009)
Por primera vez se logra la
reprogramacin nuclear y
celular sin introducir material
gentico extrao en las clulas
REPROGRAMACIN NUCLEAR POR
PROTEINAS
REPROGRAMACIN NUCLEAR POR PROTEINAS
RECOMBINATES
La combinacin con el pptido poli-arginina de 11
residuos les confiere capacidad de penetracin.
Estrategia: Hacer llegar al ncleo celular
los factores de transcripcin que van a
modificar la expresin gentica endgena
Los FT son protenas
Deben ser presentadas en formas que
atraviesen las membranas celular y nuclear
Reprogramacin celular por tratamiento transitorio
con protenas reguladoras de la expresin gentica
Las protenas recombinantes utilizadas
conjuntamente fueron los factores de
trascripcin Oct4, Sox2, c-Myc y Klf4
combinados por su extremo carboxlico
con el pptido poliarginina (11R).
Eficiencia: 3 colonias de
CMPip por cada 50000
fibroblastos tratados
das
El tratamiento con las 4 proteinas
reprogramadoras recombinantes
purificadas, Oct4-11R, Sox2-11R,
Klf4-11R y c-Myc-11R, capaces de
penetrar en las clulas, es suficiente
para que fibroblastos embrionarios
murinos en cultivo se conviertan en
clulas madre pluripotenciales
(CMPip) morfolgica y
funcionalmente equivalentes a
clulas embrionarias: capaces de
autorenovarse, diferenciarse en todo
tipo de tejidos, incorporarse a
embriones y dar origen a quimeras
que transmiten el genoma del ncleo
reprogramdo a su descendencia a
travs de la lnea germinal.
blastocisto
cresta genital en feto
FETO
1. Elimina el riesgo de modificar el genoma de la clula blanco por
secuencias genticas exgenas y, por lo tanto se logra clulas
madre pluripotentes inducidas, CMPi, (piPSC) ms seguras.
2. El mtodo reprogramador por transduccin de proteinas
(protein transduction method) es mucho ms simple y rpido
que los ms avanzados mtodos genticos disponibles hasta el
presente
3. Esta ampliamente disponible la capacidad para producir en gran
escala las proteinas recombinantes
4. El mtodo reprogramador est definido qumicamente y podra
aplicarse en forma ms amplia y econmica
Ventajas de la reprogramacin celular
con protenas recombinantes
vs reprogramacin con genes exgenos
CONCLUSIONES
Los mtodos de reprogramacin nuclear y
celular estn progresando muy rpidamente
Para mejorar la seguridad del procedimiento,
su eficacia y rapidez, sera muy recomendable
utilizar las protenas recombinantes en los
queratinocitos primarios, los cuales, segn
Assen y col. son mucho ms fciles de
reprogramar que los fibroblastos. Tambin en
clulas madre neurales, las cuales requieren
un solo factor de transcripcin externo.
PERSPECTIVA
Los avances logrados en reprogramacin
celular son de alta significacin para la
investigacin bsica y clnica y hacen
cada vez ms factibles las tan esperadas
terapias celulares con clulas especficas
para pacientes especficos.
Bibliografa:
1. Gurdon JB y Melton DA Nuclear Reprogramming in Cells. Science 2008; 322:
1811 -1815
2. Takahashi K y Yamanaka S. Induction of pluripotent stem cells from mouse
embryonic and adult fibroblast cultures by defined factors.
Cell. 2006; 126(4):663-676.
3. J. Yu y col, Induced Pluripotent StemCell Lines Derived fromHuman Somatic
Cells .Science 2007; 318(5858) 1917 1920
4. Aasen T y col. Efficient and rapid generation of induced pluripotent stem cells
from human keratinocytes Nature Biotch. 2008; 26(11):1276-1284.
5. Kim JB y col. Oct4-Induced Pluripotency in Adult Neural Stem Cells. Cell.
2009;136:411-419
6. Yu J, Hu K, Smuga-Otto K, Tian S, Stewart R, Slukvin II, y Thomson JA. Human
Induced Pluripotent Stem Cells Free of Vector and Transgene Sequences.
Science. 2009; 324: 797-801
7. Zhou, H y col. Generation of Induced Pluripotent Stem Cells Using Recombinant
Proteins. Cell Stem Cell, 2009, 4 (5):381-384