Universidad Nacional del Santa

Facultad de Ingeniera
E. A. P. de Biotecnologia


Tema:
BIOCATALISIS ENZIMATICA


Curso:
LABORATORIO DE BIOPROCESOS II


Docente:

Grupo:


Integrantes:





Nvo.Chimbote Per




BIOCATLISIS ENZIMTICA

1. OBJETIVOS
OBJETIVO GENERAL
Disear y realizar diferentes experiencias de estudios cinticos de un preparado
enzimtico en bruto de invertasa en sus formas solubles e inmovilizadas.

OBJETIVOS ESPECFICO
o Obtener el preparado enzimtico en bruto de invertasa de levadura.
o Determinar el rango de linealidad y actividad enzimtica (actividades
volumtrica y especfica) del preparado soluble.
o Inmovilizar invertasa en geles.
o Disear y montar el sistema mini-reactor con invertasa inmovilizada, para
determinar parmetros cinticos de la enzima.
o Determinar los parmetros cinticos de la invertasa soluble.

CONSIDERACIONES

Para el diseo se debe considerar:

o Usar soluciones concentradas de sacarosa: 0.2M 0.6M.
o Utilizar como soporte alginato de sodio al 1.5% - 2.5% (p/v).
o Usar un sistema mini-reactor enzimtico en reciclo.
o Definicin: una unidad internacional de invertasa es aquella cantidad de
enzima necesaria que hidroliza un micromol de sacarosa por minuto a 40C y
pH 4.7.





2. METODOLOGA EXPERIMENTAL
a. Determinacin de protenas mediante el mtodo de Bradford.-
Reactivo: Disolver 0.1g de azul de coomassieg G-250 en 250 ml de etanol al 98%,
mas 100ml de acido fosforico al 85% y con agua destilada aforar a un litro.
Se agrega a un tubo de ensayo 500 l de muestra convenientemente
diluida.
Luego se aade 5ml de reactivo de Bradford (a cada muestra) y deja
reaccionar durante 5 minutos.
Se leer la absorbancia a una longitud de onda de 595nm,
contrastndola con un blanco de agua destilada de 500 l.
Posteriormente se obtendr la concentracin interceptando la medida de
la absorbancia en la curva de calibrado.
La curva de calibrado se obtendr a partir de muestras de concentracin
conocida de una solucin estndar de albmina de suero de bovino y analizadas
segn el procedimiento descrito anteriormente.

b. Determinacin de azcares reductores mediante el mtodo del DNS.-
Para la preparacin de este reactivo, se disuelve el tartrato en aproximadamente 20
ml de agua, paralelamente se disuelve el DNS en pequeas cantidades con ayuda
de un agitador magntico y calentando. Ambas soluciones se mezclan en un matraz
aforado de 50 mL y se agita hasta la completa disolucin de todos los componentes,
para posteriormente aforar hasta 50 mL.

Se precisa realizar los siguientes pasos para el anlisis de la muestra:
o Se aade 1 mL de reactivo DNS a un 1 mL de muestra a anlizar.
o Se mantiene la mezcla en bao de agua a ebullicin durante 5 minutos para
luego enfriar con agua helada.
o Se aaden 10 ml de agua destilada, y se deja reposar por 15 minutos, luego
agitar.
o Se lee la absorbancia a 540 nm, utilizando agua como blanco.
o La concentracin se obtiene interceptando la medida de absorbancia en la
curva de calibrado.
La curva de calibrado para el azcar se obtiene a partir de muestra de
concentracin conocida y analizadas segn este procedimiento.
c. Obtencin del preparado de enzimtico en bruto de inverstasa de levadura.-
Se mezclara 10g de levadura desecada con 50 ml , de agua destilada en una
fiola de un litro hasta que la solucin ablande todos los acumulo.
Se tapara el frasco con una torunda de algodn y se colocara en un bao de
agua manteniendo la temperatura entre 40 a 45C,y se dejara Autolisar la
preparacin por 24 horas.
Se centrifugara la mezcla despus de al autolisis a 150 r.p.m. durante 15
minutos a temperatura ambiente.
Se decantara el liquido sobrenadante claro y de color ambar en una probeta;
se anotara el volumen y se vertira la solucion en un vaso manteniendo entre
0 y 2 C en bao de hielo.

Esta solucin obtenida constituye la enzima original bruto, fraccin I , es necesario
determinar la actividad especifica y total de esta preparacin mediante el anlisis de
determinados diluciones del enzima, la concentracin de protenas y el volumen
total(guarde para esto un volumen de 5 ml de la fraccin I a 0 C)

d. Rango de linealidad de la enzima

Se realizar a diferentes concentraciones de enzimas, 0.2, 0.4, 0.6, 0.8, y 1, se graficar
tiempo vs. Sustrato o Tiempo vs. Producto.
Se obtendra una grfica parecida a la siguiente






e. Medida De La Actividad Especifica De La Enzima

La actividad enzimatica de la invertasa adems de indicarnos su recuperacin puede
servir como un ndice de la calidad y rendimiento de nuestro trabajo durante el
proceso de purificacin.

Utilizaremos el mtodo del DNS para determinar la actividad enzimtica.
S
P
T
0.8
0.6
0.2
La conversin de la sacarosa en glucosa y fructosa.

f. Inmovilizar invertasa en geles

El mtodo de inmovilizacin es por unin qumica. Se debe procurar que la
inmovilizacin incremente la afinidad por el sustrato, disminuya la inhibicin, amplie
el intervalo de pH ptimo y reduzca las posibles contaminaciones microbianas.
El alginato es un polmero natural (polisacrido) y es un soporte inorgnico y el
mtodo de inmovilizacin es el siguiente
o Preparar una disolucin de alginato de sodio al 2% y calentar a 80C por 15
minutos y luego enfriar a 45C.
o De la disolucin anterior tomar 5 mL, mezclar con 1 mL del preparado
invertasa y cargar toda una jeringa provista de aguja.
o Con la jeringa gotear la mezcla dentro de 30 mL de solucin agitada de CaCl2
0.1 M.
o Los beads esfricos de enzima inmovilizada, dejarlos reposar en refrigeracin
por 3 a 4 horas y luego lavarlos con una solucin de CaCl2 0.05 M.
o Empacar los beads dentro del mini-reactor.

g. Disear y montar el sistema mini-reactor con invertasa inmovilizada, para
determinar los parmetros cinticos de la enzima.
La forma usual de usual de determinar los parmetros cinticos es a travs de
mediciones de velocidad inicial de reaccin a diferentes concentraciones de
aquellas sustancias que la afectan. La manera ms adecuada de obtenerlos es por
linealizacin de las ecuaciones cinticas. Los mtodos ms empleados aparecen en
la tabla siguiente, para un modelo cintico simple



s K
s K
V

Mtodos de linealizacin para determinar parmetros cinticos
E + S E S E + P
Mtodo Eje Y Eje X
Intercepto
Eje Y
Intercepto
Eje X
Pendiente
Lineweaver Burke 1/v 1/s 1/v -1/k k/V
Hames s/v S k/V -k 1/v
Eadie Hofstee V v/s V v/k -k









Figura N 2: Determinacin de parmetros cinticos mediante mtodo de inversos de
Lineweaver Burke

3. MATERIALES, INSTRUMENTOS Y REACTIVOS
Levadura desecada
CO3HNa 0.1 M
Bao termosttico de agua
Centrifuga
Alginato de sodio (1.5% - 2.5%)
DNS (para azcares reductores)
Sacarosa (0.2 M 0.6 M)
Sal comn
Reactivos de Bradford (para protenas)
Mini-reactor enzimtico en reciclo.




4. CRONOGRAMA DE ACTIVIDADES
K/V
1/v
1/V
-1/K 1/s
Determinacin de protenas mediante el mtodo de Bradford. Y determinacin
de azucares reductores mediante DNS
Da: martes 21
Hora : 8: 00 a.m. a 12:00 M

Obtencin del preparado de enzimtico en bruto de inverstasa de levadura.-
Da: jueves 25 y viernes 26
Hora : 3: 00 p.m. a 7:00 PM

Rango de linealidad de la enzima
Da: viernes 2 de agosto
Hora : 3: 00 p.m. a 7:00P M

Medida De La Actividad Especifica De La Enzima
Da: viernes 2 de agosto
Hora : 3: 00 p.m. a 8:00 PM

Inmovilizar invertasa en geles
Da: viernes
Hora : 3: 00 p.m. a 7:00 PM

Disear y montar el sistema mini-reactor con invertasa inmovilizada, para
determinar los parmetros cinticos de la enzima.
Da: viernes 3 agosto
Hora : 3: 00 p.m. a 7:00 pM








5. REFERENCIAS BIBLIOGRFICAS

o Cintica enzimtica. Profesor Andrs Illanes Frontaura. Escuela de
Ingeniera Bioqumica. Universidad Catlica de Valparaso.
o Reactores Enzimticos. Profesor Agustn Lpez Munguia. Departamento de
Biotecnologa. Universidad Nacional Autnoma de Mxico.