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WORKSHOP VALIDAO DE METODOLOGIA ANALTICA GGMED/ANVISA

03/12/2013


WORKSHOP VALIDAO DE METODOLOGIA ANALTICA GGMED/ANVISA
Trata-se de solicitao de manifestao da Gerncia-Geral de Medicamentos aos
questionamentos enviados pelo Setor Regulado para o Workshop de validao de metodologia
analtica, realizado no dia 03 de dezembro de 2013, no auditrio da Anvisa em Braslia,
Com relao ao padro secundrio, posso utiliz-lo nas validaes de IFA (insumo farmacutico
ativo), utilizando o padro primrio apenas na seletividade? De acordo com a atual legislao
(RE n. 899/2003), padres secundrios s podem ser utilizados se no existir padro primrio
disponvel. O item 1.4. dessa norma afirma que devem ser utilizadas substncias de referncia
oficializadas pela Farmacopia Brasileira ou, na ausncia destas, por outros cdigos autorizados
pela legislao vigente. No caso da inexistncia dessas substncias, ser admitido o uso de
padres de trabalho, desde que a identidade e o teor sejam devidamente comprovados. Esse
tambm o entendimento da RDC 17/2010 que declara no Art. 187 que devem ser utilizados
padres de referncia oficiais, sempre que existirem e na ausncia desses, devem ser
utilizados padres de referncia devidamente caracterizados. No Art. 188 afirma-se que um
padro de referncia no adquirido de uma farmacopeia reconhecida deve ser do mais elevado
grau de pureza possvel de ser obtido e cuidadosamente caracterizado a fim de garantir sua
identidade, teor, qualidade, pureza e potncia. E o 2 deixa claro que padres secundrios no
so aceitos durante a validao, uma vez que os procedimentos analticos utilizados para
caracterizar um padro de referncia no devem se basear apenas em testes de comparao a um
padro de referncia anteriormente caracterizado.
Se em um compndio oficial tenho o teste de Substncias relacionadas para o ativo necessrio
validar o teste para produto acabado, ou basta fazer somente degradao forada e/ou
adequabilidade, sendo que minha impureza padro de referncia (impureza conhecida)?A
empresa dever realizar validao completa do mtodo para o produto terminado.

Em qualquer validao de metodologia (Ex. titulometria) obrigatrio o teste de degradao
forada? Sim.
Conforme o item 2.1.2. Para anlise quantitativa (teor) e anlise de impurezas, a especificidade
pode ser determinada pela comparao dos resultados obtidos de amostras (frmaco ou
medicamento) contaminadas com quantidades apropriadas de impurezas ou excipientes e
amostras no contaminadas, para demonstrar que o resultado do teste no afetado por esses
materiais. Quando a impureza ou o padro do produto de degradao no estiverem disponveis,
pode-se comparar os resultados do teste das amostras contendo impurezas ou produtos de
degradao com os resultados de um segundo procedimento bem caracterizado (por exemplo,
metodologia farmacopeica ou outro procedimento validado). Estas comparaes devem incluir
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amostras armazenadas sob condies de estresse (por ex. luz, calor umidade, hidrlise
cida/bsica, oxidao). Sim, devem incluir as condies de estresse.
Em uma validao de metodologia por titulometria como proceder com o interferente e resduo
quando meu mtodo exige amostra branco? Deve ser avaliada. Proceder leitura de
resultados obtidos com diluentes, substncia qumica de referncia de concentrao conhecida,
amostra no estressada, amostras estressadas e placebo. Acompanhar o decaimento do ativo ou
do marcador e/ou surgimento de possveis produtos de degradao por meio de perfil
cromatogrfico para avaliar se o mtodo detecta esses componentes.
Mais esclarecimento sobre LQ e LD, em como determinar, o primeiro passo de uma validao,
entre outros. No est determinado que o primeiro passo de uma validao; no entanto, sua
determinao importante para quantificar a concentrao da amostra, que deve estar acima
desses limites. A determinao do LD e LQ est prevista na RE 899/2003.
Como devo proceder nos clculos de Especificidade e Linearidade quando minha metodologia a
ser validada (Titulometria) solicita ensaio do branco. Realizar o ensaio com o branco. Deve ser
determinada a leitura obtida com soluo que contenha todos os componentes exceto a amostra
(diluente, reagente, cido, base, etc.), antes de qualquer corrida analtica. A leitura obtida para o
branco deve ser descontada da leitura obtida com a amostra.

Pressupondo um mtodo que est sendo desenvolvido e aps os experimentos pertinentes a esta
etapa o mtodo fica definido. legalmente necessrio que este mtodo seja previamente
validado antes de ser formalizado em POP/IT ou primeiro preciso emitir o POP tal qual foi
definido no desenvolvimento e depois proceder com a validao, ainda que o resultado da
validao comprove que o mtodo fruto do desenvolvimento no estava
adequado? Entendendo-se que uma vez emitido um POP/IT, sem validar o mtodo antes, o
procedimento est passvel de execuo para anlises de controle de qualidade. Essa questo
relacionada organizao de garantia da qualidade da empresa. fundamental a elaborao de
protocolo de validao previamente a sua realizao. Todavia, os POPs so elaborados aps
concluso da validao do mtodo.

Havendo o caso de uma validao em que a SQR disponvel no mercado encontra-se limitada a
apenas um fabricante e este fabricante fornece apenas 2 frascos por empresa/ano que somam
uma quantidade insuficiente para realizao de uma validao completa, como o rgo
regulador em questo considera a disponibilidade deste material? O padro
farmacopeico/internacional estaria de fato disponvel? Em termos regulatrios, seria aceitvel
adquirir esta quantidade limitada do fabricante e ento gerar um material de referncia in house
para que atender toda a validao? De acordo com RE 899/2003 deve-se utilizar substncias de
referncia oficializadas pela Farmacopeia Brasileira ou, na ausncia destas, por outros cdigos
autorizados pela legislao vigente. Na ausncia desses, devem ser utilizados padres de
referncia devidamente caracterizados, conforme a RDC 17/2010. Nesse caso, deve ser
devidamente justificada a indisponibilidade do padro farmacopeico e a utilizao
complementar de substncia devidamente caracterizada. Situaes distintas do descrito no
sero aceitas pela ANVISA.
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Impurezas - Como devemos determinar o menor nvel de impureza esperado? Devemos
determinar o valor estimado (terico) e ento testar concentraes prximas para definir o valor
experimental, que ser o meu LD e/ou LQ? A RE n. 899/2003 explica o procedimento para
LD/LQ.
Pureza de pico: Critrios de aceitao para o parmetro pureza de pico em mtodos de
cromatografia, levando em considerao as diferentes equaes de clculo das diferentes marcas
de HPLC, e o grau de exigncia de cada um deles. //Detectores de ndice de refrao ou
Fluorescncia no possuem esta possibilidade.Seremos menos exigentes com estes mtodos?
Existem detectores de fluorescncia multi-comprimento de onda que possuem alta sensibilidade
e seletividade. Quanto aos detectores por ndice de refrao que possuem baixa seletividade, a
sua utilizao est condicionada ao objetivo do mtodo. Para a validao do parmetro
especificidade demonstrar a pureza do pico de interesse no mtodo cromatogrfico deve ser
demonstrada, conforme item 2.1.3 da RE 899/04. Quando um detector de arranjo de fotodiodos
ou espectrometria de massa no est disponvel, variaes nas condies de medio devem ser
avaliadas. A apresentao de cromatogramas com aquisio em comprimentos de onda
diferentes (por exemplo, em 220, 250, 300 e 350 nm), variao de fluxo, mudana de polaridade
de solvente e co-injees seriam uma alternativa excelente ao arranjo de diodos. Uma avaliao
em conjunto dos testes citados acima pode ser aceita como indicativo da pureza do pico. Deve
ser realizado com substncia qumica de referncia (SQR), IFA e de produto acabado.
Comparaes com resultados, variando as condies de medio e anlise de pureza de sinal,
podem ser usadas para verificar que nenhum outro componente conhecido ou desconhecido
esteja sendo determinado junto com o analito. Algumas vezes devem-se usar tcnicas
adicionais, como cromatografia de camada delgada (CCD) ou espectroscopia de massa (EM),
aps a separao e a coleta do analito. Em particular, isso necessrio em mtodos usados para
avaliar estabilidade. Para este propsito, as amostras utilizadas nos ensaios de condies
extremas, so estudadas cuidadosamente para provar que nenhum produto de degradao
conhecido ou desconhecido possa perturbar o sinal do analito (INMETRO).
Mtodos para quantificao de substncias relacionadas: Critrios de aceitao para RSD de
repetibilidade (concentraes muito baixas exigem RSD maiores que 2%, Lei de Horwitz).
Como realizar a preciso em caso de no dispor de padres de impurezas conhecidas (ex.
usando o ativo diludo ao 1%??) A preciso pode ser realizada com ativo diludo.
Validaes em geral: Ranges maiores de linearidade matematicamente (pode ser demonstrado)
so mais exigentes para os critrios de aceitao de linearidade, embora j vimos exigncias que
solicitaram que os ranges testados sejam exatamente como a RE 899 (tinham sido feito em
ranges um pouco maiores 50-150%) A empresa poder utilizar intervalos maiores, no entanto,
recomenda-se que a linearidade seja determinada pela anlise de, no mnimo, 5 concentraes
diferentes. Essas concentraes devem abranger os intervalos da Tabela 3 da RE 899/2003.
necessrio, tambm, a avaliao da homocedasticidade, por exemplo.
Por conta do alto custo e dificuldade em encontrar muitos dos padres de impurezas, na co-
validao, tendo a matriz realizado a validao completa, necessrio a realizao de testes de
preciso, linearidade e seletividade dessas impurezas, ou poderamos testar apenas o ativo na
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concentrao da impureza? A RE 899/2003 exige que tais parmetros sejam realizados com a
utilizao do padro primrio.
Se o valor mximo aceitvel deve ser definido de acordo com a metodologia, concentrao, tipo
de matriz e finalidade do mtodo, por que foi exigido o valor mximo de 5%? Exemplos:
Impurezas, dissoluo, degradao, mtodo de absoro atmica, extrao como vitaminas. No
item 2.4, temos a seguinte frase: O valor mximo aceitvel deve ser definido de acordo com a
metodologia empregada, a concentrao do analito na amostra, o tipo de matriz e a finalidade do
mtodo, no se admitindo valores superiores a 5%. Para impurezas, esses valores podem ser
diferentes a depender da situao avaliada e o teste executado. A empresa dever justificar a
utilizao de desvio padro distinto do previsto na RE 899/2003 a depender do teste analtico
que efetua. Em alguns casos, como o ensaio de teor, por exemplo, o valor de 5% muito
permissivo e sugere-se o uso de desvio menor.
O que a ANVISA sugere seguir em relao correlao de metodologias (comparar uma
metodologia desenvolvida internamente x metodologia farmacopeica)? Quando existir mtodo
em compndio oficial, o uso de um mtodo de desenvolvimento interno deve ser justificado.
Caso seja admissvel, os resultados obtidos com os dois mtodos devem ser comparados, por
exemplo,caso a empresa queira introduzir um mtodo por CLAE, ao invs de usar um mtodo
por espectrofotometria ou titulometria de compndio oficial. Como os mtodos CLAE so mais
seletivos, os resultados podem ser diferentes. Nesse caso, devem ser utilizados fatores de
correlao, obtidos por meio da anlise de vrios lotes, para demonstrar a reprodutibilidade
desse fator de correlao entre mtodos. O fator de correlao deve ser determinado porque a
dose segura e eficaz foi determinada por meio da quantificao pelo mtodo de compndio
oficial. Tal procedimento frequentemente utilizado para medicamentos fitoterpicos.
Para validao de substncias relacionadas, algumas empresas validam a quantificao de
impurezas conhecidas, e outras incluem tambm a validao de impurezas desconhecidas.
possvel considerar mtodos quantitativos, ou tambm ensaios de limite, tendo em vista que so
impurezas desconhecidas. Poderiam, por favor, esclarecer qual a melhor maneira de realizar esta
validao? Para impurezas desconhecidas, realizam-se ensaios limites, sendo possvel efetuar
LD, LQ do padro do ativo diludo, bem como especificidade e preciso.
A regulamentao vigente (RE-899/2003) requer validao de metodologia analtica em
conformidade com seus requerimentos tanto para o fabricante internacional quanto importador.
Todavia o fabricante internacional segue a sua prpria regulamentao para validao. Neste
contexto acreditamos que os requerimentos brasileiros para validao ou co-validao deveriam
ser aplicados somente para o importador. A RE 899/2003 segue as determinaes do
International Conference on Harmonisation (ICH), portanto no deve haver discrepncias
importantes entre as validaes realizadas pelo fabricante internacional e as exigncias do guia
brasileiro de validao de mtodos analticos. Assim sendo, a cpia de toda a documentao
original da validao da metodologia dever conter, no mnimo, todos os parmetros
relacionados no item 1.7. Essa situao poder ser discutida na reviso dessa Resoluo, uma
vez que entende-se que o termo co-validao deve ser alterado para validao parcial e deve
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avaliar, pelo menos a seletividade, exatido e preciso ou apresentar justificativa tcnica que
comprove que a realizao de um ou todos esses testes no seja necessria .

A regulamentao vigente requer a utilizao de padro primrio, todavia acreditamos que o
padro secundrio devidamente caracterizado, no Brasil ou no pas de origem suficiente
conforme preconizam requerimentos internacionais. Esse assunto j est definido pela RE
17/2010 e Farmacopeia Brasileira 5 edio (FB V):De acordo com definio da OMS, padres
de referncia farmacopeicos (PRef) so produtos de uniformidade reconhecida, destinados ao
uso em ensaios onde uma ou mais de suas propriedades ser(o) comparada(s) com a(s) da
substncia em exame. Possuem um grau de pureza adequado ao uso ao qual se destinam. O
PRef estabelecido e distribudo por autoridades farmacopeicas, cujo valor atribudo a uma ou
mais de suas propriedades aceito sem necessitar comparao com outro padro, destinado ao
uso em ensaios especficos descritos nas monografias farmacopeicas. Incluem substncias
qumicas de referncia, produtos biolgicos, extratos e ps vegetais, radiofrmacos, entre
outros.

Especificidade Item 2.1 da norma
Para o teste de teor por HPLC necessrio fazer o estresse conforme o Informe Tcnico de
Degradao (degradao do ativo de 10-30%)? Para os mtodos por Espectro e Titulao o
estresse necessrio? A degradao dever ser suficiente a fim de permitir a verificao da
formao de produtos de degradao. A empresa dever utilizar mtodo pertinente que no
degrade completamente a amostra e inviabilize essa verificao e que gere degradao em
ordem suficiente a fim de permitir a avaliao de produtos. Alguns artigos trazem a degradao
na ordem de 10 a 30%, mas esses valores devem ser estabelecidos pela empresa que deve
demonstrar a pertinncia em relao metodologia e objetivo estabelecidos. O estresse deve ser
realizado para todos os mtodos analticos. Para espectrofotometria e titulometria recomenda-se
acompanhar o decaimento do ativo ou do marcador e/ou surgimento de possveis produtos de
degradao por meio de perfil cromatogrfico para avaliar se o mtodo detecta os produtos de
degradao. Alm disso, na espectrofotometria deve ser observado se ocorre alguma alterao
no espectro UV-VIS.

No caso da Farmacopeia Brasileira preconizar mtodo de doseamento de ativo em formas
farmacuticas baseado em titulometria e o mtodo USP for por HPLC ou Uv/Vis, pode-se fazer
a opo por realizar os testes de adequabilidade para o mtodo USP (tecnologia mais seletiva e
robusta) em detrimento ao da Farmacopeia Brasileira? Sim.
Neste caso pode-se realizar o ensaio de doseamento pela USP e os outros ensaios pela
Farmacopeia Brasileira? Deve ser escolhido um nico compndio e realizar todos os testes
previstos. O que se permite que os testes do compndio escolhido podem ser complementados
com testes a mais que esto presentes em outro compndio oficial. Situaes diversas a essa no
so permitidas.
Alguns interpretam que s se pode utilizar mtodos validados, caso no conste em compndios
oficiais metodologia para tal produto ou insumo, esta interpretao procede? Para o controle de
qualidade a empresa poder optar por mtodo interno ou farmacopeico diante de sua existncia.
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No entanto, caso opte por mtodo interno e na existncia de mtodo farmacopeico, no poder
suprimir testes previstos em compndio e adotar especificaes menos rigorosas que as
existentes em compndio. Quando existir mtodo em compndio oficial, o uso de um mtodo de
desenvolvimento interno deve ser justificado. Caso seja admissvel, a equivalncia dos
resultados obtidos com a aplicao dos dois mtodos deve ser apresentada. Em que situao
permitido o uso de mtodos validados (no compendial)? Nos casos em que o mtodo
compendial oficial comprovadamente inadequado ao medicamento objeto de anlise,
respeitando as restries anteriormente citadas.
Item 2.4.2 da RE 899/2003 (Preciso intermediria):Para clculos de Preciso Intermediria (de
testes quantitativos para a determinao do princpio ativo) satisfatrio determinar o desvio
padro da grande media(ou mdia geral), ou necessrio realizar algum outro teste
estatstico(Teste F, Teste T...) de comparao? Segue um breve exemplo abaixo. Existem vrios
testes estatsticos que podem ser utilizados a depender da situao (teste de F, ANOVA, por
exemplo) alm da mdia, DP, DPR.
Item 2.7 da RE 899/2003 (Exatido): A exatido expressa pela relao entre a concentrao
mdia determinada experimentalmente e a concentrao terica correspondente






Qual faixa de variao aceitvel para exatido em Testes Quantitativos para Determinao de
impurezas ou produtos de degradao? Essa faixa dever ser apresentada pela empresa em
acordo com a metodologia empregada. No se tem essa faixa estabelecida na RE 899/2003.
Pureza de pico: Existe algum valor mnimo definido como especificao para pureza de pico
(ex. 0,98% ou purityangle<purityThreshold)? O clculo de pureza em essncia deve demonstrar
a homogeneidade espectral do pico de forma a garantir que o pico do ativo atribudo a um
nico componente. O clculo dever ser realizado de acordo com o equipamento que se opera e
metodologia aplicada para tal. No existe um valor padro, a avaliao realizada considerando
equipamento, tcnica e metodologia desenvolvida.
Pureza de pico: O teste deve ser feito apenas para o pico principal em caso de mtodo de
impurezas? Ou para todas as impurezas presentes? Deve ser feito para tudo, caso no exista a
separao de impurezas, no possvel mensur-las individualmente.
Pureza de pico: Como proceder nos casos de picos de impureza com intensidade muito baixa
(interferncia do rudo) ou quando o pico principal estoura a escala? A metodologia dever
ser revista. O pico principal pode extrapolar a escala desde que j se tenha estabelecido uma
relao verdadeira entre pico de ativo e pico de impureza.
Sobre utilizao de mtodos compendiais: Considerando que os mtodos analticos compendiais
no requerem validao, entretanto antes de sua implementao, devem existir evidncias
Exatido=
Concentrao Mdia Experimental
x 100
Concentrao Terica
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documentadas de sua adequabilidade nas condies operacionais do laboratrio; quais so os
testes de validao recomendados para a adequao de mtodos de farmacopeia para produto
(ex: especificidade, preciso e estabilidade da soluo da amostra, conforme RDC 17)? Deve ser
verificada a adequabilidade nas condies operacionais do laboratrio e testes como
especificidade, preciso, exatido, linearidade e intervalo.
Segundo a Consulta Pblica n 11 de 23 de janeiro de 2012, A metodologia analtica para a
quantificao de produto de degradao, mesmo que descrita em farmacopeias ou formulrios
oficiais, dever ser validada. Essa validao pode ser simplificada,considerando seletividade
(com degradao forada), preciso e linearidade? Ou necessrio realizar uma validao
completa considerando todos os parmetros? A validao dever seguir a lgica da metodologia
empregada, se quantitativa dever observar os testes necessrios para metodologia quantitativa,
se qualitativa dever observar os testes necessrios para tal previstos na RE 899/2003.

Exatido: Qual a melhor forma de fazer a exatido de mtodos de matria-prima, ou seja, sem
adio de placebo? No caso, aceita-se a anlise pelo mtodo de adio de padro, no qual
adiciona-se quantidades conhecidas do analito (padro de referncia).
Robustez: O que seria uma grande variao de resultado para Robustez? Para impurezas,
podem ser avaliadas apenas as condies de adequao de sistema (ex: resoluo, fator de
capacidade, etc)? necessria a avaliao da recuperao em todas as condies no caso de
impurezas? A Robustez deve ser feita sempre com mltiplas variveis? A robustez deve ser
realizada de preferncia incluindo mais de uma varivel. Um mtodo robusto tem a capacidade
de no ser afetado por uma pequena e deliberada modificao em seus parmetros, ou seja, os
parmetros que a empresa determinou para considerar o seu mtodo apto (Tailing, Resoluo,
Eficincia, Fator de capacidade, entre outros, casos esses tenham sido escolhidos). A robustez
de um mtodo de teor, por exemplo, deve demonstrar que deliberadas modificaes nas
condies de anlise (em cromatografia pode ser: fluxo, pH, proporo de fase mvel entre
outras) no iro afetar a quantificao do princpio ativo. Na robustez, no se aconselha utilizar
amostra, pois, no caso de diferena de teor, no h como correlacionar com as sutis diferenas
da amostra ou com os problemas relacionados uniformidade de contedo da amostra. O
critrio de aceitao da variao na robustez o mesmo para a exatido.
Linearidade:O ICH Q3B(R2) sugere que as especificaes devem ser preferencialmente
determinadas com base no estudo de estabilidade. Em caso de validao analtica anterior ao
estudo de estabilidade, como definir os cinco pontos da linearidade? Poderiam ser escolhidos
em uma faixa mais ampla para posterior definio da especificao? A faixa a ser escolhida
dever ser apropriada a metodologia e objetivos definidos. Na estabilidade a alterao permitida
de no mximo 10 %, portanto est prevista na faixa de 80-120%. Uma faixa mais ampla pode
ser escolhida, desde que contemplem, no mnimo, 5 concentraes no intervalo exigido na RE
899/2003 e que se avalie a homocedasticidade.
Linearidade: Sobre a definio do fator de resposta de impurezas conhecidas, existe um valor
mximo e mnimo para a adoo Fator de Resposta de Impurezas? Qual o valor seguro? (Ex. 0,8
a 1,2). Ou seja, em que casos se recomenda o uso do prprio padro da impureza para a
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quantificao da mesma? Na existncia do padro da impureza, recomendvel que esse seja
utilizado.
Linearidade: Se a linearidade for provada em uma faixa mais ampla do que o preconizado (ex.
80-120% para teor), so mesmo necessrios 5 pontos somente dentro dessa faixa? A RE
899/2003 exige o mnimo de 5 pontos. No entanto, podem ser adotados mais pontos a fim de
construir a curva analtica apropriada. importante avaliar estatisticamente os valores
relacionados a curva de linearidade para que os resultados sejam considerados vlidos.
Soluo de ReportingThreshold: Em caso de preparo de uma soluo para definir a rea
mnima, a mesma pode ser preparada a partir de uma amostra? Ou deve ser preparada a partir do
padro? Qual a melhor maneira? Na existncia do padro da impureza, realizar sobre esse. Na
inexistncia realizar sobre padro do ativo diludo.
Limite de Quantificao: Durante a validao todos os valores de impurezas acima de LOQ
devem ser reportados, ou podem ser reportados apenas os valores acima do Limite de
Notificao (ReportingThreshold), de acordo com o ICH (0,05% ou 0,1%)? Valores acima do
limite de notificao devem ser reportados para impurezas provenientes da degradao.
Reprodutibilidade (preciso inter-laboratorial): Segundo a RE 899/03 no so admitidos valores
superiores a 5%. Essa especificao se mantm para mtodos de impurezas, por exemplo? Para
impurezas esses valor pode ser distinto a depender da situao avaliada e do teste executado. A
empresa dever justificar a utilizao de desvio distinto do previsto na RE 899/2003 a depender
do teste analtico que efetua. Em alguns casos, como o ensaio de teor, por exemplo, o valor de
5% muito permissivo e sugere-se o uso de desvio menor.
Quando a quantificao do mtodo de impurezas se d por rea/%, necessrio comprovar a
linearidade do mtodo do nvel esperado de impurezas at 120% da concentrao mxima do
pico principal na amostra?A linearidade aplicvel para mtodos quantitativos.
Sobre a validao de mtodos para produtos com mais de um ativo: Qual a forma preferencial
de quantificao das impurezas? Seria aceitvel um mtodo que considere rea/%?A
porcentagem rea aplicvel desde que a relao de % seja demonstrada verdadeira.
Sobre a validao de mtodos para produtos com mais de um ativo e vrias dosagens:O que
considerada uma frmula proporcional? O mtodo pode ser validado com apenas uma dosagem?
necessrio algum teste adicional para as demais dosagens? O mtodo pode ser validado
apenas com uma dosagem desde que a concentrao final das amostras para anlise sejam
exatamente iguais e que os passos de extrao sejam exatamente os mesmos bem como se no
houve alteraes nos parmetros cromatogrficos. Em se tratando de concentraes distintas no
possvel.
Para a validao de tamanho de partcula por laser: A proposta, de acordo com a USP e a
ASTM, realizarmos apenas a preciso do sistema (com 6 leituras da mesma amostragem no
mdulo liquido) e a preciso interdia e intradia com amostragens diferentes. Isso o que
realmente est em prtica? Como deve ser realizada a preciso do sistema para o modulo seco?
Onde a amostra descartada aps a leitura? Alm disso:1) A Robustez dever ser apresentada
durante o desenvolvimento para a definio do mtodo. Ou deve ser apresentada na validao?
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Se sim, como ela deve ser realizada? 2) necessrio utilizar mais de um lote de API durante a
validao? 3) necessrio mais algum teste para a validao dessa metodologia? Sobre a
preciso do sistema (6 leituras da mesma amostragem no mdulo lquido) informamos que no
h meno no captulo <429> (USP 36, 2013), na ISO 13320 (verses de 1999 e 2009), RE 899
(2003), ASTM E2651 (2010) e ASTM E1617 (2009). Tal quesito faz parte dos protocolos de
validao de distribuio granulomtrica por espalhamento de luz laser esttica do laboratrio.
H um captulo geral sobre a tcnica de distribuio granulomtrica por espalhamento de luz
laser esttica na Farmacopeia Europeia (EP 2.9.31) e na Britnica (apndice XVII), e as trs
farmacopeias (USP 36, EP 2008 e Britnica 2012) referenciam a verso de 1999 da ISO 13320.
No caso da preciso intradia e interdia, informamos que at o momento no h uma
uniformizao de nomenclatura entre os documentos que possuem as diretrizes de validao da
tcnica (preciso intradia = preciso intermediria; preciso interdia = repetibilidade do mtodo)
e h uma falta de padronizao dos testes que devem ser realizados para tais parmetros. De
acordo com o nosso ponto de vista atual, sugerimos que o processo de validao de mtodos de
distribuio granulomtrica por espalhamento de luz laser esttica contemple as seguintes etapas
para o mdulo lquido: preciso do sistema, repetibilidade do mtodo e preciso intermediria.
Entretanto, o ensaio de microscopia (tica e/ou eletrnica de varredura) de extrema
importncia, e deve fazer parte do processo de validao para corroborar com os resultados
obtidos pelo laser. Apesar da importncia da microscopia, ressaltamos que ela possui carter
qualitativo, pois apesar da microscopia fornecer dados que podem corroborar e, de certa forma,
validar os resultados obtidos pelo laser, o mesmo no apresenta especificidade suficiente para
comprovar a totalidade do perfil da distribuio do tamanho das partculas de uma amostra. Ou
seja, na etapa de validao, o objetivo principal da tcnica de microscopia avaliar a presena
de partculas fora das margens da distribuio apresentada pelo laser. Portanto, a tcnica de
microscopia no deve ser utilizada como a nica verificao de um processo de validao
para a tcnica de distribuio granulomtrica por espalhamento de luz laser esttica. Cabe
ressaltar que no consideramos nessa discusso a utilizao da microscopia automatizada, pois
essa possui condies de avaliar, entre outros parmetros, o perfil da distribuio do tamanho
das partculas. Entretanto, mesmo neste caso, no consideramos plausvel a utilizao apenas da
microscopia automatizada para verificar um processo de validao, uma vez que h questes
estatsticas que devem ser avaliadas e seguidas nas normas / compndios oficiais que versam
sobre o laser. Vale mencionar que, apesar da RE 899 /2003 no ser especfica e contemplar a
validao para ensaios focados em caractersticas fsicas, utilizamos essa para nos auxiliar no
embasamento dos conceitos de cada um dos requisitos necessrios para o processo de validao.
Sendo assim, fica claro que para o processo de validao de mtodos h uma adequao dos
conceitos e critrios de avaliao para os parmetros mencionados acima. Atualmente,
preconizamos a realizao do processo de validao com trs amostras distintas (fabricante e/ou
lote). Entretanto, caso no seja possvel, a empresa deve justificar. recomendvel utilizar
amostras que possuam partculas com morfologias e dimenses mais distintas possveis para
possibilitar o desafio do mtodo, de forma a tentar garantir um mtodo eficiente para analisar
lotes que possuam caractersticas distintas. Apesar de haver peculiaridades intrnsecas a cada
forma de disperso (lquido ou seco) que devem ser consideradas, julgamos que a sistemtica
macro de validao permanece vlida. As amostras devem ser descartadas devidamente
identificadas e classificadas conforme as normas de descarte de resduos vigente. A robustez
deve ser apresentada nos documentos regulatrios e avaliada durante o desenvolvimento e
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utilizao do mtodo, conforme mencionado na RE 899 (2003) e na USP 36 <429> (2013).
Quanto ao questionamento se necessrio mais algum teste para a validao dessa metodologia,
essa avaliao deve ser feita pela empresa. H necessidade de se avaliar inmeras etapas durante
o desenvolvimento do mtodo (preparo da amostra, solubilidade da amostra no meio de
disperso, agitao quando aplicvel, ultrassom quando aplicvel, modelo tico, ndice de
refrao do meio, ndice de refrao da partcula quando aplicvel, entre outros) para se obter
um mtodo adequado e robusto. Caso seja identificada alguma inconsistncia durante a
validao, deve-se avaliar a necessidade de retornar ao estgio de desenvolvimento do mtodo.

Para a validao de analise de polimorfismo por DSC / DRX e IR ?
1) H algum teste preconizado para realizarmos, uma vez, que dificilmente
conseguimos os padres das formas polimrficas?
2) Podemos realizar apenas a preciso intra e interdia e repetibilidade (preciso) do
sistema?
3) Para os casos de DSC onde h a degradao da amostra, como ser realizada a
preciso do sistema?
4) Para as anlises que sejam quantitativas, e que teremos os padres das formas
polimrficas, podemos realizar uma validao com quais testes

Nos ensaios de anlise trmica (no caso do polimorfismo destacam-se a termogravimetria e a
calorimetria exploratria diferencial), difrao de raios-X e espectroscopia de infravermelho
podem ser realizadas anlises qualitativas e quantitativas. Logo, a validao de mtodos para
estas tcnicas tambm dependente desse parmetro. At onde sabemos, entre as trs tcnicas
anlise trmica, difrao de raios-X e espectroscopia de infravermelho, esta ltima a que
possui citaes bibliogrficas mais consistentes para a validao de mtodos, em especial
quando se trata do infravermelho prximo (NIR). Infelizmente, no temos estabelecido os
parmetros sobre a validao de mtodos de difrao de raios-X (DRX). Entretanto,
apresentamos a seguir algumas consideraes sobre a validao de mtodos quantitativos para a
calorimetria exploratria diferencial (DSC). Acreditamos que os parmetros para a realizao do
processo de validao da DSC devem contemplar: linearidade, preciso (repetibilidade e
preciso intermediria), limites de quantificao e deteco e robustez. Quando houver a
possibilidade de ocorrer dois eventos que interfiram na interpretao correta do perfil energtico
da amostra, consideramos importante avaliar tambm a especificidade. Outro ponto que deve ser
considerado o evento objeto de estudo. Nas curvas de DSC h a possibilidade de ocorrerem
eventos que so identificados por sinais endotrmicos, sinais exotrmicos e variaes de linha
base. Por tudo que foi exposto at aqui, acreditamos que deve ser invivel um procedimento
nico para a validao de mtodos de DSC, mesmo em mtodos qualitativos ou quantitativos.
Talvez a melhor estratgia seja a elaborao de uma rvore de deciso, de forma que se possam
contemplar os diferentes caminhos que podem existir para o processo de validao. Neste
contexto, discutimos alguns pontos que conseguimos chegar a um consenso inicial:
Linearidade: se admitirmos eventos identificados por sinais endo ou exotrmicos, pensamos na
realizao de testes que comprovem a capacidade do mtodo em relacionar a massa da amostra
com a entalpia do sinal. Para amostras cristalinas anidras que apresentam exclusivamente um
nico sinal endotrmico relacionado fuso do material, sugerimos a realizao da anlise de
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diferentes amostragens com diferentes massas, e a correlao das mesmas com os respectivos
resultados de entalpia. Entretanto, para amostras que apresentarem outros sinais endotrmicos
(ex.: solvatos, solventes adsorvidos na amostra e misturas polimrficas), torna-se necessrio a
realizao de ensaio(s) utilizando tcnica(s) complementar(es). Para algumas dessas situaes
pode-se citar o uso da anlise termogravimtrica (TG). Esta tcnica tambm pode auxiliar na
correo da massa real a ser quantificada, pois em casos que houver uma quantidade
significativa de material voltil, a quantidade desse deve ser desconsiderada, para que se
correlacione apenas a massa de amostra que est relacionada com a entalpia de interesse.
Cabe ressaltar que, de acordo com a RE 899 (2003), a linearidade deve apresentar um
coeficiente de correlao maior que 0,99 e, que dependendo do propsito do ensaio, a entalpia
de interesse pode ser da prpria volatilizao do material voltil. Preciso: para o caso de sinais
endo ou exotrmicos, uma opo para a avaliao deste parmetro a anlise de diferentes
amostras e a avaliao do coeficiente de variao das entalpias obtidas. A literatura escassa
quanto aos limites de aceitao para este clculo, entretanto, h meno a utilizao de 2,0%.
Preciso intermediria: conforme preconizado pela RE 899 (2003), sugere-se a realizao de
anlises de diferentes amostragens em diferentes dias (com intervalo mnimo de dois dias) e a
realizao da mesma por diferentes analistas. Limite de quantificao e deteco: para a
avaliao destes parmetros deve-se primeiramente considerar algumas peculiaridades dos
equipamentos existentes no mercado, como por exemplo, a sensibilidade do sensor. Isso porque,
os referidos limites esto relacionados com a relao sinal rudo do equipamento e existem
casos, inclusive, que o equipamento pode possuir sensores de diferentes sensibilidades que so
intercambiveis. Para o limite de quantificao e deteco, uma proposta considerar a relao
de 1:10 e 1:3, respectivamente. Utilizando esse raciocnio, a avaliao destes parmetros no
processo de validao pode ser realizada por meio da pesagem de diferentes amostragens e
verificao do maior intervalo referente ao sinal rudo do equipamento. Posteriormente, deve-se
realizar novamente a pesagem de diferentes amostragens, entretanto, de acordo com as
respectivas propores mencionadas para cada um dos limites a serem avaliados. O resultado
obtido ser a confirmao da capacidade do equipamento em detectar e quantificar a mnima
quantidade de amostra frente ao mtodo utilizado. Robustez: a medida da capacidade do
mtodo em suportar pequenas variaes dos parmetros analticos. Este parmetro
normalmente avaliado durante o desenvolvimento da metodologia. Entre os parmetros que
podem ser alvo deste estudo em um mtodo de DSC, no momento, estamos discutindo a
possibilidade de avaliar a influncia da variao da razo de aquecimento / resfriamento, fluxo
de gs e massa da amostra. De acordo com a RE 899 (2003), ao constatar a susceptibilidade do
mtodo s variaes nas condies analticas, essas devero ser controladas e precaues devem
ser includas no procedimento. Cabe ressaltar que toda essa discusso est baseada no
conhecimento que possumos no momento e que a parte apresentada sobre a DSC est longe de
contemplar todas as variveis / situaes possveis. Alm disso, ainda h muito que se discutir e
aprender quando falamos de validao de mtodos para as tcnicas que caracterizam fisicamente
um material. Por fim, lembramos que grande parte destas tcnicas tambm pode ser utilizadas
para avaliaes qumicas. Das tcnicas abordadas neste documento, a espectroscopia de
infravermelho a tcnica que mais utilizada para este propsito. Mas as outras tcnicas
tambm podem ser utilizadas para avaliaes qumicas, como por exemplo, a DSC, que
possui um mtodo primrio para a determinao de pureza, mtodo este que possui at uma
norma (ASTM E928-08).
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Quais parmetros de validao devem ser verificados para adequabilidade de mtodos
compendiais usados em anlises microbiolgicas para contagem microbiana e pesquisa de
patgenos , pois a RE 899, 2003 no faz referncia a adequabilidade de mtodos? Os testes
microbiolgicos possuem caractersticas muito especficas, que no permitem ser abordados da
mesma forma que so validados os testes qumicos e fsico-qumicos. Os parmetros utilizados
para a validao de testes qumicos no so adequados para a maioria das anlises
microbiolgicas, devendo considerar a natureza do ensaio microbiolgico: teste qualitativo ou
teste quantitativo. A palavra validao em microbiologia causa preocupao e sentimento de
complexidade, principalmente devido s literaturas bsicas e referncias que utilizamos no
Brasil. Na realidade, grande parte dessa confuso um problema de terminologia,
principalmente entre os termos Validao e Verificao, que frequentemente eram tratados
como sinnimos, ou usados de forma imprpria. A definio e a diferena entre os dois termos
ficaram mais claramente descritas nos captulos <1223>, <1225> e <1226> da Farmacopeia
USP. Captulo <1223> sobre Validation of Alternative Microbiological Methods, um guia
para a validao de mtodos alternativos aos mtodos microbiolgicos compendiais. Captulo
<1225> sobre Validation of Compendial Procedures, que descreve os parmetros para a
validao de novos mtodos, com recomendaes para validar os mtodos desenvolvidos pelos
laboratrios farmacuticos, e Captulo <1226> sobre Verification of Compendial Methods,
com foco nos laboratrios que esto implementando os mtodos padres e/ou compendiais.
Conforme o capitulo <1225> da Farmacopia USP, Validao de um procedimento analtico
um processo estabelecido por estudos laboratoriais, em que as caractersticas de desempenho
dos procedimentos necessitam de requerimentos conforme a inteno da aplicao analtica.
Para o termo Verificao, quando o mtodo analtico est descrito em USP-NF, no requer
validar a exatido e a confiabilidade desse mtodo, mas precisa verificar a sua adequabilidade
conforme condies de uso. Conforme referenciado em Resoluo RDC n. 17 de 16 de abril de
2010 (Anvisa), Artigo 209, pargrafo nico: Mtodos analticos compendiais no requerem
validao, entretanto antes de sua implementao devem existir evidncias documentadas de
sua adequabilidade nas condies operacionais do laboratrio, desse modo, para mtodos
microbiolgicos compendiais, estas condies operacionais e as adequabilidades ao mtodo so
estabelecidas nos compndios oficiais ou guias internacionais. A verificao de desempenho de
meios de cultura, micro-organismos, diluentes e ensaios na presena e ausncia do produto,
confirmam a adequabilidade do mtodo microbiolgico compendial para o produto que est
sendo pesquisado. Para mtodo microbiolgico compendial, quando h pequenas alteraes no
mtodo como a troca de meios de cultura, tempo de incubao, pH, temperatura, aditivos e
micro-organismos, requerida validao do mtodo, pois esse considerado novo. Para a
validao de novos mtodos, o Technical Report n 33 (PDA, 2000) e o Captulo <1223> da
USP so referncias a serem seguidas, principalmente no tocante introduo de mtodos
rpidos ou alternativos. Os itens sobre Promoo de crescimento dos meios de cultura,
Inoculao dos micro-organismos teste na presena do produto, Neutralizao ou remoo da
atividade antimicrobiana e Tempo de incubao para o ensaio de contagem de micro-
organismos descrevem os passos e os cuidados envolvidos na verificao de desempenho do
mtodo compendial para contagem de micro-organismos mesfilos totais, confirmando a
adequabilidade do mtodo ao produto pesquisado. Adotando-se na ntegra a metodologia dos
compndios oficiais, estes mtodos possuem uma sistemtica de verificao consolidada, sendo
considerado um mtodo validado. Concluindo, mtodos novos necessitam de novas anlises
para confirmar a adequabilidade de acordo com o produto analisado (descrito em compndios
oficiais) e tambm a verificao dos ensaios conforme o Technical Report n 33 (PDA, 2000) e
o Captulo <1223> da USP. Caso no atenda na ntegra os requisitos destas referncias, devem
ser justificados os motivos, atendendo os critrios pr-estabelecidos em protocolo de validao.

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Para pesquisa de patgenos em matrias-primas e produtos no estreis, quais micro-
organismos devem ser testados, uma vez que a Farmacopeia Brasileira 5 ed. 2010, preconiza
ausncia apenas de E. coli para slidos e lquidos? Para produtos no estreis indicado a
Tabela 1 - Limites microbianos para produtos no estreis - Farmacopeia Brasileira 5 ed. 2010,
que apresenta, no final da tabela, a indicao para matrias-primas.
Quantas concentraes de micro-organismos devem ser estudadas para adequabilidade de
mtodos microbiolgicos para contagem microbiana e pesquisa de patgenos? Promoo de
crescimento dos meios de cultura: para cada micro-organismo, necessrio confirmar a curva
de crescimento, fixando-se um parmetro como tempo de cultivo, densidade ptica alcanada
(DO), turbidez do caldo (por fotmetros ou escala nefelomtrica de Mc Farland), de forma a
estabelecer as condies de preparo do inculo. Define-se ento a diluio necessria para a
obteno de contagens em torno de 80 a 120 UFC/mL. Por questes prticas, no laboratrio,
opta-se por manter as condies de cultivo constantes para diferentes cepas (por exemplo, TSB,
24h, 37oC), e aplica-se um fator de diluio adequado para cada inculo. Obviamente, a
contagem de microrganismos em suspenso no possui um valor exato igual a 100 UFC/mL.
Neste caso, deve-se realizar, simultaneamente preparao do inculo, o ensaio de contagem
em placa do mesmo inoculo utilizado, para verificao da quantidade de micro-organismos
presentes. Desta forma, o nmero exato de clulas por mL ser conhecido somente com a
contagem microbiana do inculo (controle) de cada teste, tornando o controle do ensaio
absolutamente necessrio para cada teste realizado. O modo de preparo, meios de cultura para
manuteno e meios de cultura para enriquecimento para cada tipo de inculo, esto descritos
em compndios oficiais. Inoculao dos micro-organismos teste na presena do produto: a
quantidade de micro-organismos teste a ser inoculada no pode ser maior que 100 UFC/mL e
no deve exceder 1% do volume final do produto diludo, ou seja, para 100mL de volume final
contendo amostra e diluente deve ter no mximo 1mL de inculo. Este ensaio realizado
separadamente para cada mtodo utilizado (contagem de micro-organismos mesoflicos totais,
pesquisa de micro-organismos patognicos, teste de esterilidade, atividade de antibiticos e
outros, quando houver necessidade) e para cada micro-organismo listado, conforme tabelas
descritas em compndios oficiais e guias internacionais. A pesquisa de patgenos utilizada
para verificar a presena/ausncia ou a quantificao de determinados micro-organismos no
produto em anlise, utilizando meios seletivos.
Quantas rplicas de cada concentrao de micro-organismos devem ser trabalhadas no estudo
para contagem microbiana e pesquisa de patgenos? Para o ensaio de Capacidade nutritiva dos
meios de cultura, a para os meios indicados na Tabela 3, inocular uma pequena quantidade de
micro-organismo, inferior a 100 UFC. Usar uma placa ou tubo para cada micro-organismo. Para
ensaios de adequabilidade do mtodo, seguir conforme mtodo descrito nos compndios
oficiais. Para mtodos novos, seguir o Technical Report n 33 (PDA, 2000) e o Captulo <1223>
da USP, ao quais, trazem o nmero de rplica que dever ser adotado.