EJEMPLOS DE FASES LIGADAS

CARACTERSTICAS DE LA FASE MVIL

Fuerza
Capacidad de la FM
para eluir al soluto
En NPLC la fuerza
aumenta al aumentar
la polaridad
En RPLC la fuerza de
la FM aumenta al
disminuir su polaridad
La influencia de la fuerza del
disolvente es muy
importante
CARACTERSTICAS DE LA FM: FUERZA Y
SELECTIVIDAD
Capacidad de un solvente
para disolver
selectivamente un soluto
frente a otro, cuando las
polaridades de ambos no
son excesivamente
diferentes
Existen varios ndices para
cuantificar la polaridad de
los solventes:
Parmetro de solubilidad
de Hildebrand ()
ndice de polaridad de
Snyder (P)
CARACTERSTICAS DE LA FASE MVIL:
POLARIDAD
La interaccin total entre una molcula de FM y una
mlecula de soluto es el resultado de las siguientes
interacciones:
Cuanto mayor se la combinacin
de estas interacciones, mayor
ser la atraccin entre molculas
de FM y soluto.
La capacidad de una molcula de
interactuar de acuerdo a estos
mecanismos, es una medida de
lo que llamamos polaridad.
As, los solventes "polares"
disuelven preferencialmente
molculas "polares.
La fuerza de un solvente se
relaciona con su polaridad.
En NPLC y en cromatografa de
adsorcin, la fuerza del
solvente aumenta con su
polaridad.
En RPLC ocurre lo contrario: la
fuerza del solvente disminuye a
medida que aumenta su
polaridad.
CARACTERSTICAS DE LA FASE MVIL:
POLARIDAD
POLARIDAD DE SOLVENTES PUROS
La polaridad de los solventes se ha definido de varias
maneras.
En HPLC el parmetro ms usado es P' , basado en datos
experimentales de solubilidad reportados por Rohrschneider.
El nmero de polaridad de Snyder (P) se define como:
POLARIDAD DE SOLVENTES PUROS
A travs de cada una de las constantes de reparto se mide la
tendencia a recibir protones (basicidad), a darlos (acidez) y a
generar momentos dipolares.
FUERZA Y SELECTIVIDAD DE SOLVENTES
TRINGULO DE SELECTIVIDADES DE SNYDER
CLASIFICACIN DE LA SELECTIVIDAD DE LOS
SOLVENTES
Los mayores cambios en la selectividad de
la FM resultan cuando las propiedades de
los solventes cambian fuertemente.
As, la sustitucin de un solvente
polar B (por ej., metanol) por su
homlogo C (por ej., propanol) no
genera un cambio perceptible en
las interacciones soluto-FM y por
lo tanto en la selectividad. En
ambos casos se trata de
solventes donores de puente de
hidrgeno.
Si, en cambio, pasamos a un solvente C que se comporte como un
aceptor de puentes de hidrgeno (por ej., ter etlico) o que posea un
momento dipolar elevado (por ej., cloruro de metileno), aparecern
cambios notables en la selectividad.
Con un solvente aceptor, las
molculas de la muestra que se
comporten como donores de H,
permanecern preferencialmente
en la FM (menor retencin).
Con una FM de momento dipolar
elevado, las molculas ms
polares, interactuarn ms
fuertemente con la FM.
En cada
caso, las
molculas
que
desarrollen
mayor
interaccin
con la FM,
disminuirn
su valor de
k(menor
retencin).
SELECTIVIDAD DE SOLVENTES
Selectividad por tipos de solventes en RPLC
(a) 50% MeOH-agua; (b) 25% THF-agua.
Compuestos: (1), p-nitrofenol; (2), p-dinitrobenceno; (3), nitrobenceno;
(4), benzoato de metilo
PARMETRO DE POLARIDAD P
Un cambio de P' de dos unidades provoca
(aproximadamente) una variacin de 10 veces en el
valor de k, lo cual permite calcular su variacin en
NPLC con la siguiente expresin:


Para RPLC esta expresin se transforma en:


k
1
y k
2
son los valores inicial y final de k' para un dado
soluto, y P
1
y P
2
se refieren a los valores iniciales y
finales de P
MEZCLAS DE SOLVENTES
Tanto en RPLC como en NPLC, es usual ajustar la fuerza de la FM con mezclas de
solventes.
En general, un solvente A que resulta demasiado dbil se mezcla con un solvente B
que es demasiado fuerte, y su mezcla brinda la fuerza correcta para la separacin.
La polaridad P' de la mezcla de solventes se calcula como:
Donde
a
y
b
son las fracciones en volumen de los solventes A y B en la mezcla, y P
a
y
P
b
se refieren a los valores de P' de los solventes puros.
OTROS PARMETROS DE POLARIDAD
PROPIEDADES DE LAS FM MS COMUNES EN
HPLC
Modo de separacin ms empleado en HPLC
CROMATOGRAFA EN FASE INVERSA (RPLC)
CROMATOGRAFA EN FASE INVERSA (RPLC)
Es la primera opcin para la mayor parte de las muestras
comnmente analizadas por HPLC.
Es ms probable que se obtenga como resultado una separacin final
satisfactoria.
Las columnas de RPLC son eficientes, estables y
reproducibles.
La deteccin es ms fcil en RPLC (especialmente para los detectores UV)
debido a los solventes utilizados.
Aunque muchos compuestos orgnicos tienen una
solubilidad limitada en la fase mvil (acuosa), esto no es
una limitacin prctica, ya que slo se inyectan pequeas
cantidades (nanogramos o microgramos) de muestra.
RETENCIN EN CROMATOGRAFA EN FASE INVERSA
FM Polar
FE No Polar
Hidrofbico
(No Polar)
La separacin es similar a la extraccin desde agua a un disolvente orgnico: los
compuestos ms hidrofbicos (no polares) son preferentemente extrados hacia la
fase no polar.
La columna es tpicamente un soporte de slice modificada con C8 o C18 como fases
ligadas.
Los compuestos
hidroflicos (polar) son
menos retenidos y
eluyen primero
Los compuestos ms
hidrofbicos (no polares)
son retenidos ms
fuertemente
EFECTOS DE LA FASE MVIL
La retencin (valor de k) se ajusta preferentemente cambiando la
composicin de la fase mvil o la fuerza del solvente.
En RPLC, la retencin es menor para las FM ms fuertes, que son las menos
polares.
La polaridad del solvente se puede medir por el ndice de polaridad P.
La fuerza del solvente depende tanto de la eleccin del solvente orgnico
como de su concentracin en la fase mvil (B%), siendo A el agua.
Un primer (y principal) objetivo en el desarrollo del mtodo es la obtencin de
la retencin adecuada de todos los compuestos de la muestra.
Un intervalo de retencin de 0,5 < k<20 es aceptable para las muestras que
se separan mediante condiciones isocrticas (aunque se prefiere 1 <k<10).
ELECCIN DEL % DE B.
El desarrollo del mtodo comienza usando una fase
mvil muy fuerte (100% de ACN).
El uso inicial de una fase mvil fuerte hace que el
tiempo de anlisis sea convenientemente corto, y los
todos los compuestos eluyan.
Para 100% de ACN toda la muestra eluye cerca de t
M

(k < 0,2) por lo que se requiere una FM ms dbil.
Las sucesivas reducciones de ACN% hasta 80% y 60%
ACN no dan resultados aceptables en trminos de
retencin del primer pico (t
R
= 1 min, k < 0,5).
Una retencin adecuada se logra con 50% y 40% de
ACN (0,5 < k < 20).
Si la fase mvil es mucho ms dbil (<30% ACN), la
retencin para el compuesto D sera demasiado larga
(k> 20).
ELECCIN DEL % DE B
Las lneas
punteadas
horizontales en k=
0,5 y 20 definen los
valores mnimo y
mximo de %B para
obtener una
retencin aceptable:
30 a 56% B (lneas
de puntos
verticales).
ELECCIN DEL % DE B
k
w
es el valor terico
de k para agua
pura como FM,
S es una
constante para
un compuesto
dado
es la fraccin
en volumen de
solvente orgnico
en la FM.
Para compuestos
de PM<500 Da,
S = 4.
k aumenta por un
factor de 2 a 3 por
una disminucin del
10% B.
A partir del modelo de
particin antes visto aplicado
a fases estacionarias ligadas,
se obtiene:
FUERZA DE LA FASE MVIL
No slo hay que tener en cuenta la fuerza del solvente
con respecto a su influencia sobre %B sino que
tambin tiene importancia el tipo de solvente utilizado.
Los solventes
ms utilizados
son el
acetonitrilo, el
metanol y el
tetrahidrofurano
(THF).
Entre ellos la
sucesin en
funcin de su
fuerza es la
siguiente:
agua (el ms dbil) <metanol <acetonitrilo <etanol
<tetrahldrofurano <propanol <cloruro de metileno (el ms
fuerte)
De todos ellos, el cloruro
de metileno no es muy
utilizado debido a que es
inmiscible en agua.
El ms utilizado es el
AcN porque tiene la
suficiente fuerza y
porque cuando se
emplea como sistema
detector el
espectrofotometricoo UV-
V es transparente a
Iongitudes de onda
cortas.
Las mezclas de AcN son
de baja viscosidad y eso,
en cierta manera,
aumenta la eficiencia de
la columna (N) y la
presin a utilizar es
menor.
Algo menos que el AcN
se utiliza el metanol y
algo menos todava el
THF.
DIAGRAMA DE COMPARACIN DE SOLVENTES
EN RPLC
Mezclas isoeluotrpicas: mezclas acuosas binarias de
composicin tal que mantienen la retencin global de la
mezcla de analitos
El empleo de los nomgrafos permite cambiar la selectividad
sin cambiar la retencin global de la mezcla
EFECTO DE LA FE
Aparte de la fase
mvil, las
retenciones
presentan
dependencia
respecto a la fase
estacionaria.
La retencin de
los analitos
depende de tres
caractersticas de
la columna: tipo
de fase enlazada,
concentracin y
superficie.
Si se analiza el tipo de fase enlazada la
retencin de analitos no polares y no inicos
sigue el siguiente orden:
Slica desnuda (dbil) < < ciano < C1 (TMS)
< C3 < C4 < fenilo < C8 C18 (fuerte)
EFECTO DE LA LONGITUD DE LA CADENA EN LA
EFICIENCIA DE UNA COLUMNA DE RPLC
CROMATOGRAFA DE FASE NORMAL (NPLC)
ASPECTOS GENERALES
La FE es ms polar que la FM.
Por lo general, la FM es una mezcla de solventes orgnicos,
sin adicin de agua (por ejemplo, isopropanol + hexano)
El relleno de la columna es un adsorbente inorgnico (slice o
almina) o una fase ligada polar (ciano, diol, aminocidos).
La retencin de la muestra aumenta a medida que disminuye
la polaridad de la FM.
En NPLC, los compuestos menos polares (hidrofbicos) eluyen
primero, mientras que los ms polares (hidroflicos) son los
ms retenidos.
MECANISMO DE RETENCIN

La retencin en NPLC se describe bien por un
proceso de desplazamiento
Se basa en que la superficie de la slice est
inicialmente cubierta por una monocapa de
molculas de FM adsorbida.
Para que una molcula de soluto pueda quedar
retenida, deber desplazar previamente e las
molculas de FM adsorbida.
El equilibrio vendr dado por:
nM(m) Y(s) nM(s) Y(m) + +
MECANISMO DE RETENCIN
La figura muestra el desplazamiento de un soluto relativamente no
polar (clorobenceno) en una FM menos polar (cloruro de metileno).
Una o ms molculas pre-adsorbidas de CH
2
Cl
2
son desplazadas de
la FE y regresan a la FM.
MECANISMO DE RETENCIN
Snyder obtuvo una expresin para la retencin en NPLC
en funcin de la "fuerza del solvente":


es un parmetro que refleja la polaridad de la FM.
A
s
es el rea superficial del soluto.
es la relacin de fases.

2
es un parmetro de segundo orden que sirve para
corregir por falta de linealidad del modelo asumido.

=
1 2
2

log
solv solv
s
A
solv
K
solv
K

En la ecuacin de Snyder, las caractersticas del solvente estn representadas por e,
el parmetro del solvente.
El solvente debe elegirse de modo que k caiga en el rango ptimo (entre 1 y 10).
La fuerza del solvente est determinada por cun fuertemente el solvente se adsorbe
sobre el slido.
Para adsorbentes polares, la fuerza del solvente crecer con su polaridad y un solvente
fuerte dar valores de k bajos.
Si un mismo soluto es cromatografiado sobre un mismo adsorbente empleando dos
solventes diferentes, la relacin de las K ser:
PAPEL DEL SOLVENTE
Se define = 0 para el pentano (que es uno de los
solventes ms dbiles).
Se construye una escala de valores crecientes de ,
conocida como serie eluotrpica
Para adsorbentes polares, crece con la polaridad, y
la serie eluotrpica es ms o menos coincidente con la
escala de P.
Al aumentar , los K de todos los solutos se harn
menores, pero el efecto es mayor cuando las molculas
tienen reas moleculares (A
s
) ms grandes.
PAPEL DEL SOLVENTE
SELECTIVIDAD DE LA FM
El parmetro e para mezclas
se puede calcular a partir de
los valores de e para los
solventes puros.
Para la obtencin de FM de
diferente selectividad y
similares valores of k existen
nomgrafos.
A diferencia de RPLC, estos
nomgrafos dependen de la
FE.
Nomgafos para NPLC y slice desnuda
como FE.
SELECTIVIDAD DE LA FE
Condiciones:
Columna de 150 4.6-mm de
slica (FE) (d
p
= 5-m)
FM: acetato de etilo (B)-ciclohexano
(A)
Temperatura ambiente
Caudal: 2.0 mL/min.
(1) 2-aminonaftaleno
(2) 2,6-dimetilquinolena
(3) 2,4-dimetilquinolena
(4) 4-nitrofenol
(5) quinolena
(6) isoquinolena

HPLC
FASE MVIL EN HPLC
Los solventes ms utilizados en HPLC son: agua, soluciones buffer
acuosas y solventes orgnicos tales como metanol, acetonitrilo o
diferentes mezclas.
La fase mvil debe microfiltrarse para evitar obstrucciones en el
sistema (conexiones muy estrechas, pistones de zafiro y columna
muy empaquetada)
Bomba
(flujo
inestable)
Detector
(seales
errticas)
Aire disuelto
en la fase
mvil
(problemas)
HPLC: BOMBAS
Construidas con materiales inertes a los
disolventes empleados
Flujo entre 0.1 y 10 mL/min libre de pulsaciones
Generar presiones superiores a los 6000 psi (14.7
psi = 1 atm)
Las bombas pueden liberar el eluyente a una
composicin fija (rgimen isocrtico) o a una
composicin variable en el tiempo (rgimen de
gradiente)
En el caso de una bomba, los solventes se mezclan previamente en una
cmara a baja presin
En el montaje de alta presin se emplean tantas bombas como solventes se
usen y luego se produce la mezcla
HPLC: INYECTORES
El inyector ms empleado
es una vlvula de 6 vas,
con lazos de volumen
conocido y una palanca
con dos posiciones:
llenado e inyeccin
En la posicin de llenado,
la FM pasa directamente
a la columna y la muestra
se introduce en el lazo
mediante una
microjeringa
Al girar la palanca a la
posicin de inyeccin, la
FM impulsa la muestra
que estaba en el lazo
hasta la columna
De este modo la varianza
en la inyeccin es
constante y no hay que
usar patrn interno como
en GC
Los lazos ms habituales
oscilan entre 2 y 1000 mL
HPLC: COLUMNAS
Son generalmente de acero plstico, de una
longitud de 5-30 cm y con dimetros interiores
de 1-5 mm
Las convencionales tienen un dimetro interno
de 4.6 mm. (L=15 25 cm y 5m tamao
partcula)
Son caras y se degradan con facilidad (polvo,
partculas de la muestra o disolventes)
La entrada de la columna se protege con una
precolumna que se reemplaza peridicamente
PRE-COLUMNAS
En cromatografa de reparto, la
FM y la FE deben seleccionarse
de forma que la solubilidad
recproca sea mnima.
Por muy distintos que sean dos
lquidos, siempre sern algo
miscibles.
Por ello, la FM deber
presaturarse con la FE antes de
ponerse ambas en contacto
dentro de la columna.
Esta pre-saturacin se hace en
una pre-columna situada antes
del sistema de introduccin de
las muestras.
La pre-columna deber
contener un relleno de gran
rea superficial, tal como gel de
slice, recubierto con una
cantidad relativamente grande
(30-40%) de la sustancia usada
como fase estacionaria.
El problema de la solubilidad de
la fase estacionaria impide
utilizar la tcnica de la elucin
con gradiente.
DETECTORES
Los detectores basados en una PROPIEDAD DEL SOLUTO responden
a una propiedad fsica o fsico-qumica del soluto, y que
generalmente no la presenta la fase mvil. Estos detectores suelen
ser bastante selectivos y muy sensibles.
Los detectores basados en una PROPIEDAD DE LA DISOLUCIN
comparan el cambio global de alguna propiedad fsica de la fase
mvil con y sin soluto eluido. Estos detectores responden a un
conjunto amplio de solutos, pero suelen ser poco sensibles.
Caractersticas
de un detector
para HPLC
Sensibilidad
elevada.
Buena
estabilidad y
reproducibilid
ad.
Amplio
margen de
respuesta
lineal.
Pequeo
tiempo de
respuesta.
Pequeo
volumen
muerto.
Insensible a
cambios en
la presin y
la
temperatura.
Respuesta
independien-
te de la
composicin
de la fase
mvil.
No
destructivo.
DETECTORES DE ABSORBANCIA ULTRAVIOLETA
La modificacin ms
importante es disear
adecuadamente la celda
de flujo.
Esta deber contener un
volumen mnimo (entre
1 y 10 L) y ser capaz
de soportar presiones
de varias atmsferas.
Celda diseada en
forma de Z.

DETECTORES DE ABSORBANCIA ULTRAVIOLETA
El detector UV ms sencillo
utiliza la emisin intensa a
254 nm de una lmpara de
mercurio y la deteccin a una
sola longitud de onda.
Se estima que casi las dos
terceras partes de los solutos
orgnicos analizados por HPLC
presentan absorcin a esa ,
especialmente los compuestos
aromticos, los cuales tienen
absortividades molares del
orden de 10
4
.
En instrumentos ms verstiles
se utiliza una lmpara de
deuterio y un monocromador
para mediciones a longitud de
onda variable.

APLICACIONES
La cromatografa en FASE
NORMAL se utiliza extensamente
para el anlisis de sustancias que
son solubles en disolventes no
polares.
Vitaminas, pigmentos, aceites
esenciales, aditivos no polares en
distintos productos comerciales y
formulaciones farmacuticas.
Asimismo, uno de los usos ms
importantes de esta modalidad
de cromatografa es la separacin
de ismeros.
La cromatografa en FASE
INVERSA, y particularmente la de
fase enlazada, es, sin duda, la ms
ampliamente utilizada.
Se calcula que el 75 % de las
separaciones por HPLC se llevan a
cabo por dicha tcnica.
En la industria farmacutica sus
aplicaciones se centran, entre
otras, en el anlisis de vitaminas,
-bloqueantes, alcaloides,
esteroides, tetraciclinas,
prostaglandinas, etc.
Asiismo, es utilizada para el
anlisis de especies
biolgicamente activas, como
aminocidos, protenas y cidos
nucleicos.
CROMATOGRAFIA PLANA
El cromatograma est constituido por un conjunto de manchas que corresponden a los componentes separados
Una vez que el disolvente ha pasado a travs de la mitad o de las dos terceras partes de la longitud de la lmina,
se saca sta de la cmara y se seca, ponindose de manifiesto la presencia de las especies separadas por los
procedimientos que se indicarn ms adelante.
La fase mvil percola a travs de la fase estacionaria por capilaridad y desplaza los componentes de la muestra a
distinta velocidad, teniendo lugar la separacin.
En cromatografa plana, la muestra se aplica en forma de gota sobre una lmina o superficie plana. Despus de
evaporado el disolvente, la lmina se coloca verticalmente en una cmara cerrada con su extremo sumergido en el
eluyente elegido (fase mvil), pero no la muestra.
Existen dos tcnicas de cromatografa plana: cromatografa en papel (CP) y cromatografa de capa fina (CCF o TLC).
Cromatografa lquida en la que la fase estacionaria es una superficie plana, en lugar de estar contenida en una
columna.
CROMATOGRAFIA PLANA
PRINCIPIOS BASICOS
La caracterizacin de los componentes separados se lleva a
cabo por el denominado factor de retardo, R
F
, definido por:




Los valores de R
F
pueden variar desde 1, para los analitos
que no se retrasen, hasta valores prximos a cero.
Ayudan a la identificacin de una determinada especie, si
bien, la coincidencia en los R
F
no deber tomarse como
prueba inequvoca de identificacin
M
R
F
d
d
R = =
solvente del frente el por recorrida distancia
soluto el por recorrida distancia
PRINCIPIOS BASICOS
Con objeto de minimizar las diferencias entre los
valores de los RF, se ha propuesto utilizar el
parmetro R
x
, definido por:



A pesar de la coincidencia en los valores de R
x
, la
identificacin plena de un compuesto deber
hacerse de forma especfica, con tcnicas
auxiliares, como espectroscopia IR,
espectrometra de masas, RMN, etc.
P
R
X
d
d
R = =
patrn el por recorrida distancia
soluto el por recorrida distancia
PRINCIPIOS BSICOS
Factor de retencin o factor de capacidad


Nmero de platos tericos
F
F
M
R
R
R
t
t
k
1
= =

16 =
2
W
d
N
R
LOCALIZACIN DE LAS SUSTANCIAS
SEPARADAS
Implican una reaccin qumica, especfica o general.
Vapor de yodo, se adsorbe sobre una gran cantidad de
sustancias, originando puntos oscuros.
cido sulfrico concentrado, el cual, pulverizado permite
visualizar las sustancias orgnicas
Fluorescena origina color amarillo-verdoso
Ninhidrina se utiliza para detectar aminocidos.
Radiacin ultravioleta, en combinacin con un indicador
fluorescente.
La placa contiene un material fluorescente cuya emisin (a 254
nm) es inhibida por la mayora de los solutos.
Una vez evaporado el solvente, se ilumina la placa con radiacin
ultravioleta en un cuarto oscuro.
Las manchas de soluto se ven ms oscuras, mientras que el
resto de la placa es brillante.