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Tecnologa del ADN

recombinante

Viridiana Lechuga Rosas
Clonacin
de DNA
En 1970 surgen
tcnicas que
permiten
aislamiento del DNA
Enzimas de
restriccin
Ingeniera
gentica
Tcnicas del DNA
recombinante
Clonacin
1. Preparacin del DNA
2. Preparacin del vector
3. Unin del DNA al vector
4. Incorporacin del DNAr
5. Propagacin celular y seleccin
6. Expresin del DNA (opcional)
Enzimas de restriccin
Endonucleasas Tijeras moleculares
Cortan la doble cadena de DNA a travs del esqueleto de fosfatos sin daar las
bases
Especificidad
Proteger a los organismos contra la invasin de DNA extraos
Las enzimas de restriccin no pueden cortar DNA metilado
Permiten cortar DNA de hebra doble, donde reconocen secuencias
palindrmicas
Enzimas de restriccin
Tipo I Tipo II
Cortan las dos cadenas del DNA en una
posicin aleatoria a cierta distancia del sitio
de restriccin
No se utilizan en investigacin de DNA
recombinante ya que el sitio de corte no es
preciso.
Reconocen una secuencia especfica y
cortan las dos cadenas de la molcula de
DNA con absoluta precisin dentro de la
secuencia reconocida.
Se usan ampliamente en investigacin de
DNA recombinante puesto que cortan en
sitios especficos.
Las secuencias reconocidas por las enzimas
de Tipo II son simtricas (palindrmicas)

Nombran
Tres letras tomadas del gnero y especie de la bacteria donde se aisl
Seguida por el serotipo
Nmero romano
Escherichia coli cepa RY13 Eco RI


DNA metilado

Enzimas de restriccin tipo II

Ligasas
Cataliza la formacin de enlaces fosfodister entre bases de DNA
Grupo fosfato en 5
Grupo OH en 3'
Extremos salientes complementarios
Extremos rasurados
Los extremos no compatibles son imposibles de ligar
Purificacin del DNA
Rompimiento de la estructura que lo contiene y eliminacin de cualquier
sustancia contaminante o molcula unida a l.
Protenas, membranas, sales, etc.
Mtodos
Disolventes
Precipitaciones

Origen de DNA
Tamao y estructura
Uso de molcula
Purificacin del DNA
Pasos Objetivos Mtodos
Lisis Liberar los componentes
internos de la clula
Detergentes fuertes y
desnaturalizantes para
lisis de clula

Mtodos para separar
el ncleo del
citoplasma
Separacin inicial Remover los
contaminantes
mayoritarios
Precipitacin de cidos
nucleicos
Tratamiento con
enzimas especficas
Purificacin Remover contaminantes Extraccin
Purificacin final Remover contaminantes
residuales
Mtodos especficos
Confirmacin Determinar pureza y
concentracin
Espectroscopia con luz
UV
Vectores
Portador de DNA que se unir al fragmento que se quiere clonar
Extracromosomales
Replicacin autnoma (replicones )
Plsmidos, virus y bacterifagos

Unin de vector o inserto
Cortar vector
con mismas
enzimas de
restriccin
Unin con ligasas
DNA recombinante
(DNAr)
Amplificar el
DNA de
inters
Vectores de
insercin
Expresin del
DNA por parte
de la clula
anfitriona
Vectores de
expresin
El vector original
tiene sitios de
restriccin
adecuados para
unirlo con el mismo
inserto de DNA
Mtodo
directo
El vector original no
tiene los sitios de
restriccin
adecuados para
unirlo con el inserto
de DNA
Policonector
Mtodo
indirecto
Obtencin de fragmentos de DNA
Mtodos
Digestin por enzimas de restriccin Fragmentos de longitud pequeo
Rompimiento mecnico del DNA Fragmentos largos (10000 pb)
Sntesis enzimtica de DNA PCR
Sntesis qumica de DNA Formacin de enlaces fosfodister en
direccin 3-5'
Formacin del DNA recombinante
DNA que sufre clonacin
Combinar dos fragmentos de DNA de orgenes diferentes
Vector + inserto
Unin covalente in vitro
Ligasa
Productos secundarios no deseados
Incorporacin de DNA recombinante
Clula anfitriona
Clulas especializadas


Procariticas Eucariticas
Transformacin
El inserto de DNA permanece unido a
plsmido
Recombinarse con el DNA del cromosoma

Expresin de una protena
Levaduras
Mtodos de introduccin del DNAr
La permeabilidad de la membrana no permite el paso de DNAr
Mtodo pasivo (facilitar su captacin)
Mtodo activo (directo)
Transformacin (bacterias anfitrionas)
Trasfeccin (virus como vectores)

Mtodo de introduccin de DNAr

Fsico-qumico Incubacin con CaCl a 0C
37-43 C
Incorporacin pasiva de DNA Interaccin de cationes
Fosfato clcico
DEAE-dextrano
Agente qumico PEG( polietilenglicol)
Liposomas Fusin con membrana
Vectores vricos Transfeccin
Electroporacin Apertura de poros transitorios en la
membrana
Biolstica bombardeo Microesferas recubiertas con DNAr
Pistolas de genes
Deteccin y seleccin de clones
recombinantes
Necesario conocer que clulas introducen el material clonado
Mtodos
Mtodo de hibridacin Deteccin de una secuencia del DNA
clonado
Sonda marcada
Mtodo inmunoqumicos Deteccin de protena codificada
Anticuerpo especfico
Mtodos genticos o de seleccin fenotpica Cambios en clula anfitriona
Genes marcadores

Genes que codifican una protena
detectable
Genes de resistencia a un antibitico
Genes que complementan defectos
nutricionales
Asociaciones