Anda di halaman 1dari 9

TEKNIKPENGGUNAANMARKARAPDDENGAN

PCR
ZULQOYAHLAYLA
Bal ai Penel i t i an Ter nak, Po. Box221 Bogor 16002
RINGKASAN
TemuTekni s Fungsi onal Non Penel i t i 2001
PCR( Pol ymer ase Chai n React i on) at au r eaksi pol i mer ase ber ant ai
adal ah t ekni k
ampl i f i kasi DNAyang spesi f i k dengan car a mel akukan pr oses
pemanj angan nukl eot i da dar i pr i mer
yang mer upakan pasangan kompl emen
dar i ut as DNAsecar a si mul t an
.
Unt uk mengat ahui
hasi l ampl i f i kasi , per l u
di l akukan mi gr asi pr oduk
PCR
di
dal amgel ( el ekt r o- f or esi s) dan di amat i
dengan UVt r ansi l umi nat or
. Hasi l vi sual i sasi akan menunj ukkan adanya
per bedaan si f at
di ant ar a sampel yang di uj i ber dasar kan pada ukur an DNAyang
t er separ asi
. Sal ah sat u kegunaan pr oses PCRadal ah unt uk kaj i an ker agaman
mol ekul er seper t i RAPD. Tekni k RAPD( RandomAmpl i f i ed
Pol i mor phi c
DNA) seder hana dal ampenger j aannya, memer l ukan sedi ki t sampel , dan pal i ng
cepat dal ampenggunaannya, namun r el at i f
cukup mahal t er ut ama pada enzym
Taq pol i mer ase. Dar i
masi ng- masi ng 5 sampel dar ah domba bangsa Gar ut ,
Sumat er a, St Cr oi x,
Mer i no, dan Ekor Gemuk, t el ah ber hasi l di i sol asi sebanyak
25 nomor
DNAdengan kemumi an ber ki sar ant ar a 1, 440- 2, 330, ser t a memi l i ki
konsent r asi ant ar a 87, 5ng/ ul - 1912, 5 ng/ ul . Dar i hasi l separ asi pr oduk PCR
dengan
pr i mer OPH- 03, muncul pi t a- pi t a dengan j uml ah ber f ar i asi ant ar a 2- 4.
Hal i ni menunj ukkan bahwa bangsa domba yang di per i ksa memi l i ki si f at
pol i mor f i s .
PENDAHULi 1AN
PCR( Pol ymer ase Chai n React i on) at au r eaksi pol i mer ase ber ant ai
adal ah t ekni k ampl i f i kasi DNAyang spesi f i k dengan car a mel akukan pr oses
pemanj angan nukl eot i da dar i
pr i mer yang mer upakan pasangan kompl emen
dar i ut as DNAsecar a si mul t an. Pr oses
pemanj angan nukl eot i da mer upakan
pr oses pol i mer ase yang di l akukan ol eh
DNAkar ena
adanya
"pr i mer " yang
ber kompl emen dengan DNAut as
t unggal
. ( SUHARSONO,
2000) .
Pengul angan dar i si kl us ber dasar kan pada per ubahan suhu
yang
t er di r i
dar i t ahap "denat ur asi ",
"anneal i ng " dan "ext ensi on" . Tahap "denat ur asi "
mer upakan
t ahap awal di mana pada t ahap i ni DNAyangmer upakan r ant ai ut as
panda
akan t er l epas sehi ngga membent uk r ant ai ut as t unggal . Tahap
"anneal i ng" mer upakan t ahap di mana t er j adi per l ekat an pr i mer pada i kat an
DNAWas t unggal _ Pr i mer yangmemi l i ki sekuens basa t er t ent uakan mengenal i
sekuens basa DNAut as t unggal . Tahap sel anj ut nya adal ah t ahap "ext ensi on"
at au pemanj angan , di mana pada
t ahap i ni t er j adi pemanj angan pr i mer dengan
147
TemuTekni s Fungsi onal
Non Penel i t i 200/
bant uan enzymTaq DNA
pol i mer ase. Hasi l pr oduk i ni ber f ungsi sebagai
t empl at e ( cet akan) pada si kl us
ber i kut nya. PCRsangat sensi t i ve, dapat
mengampl i f i kasi sampai
l ebi h dar i sej ut a kal i , sehi ngga dapat menghasi l kan
DNAdal amj uml ah yang sangat besar .
Kar ena dapat mengampl i f i kasi demi ki an
banyak, maka DNAcet akan ( t empl at e) di but uhkan
dal amj uml ah yang
sedi ki t . ( SUHARSONO, 2000) .
Unt uk menget ahui
hasi l ampl i f i kasi maka per l u di l akukan mi gr asi
pr oduk PCR di
dal am gel ( el ekt r of or esi s) dan di amat i dengan
UV
t r ansi l umi nat or .
Hasi l vi sual i sasi akan menunj ukkan adanya per bedaan
si f at
di ant ar a sampel yang di uj i ,
ber dasar kan pada ukur an DNAyangt er separ asi .
Pr oses PCRdapat di per gunakan
unt uk ber bagai keper l uan di ant ar anya
unt uk i dent i f i kasi suat ugen at au DNAyang spesi f i k
; unt uk i dent i f i kasi adanya
suat u pat ogen penyebab suat u penyaki t , seper t i
Hepat i t i sB, TBC, AI DS, at au
kel ai nan l ai nnya ; per banyakan gen unt uk ber bagai
keper l uan; unt uk kaj i an
ker agaman mol ekul er seper t i RAPD( RandomAmpl i f i ed
Pol i mor phi c DNA) ;
unt uk pengur ut an DNA, dl l .
RAPDmer upakan
sal ah sat u t ekni k yang pal i ng l uas di per gunakan
kar ena keseder hanaannya. . Pr i mer yang
di gunakan adal ah pr i mer
ol i gonukl eot i da di mana ur ut an basanya di buat
secar a r andom( acak) . Dal am
RAPDdi per l ukan sedi ki t sampel DNAunt uk anal i sa
. Tekni k i ni mer upakan
t ekni k yang pal i ng cepat dal ampenggunaannya, namun r el at i f
cukup mahal ,
t eni t ama unt uk enzymTaqDNApol i mer ase. ( WI LLI AMat al , 1990) .
Tuj uan
penul i san i ni adal ah unt uk mengemukakan sal ah sat u met ode
i sol asi
DNA,
pel aksanaan
met ode mar ka RAPDyang di gunakan di
l abor at or i umGenet i ka Bal i t nak Bogor t er hadap sampel dar ah domba.
Al at
dan bahan yang di gunakan
Mi kr opi pet , t i ps, t abung eppendor f
1500
ul ,
t abung eppendor f 200 ul ,
mi kr osent r i f us, spekt r of ot omet er doubl e beamUV150-02
Shi madzu, t angki
el ekt r of or esi s, cet akan gel
+
si si r mesi n PCRMJ Resear ch,
kamer a Pol ar oi d. ,
UVt r ansi l umi nat or , sar ung t angan l at ex .
Lar ut an yangdi gunakan
BAHANDANMETODA
Penyangga TE, penyangga TBE,
NP-40, SDS, al kohol 70 %, al kohol
absol ut , NaOAc 3M, Pr ot ei nase-K , buf f er PCR( Pr omega) ,
dATP( Pr omega) ,
dCTI ' ( Pr omega) , dGTP( Pr omega) , dTTP( Pr omega) , MgCl z ( Pr omega) , DNA
Taq
pol i mer ase( Pr omega) , pr i mer OPH-03( Oper on) , dd HZ O. Penanda ukur an
mol ekul er 1
Kb
dan
100 bp.
Metode
I sol asi DNA
Temu Tekni s Fungsi onal NonPenel i ti 100/
DNAcetakan di i sol asi dar i dar ah
domba ber dasar kan metode
SAMBROOKat al , ( 1989) yang tel ah di modi f i kasi . Sebanyak 5 ekor
dar i
masi ng masi ng domba bangsa Ekor gemuk, Mer i no, Gar ut, StCr oi x
dan
Sumatr a di ambi l dar ahnya secar a asepti s mel al ui vena j ugul ar i s
. Pengambi l an
dar ah sebanyak 5 ml di masukkan kedal amtabung vacutai ner yang
tel ah ber i si
anti koagul ant EDTA. Sebanyak 35 0 ul pl asma dar ah di masukkan
ke dal am
tabung eppendor f 15 00ul , di tambah sebanyak 70 ul l ar utan NP40, 35 0 ul
l ar utan SDSdan 10
ul
Pr otei nase K
.
Tabung di vor tex, kemudi an di i nkubasi
pada suhu
5 0C
semal am
.
Keesokan har i nya di tambah 35 0ul l ar utan f enol ,
di sentr i f ugasi
pada 13000 r pmsel ama
5
meni t
.
Fase atas di ambi l untuk
di pi ndahkan ke dal amtabung
eppendor f bar u, di tambah 1/ 10 bagi an l ar utan
NaOAc 3Mdan 2 bagi an l ar utan al kohol
absol ut di ngi n
.
Tabung di goyang
per l ahan ( dasar tabung di j enti k j enti k ) hi ngga ter bentuk
endapan puti h
( DNA) . Tabung di si mpan pada suhu - - 20C semal am. Keesokan har i nya
tabung di sentr i f ugasi pada kecepatan 13000 r pm sel ama 5 meni t
. Cai r an
yang ada di dal amtabung di buang dengan hati hati hi ngga yang
ter si sa
ber upa endapan ( DNA) ber war na puti h. Kedal amtabung yang ber i si DNA
ter sebut di tambahkan
sebanyak 1 ml l ar utan al kohol 70 %, campur per l ahan,
sentr i f ugasi pada kecepatan 13000 r pmsel ama
5 meni t. Cai r an al kohol
di buang, tabung di i nkubasi pada suhu 5 0C sel ama 1 j am, atau
di ker i ng
angi nkan hi ngga ter bentuk pel et DNAdi dasar tabung. Kedal amtabung yang
ber i si pel et DNAdi i si kan sebanyak 200 ul l ar utan TE untuk mel ar utkan
kembal i DNA,
di i nkubasi pada suhu 65 C sampai DNAl ar ut . Kedal amDNA
di tambahkan 5 ul l ar utan RNAse,
di i nkubasi sel ama 2 j ampada suhu 37C,
kemudi an di r ebus sel ama 5 meni t untuk
menghenti kan r eaksi . DNAyang
di hasi l kan sel anj utnya di ukur kual i tas dan kuanti tasnya .
Kuanti tas DNAdapat di l i hat dengan
UVspektr of otometer pada
panj ang gel ombang 260 nmdan 280 nm.
Adapun pr osedur nya yai tu
memasukkan sebanyak 5 ul DNAkedal amtabung cuvet
di tambah 2495 ul TE
sebagai pengencer , di l i hat ( di baca) ni l ai opti kal
densi ti nya pada
UVspektr of otometer dengan panj ang gel ombang 260nmdan 280 nm.
Sebagai
l ar utan standar di pakai l ar utan
penyangga TE. Dar i hasi l pengecekkan ter sebut
di dapat data kemur ni an DNA
yang dapat di hi tung dengan mel i hat
per bandi ngan bacaan pada
spektr of otometer dengan panj ang gel ombang
260
nmdan 280 nm. Sel anj utnya dar i hasi l
pengukur an ter sebut dapat di tentukan
j uml ah DNAsampel yang di per ol eh dengan r umus
: J uml ah DNA=[ 260 x
25 00/ 5 x 5 0 ] / 1000. I nf or masi kuanti tas i ni dapat di gunakan
untuk menentukan
per hi tungan dal am pengencer an DNAagar dapat
di ketahui secar a tepat
konsentr asi DNAdi i ngi nkan.
Uj i kual i tas DNAdapat di l akukan dengan el ektr of or esi s
. DNAbasi l
i sol asi di ambi l
sebanyak 3 ul dan di campur dengan l ar utan
bl ue j ui ce
( pember at/ penanda mi gr asi ) , l al u di i si kan
ke dal amsumur an gel yang
149
mengandung
1 %
agar ose. Pada sumur an
l ai n, di i si
penanda DNAber ukur an
1 Kb
. Gel di el ekt r of or esi s
dengan t egangan
90 vol t sel ama
1 , 5
j am, kemudi an
di r endamdal aml ar ut an Et hi di umBr omi da sel ama
1 0
meni t , di bi l as dengan
mer endamgel
di
dal amai r sul i ng, di amat i dengan bant uanUV
t r ansi l umi nat or ,
bi l a per l usel anj ut nya di f ot o dengankamer aPol ar oi d.
Met odeRAPDdenganPCR
1 . Sampel DNA yang akan di uj i

masi ng- masi ng di encer kan dengan
konsent r asi 5 ng/ ul . dal aml ar ut an penyangga TE. Unt uk set i ap bangsa
di buat l ar ut an gabungan( bul k) 1 0 ul DNA5ng/ ul set i ap i ndi vi dudi j adi kan
sat u.
2. Membuat l ar ut an campur an( cockt ai l ) unt uk t i ap sampel bul k
DNA
ke
dal amt abung
eppendor f i si
200
ul dengankomposi si :
1 5 0
Buf f er PCR[ Pr omega]

2, 5 ul
dATP [ Gi bco]

0, 5 ul
dCTP

[ Gi bco]

0, 5 ul
dGTP

[ Gi bco]

0, 5 ul
dTTP

[ Gi bco]

0, 5

ul
MgC1
2 [ Pr omega]

1 , 5 ul
Pr i mer [ Oper on] H- 03

1 , 25 ul
Taq DNAPol i mer ase
[ Pr omega]

1 , 2 ul
ddHZ 0

7, 5 ul
Templ at DNA5ng/ ul

1 0 ul
Tot al
vol ume

25

ul
"Cockt ai l "yang sudah di buat , kemudi an di sent r i f ugasi dengan
kecepat an 6000 r pmagar bahan- bahan dal am"cockt ai l " dapat t er campur
sempur na. Unt uk menghi ndar i t er j adi nya penguapan pada saat pr oses
ampl i f i kasi ber l angsung, di at as per mukaan l ar ut an
"cockt ai l "di l api si
mi nyak
mi ner al sebanyak 25 ul .
"Cockt ai l " di buat dengant uj uanunt uk memudahkancar a ker j a. Buf f er
PCRber f ungsi sebagai l ar ut anpenyangga pada pr oses ampl i f i kasi . Sedangkan
dATP dCTP dGTP, dTTP, di gunakan unt uk pemanj angan pr i mer dal am
membent uk ut as DNAbar u. Pr i mer yang di gunakan adal ah OPH- 03 buat an
Oper on yang mempunyai ur ut an basa 5' - AGACGTCCAC- 3' . Enzi mTaq
DNApol i mer ase ber f ungsi unt uk memanj angkan pr i mer pada t ahap
"el ongasi / ext ensi on( BUDI ARTI . P, 1 993) .
Ampl i f i kasi
DNAdenganPCR
Temu Tekni s Fungsi onnl NonPenel i t i 2001
Set el ah "cockt ai l " sel esai di buat maka t ahap sel anj ut nya adal ah
mengampl i f i kasi DNAsampl edenganmesi nPCR( MJ Resear ch I nc ) .
Mengetahui hasi l ampl i f kasi [ separ asi l
Hasi l ampl i f i kasi dapat di l i hat dal amgel agar ose yang
di amati dengan
UVtr ansi l umi nator . Tahapannyaadal ahsebagai ber i kut :
1 . Membuat l ar utan agar ose 1 , 2% dal aml ar utan penyangga 0, 5x TBE
dengan car a memanaskannya hi ngga l ar ut, menuangkannya ke dal am
cetakan husus dengan si si r ter pasang, bi ar kan sampai beku. Si si r
sel anj utnyadi l epas .
2. Cetakan yangber i si
gel
beku di masukkanke dal amtangki el ektr of or esi s
yang
sudahdi i si l ar utanpenyangga0, 5xTBEhi nggater endam.
3 .

Sebanyak 3ul sampel DNAhasi l ampl i f i kasi di campur dengan2ul l ar utan
pember at , di aduk hi ngga homogen. Tuj uan pember i anl ar utan pember at
adal ahsebagai i ndi kator war na danj ugasebagai pember at sehi nggaketi ka
sampel DNAdi masukkan ke dal amsumur an gel , dapat tur un kedasar
sumur an. Sumur an pal i ng kanan
di i si
penandaukur an mol ekul er 1 00 by
buatanPr omegadengani si yangsama. .
4. Pr oses separ asi ( el ektr of or esi s) di l akukan pada tegangan 90 vol t
sel ama
seki tar 2j am.
5 . Separ asi di henti kan apabi l a sampel DNAtel ah ber ger ak hampi r
mendekati akl i i r gel .
Vi sual i sasi f r agmenDNAdal amgel
Temu Tekni s Fungsi onal Non
Penel i ti 200/
Ampl i f i kasi di l akukan sebanyak 45 si kl us .
Seti ap
si kl us
ter di r i dar i
ti ga tahap yai tu tahap "denatur asi " dengansuhu 94C sel ama 1
meni t, tahap
"anneal i ng" dengan suhu 36C sel ama 1 meni t dan
tahap "el ongasi " dengan
suhu 72C sel ama 2 meni t . Setel ah si kl us sel esai , sel anj utnya PCR
akan
mel akukanpr oses i nkubasi padasuhu72C sel ama5 meni t . Waktui nkubasi i ni
di maksudkan untuk memasti kan bahwa DNAyang di ampl i f i kasi tel ah
mengal ami r enatur asi . Setel ah pr oses ampl i f i kasi sel esai sel anj utnya tabung
eppendor f di si mpanpada suhu0C sampai saatnya untuk mel akukan separ asi
dal amgel agar ose.
Setel ahpr oses separ asi sel esai , sel anj utnyagel di r endamdal am
l ar utan
Ethi di umBr omi da dengan konsentr asi 0, 5 ul /ml sel ama 1 0 meni t .
Tuj uan
per endaman i ni di har apkan Ethi di umBr omi da dapat menyi si p pada
DNA,
sehi ngga pi ta- pi ta DNAyangter separ asi dapat ter l i hat denganbantuansi nar
UVdar t UVtr ansi l umi nator .
Sel anj utnya gel di r endam dal amdH, O sel ama 1 0 meni t, untuk
menghi l angkan
senyawa Ethi di umBr omi da yang
ter i kat secar a l i on spesi f i k
pada bagi an gel
yang ti dak ada
DNAnya.
Bi l a
ti dak
di l akukan per endaman,
maka
pi ta- pi ta
DNA
akan
tampak
pucat kar ena pendar an l atar bel akang gel
yang
mengi kat
Ethi di umBr omi da.
Gel di kel uar kan
dar t r endaman
ai r sul i ng dan di l etakkan di atas
pennukaan
UVtr ansi l umi nator untuk di ar nati
ada
ti daknya
pi ta- pi ta DNA, dan
bi sa
di l anj utkan pemotr etandenganmenggunakan
kamer a
Pol ar oi d
.
LI sol asi DNA
HASI L
DANPEMBAHASAN
Dar i
sebanyak masi ng- masi ng l i ma
nomor dar ah yang ber asal dar i
domba
Gar ut , St . Cr oi x, Mer i no,
Sumat er a, dan Ekor Gemuk, dengan
menggunakan
met ode Sambr ook yang t el ah
di sempur nakan, t el ah di i sol asi
sebanyak
25 nomor DNA.
2Xual i f i kasi DNA
Gambar
l . I sol asi DNA
Temu Tekni s Fungsi onal NonPenel i t i 2001
Kual i t as DNAyang di hasi l kan dapat
di amat i pada gambar 1 .
Kemur ni an DNA
ber dasar kan basi l bagi ni l ai
absor bensi pada panj ang
gel ombang 260 t er hadap
ni l ai absor bensi pada
panj ang gel ombang 280 dar i
sampel DNAbangsa
Ekor Gemuk, Sumat er a,
Gar ut , St . Cr oi x dan
Mer i no,
ber ada ant ar a
1, 440- 2, 330 . Menur ut st andar d
yang di t et apka
kemur ni an DNA
sebai knya ber ada pada
ki sar an 1, 8 (SAMBROO
at al , 1989) . Kar ena
unt uk
penger j aan RAPD
si f at nya adal ah r andom
(acak) , maka DNAdengan
ki sar an
t r i l ai 1, 44- 2, 33 masi h
dapat di gunakan.
Ket er angan
I So' 108 6Ekor
GemukM1 11 . Mer i no 1003 16
. Gar ut 3579 21 . St Cr oi x 40015
2
. Sumat er a
a=
I I I 7. Ekor Gemuk111 12.
Mer i no 1023 17. Gar ut 3613
22.
St
Cr oi x32257
3. Sumt er a 119
8. Ekor gemukSus 4 13 . Mer i no 1249
18. Gar ut 9062 23. St . Cr oi x 20113
4. Sumat er a 120 9. Ekor GemukSus2
14 . Mer i no1036 19. Gar ut 1094
24- St . Cr oi x 519
5. Sumat er a 128
10 Fkor Gemuk I sa 2 15 . Mer i no
1109 20. Gar ut 9105 25. St . Cr oi x 603
3. Kuanti f i kasi DNA
Temu Tekni s Fungsi onal Non Penel i ti
2001
Dar i hasi l kuanti f i kasi DNAdengan
spektr of otometer , di dapat
konsentr asi DNAseper ti ter dapat pada tabel 1. Konsentr asi DNA
total yang
di hasi l kanber ki sar antar a 87, 5 ng/ ul - 1912, 5 ng/ ul .
Tabel
1
.

Kuanti f i kasi
DNADombapada
panj anggel ombang
260
nm
4. Vi sual i sasi pr oduk PCR
Hasi l vi sual i sasi yang dapat di l i hat pada gambar 2, menunj ukkan
bahwa
pi ta- pi ta DNAter l i hat j el as untuk seti ap
bangsa domba dengan j uml ah
153
No. Spesi men X11C7 XE0
Konsentr asi
DNAng/ ul Kemumi an
1 EGMl 0, 018
0, 011
225 1, 640
2 H1 0, 020 0, 012 250 1, 670
3 Sus4 0, 034 0, 019 430 1, 800
4 SUS2 0, 036 0, 019 450 1, 890
5 I SA2
0, 013 0, 007 163
1, 860
6 Mer 1003 0, 013 0, 006 162, 5 2, 170
7 1023 0, 040 0, 022 500 1, 820
8 1249 0, 008
0, 004
100 2, 000
9 1036
0, 007 0, 003
87, 5 2, 330
10
1109
0, 014 0, 006 175 2, 330
11 Smt 108 0, 040 0, 025 500 1, 600
12 120 0, 062 0, 0036 775 1, 720
13 119 0, 113 0, 063 1912, 5 1, 800
14 111 0, 026 0, 018 325 1, 440
15 128 0, 067 0, 038 837, 5 1, 760
16
Gr t 3579 0, 031 0, 017 387, 5 1, 820
17 3613 0, 013 0, 007 162, 5 1, 860
18
9062 0, 043 0, 025 537, 5 1, 720
19 1094 0, 020 0, 012 250 1, 670
20 9105 0, 016 0, 008 200 2, 000
21 StCr 40015 0, 047 0, 029 587, 5 1, 620
22 32257 0, 036 0, 022 450 1, 640
23 20113 0, 015 0, 008 187, 5 1, 880
24 519 0, 053 0, 027 662, 5 1, 960
25 603 0, 055 0, 029
687, 5 1, 900
pi t a yang muncul ber ki sar ant ar a 2- 4 pi t a . J uml ah pi t a yang
muncul ber var i asi ,
yai t u 4 dar i domba bangsa St Cr oi x, Sumat er a, dan Gar ut dan 2 buah pada
domba bangsa Mer i nodan Ekor Gemuk.
Dengan t er bent uknya pi t a DNAdengan pr i mer OPH- 03, maka pr i mer
i ni dapat di gunakan unt uk anal i si s
ker agamanbangsa- bangsa domba. Pada hasi l
vi sual i sasi menunj ukkan si f at pol i mor f i s, ar t i nya
ant ar bangsa memi l i ki ukur an
DNAyang ber beda ber dasar kan ukur an pasangan basa . Hal i ni
menunj ukkan
adanya per bedaan si f at di ant ar a bangsa domba yang di amat i
yang dapat di l i hat
dar i ukur an DNAyang t er separ asi . Si f at pol i mor f i s i ni l ah yang
di har apkan
muncul dar i anal i sa RAPDi ni .
Tabel 2. .

Lar ut an unt uk pr oses
per si apan sampel
TemuTekni s Fungsi onal NonPenel i t i 2001
Nama l ar ut an Komposi si Pel ar ut / vol ume akhi r
1 MTr i sCl . pH8, 5 6, 06 gr ( 40 ml ai r bebas i on+ ai r bebas i on/ 50
ml
1ml HCI pekat )
1 MTr i sCl . pH7, 5 6, 06 gr ( 40 ml ai r
bebas
i on+
ai r bebas i on/ 50 ml
2ml HCI pekat
5MNacl 14, 61 gr Nacl ai r bebas i on/ 50 ml
TBEbuf f er 5x t r i s base 54 gr ai r bebas i on/ 1000 ml
bor i c aci d 27, 5 gr
0, 5 MEDTApH8, 0 20ml
TE buf f er 1MTr i s Hcl pH8, 0 10 ml ai r bebas i on/ 1000ml
0, 5 MEDTApH8, 2 ml
NaOAc 3M 62, 52 gr NaOAcanhydr ous ai r bebas i on/ 150ml
102, 02 gr NaOAc 3H20
pH5, 2 ( acet at gl asi al )
Penyangga NP- 40 5MNacl 2, 80 ml ai r bebas i on/ 100ml
1MMgC12 0, 15 ml
l MTr i s Hcl pH8, 5 10ml
SDS 10%SDS 6ml ai r bebas i on/ 50 ml
0, 5MEDTA1, 2m1
5MNacl
1, 2 ml
Bl ue j ui ce 0, 125 gr bl ue j ui ce + ai r bebas i on/ 50 ml
20gr sucr ose
70 %al kohol 70ml al kohol absol ut ai r bebas i on/ 100 ml
Pr ot ei nase K 1MTr i sCI pH7, 5 50u1 ai r
bebas i on/ 10 ml
Pr ot ei nase K100mg( 18 uni t / mg)
gl yser ol 100%5 ml
KESIMPi 1LAN
DAFTARBACAAN
Temu Tekni s Fungsi onal Non Penel i t i 1001
Ekor Gemul
Garut
Meri no
Surnat era
St . Croi x
100 by
Gambar 2. Hasi l separasi ampl i f i kasi dengan pri mer 01H-03
Dari hasi l ampl i f i kasi DNAyang di hasi l kan dengan t ekni k RAPD
menggunakan
mesi n PCRmemperl i hat kar_ bahwa muncul nya pi t a-pi t a
dengan
j ut nl ah yang bervari asi yai t u ant ara 2-4. Ini menunj ukkan bahwapri mer OPH
03 dapat mengenal i DNAdomba, sehi ngga pri mer i ni dapat mel akukan
pembent ukan kompl emen sekuen DNA. Perbedaan ukuran pasangan basa ant ar
bangsa domba yang t erl i hat pada gambar, menunj ukkan si f at pol i morf i s dari
bangsa domba yang di peri ksa.
BUDIARTI S.
1993
. Tehni k PCRdan apl i kasi nya, Kursus Si ngkat Bi ol ogi
Mol ekul er PAU. Bi ot eknol ogi IPB.
SAMBROOK J . E
. F,
FRITISCH ANDT. MANIATIS.
1989. Mol ecul ar Cl oni ng. A
Laborat ory manual
2nd
Ed. Col d Spri ng Harbor Laborat ory Press .
Anal ysi s andCl oni ng of Eukaryot i c Genomi c DNA, 9. 19 .
SUHARSONO
S. 2000. Pri nsi p Ampl i f i kasi DNA
dengan
PCR
.
Pel at i han
Peni ngkat an Penget ahuan dan Ket rampi l an Tekni si Tent ang Tekni k
Laborat onumBi ol ogi Mol ekul er
. PAU
.
IPB
.
WILLIAM
J . G. K, A. R
. KUBELIC,
K. J .
LIVAKJ . A. RAFALSKI AND
S. V.
TINGEY,
1990. DNAPol ymorphi s Ampl i f i ed by Arbi t ary
Pri mer
are usef ul l as
Genet i c Marker,
Nucl ei c
Aci d-Res . 18: 6531-6535.