Revista TEORA Y PRAXIS INVESTIGATIVA, Volumen 5 - No.
2, Julio - Diciembre 2010
Centro de Investigacin y Desarrollo CID / Fundacin Universitaria de rea Andina 79 Polihidroxialcanoatos (PHAs): Biopolmeros producidos por microorganismos. Una solucin frente a la contaminacin del medio ambiente Polyhydroxyalkanoates (PHAs) polymers produced by microorganisms. A solution to environmental pollution Julieth Yadira Serrano Riao 1 1 Magister en microbiologa de la Universidad Nacional de Colombia, Centro de Investigacin y Desarrollo de la Fundacin Universitaria del rea Andina, Bogot, Colombia. jserrano@areandina.edu.co Resumen Los polihidroxialcanoatos (PHAs) son biopolmeros que algunos microorganismos acumulan como reserva de carbono y energa, son producidos cuando hay limitaciones nutricionales en el medio. El sistema gentico asociado con la produccin de PHAs codifica para diversas protenas formadoras de grnulos citoplasmticos. Estos biopolmeros han cobrado gran importancia debido a que pueden ser utilizados reemplazando materiales como el plstico, que actualmente genera gran acumulacin y que se ha convertido en un alto foco de contaminacin ambiental debido a su lenta degradabilidad. La principal ventaja de los polihidroxialcanoatos frente a los plsticos derivado del petrleo es que al ser producidos por microorganismos son biodegradables por lo tanto no hay una acumulacin; los PHAs tienen diversas aplicaciones entre las que se encuentran: empaques de larga y corta duracin, injertos utilizados en medicina, productos de higiene y biocombustibles. Palabras clave: biopolmeros, polihidroxialcanoatos, contaminacin ambiental, microorganismos, biodegradabilidad. Abstract The polyhydroxyalkanoates (PHAs) are biopolymers that some microorganisms accumulate as carbon and energy reserve, they are produced under nutritional limitations in the culture media. The genetic system associated with the production of PHAs coding for various proteins forming the cytoplasmatic granule. These biopolymers have gained great importance because they can be used to replace other materials like plastic, due to its slow degradability accumulate in large quantities that have become a high source of environmental pollution. The main advantage of the polyhydroxyalkanoates is that they are produced by microorganisms are consumed by them, therefore there is no accumulation, in contrast with plastics derived from oil; the PHAs have various applications among which are: packaging of short and long term, grafts used in medicine, hygiene products and biofuels. Key words: biopolymers, polyhydroxyalkanoates, environmental pollution, microorganisms, biodegradability. Revista TEORA Y PRAXIS INVESTIGATIVA, Volumen 5 - No. 2, Julio - Diciembre 2010 Centro de Investigacin y Desarrollo CID / Fundacin Universitaria de rea Andina Julieth Yadira Serrano Riao 80 INTRODUCCIN Los plsticos derivados del petrleo (sintticos, no biodegradables), han sido utilizados desde la dcada de los 40s, segn la Enviromental Proteccin Agen- cy [EPA], solo en Estados Unidos en el ao 2009 se generaron 13 millones de toneladas de plsticos en envases y embalajes, casi 11 millones de tonela- das en objetos duraderos, como electrodomsticos, y alrededor de 7 millones de toneladas en objetos no duraderos como platos y tazas. En los pases desarro- llados se observa un uso mayor de este material; por ejemplo el consumo per capita en Estados Unidos es de 80 kg, en Europa 60 Kg, y en pases como India es de 2 Kg. (Kato, Bao, Kang, Fokui & Doi, 2000), lo que refleja que sin lugar a dudas este ma- terial es imprescindible en la poca actual. Situacin que ha generado acumulacin y que se ha converti- do en un grave problema de contaminacin ambien- tal (Ojumu, Yu & Solomon, 2004).Un Informe del PNUMA (Programa de Naciones Unidas para el Me- dio Ambiente) en el 2005 ha sealado que para ese ao se encontraban ms de 13.000 fragmentos de desechos plsticos flotando sobre cada kilmetro cua- drado del ocano citado por (Allsopp, Wallers, Santi- llo & Johnston, 2007). A su vez, en el pas segn la Armada Nacional de Colombia [ARC], (2004) existen datos que revelan que en las playas se desechan en un da 2.875 unidades de plstico. La contaminacin debido a la acumulacin de plstico es un problema que ha sido de manera ineficientemente abordada ya que los mtodos utilizados para la disminucin de este problema resultan intiles frente a la produccin desbordada del mismo. Por lo mencionado es de vital importancia generar nuevas alternativas que sean competitivas y amiga- bles con el medio ambiente; por tal razn el hombre ha buscado en la biotecnologa soluciones que son viables y que brindan soluciones ms eficientes. Es all donde aparecen los polihidroxialcanoatos (PHAs), polisteres de hidroxialcanoatos que conservan ca- ractersticas propias del plstico sinttico, con la ven- taja de ser completamente degradados pocos meses despus de su uso. Los grnulos de PHA son produ- cidos intracelularmente por ms de 300 bacterias di- ferentes incluyendo Eubacterias y Archeas (Braune- gg, Lefebrie & Genser, 1998; Ojumu et al., 2004). Una vez se conocieron las bondades de este material biodegradable, las investigaciones apuntan a crear estrategias que superen la principal desventaja exis- tente y es su alto costo de produccin frente a los plsticos derivados del petrleo; la utilizacin en el medio de cultivo de fuentes de carbono econmicas, y optimizacin en los procesos de fermentacin, recuperacin y purificacin del biopolmero son las estrategias ms usadas (Choi, Lee & Han, 1998). A su vez el empleo de microorganismos recombinantes como Escherichia coli, ayuda a resolver algunas limi- taciones tecnolgicas que se pueden presentar con los mtodos anteriores ya que permiten manejar a fondo la parte metablica y cintica del microorganis- mo, por lo tanto y de manera directa la produccin de PHAs. (Garca et al., 2004; Hein, Shling, Gotts- halk & Steinbchel 1997; Park & Lee, 2002; Sato, Nomura, Abe, Doi & Tsuge, 2007). Caractersticas generales de los PHAs Los grnulos de PHAs sirven como almacenamiento de energa y carbono cuando en el medio hay abun- dancia de este y dficit de elementos como nitrgeno, fsforo, magnesio entre otros (Lee, Choi & Wong, 1999), lo que los hace ms resistentes bajo esta con- dicin de estrs (Hezayen, Steinbchel, & Rehm, 2002; Rehm & Steinbchel, 1999; Steinbchel & Eversloh, 2003). Su tamao oscila entre 0.2 - 0.5 m con un nmero aproximado de 8-10 grnulos por clula y con un peso molecular de 2x10 5 -3x10 6
daltons (Figura 1), sin embargo esto vara dependien- do de la especie (Ojumu et al., 2004). A su vez pue- den acumular biopolmero hasta el 90% de su peso seco (Reddy & Rashm, 2003; Sudesch, Abe & Doi, 2000).
Figura 1. lmagen por microscopia eIectrnica donde se muestra Ia acumuIacin de PHAs por Pseudomonas aerugInosa Rohm, 2003
Pscudomonas ac:ugnosa Pol,ostor grnnulum Revista TEORA Y PRAXIS INVESTIGATIVA, Volumen 5 - No. 2, Julio - Diciembre 2010 Centro de Investigacin y Desarrollo CID / Fundacin Universitaria de rea Andina Polihidroxialcanoatos (PHAs): Biopolmeros producidos por microorganismos. 81 Sntesis de PHAs La composicin monomrica de los biopolmeros de PHAs es muy variada, depende de las rutas metab- licas por las cuales fueron sintetizados y por la fuente de carbono externa que se usa como materia prima para dicha ruta. Provienen bsicamente de tres vas metablicas: la degradacin de azucares mediante la obtencin de Acetil CoA, la degradacin de cidos grasos (-oxidacin) y/o biosntesis de cidos grasos (Aldor & Keasling, 2003). Clasificacin de PHAs Los polihidroxialcanoatos se clasifican de acuerdo con la naturaleza de sus unidades monmeras, si el polmero est formado por solo un tipo de unidades se denomina homopolmero (Anderson & Dawes, 1990; Chung et al., 2001). A su vez, si est integra- do por monmeros con distinta longitud de tomos de carbono en el mismo granulo se refiere entonces a un copolmero (Zhao & Chen, 2007). Del mismo modo si los monmeros que forman el polmero po- seen cada uno de 3-5 tomos de carbono se conocen como PHAs de cadena corta (scl - PHA), y PHAs de cadena media (mcl - PHA) cuando contienen de 6-14 tomos de carbono. La razn por la cual un PHAs se forma como un polmero de cadena corta o media est relacionada directamente con la enzima encargada de la sntesis (sintasa) ya que esta tiene una especificidad de sustrato que puede actuar sobre monmeros con diferente nmero de tomos de car- bono (Anderson & Dawes, 1990). Las PHA sintasas son las enzimas que catalizan la conversin de sustratos (R)-3-hidroxiacil-CoA a PHAs con la liberacin de CoA, es decir une los monme- ros formando el polmero (Rehm & Steinbchel, 1999). Hacen parte de una familia de enzimas que poseen cualidades no muy comunes considerando la funcin en la formacin de estructuras intracelulares insolubles en agua (los grnulos de PHA) y la asocia- cin de estas inclusiones con una monocapa lipdi- ca (Rehm, 2003). Estas enzimas estn unidas a las superficie de los grnulos y como todas ellas tienen una especificidad de sustrato, en este caso pueden aceptar monmeros con diferente nmero de carbo- nos, caracterstica principal por la cual se clasifican (figura 2). Figura 2. CIasiIicacin de Ia sintasas. So ospoclllcn ln ospoclo moJolo Jo cnJn clnso , ol sustrnto JonJo nctn Rohm, 2003. Clase I HasIona cuI:opha 3HA SCL -CoA 4HA SCL -CoA 3HA SCL -CoA, 3HA SCL -CoA C3-C5 3HA SCL -CoA 3HA SCL -CoA 3HA MCL -CoA [C6-C8|, 4HA-CoA, 5HA-CoA 3HA MCL -CoA C5 Pscudomonas ac:ugnosa A!!och:omaIum vnosum Bac!!us mcgaIc:um II III IV Subunidad Especies Sustrato ~60-73 kDn PhnC ~60-65 kDn PhnC ~40 kDn ~40 kDn PhnC PhnE ~40 kDn ~22 kDn PhnC PhnR Las PHA sintasas clase I tienen como microorga- nismo modelo Ralstonia eutropha, estn compues- tas de una sola clase de subunidad (PhaC), y actan sobre tiosteres CoA de varios 3 hidroxialcanoatos de cadena corta (Eversloh, Bergander, Luftmann & Steinbchel, 2001; Rehm, 2003). Las PHA sintasas Clase II tambin se componen de una sola subunidad (PhaC) y son activas sobre tiosteres CoA de varios 3-hidroxialcanoatos pero en este caso de cadena media (preferencialmente cidos grasos 3-hidroxi), el PHA resultante de la produccin de un microorga- nismo que posee esta clase de enzima tiene muchas aplicaciones debido a su gran similitud con el ltex los microorganismos representantes de este grupo son en su mayora las bacterias del gnero Pseudo- monas, principalmente Pseudomonas aeruginosa (Rehm,2003). Las PHA sintasas Clase III son representadas por Allochromatium vinosum, a diferencia de las dos anteriores estn conformadas por dos subunidades (PhaC y PhaE), pero al igual que las de clase I pre- fierentiosteres CoAde3-hidroxialcanoatosdecadena corta (Rehm, 2003); por ltimo las sintasas clase IV Revista TEORA Y PRAXIS INVESTIGATIVA, Volumen 5 - No. 2, Julio - Diciembre 2010 Centro de Investigacin y Desarrollo CID / Fundacin Universitaria de rea Andina Julieth Yadira Serrano Riao 82 poseen dos subunidades (PhaC y PhaR) actan sobre tiosteresCoAde3-hidroxialcanoatosdecadenacorta y su microorganismo representante es Bacillus mega- terium (McCool & Cannon, 2001). Cluster de sntesis de PHA Un cluster se refiere a una agrupacin de genes contiguos enfocados hacia una misma funcin, en este caso los grnulos de PHA son formados por un grupo de genes que codifican protenas que no solo producen la inclusin sino tambin la estabilizan y la degradan cuando sea necesario. Se han descrito dife- rentes cluster de sntesis de PHA a partir de una gran variedad de bacterias; se observan diferentes genes dependiendo del microorganismo y con diferente or- den; sin embargo el gen de la PHA sintasa (phaC) se encuentra presente en todos los cluster independien- temente del microorganismo, lo que sugiere que es una enzima crucial en todas las rutas de sntesis de PHA (Anderson & Dawes, 1990; Madison & Huis- man, 1999; Rehm & Steinbchel, 1999) (Figura 3). Se habla con detalle de la organizacin del cluster productor de PHAs de cadena media producidos por sintasa tipo II ya que han cobrado gran inters debido a su propiedad de elastmeros y gran similitud con el ltex. El cluster de este tipo de PHA est conforma- do por 6 genes en su orden (phaC1, phaZ, phaC2, phaD, phaF y phaI) y se han descrito principalmente en el gnero Pseudomonas (Rehm, 2003). n R. outrophn phaC phaA phaB phaC phaA phaB b Z. rnmlgorn phaC phaI phaA phaF phaB c C. vlnosum phaC phaP phaJ J A. cnvlno phaCJ phaC2 phaI phaF phaI phaZ o P. oloovornns phaCJ phaC2 phaI phaF phaZ phaJ l P. nuroolnclons Figura 3. Cluster de PHAs en diferentes microorganismos. Aunquo toJos prosontnn unn orgnnlzncln Jlloronto , gonos Jllorontos toJos prosontnn phnC quo coJlllcn pnrn ln onzlmn slntnsn rosponsnblo Jo ln pollmorlzncln Surl,nmongkol, Wosolnko, Nnrlno, Molono, & Shnh, 2007. Sintasas (phaC1 y phaC2) Los genes phaC1 y phaC2 son los genes encargados de la codificacin de las PHA sintasas se encuentran separados por la depolimerasa PhaZ y solo se ex- presa una a la vez, el que se exprese el gen phaC1 y phaC2 depende del microorganismo y del sustrato proporcionado. En su secuencia primaria y secunda- ria son idnticas entre un 50 y 60 % y las dos pre- sentan especificidad de sustrato similares (Hezayen et al., 2002; Liebergesell et al., 1991; Zhang, Kolves, Lenz & Goodwin, 2003). Son las enzimas ms estudiadas de todas las implica- das en la produccin del granulo. Se han realizado diferentes estudios sobre la estructura y comporta- miento general de esta protena, uno de los ms re- presentativos es el realizado por Rehm & Steinbchel en 1999, donde realizaron un alineamiento mltiple utilizando las estructuras primarias de 59 sintasas no solo de clase II sino tambin de las clases I, III y IV. All, demostraron la presencia de seis regiones de secuencias de aminocidos conservados y ocho residuos idnticos en todas las secuencias (Rehm & Steinbchel, 1999). En el caso de las sintasas tipo II la PhaC1 posee una longitud de 559 aminoci- dos y la PhaC2 de 560. Los ocho residuos conser- vados varan ligeramente en cuanto a su posicin entre la PhaC1 y PhaC2, en la PhaC1 se ubican de la siguiente manera: serina (S) en la posicin 238, cistena (C) en la 296, glicina (G) en la 299, acido Revista TEORA Y PRAXIS INVESTIGATIVA, Volumen 5 - No. 2, Julio - Diciembre 2010 Centro de Investigacin y Desarrollo CID / Fundacin Universitaria de rea Andina Polihidroxialcanoatos (PHAs): Biopolmeros producidos por microorganismos. 83 asprtico (D) en la 328, triptfano (W) en la 397, acido asprtico (D) en la 451, glicina (G) en la 478e histidina (H) en la479). Tres residuos (C296; D 451; H479) son los pertenecientes a la triada cataltica es decir, son los aminocidos que tienen la funcin di- recta con el sustrato. Se evidenci tambin que todas las PHA sintasas pertenecen a la familia de las lipasas que se caracterizan por contener un motivo funcional denominado caja lipasa [GX(S/C)XG] residuos 294- 298, en la cual la serina, el sitio activo esencial de las lipasas,es reemplazado con una cistena (Gerngross, Snell, Peoples & Sinskey, 1994; Jian, Ye, Wu & Zhang, 2004;Mh & Sinskey, 1999). Depolimerasa phaZ El gen que codifica esta protena (phaZ) se encuen- tra en medio de las sintasas y su producto cumple una funcin fundamental, ya que como se mencion anteriormente los grnulos de PHA se forman en la clula como reserva de carbono y energa de esta manera cuando se necesita en los procesos celulares es fundamental la presencia de una enzima que de- grade esta inclusin y es ah donde la protena PhaZ aparece. Esta protena se conoce con el nombre de depolimerasa y est relacionada estructuralmente con la familia de las esterasas. Estas enzimas catali- zan la liberacin de (R)-3-hidroxi-acil /aril -CoA deri- vados de polmeros intracelulares (De Eugenio et al., 2007; Jendrossek & Handrick 2002; Ohura, Kasuya & Doi, 1999). Se ubican en la superficie del granu- lo e hidrolizan todas las inclusiones de PHAs incluso los formados por monmeros poco usuales, lo que demuestra que acta sobre gran cantidad de sustra- tos como acurre con otras esterasas (Sandoval et al., 2005) (Figura4). Genes phaD, phaF y PhaI Seguido del gen phaC2 se encuentra el gen phaD, un gen del cual no se conoce mucho pero estudios como el de Klinke, Roo, Witholt & Kessler, 2000 en don- de mutan este gen demuestran que es importante en cuanto a la biosntesis y acumulacin del granulo ya que si haba ausencia o mutacin de este se observa- ban efectos en la acumulacin del polmero y reduc- cin de la produccin de PHAmcl a menos del 20%. El gen phaF se conoce como fascina y acta de dos maneras, primero como un elemento estructural que se necesita para la elongacin del polmero crean- do una interaccin polmero-protena (PHA-PhaF), y como un activador transcripcional de phaC1 actuan- do directamente sobre la regin reguladora del gen. La otra fascina PhaI es la otra protena asociada al grnulo que se sugiere tiene una funcin reguladora sobre el gen phaF actuando como represor del mis- mo (Figura4) (Prieto, 1999; Chen, 2010). PHA granule phaC1 phaZ phaC2 Depolymerase PHA polymerases Monolayer phospholipid membrane CoA CoA (R)-3-hydroxyacyl-CoA Phasins Uknown Proteins phaD phaF phaI transcription Figura 4. Organizacin gentica del cluster phaC1ZC2DFI involucrado en la sntesis de PHAmcl. Lns lunclonos putntlvns Jo nlgunns protolnns son lnJlcnJns Chon, 2010. Revista TEORA Y PRAXIS INVESTIGATIVA, Volumen 5 - No. 2, Julio - Diciembre 2010 Centro de Investigacin y Desarrollo CID / Fundacin Universitaria de rea Andina Julieth Yadira Serrano Riao 84 Degradacin de PHAs La principal ventaja de los polihidroxialcanoatos es su biodegradabilidad y esto lo logran ya que los gr- nulos son hidrolizados por microorganismo que bus- can en ellos fuentes de carbono y energa; lo hacen por medio de depolimerasas que son secretadas de las clulas y se adhieren a la superficie del polmero convirtindola en unidades de monmeros indepen- dientes. El tiempo que demora la degradacin de- pende de la naturaleza propia del polmero as como tambin las condiciones ambientales a las que sean expuestos, se ha observado degradacin de los PHAs en gran cantidad de ambientes incluyendo aerobios, anaerobios, salinos, marinos y otros (Ojumu, Yu & Solomon, 2004) (Figura 5). Aplicaciones de PHAs Se han reportado cerca de 150 monmeros diferen- tes formadores de PHAs, esto indica no solo que son ricos estructuralmente sino adems que pueden tener aplicaciones variadas, razn por la cual se pueden encontrar en empaques (envolturas de elementos de aseo y alimentos, en general envases de plsticos desechables o de larga duracin); al ser biocompati- bles tambin se utilizan en medicina como en injertos, reemplazando parte de tejidos, o como materia pri- ma de implementos mdicos, tambin en productos de higiene y en biocombustibles (Lee, et al, 1999). CONCLUSIONES En este artculo se describe otra manera de combatir la acumulacin y actualmente contaminacin debida al uso desenfrenado del plstico de origen petroqu- mico; se hace nfasis en el uso de microorganismos para la produccin de polihidroxialcanoatos (PHAs); material con caractersticas similares al plstico y to- talmente biodegradable, tienen aplicaciones variadas como en empaques, matera prima para productos de higiene y biocombustibles y gracias a su biocom- patibilidad tiene gran aplicacin en el campo de la medicina. Los PHAs son polmeros formados por monmeros que son unidos gracias a la accin de una enzima denominada PHA sintasa. Existen varias clases de esta enzima, sin embargo la PHA sintasa clase II llama es de inters ya que produce grnulos Figura 5. Degradacin completa de PHA en menos de 50 das bajo condiciones tropicales SuJosh, ot nl, 2000
de PHA de cadena media que son los que presentan mayor variedad de aplicaciones por su caracterstica de ser similar al ltex. Los grnulos se forman cuando los microorganismos se encuentran bajo ciertas condiciones de estrs es- pecficamente cuando en el medio hay abundancia de carbono y dficit de elementos como nitrgeno, fsforo, magnesio entre otros, por tanto sirven como almacenamiento de energa y carbono. La maquina- ria gentica encargada de producir los grnulos es compleja y ordenada est conformada por un grupo de genes cluster encargados no solo de la forma- cin sino tambin de la estabilizacin y degradacin del granulo cuando el microorganismo necesita utili- zar la reserva de energa que acumulo en la inclusin. Es necesario seguir con el estudio detallado de estos microorganismos ya que proveen una fuente inago- table de recursos y de nuevas alternativas que suplen muchas de las necesidades que actualmente deman- da la sociedad o que afrontara en el futuro. REFERENCIAS Allsopp, M; Walters, A; Santillo, D; Johnston, P. (2007).Contaminacin por plstico en los oca- nos del mundo. Recuperado de: http://www. greenpeace.org/espana/es/reports/contami- naci-n-por-plasticos-en/.