Anda di halaman 1dari 14

BAB I

PENDAHULUAN

1.1 Tujuan
Tujuan percobaan ini adalah dapat mengisolasi asam nukleat dalam sel tau jaringan

1.2 Tinjauan Pustaka
Pada organisme yang hidup terdapat dua golongan besar asam nukleat yaitu asam
deoksiribenukleat (DNA) dan asam ribonukleat (RNA). Kedua asam ini adalah polimer linier
yang tidak bercabang. Berat molekulnya berkisar 25.000 sampai 50 milyar. Seperti halnya
dengan polimer lain, asam nukleat dapat dipecah menjadi monomer. Monomer ini disebut
nukleotida (kimball, 1998).
Asam nukleat adalah ribonukleat protein purin dan primidin yang diikat bersama oleh 3,
5 fosfodiester yang analog dengan yang terdapat dalam DNA. Perbedaan antara DNA dan
RNA adalah (Martin, 1992):
a. Mempunyai gula ribosa untuk melekat basa purin dan pirimidin
b. Terdiri dari adenin, guanin, sitosin, dan urasil
c. Merupakan basa tunggal
d. Kandungan gianin tidak perlu sama dengan sitosi dan adenin serta urosil
e. Dihidrolisis oleh alkil menjadi 2,3 siklik diester dari mononukleotida dengan zat
antara 2,3,5-triester
Beberapa struktur pirimidin (Kuchel dan Raltson, 2002):



Beberapa struktur purin (Kuchel dan Raltson, 2002):

Tulang punggung kovalen baik dari DNA maupun RNA terdiri dari gugus-gugus
pentosa yang terikat sebagai fosfodiester dengan basa-basa purin dan pirimidin yang bekerja
secara gugus-gugus rantai samping sama seperti dengan menetukan bagi sifat informasional
molekul-molekul asam nukleat, karena menyusun suatu cara untuk menentukan asam amino
dan protein. DNA dan RNA bukan saja berbeda dari sifat maupun gugus pentosa dan basa-
basa tertentu. Akan tetapi juga dalam struktur seluruhnya dari molekul asam nukleat, biasanya
DNA ditemukan sebagai molekul yang berantai atau bersifat rangkap dua seperti keliks
tunggal dibandingkan oleh ikatan hidrogen antara basa-basa dalam serat yang bersangkutan,
RNA biasa adalah molekul yang berserat tunggal (White, 1964).
Asam nukleat merupakan polimer berupa rantaipanjang yang membawa sifat genetik.
Asam nuklet secara umum dibagi menjadi 2 golongan yaitu DNA dan RNA, dimana DNA
sering dijumpai dalama inti sel tumbuhan dan binatang yang merupakan suatu golongan
senyawa kimia yang ada hubungannya dengan asam nukleat yang dijumpai di sitoplasma,
bahan seluler di luar inti sel dan berguna dalam transkripsi dan transisi (informasi) (Fessenden
dan Fessenden, 1997).
DNA membawa kode genetik, tetapi RNA-lah yang menerjemahkan kode itu dalam
sintesis protein. Struktur RNA serupa dengan DNA, sederet satuan gula (dalam hal ini ribosa)
bergabung bersama-sama dengan ikatan fosfat, terikat ke suatu basa untuk setiap gulanya.
Basa utama RNA adalah guanin, sitosin, adenin, urasil. Urasil membentuk ikatan hidrogen
yang disukai oleh adenin dan selalu berpasangan dengan adenin dalam sintesa RNA
(Fessenden dan Fessenden, 1997).
Perpasangan basa dalam DNA, dua ikatan hidrogen terbentuk antara A dan T.
Sementara 3 ikatan hidrogen terbentuk antara C dan G (Kuchel dan Raltson, 2002):

Ikatan hidrogen berhubungan dengan nukleotida deoksi guanin dengan nukleotida
sitosin. Sedangkan pasangan yang lain, pasangan A-T, dihubungkan oleh dua ikatan hidrogen.
Jadi ikatan G-S lebih kuat kira-kira 50% (Girinda, 1990).
Pada sel prokariotik dan eukariotik, ketiga golongan utama RNA adalah RNA data
(nRNA = messenger RNA), RNA ribosom (rRNA) dan RNA pemindah (tRNA). Masing-
masing terdiri dari satu rantai ribonukleotida dan masing-masing mempunyai molekul urutan
nuklotida, dan fungsi biologis yang khas. RNA data (mRNA) berfungsi sebagai cetakan yang
digunakan oleh ribosom untuk melangsungkan proses translasi informasi genetik, menjadi
urutan asam amino protein. RNA pemindah juga terdiri dari untai ribonukleotida, tetapi dalam
konformasi yang berlipat-lipat. Masing-masing dari ke-20 asam amino yang ditemukan
memiliki tRNA masing-masing akan mengikat asam tersebut dan membawanya ke ribosom,
dan berperan dalam menerjemahkan kata sandi grnrtik pada mRNA (Legninger, 1992).
Tak semua jaringan yang mengansung DNA merupakan sumber yang bagus bagi isolasi
dan karakterisasi DNA. Adanya enzinpengikat, komponen protein, polisakarida dan ikatan
yang kuat antar DNA dan protein atau lipoprotein dan menghambat isolasi DNA aktif. Salah
satu prosedur dilakukan dengan menghomogenisasi jaringan pada pH netral dan disentrifuge
pada kecepatan rendah untuk memperolekeg reaksi inti (Martoharsono, 1993).
1.3 Tinjauan Bahan
1.3.1 Larutan Buffer Tris
Larutan yang dapat dibuat dari tris hidroksi metil amino protein yang ditambah HCl
dan EDTA. Digunakan untuk mempertahankan pH pada saat isolasi (Sax dan Lewis, 1987)
1.3.2 Kecambah
Tumbuhan (saprofit muda) yang baru berkembang dari tahap embriotik di dalam biji.
Tahap pengembangan ini disebut perkecambahan dan merupakan suatu tahap kritis dalam
kehidupan tumbuhan. (Windhalz,1976)
1.3.3 Etanol
Cairan tak berwarna, berbau khas jeruk, dengan MP = -134,5
o
C, BP = 78,32
o
C. Bersifat
larut dalam eter dan air, terbakar di udara, menghasilkan CO
2
dan H
2
O dalam pembakaran
dan warna biru tua, digunakan sebagai pelarut organik dan bahan bakar. (Sax dan Lewis,
1987)
1.3.4 Metilen Klorida
Metilen klorida digunakan sebagai pelarut dalam stipper dan remover cat, sebagai
pelarut dalam proses pada pabrik obat, farmasi dan pelapisan film. Senyawa berbentuk cairan
dan digunakan sebagai pelarut untuk mengekstraksi asam nukleat. Dihasilkan dari reaksi HCl
dan Alkohol atau pengklorinasi mentana. (Basri, 2003)
1.3.5 Amonium Sulfat ((NH
4
)
2
SO
4
)
Senyawa ini dihasilkan dari amoniak dan asam sulfat pekat. Digunakan dalamindustri
pupuk, sangat larut dalam air, dan tidak larut dalametanol. (Sax dan Lewis, 1987)
1.3.6 Larutan SDS
Larutan SDS merupakan surfaktan anion dengan rumus molekul NaC1
2
H
2
S.SO
4
, yang
digunakan dalam proses lisis suatu membran sel yang belum sempurna. Larutan SDS dapat
dapat membuat aktivitas enzim yang berbahaya dengan cara mendenaturasi protein. Massa
molar 288,38 g/mol, densitas 1,01 g/cm
3
, MP= 206 C (Windhalz,1976)
1.3.7 2-Butanol
Senyawa kimia dengan rumus C4H10O. Alkohol sekunder tidak berwarna, mudah
terbakar, larut dalam I2 bagian air dan tercampur sempurna dengan pelarut organik polar
seperti eter (Dainith, 1994).

















BAB II
METODOLOGI
2.1 Alat
Alat-alat yang digunakan dalam percobaan isolasi DNA adalah pipet tetes, pipet ukur,
gelas kimia, corong pisah, gelas ukur, pengaduk gelas, pengaduk kayu, botol semprot,
sentrifuge, tabung sentrifuge, martor, bola hisap, plastik perekat, statif, alumunium foil,
pestel, dan neraca.
2.2 Bahan
Bahan yang digunakan dalam percobaan ini adalah kecambah panjang, kecambah
pendek, larutan SDS, etanol 95%, metilen klorida-butanol, buffer tris-HCL, ammonium sulfat,
dan akuades.
2.3 Skema Kerja
2.3.1 Isolasi asam nukleat dari kecambah besar

-dihaluskan dengan mortar
-ditambah 10 mL buffer tris

- ditambah 2 mL larutan ammonium sulfat
- diaduk dengan pengaduk gelas selama 10 menit
- ditambahkan 15 mL larutan SDS dan diaduk lagi 10 menit

- dipindahkan masing-masing kedalam corong pisah
- diekstrak dengan 20 mL metilen klorida-butanol, dikocok
-dipisahkan kedua lapisan

-disentrifuge pada 4000 g selama 15 menit
- dipipet cairan atas dan dipindah ke beaker glass
- ditambahkan etanol 2,5 x volume asam nukleat dan diaduk


Lapisan Atas Lapisan Bawah
Campuran Pasta
Pasta
5 gram kecambah panjang bagian kepala
Hasil
2.3.2 Isolasi Asam Nukleat dari Bakteri

- disuspensikan kedalam 25 mL NaCl, dan Na
2
EDTA 0,1 M.
- ditambahakn 1 mL lizozim 10 mg/mL
- diinkubasi selama 10 menit pada temeprature 37C sambil sesekali digoyangkan
- ditambahkan 2 mL SDS 25%
-disimpan di penangas air suhu 60 C selama 10 menit
-didinginkan sampai suhu kamar dengan menggunakan air kran
-ditambah NaClO
4
5 M hingga menjadi 1 M
-ditambah kloroform isoamilalkohol 24:4 sejumlah volume yang sama
-digoyangkan perlahan (30-60 osilation/menit) selama 30 menit pada suhu kamar

-dimasukkan dalam botol bertutup rapat
-disentrifugeasi pada suhu kamar 1000 g
-diaduk dengan batang pengaduk bebas enzim


-dipipet dan dipindahkan ke dalam gelas kimia
-ditambahkan etanol 95% sebanyak 2 kali volume supernatan
-diaduk perlahan hingga DNA menempel pada batang pengaduk














2 gram pasta gel bakteri
Campuran
Supernatan Jernih
HASIL
endapan
DAFTAR PUSTAKA

Dainith, J. 1994, Kamus Lengkap Kimia, Erlangga, Jakarta.
Fessenden, R. J dan J.S Fessenden, 1997, Kimia Organik, Jilid II, Erlangga, Jakarta.
Girinda, A, 1990, Biochemistry, Prentice Hall, New York.
Kimball, J.W, 1998, Biology, 5th edt, Addison Wesley Publishing Company Inc, London.
Kuchel, P, dan G.B Raltson, 2002, Schaums Easy Outline: Biokimia, Erlangga, Jakarta.
Lehninger, 1992, Dasar-Dasar Biokimia, Jilid II, Erlangga, Jakarta.
Martin, D.W dan Jr. D. A. Mayes, 1983, Harper Biokimia (Review of Biochemistry), Penerbit
EGC, Jakarta.
Martoharsono, S., 1993, Biokimia, Gramedia Pustaka Utama, Jakarta.
Sax, N. J and R. J. Lewis, 1987, Hawleys Condensed Chemical Dictionary, Van Nastard
Reinhold, New York.
White, 1964, Principles of Biochemistry, Mc. Graw Hill Book Company, New York.





















BAB III
DATA DAN HASIL PENGAMATAN

3.1 Isolasi Asam Nukleat dari Kecambah (Kepala besar)
No. Perlakuan Pengamatan
1. Dipisahakan kepala kecambah dari ekornya Diperoleh kepala kecambah
2. Ditimbang sebanyak 5 gram kepala
kecambah besar.
Diperoleh kepala kecambah besar sebanyak
5 gram.
3. Dimasukkan 5 gram kepala kecambah
kedalam mortar dan ditumbuk hingga halus.
Diperoleh kecambah besar yang halus.
4. Ditambahkan buffer tris HCl sebanyak 10
Ml dan diaduk.
Buffer tris HCl tidak berwarna dan terbentuk
pasta.
5. Pasta dimasukkan ke dalam gelas kimia. Pasta berada dalam gelas kimia.
6. Mortar dibilas dengan ammonium sulfat
sebanyak 2 Ml dan dimasukkan ke dalam
gelas kimia yang di dalamnya terdapat
pasta.
Larutan ammonium sulfat tidak berwarna
dan pasta dalam gelas kimia.
7. Diaduk selama 10 menit. Campuran ammonium sulfat dan pasta
berwarna kuning.
8. Ditambahkan 15 Ml SDS ke dalam gelas
kimia dan diaduk selama 10 menit.
Campuran berwarna kuning terdapat banyak
gelembung.
9. Campuran dimasukkan kedalam corong
pisah dan ditambahkan 20 Ml metilen
klorida-butanol dan didiamkan.
Metilen klorida-butanol tidak berwarna dan
campuran didapatkan 3 lapisan:
- Lapisan atas : kuning bening
- Lapisan tengah : terdapat endapat
berwarna kuning gelap.
- Lapisan bawah : kuning agak keruh.
10. Dipipet lapisan atas dan dimasukkan dalam
kuvet.
Larutan berwarna kuning jernih.
11. Disentrifugasi selama 10 menit dan kuvet
ditutup dengan aluminium foil.
Didapatkan larutan berwarna kuning bening
selama 3 Ml dan terdapat sedikit endapan
pada kuvet.
12. Dimasukkan larutan bening ke dalam gelas
kimia dan ditambahkan etanol 2,5 kali
Didapatkan endapan berupa beruapa
benang-benang halus yang diduga asam
volume. Larutan (7, 5 Ml) dan dimasukkan
dalam tabung reaksi.
nukleat.

3.2 Isolasi Asam Nukleat dari Kecambah (Ekor besar)
No. Perlakuan Pengamatan
1. Dipisahakan ekor kecambah dari kepalanya. Diperoleh ekor kecambah
2. Ditimbang sebanyak 5 gram ekor kecambah
besar.
Diperoleh ekor kecambah besar sebanyak 5
gram.
3. Dimasukkan 5 gram kepala kecambah
kedalam mortar dan ditumbuk hingga halus.
Diperoleh kecambah besar yang halus.
4. Ditambahkan buffer tris HCl sebanyak 10
Ml dan diaduk.
Buffer tris HCl tidak berwarna dan terbentuk
pasta. Pasta berwarna coklat muda.
5. Pasta dimasukkan ke dalam gelas kimia. Pasta berada dalam gelas kimia.
6. Mortar dibilas dengan ammonium sulfat
sebanyak 2 Ml dan dimasukkan ke dalam
gelas kimia yang di dalamnya terdapat
pasta.
Larutan ammonium sulfat tidak berwarna
dan pasta dalam gelas kimia.
7. Diaduk selama 10 menit. Campuran ammonium sulfat dan pasta
berwarna coklat muda.
8. Ditambahkan 15 Ml SDS ke dalam gelas
kimia dan diaduk selama 10 menit.
Campuranberwarna kuning muda dan
terdapat banyak gelembung atau busa.
9. Campuran dimasukkan kedalam corong
pisah dan ditambahkan 20 Ml metilen
klorida-butanol dan didiamkan.
Metilen klorida-butanol tidak berwarna dan
campuran didapatkan 2 lapisan:
- Lapisan atas : kuning pucat dan
terdapat serat- serat halus.
- Lapisan bawah : keruh.
10. Lapisan bawah yang terbentuk di corong
pisah dibuang, sedangkan lapisan atas di
sentrifugasi selama 10 menit.
Diperoleh dua lapisan, lapisan atas berwarna
kuning bening, dan lapisan bawah berwarna
coklat muada dan terdapat serat.
11. Lapisan atas dipipet yang berupa cairan dan
dimasukkan dalam gelas ukur.
Diperoleh volume 9,2 Ml.
12. Dimasukkan larutan bening ke dalam gelas
kimia dan ditambahkan etanol 23 Ml dan
Didapatkan cairan berwarna keruh dan
sedikit benang-benang halus yang diduga
dimasukkan dalam tabung reaksi. asam nukleat.

3.3 Isolasi Asam Nukleat dari Kecambah (Kepala kecil)
No. Perlakuan Pengamatan
1. Kecambah dipisahkan antara kepala dan
ekornya
Yang digunakan adalah kepala
kecambahnya
2. Kepala kecambah ditimbang sebanyak 5
gram menggunakan neraca analitik
Didapat kepala kecambah sebanyak 5
gram
3. Kepala kecambah dimasukkan kedalam
mortar
Didapat kepala kecambah dalam mortar
4. Buffer Tris HCl ditambahkan sebanyak 10
Ml dalam mortar
Didapat kepala kecambah dan buffer tris
HCl dalam mortar
5. Kepala kecambah dihaluskan Didapat kepala kecambah halus (pasta)
6. Pasta dipindahkan pada gelas kimia dan
ditambahkan 2 Ml ammonium sulfat
Didapatkan pasta dan ammonium sulfat
pada gelas kimia
7. Campuran diaduk selama 10 menit
menggunakan spatula
Tidak terjadi perubahan pada campuran
8. Larutan SDS ditambahkan pada campuran
yang ada sebanyak 15 Ml
Larutan SDS tidak berwarna dan terdapat
gelembung, larutan campuran berwarna
kuning dan terdapat gelembung
9. Campuran diaduk selama 10 menit
menggunakan spatula
Tidak terjadi perubahan pada campuran
10. Campuran dimasukkan kedalam corong
pisah dan ditambhakan metilen klorida
butanol sebanyak 20 Ml. Campuran dalam
corong pisah dikocok hingga homogen dan
dibiarkan/didiamkan sampai terbentuk 2
lapisan
Didapatkan 2 lapisan:
Lapisan atas: kuning keruh + endapan
kuning
Lapisan bawah: putih keruh
11. Larutan kuning keruh + endapan kuning
pada corong pisah dimasukkan kedalam
kuvet
Didapatkan larutan kuning keruh +
endapan kuning pada kuvet
12. Kuvet dimasukkan kedalam sentrifuge dan
disentrifuge selama 10 menit
Terbentuk 2 lapisan:
Lapisan atas: kuning bening
Lapisan bawah: endapan putih
13. Larutan kuning bening dipipet dan
dipindahkan dalam gelas kimia dan
ditambahkan 27,5 Ml etanol 95% lalu
campuran diaduk
Didapatkan larutan kuning bening
sebanyak 11 Ml. Dan didapatkan volume
campuran sebanyak 38,5 Ml. Larutan
menjadi keruh dan terdapat butiran-butiran
putih (serabut)

3.4 Isolasi Asam Nukleat dari Kecambah (Ekor kecil)
No. Perlakuan Pengamatan
1. Peralatan gelas dicuci bersih dengan
aquades
Peralatan gelas bebas dari pengotor
2. Ditimbang 10,2 gram ekor kecambah kecil
dengan neraca analitik
10,2 gram ekor kecambah kecil berwarna
putih
3. Dimasukkan kedalam mortar dan
ditaambahkan 20 Ml buffer tris-HCl
Buffer tris-HCl yang tak berwarna berada
dalam mortar bersamaan dengan
kecambah
4. Digerus hingga halus Terbentuk pasta berwarna coklat muda
keruh
5. Pasta kemudian dipindahkan kedalam
gelas kimia 250 Ml dan kedalamnya
ditambahkan 4 Ml ammonium sulfat
Ammonium sulfat yang tak berwarna
bercampur dengan pasta, pasta berwarna
kuning keruh kecoklatan
6. Diaduk pasta dengan spatula selama 10
menit
Warna tetap kuning keruh kecoklatan
7. Kedalam gelas kimia ditambahkan 30 Ml
SDS (Sodium Dedosil Sulfat)
SDS yang tak berwarna dan berbusa
bercampur dengan pasta. Pasta menjadi
lebih encer dan terdapat busa, pasta
berwarna kuning keruh kecoklatan
8. Campuran pasta dimasukkan kedalam
corong pisah dan ditambahkan 40 Ml
metilen klorida butanol
Metilen klorida butanol yang tak berwarna
berada dalam corong pisah
9. Larutan dalam corong pisah diekstraksi Terbentuk 2 lapisan:
Lapisan bawah tak bewarna sedikit keruh
Lapisan atas berwarna krem yang
bercampur dengan kecambah yang belum
halus secara sempurna
10. Lapisan bawah dibuang dan lapisan atas
ditampung kedalam kuvet
Lapisan atas yang berwarna krem berada
dalam kuvet
11. Larutan dalam kuvet disentrifugase selama
10 menit
Terbentuk 2 lapisan:
Lapisan bawah: coklat muda (gumpalan)
Lapisan atas: kuning bening (larutan)
12. Diambil lapisan atas pada kuvet dan
diletakkan dalam gelas kimia
12,75 Ml lapisan atas kuning bening
berada dalam gelas kimia
13. Ditambahkan 31,875 Ml etanol yang
kemudian ditutup dengan aluminium foil
Terbentuk larutan berwarna putih keruh
dan ada serabut putih melayang dilarutan


















BAB IV
PEMBAHASAN
Prinsip percobaan ini adalah mengisolasi DNA dari kecambah dengan proses
penghalusan, ekstrasi dan sentrifugasi. Asam nukleat terdapata dalam inti sel tersebut dapat
diisolasi dengan 3 langkah besar tersebut.
Untuk isolasi asam nukleat, inti sel harus terpecah terlebih dahulu, yaitu antara kepala
dan ekor kecambah. Pemisahan ini bertujuan untuk membandingkan hasil isolasi dari
keduanya. Penambahan buffer tris sebelum proses penghalusan berfungsi agar kondisi pada
pH 8 dapat dipertahankan, dimana pH tersebut menyebabkan asam nukleat tidak rusak dan
struktur nukleoprotein dalam keadaan utuh. Selanjutnya kecambah dihaluskan untuk
menghasncurkan jaringan penyusun kecambah sehingga asam nukleat yang terikat pada
jaringan dapat dibebaskan. Dengan kondisi pH yang basa, yang terhidrolisis adalah RNA-nya.
Sedangkan pada pH yang asam maka RNA dan DNA akan terhidrolisis bersamaan.
Penambahan buffer tris pada perlakuan sebelumnya juga bertujuan untuk menonaktifkan
enzim nuklease dimana kofaktor Mg
2+
digunakan oleh enzim nuklease untuk mengikat EDTA
yang terkandung dalam buffer tris. Seteah kecambah berbentuk pasta, maka dilakukan
penambahan (NH4)SO4 yang berfungsi untuk memecah nukleoprotein yang terlarut menjadi
protein, juga untuk proses salting out pada nukleoprotein sehingga mengendap. Kemudian
ditambah SDS (Sodium Dodesil Sulfat) yang merupakan detergen untuk penyempurna lisis
membran sel dan dapat menahan altivitas enzim nuklease dengan cara mendenaturasi enzim
tersebut. Sedangkan NaCl pada SDS akan mendekomposisi nukleoprotein menjadi garam
natrium dari asam nukleat dan protein. Dilakukan proses pengadukan selama 10 menit untuk
menyempurnakan proses lisis dan dekomposisi.
Dilakukan ekstraksi yang bertujuan memisahkan asam nukleat dengan zat-zat lain
sehingga DNA akan terpisahkan dari protein, karbohidrat, lipid dan lain-lain. Dari ekstraksi
akan dihasilkan beberapa lapisan dari larutan campuran yang diekstrak pada percobaan ini,
lapisan atas disentrifugasi untuk menyempurnakan pemisahan sehinhgga dapat
mengendapkan zat-zat yang belum terpisahkan selama proses ekstraksi. Supernaton jernih
dari proses sentrifugasi diambil dan ditambah etanol untuk megendapkan asam nukleat yang
terbentuk. Dengan etanol tersebut, kelarutan asam nukleat dalam air akan menurun sehingga
lebih cepat mengendap, selain itu digunakan pengadukan dengan menggunakan pengaduk
agar asam nukleat dapat dengan mudah diamati.

BAB V
PENUTUP
Asam nukleat dapat diisolasi dab sel-sel jaringan tumbuhan yang pada percobaan ini
digumakan adalah kecambah. Proses isolasi asam nuklreat. Ini melibatkan proses ekstraksi
dan sentrifugas. Hasil akhir yang diperoleh dari hasil isolasi ini adalah terdapat serat yang
menunjukkan DNA terisolasi baik dari kepada maupun ekor kecambah.